BIOLOGIA MOLEKULARNA

WYKŁAD 8

24-11-2006

ELEMENTY TRANSPOZONOWE

Zaczniemy od sprawy, która ma swoją historię już ponad półwieczną. Chodzi
o moment, w którym po raz pierwszy zdano sobie sprawę, że w dziedziczeniu cech istnieją pewne niewyjaśnione zjawiska, które nie są zgodne z koncepcją w pełni liniowego, stabilnego ułożenia i zorganizowania materiału genetycznego.

Lata 40 XX wieku, kiedy Barbara McClintock, amerykańska uczona (genetyk),

zaobserwowała, a właściwie podała pierwsze wyjaśnienie dziwnego zjawiska, które było najbardziej widoczne w kukurydzy.

W kolbach kukurydzy bardzo często się zdarzają ziarniaki, które na tle purpurowego zabarwienia kolby wykazują rozmaite plamki, bardzo nietypowo ułożone i słabo powtarzalne z pokolenia na pokolenie.

Normalny purpurowy kolor ziarniaków w kolbie kukurydzy to wynik ekspresji genów, które kodują enzymy szlaku biosyntezy antocyjanów - barwników roślinnych nadających purpurową barwę.

Okazuje się, że dezaktywacja niektórych genów kodujących enzymy szlaku biosyntezy antocyjanów w pewnych komórkach, która następuje w jakimś etapie rozwoju tych ziarniaków, prowadzi do tego, że potomstwo tych komórek nie ma barwnika i jest białe. Ten rejon ziarniaka (elementu kolby), który pochodzi z tych komórek, nie zawiera barwnika. Stąd ten plamkowaty kolor.

Czyli po prostu komórka, w której doszło do dezaktywacji barwnika daje potomne komórki bez barwnika. Pozostałe komórki, w których nie było dezaktywacji dają komórki
z barwikiem. Stąd taka mozaikowa struktura kolorystyczna tych ziarniaków.

Jest taka zasada, że im wcześniej w rozwoju ziarniaka dojdzie do takiej mutacji i tym większa

Liczba komórek potomnych będzie dziedziczyła ten fenotyp no i tym bardziej biały będzie ten ziarniak. Czasami jest tak, że kolba jest właściwie cała biała z purpurowymi plamkami, jeśli mutacje zajdą wcześniej.

W latach 40 było to zjawisko trudne do wyjaśnienia. Trzeba sobie zdawać sprawę, że wtedy jeszcze nie była znana struktura materiału genetycznego. Oczywiście genetyka mendlowska to był główny element element teoretyczny, jakim dysponowali genetycy (jak
i dziś zresztą)

Na gruncie genetyki mendlowskiej tego się nie dało wyjaśnić.

Barbara McClintock w `48 roku, sformułowała taki postulat, nie wiedząc jeszcze nic o strukturze materiału genetycznego, nawet nie będąc do końca pewna, co jest tym materiałem genetycznym (To było wprawdzie po pracach Annellego, dowodzących, że to DNA jest materiałem genetycznym, ale te prace nie były jeszcze dobrze znane).

Pomijając podłoże chemiczne i fizyczne materiału genetycznego ona sformułowała postulat taki, że w kukurydzy są elementy, które nazwała elementami kontrolującymi (kontrolic elements), które kontrolować miały stan informacji genetycznej, stan genomu.

Wyróżniła 2 takie elementy:

- DS (od dysociation) elementy nieautonomiczne,

- AC (od activation) elementy autonomiczne.

Te 2 rodzaje elementów przemieszczają się w genomie powodując mozaikową ekspresję pewnych genów, czyli w konsekwencji mozaikowy fenotyp. Nieautonomiczne elementy wymagały do swojej aktywności elementów autonomicznych. Generalnie te 2 mechanizmy łącznie zapewniały (tłumaczyły) mozaikowość.

Ona miała na to dowody genetyczne. Jej prace zawierały bardzo rozbudowaną analizę ilościową sposobu tego dziedziczenia. Postulat był konsekwencją, sumą tych danych ilościowych, które ona zebrała, to nie jest tak, że jej to po prostu przyszło do głowy. To było bardzo mocno poparte analizą ilościową. Trzeba przyznać, że jej prace były wtedy trudne dla genetyków, a ponadto również sprzeczne z dogmatem. (a wszystko, co jest sprzeczne
z dogmatem zawsze jest krytycznie przyjmowane, w większości przypadków słusznie,
a czasem niesłusznie;). Ponieważ dogmat wtedy był taki, że materiał genetyczny stanowi ciągły, nienaruszalny, jednolity, liniowy, stabilny zbiór informacji, gdzie nie ma mowy, żeby się ona gdzieś przemieszczała, ta koncepcja była trudna do przyjęcia.

W związku z tym te prace przez parenaście lat były nieznane, a w każdym razie nie

uznawane. Aż do początku lat '60, kiedy w E. coli wykazano istnienie elementów mobilnych

Wtedy szybko wrócono do koncepcji McClintock. Okazało się, że ta koncepcja jest generalna. Dotyczy właściwie zjawisk, które dzieją się w genomach wszystkich organizmów.

McClintoc została uhonorowana nagrodą nobla w '83 roku (miała wtedy ponad 80 lat).

Co do tych elementów u bakterii. Pierwszy taki element, który odkryto w latach '60, należy do klasy elementów IS (od insertion sequences) i to jest najprostszy element mobilny. Okazało się, że taki najprostszy element mobilny wystarczy, że zawiera sekwencję kodującą enzym zwany transpozazą (który współuczestniczy w tym przenoszeniu się DNA. Jest
w stanie wyciąć i jakby przerzucić DNA w inne miejsce), która to sekwencja jest oflankowana, czyli otoczona na obu końcach odwróconymi powtórzeniami o długości ok. 10-30 par zasad.

W przypadku typowych elementów IS, np. IS-1 miał 800 kilkadziesiąt par zasad. Ale mogło być też 700 do 1,5 tys. par zasad.

Warto zwrócić uwagę, że system tych odwróconych powtórzeń od tego czasu wykrywano
i wykrywa się dziś w bardzo wielu takich mobilnych elementach genetycznych. Jest to w pewnym sensie cecha, gdy się odkryje takie odwrócone powtórzenia gdzieś na krańcach jakichś sekwencji DNA, jest to znak, że ta sekwencja jest potencjalnie ruchoma.

Te elementy u bakterii zauważono, ponieważ w pracy nad genetyką bakterii szybko wyszło, że istnieją różne zjawiska trudne do wyjaśnienia, związane z przeskokiem elementów genetycznych tego rodzaju, które powodują blokowanie genu, do którego taki element się włączy, ale nie tylko tego genu, ale także genów pozostających w tym samym operonie. Taka insercja transpozonu wyłącza również sąsiadujący operon, w dół od tej inercji.

Transpozaza to enzym katalizujący transpozycję.

Te fragmenty są różnego rodzaju. Np. taki najprostszy element IS-1, występuje w ilości 5-8 kopii na jeden kolisty chromosom bakterii. Są inne takie sekwencje insercyjne różnego typu, różnej długości, o różnych układach tych powtórzeń, jedne występują powszechnie, inne rzadziej.

To był taki najprostszy system, który wykryto i który dał właśnie ten ……. do poszerzenia wniosków Barbary McClintock na wszystkie elementy.

Później się szybko okazało, że u kukurydzy element autonomiczny AC to jest element, który zawiera pełny zestaw enzymów do wycięcia i transpozycji. Element DS to jest element troszeczkę zepsuty jak gdyby, który nie zawiera funkcjonalnych enzymów w środku. Ale wystarczy, że jest w sąsiedztwie ten element AC, który dostarcza swoich enzymów, żeby ten element DS również mógł wycinać.

Generalnie są one zbudowane tak, że mają odwrócone powtórzenia na końcach i w środku te sekwencje są przerzucane.

U bakterii jest cała gama różnych transpozonów. Są one podobne do tych sekwencji insercyjnych, ale DNA może być bardziej złożone. Może kodować kilka produktów np. ten enzym transpozazę i dodatkowo drugi enzym reforwazę, który wspomaga włączanie
w miejsce docelowe. I często sekwencje kodujące enzymy przenoszące odporność na antybiotyki (historycznie to wynikło mniej więcej w tym czasie, kiedy zaczęto poznawać pierwsze plazmidy bakteryjne).

Np. taki transpozon TN-1 ma blisko 5 tys. Par zasad. Koduje oprność na ampicylinę.

TN-7, jeszcze większy, 14 tys. par zasad. Kodowana oporność na 3 różne antybiotyki.

Generalnie zasada jest taka sama. Czyli w środku jest sekwencja coś zawierająca, nie jest takie ważne, co ona zawiera (poza tą transpozazą), i sekwencje flankujące, odwrócone powtórzenia o różnej długości. Są jeszcze bardziej złożone transpozony u bakterii. Np. takie, gdzie nastąpiła synchronizacja między dwoma prostymi tymi elementami insercyjnymi IS, które same flankują oba jakiś inny kawałek DNA. I działają synchronicznie. Przez wycięcia siebie samych, przenoszą również ten kawałek DNA. Zwykle jest tak, że Transpozaza jest czynna tylko w jednym z nich, w drugim jest wyłączona. Prawdopodobnie wspomaga to synchronizację między nimi. Do nich należą takie jak TN-9, TN-5. Kodują zwykle też oporności na antybiotyki. I mają różne długości tych pośredniczących, wewnętrznych sekwencji.

Czyli istnieje rozmaitość układów sekwencyjnych. Nawet mogą tandemowo działać 2 proste elementy pomiędzy sobą zawarte.

Mechanizmy tej transpozycji są generalnie podobne, chociaż w zależności od układu, mogą się różnić szczegółami. Np. transpozycja prosta, bezpośrednia, konserwatywna, która polega tylko na przeniesieniu elementu z jednego miejsca w drugie, jest często powiązana ze zniszczeniem tego rejonu, z którego pochodzi ten fragment, czyli to wycięcie pozostawia nienaprawialne dwuniciowe nacięcie, które dezaktywuje ten element. Potem następuje nacięcie w miejscu docelowym. Takie nacięcie z przesunięciem, w które jest wstawiana sekwencja transpozonu. By zamknąć układ, jest doreplikowany brakujący odcinek.

Efektem tego jest doreplikowanie tych fragmentów końcowych w DNA donorowym

Wstawiamy w środek insert, czyli ten transpozon. Replikacja sekwencji donorowej w miejscu wstawienia.

Istnieją inne mechanizmy transpozycji, które np. dają w efekcie podwójny zestaw, czyli duplikację całego transpozonu, obszaru sąsiadującego w donorze. To jest tak zwana transpozycja z replikacją Często jest to związane z działalnością enzymu resolwazy.

Enzym resolwaza katalizuje replikację między dwoma połączonymi cząsteczkami, także
w efekcie mogą powstać dwie niezależne cząsteczki po replikacji, każda zawiera kopię transpozonu.

Jeszcze kilka słów na temat transpozycji i konsekwencji ich. To był tylko przykład elementów mobilnych. Są bardzo różne elementy mobilne (z braku czasu nie wchodzimy w to).

Są elementy, które się przenoszą, które są jak gdyby pochodnymi retrowirusów, które mogą się przenosić poprzez swoje transkrypty potem odwrotną transkryptazy przekształcane z RNA na DNA.

Są różne formy pośrednie, takie zdegenerowane retrowirusy, które zresztą wiadomo, że też się przenoszą, oraz rozmaite elementy mobilne, o innej jeszcze strukturze, mniej, lub bardziej wysoko powtarzalne, które „zamieszkują genomy”, w rozmaitych ilościach w stosunku do innych sekwencji, w rozmaitych miejscach występujące.

Co z tego wynika?

To co pierwotnie Barbara McClintock postulowała, że mozaikowy fenotyp ziarniaków kukurydzy, musi mieć za przyczynę niestabilność genomu związaną z elementami DS i AC, które się po prostu ruszają i powodują deaktywację genu.

Konsekwencją tej transpozycji mogą być rozmaite fenotypowe zjawiska: obniżenie, wyłączenie ekspresji genu, czasami wzmocnienie przez przypadek, np. jeśli to jest włączenie do promotora w jakimś krytycznym miejscu. To wszystko się odbija na stanie ekspresji genów.

To co ona zauważyła, co się wydawało wyjątkiem od reguły, czymś niezwykłym, to się okazuje całkowicie powszechnym zjawiskiem występującym w genomach. To co dosłownie ostatnio się ujawnia poprzez już bardzo złożoną, precyzyjną analizę pełnych sekwencji genomowych, świadczy o tym, że to jest daleko bardziej aktywny i częsty proces niż wydawało się jeszcze rok, czy 2 lata temu.

Tu nawiązuję do różnic między osobnikami (mówię o genomach ludzkich). Różnice międzyosobnicze są w znacznej mierze związane z wyst polimorfizmów jednonukleotydowych (single nuclear polimorfizm SNP). Wszyscy różnimy się ogromną ilością pojedynczych podstawień. Mamy średnio parę miliomów takich różnic między dwoma osobnikami. Z tego wynikają najrozmaitsze różnice fenotypowe.

Ale okazuje się z bardzo precyzyjnej analizy, którą się robi za pomocą mikropłytek. (Są to płytki mikromacierzowe, które umożliwiają analizę sekwencji nukleotyd po nukleotydzie
w całym DNA). W tej chwili porównuje się sekwencje między sobą poszczególnych ludzi. Niedawno wykonano próbę porównawczą dla 200 kilkudziesięciu ochotników
z podstawowych 4 grup etnicznych na Ziemi.

Okazuje się, że oprócz tych SNP (różnic pojedynczych nukleotydów, podstawień) między osobnikami jest ogromna różnorodność w sekwencjach niekodujących bardzo rozmaitej długości od kilkunastu zasad do kilku tysięcy zasad, które występują między genami. Nie przypuszczano do tej pory, że są one tak zmienne. My się różnimy nie tylko tymi SNP, ale również ogromną ilością mniejszych i większych delecji, insercji, przesunięć w rejonach zwykle międzygenowych. Czasami również w rejonach genów, często też intronów. Ale wiemy również, że introny mają czasami funkcjonalne znaczenie. Generalnie jak spojrzeć teraz na genom, to widać, że to wszystko, co się w nim dzieje, ta aktywność związana między innymi z transpozycjami, konsekwencją tego jest gigantyczne zróżnicowanie międzyosobnicze w tych sekwencjach głównie niekodujących.

Te sekwencje nie kodujące mają bardzo duże znaczenie. Teraz wiemy, też z analiz mikromacierzowych na poziomie transkryptomu, że te sekwencje w zasadzie nieustannie produkują RNA. Część tych RNA, to są RNA regulatorowe o ogromnym znaczeniu.

W związku z tym, zróżnicowanie międzygenowe między nami ma znaczenie bo przejawia się też zróżnicowaniem transkrypcyjnym. To jest w jakimś sensie konsekwencja tej mobilności genomu. Czyli genom jest bardzo mobilny. Patrząc na to od tej strony, to aż dziwne jest, że tak stabilnie zachowujemy gatunkową informację. Są oczywiście systemy przeciwdziałające naruszaniu jej, ale jest to najwyraźniej walka w systemie genetycznym o utrzymanie stabilnego zapisu genów podstawowych.

BIAŁKA HISTONOWE

Jak jest ukształtowany materiał genetyczny u eukaryota?

Materiał genetyczny eukaryota ulokowany jest przede wszystkim w jądrze. Nie będziemy mówili o mitochondriach ani o chloroplastach, autonomicznych organellach, bo one mają genom typu bakteryjnego i nie dotyczy ich ten typ budowy strukturalnej, który wykształcił się w ewolucji w odniesieniu do DNA jądrowego.

Co można ogólnego powiedzieć o DNA jądrowym. Najogólniej rzecz biorąc jest go bardzo dużo w stosunku do tego, co jest u prokariota.

Generalnie średnio genomy eukaryotyczne są dużo większe niż prokariotyczne. W związku z tym, żeby takie zwiększenie materiału genetycznego na ogromną ewolucyjną skalę mogło nastąpić, to dla zachowania precyzji podziału replikacji jak też innych zjawisk dotyczących procesów, w które DNA jest zaangażowany, musiał powstać jakiś system architektoniczny, strukturalny, który takie ogromne ilości informacji genetycznej jest w stanie skutecznie obrabiać. 2 kryteria, które taki układ musi przejść (spełniać) to jedna replikacja i podatność na transkrypcję i regulację.

To co się utworzyło u eukariontów i co dotyczy organizacji chromosomu nosi nazwę struktury chromatynowej.

Chromosomy w stanie kondensacji metafazalnej w mitozie - to jest najbardziej skondensowany stan chromosomu, gdzie pozorne skrócenie (pozorne, bo tam zawarte jest całe DNA) w stosunku do DNA rozciągniętego (jakby go rozciągnąć po prostu na płaszczyźnie) wynosi między 10 a 15 tys. razy.

Jak to jest osiągane.

Podstawą są tu białka histonowe, których nie ma w takiej klasycznej postaci u bakterii,
u prokariota. Są u archea - grupy równie starej jak prokarionty, które są czymś pośrednim między prokariontami a eukariontami (ale nie w tej klasycznej postaci).

Co to są histony.

Jest to klasa małych białek zasadowych. Zasadowych, ponieważ bardzo bogatych w lizynę
i argininę, zasadowe aminokwasy.

Zbudowanych wg pewnego wzorca, dość charakterystycznego. Wyróżniamy tutaj 4 typy histonów, tzw. rdzeniowych: H2A, H2B, H3, H4, które mają bardzo podobną budowę, mianowicie reprezentują trójdomenową strukturę. Zawierają globularną część wewnętrzną
(C-końcową) i nieustrukturyzowane ogony.

H2A - N-końcowy ogon i C końcowy ogonek

H2B - N-końcowy ogon

H3 - N-końcowy ogon

H4 - N-końcowy ogon

To właśnie te ogony są miejscem, gdzie występują aminokwasy zasadowe.

Aminokwasy zasadowe są rozmieszczone przede wszystkim

Średnie występowanie aminokwasów zasadowych w histonach:

	lys [%]	arg [%]
H2A	11	9
H2B	16	6
H3	10	15
H4	11	4

To jest bardzo duża średnia zawartość aminokwasów zasadowych, która powoduje, że białka histonowe należą do klasy białek zasadowych. Natomiast te zasadowe aminokwasy są rozmieszczone przede wszystkim w tych bocznych nieustrukturalizowanych łańcuchach.

Wnętrza globularnej części są ustrukturalizowane, tzn. mają strukturę II i III-rzędową,
w której występują przede wszystkim rejony helikalne.

Te 4 białka, (w szczególności H3 i H4) należą do grupy najbardziej konserwowanych białek w przyrodzie. Oznacza to, że w historii eukariontów, ich sekwencja jest konserwowana znacznie bardziej niż sekwencja innych białek, np hemoglobin czy różnych enzymów. Trudno znaleźć białko o podobnej konserwatywności. np. histon H4. między grochem a grasicą cielęcą różni się tylko w dwóch pozycjach. Ponieważ te 2 organizmy należą do linii ewolucyjnych, które się rozeszły ponad miliard lat temu, więc można obliczyć sobie częstość utrwalania się mutacji, czyli w tym przypadku raz na 0,5 mld lat. To bardzo, bardzo rzadko. Wniosek z tego jest taki, że tak wysoka konserwatywność oznacza po prostu, że żadne mutacje nie są tu tolerowane. Czyli to musi oznaczać, że ta struktura, która jest pochodną tej sekwencji aminokwasowej, musi być niesłychanie istotna.

Jest jeszcze piąty histon, który ma też strukturę trój-domenową, ma wewnętrzny rejon ustrukturalizowany, globularny i N i C-koniec, też silnie naładowany dodatnio. Zawiera 27% lizyn i arginin. To jest histon H1, lub łącznikowy, który należy do innej rodziny niż pozostałe histony i dlatego też jest inaczej ulokowany. Ma on trochę inny układ wewnętrznych globulin.

Co komórka zawdzięcza tym histonom?

Żeby się o tym przekonać, trzeba prześledzić co jest w wewnętrznej strukturze takiego histonu.

wnętrze globularne:.

Tutaj kluczowym motywem jest tzw. fałd histonowy, który się składa z trzech heliakalnych rejonów, i z dwóch beta zagięć między nimi.

Dłuższy heliks ma symetrycznie na dwóch końcach ustawione krótsze fragmenty helikalne.

To jest coś co nosi miano fałdu histonowego (po ang. Histone fold).

W strukturze białek wyróżnia się tzw. fałdy (foldy jak mówią w żargonie krystalografowie), które są pewnymi charakterystycznymi strukturami przestrzennymi, występującymi
w rodzinach białek. Typ fałdu reprezentuje zwykle jakąś rodzinę strukturalną.

Funkcja fałdu.

To jest struktura, która wyewoluowała do tego, żeby oddziaływać z drugą taką strukturą, wytwarzając coś co po ang. nazywane jest handshake, czyli uścisk dłoni. One pasują do siebie tak jak dwie dłonie, są swoimi lustrzanymi odbiciami i tworzą bardzo ścisłą zwartą strukturę noszącą nazwę tego złożenia dłoni, uścisku dłoni, która wynika z tego, że te 2 dłuższe alfa heliksy i 2 krótsze wpasowują się do siebie. Te 2 zagięcia też oddziałują z sobą
i utrwala się tego typu struktura.

Prawdziwym efektem zdolności do wytwarzania tego uścisku dłoni jest to, że histony czterech rodzajów (rdzeniowe H2A, H2B, H3 i H4), wytwarzają strukturę, w której te poszczególne uściski dłoni oddziałują między sobą. 2 różne heterodimery są w stanie oddziaływać z sobą. Jest to jakoś zakodowane w tej pierwotnej sekwencji.

1) ta pierwotna sekwencja koduje ten układ przestrzenny fałdu histonowego,

2) koduje jakby w drugiej warstwie informacyjnej, koduje zdolność powstania heterodimeru,

3) (w trzeciej warstwie informacyjnej), koduje zdolność wytworzenia oddziaływania z innym heterodimerem,

4) już w pełni ukształtowanej strukturze koduje możliwość wytworzenia pełnej szpulki, pełnego rdzenia histonowego, który się składa z ośmiu cząsteczek histonowych, po 2 każdego rodzaju, (czyli 2 · H2A, 2 · H2B, 2 · H3, 2 · H4). Tworzą one oktamer, bardzo silnie oddziałujących z sobą, tworząc „szpulkę” strukturalną o idealnie ściśle ustalonych parametrach. Te parametry wynikają z jedynych możliwych oddziaływań, jakie w tej szpulce są generowane między tymi heliksami, między końcami, zagięciami i wzajemnie między heterodimerami.

Efektem jest struktura, której podstawową cechą jest zdolność zaginania DNA.

W ewolucji doszło do powstania funkcjonalnej szpulki białkowej, która jest w stanie zawijać wokół siebie DNA.

Zawinięcie, czy zagięcie DNA nie jest termodynamicznie korzystne ani proste, więc żeby to było możliwe, ewolucja musiała doprowadzić do wytworzenia bardzo szczególnej struktury.

Zagięcia i końce helis mają wybitne zdolności oddziaływania z DNA.

Każde poprzednie oddziaływanie, podwaja szanse powstania kolejnego oddziaływania i ułatwia je, czyli jest w pewnym sensie synergia. Ta synergia powoduje, że to zjawisko przebiega ….. kinetyki allosterycznej. Samonapędza się w jakimś stopniu. DNA jest w stanie owinąć się wokół takiej szpulki.

Efektem tego owinięcia jest powstanie super helikalnego DNA. Czyli w obecności tych zasocjowanych oktamerów histonowych, rdzeni białkowych, DNA owija się wokół nich
w postaci ściśle zwiniętej lewoskrętnej super helisy, która ma 80 par zasad na zwój. Blisko
2 pełne zwoje występują na pojedynczej szpulce nukleosomowej.

…………..takiej super helisy jest 27,5 Å. Czyli jest to w efekcie bardzo regularna struktura, która powstała ze zwinięcia DNA i owinięcia go lewostronnie na takiej szpulce histonowej.

Fałd histonowy wyewoluował po to, żeby DNA można było skracać pozornie i owijać.

Jak się bada DNA owinięte na tych szpulkach

Nukleosom - szpulka histonowa z owiniętym DNA.

Jak się bada taki nukleosomowy DNA, np. za pomocą badania podatności na enzymy przecinające DNA.

Klasycznym takim enzymem jest DNAza I, która przecina DNA co 10 par zasad.

Przecina ona fragmenty, które są eksponowane na zewnątrz powierzchni białkowej, natomiast fragmenty, które nie są eksponowane, nie są przecinane. Czyli istnieje tam wyraźna, dająca się zanalizować topologia DNA, która ma odbicie w eksperymentach.

To, że dla formowania tej struktury są kluczowe te stabilne miejsca, w których DNA może być owijane lub gdzie zaczyna się to owijanie i postępuje dalej, świadczą efekty mutacji. Np. mutacje, które noszą nazwę SIN, które pierwszy raz zostały zidentyfikowane w drożdżach,

które polegają na wymianie niektórych aminokwasów w histonach, w rejonach kluczowych dla oddziaływania z DNA. Te mutacje znoszą całkiem strukturę Nukleosomu. DNA przestaje ściśle przylegać do tego oktameru. Jest dostępny dla wewnętrznych sond, m. In. Enzymów nukleolitycznych i innych. To pokazuje jak kluczowe są te pojedyncze konserwowane aminokwasy w histonie.

Nukleosom można schematycznie wyobrazić tak, że to jest 8 cząsteczek histonowych, które tworzą wewnętrzny rdzeń, wokół którego owija się DNA w postaci lewoskrętnej superhelisy (1,75 zwoju czyli prawie 2 zwoje).

Długość DNA między wejściem i wyjściem DNA z histonu, wynosi 146 par zasad.

Czyli to, co klasyczny Nukleosom jest w stanie owinąć.

Cząstka rdzeniowa Nukleosomu to 8 histonów rdzeniowych i 146 par zasad owiniętych
w postaci prawie dwóch pełnych zwojów.

Pełny Nukleosom jest jednak czymś więcej. mianowicie

Histon H1. w zasadzie tylko z nazwy należy do tych histonów z rodziny histonowej z fałdu G. różni się również rozmieszczeniem w nukleosomie.

To białko nie leży wewnątrz Nukleosomu, tylko na zewnątrz cząstki rdzeniowej. Można powiedzieć, że blokuje (stabilizuje) położenie końców DNA po jednej stronie, po tejsamej stronie Nukleosomu. Końce DNA

Stabilizująca funkcja histonu H1. on jeszcze dodatkowo ochrania i stabilizuje ok. 20-40 par zasad. W zależności od typu nukleosomu, rejony stabilizowane są krótsze lub dłuższe..

Taki fragment DNA

Tę strukturę nazywamy chromatosomem. Ma ok. 156 par zasad czyli jeszcze po 10 par zasad dodatkowo po jednej i po drugiej stronie DNA rdzeniowego jest chronione przez główną część histonu H1. W rzeczywistości w natywnej chromatynie w jądrze, histon H1 dodatkowo chroni (za pomocą swojego C końca przede wszystkim) jeszcze dodatkowe 10-15 par zasad po obu stronach. Także ostateczna długość DNA chronionego ( w tym sensie, że np. po potraktowaniu nukleazą tego DNA). Wszystko to co jest pomiędzy nukleosomami jest wycinane przez nukleazę, a w pierwszej fazie powstają fragmenty odpowiadające długości chronionej przez wewnętrzną strukturę. Ta pierwsza faza liczy ok. 180-200 par zasad. I to nosi nazwę pełnego nukleosomu.

Czyli mamy 3 szczeble Nukleosom, chromatosom, cząstka rdzeniowa. Mają one zmniejszającą się długość DNA przy delikatnym trawieniu DNA nukleazą i przeciąganiu tego trawienia w czasie, można obserwować stopniowe przeskakiwanie długości minimalnego chronionego fragmentu DNA z 200 na 146 par zasad.

Tak właśnie początkowo analizowano te struktury.

To jest taki przykład tej pierwotnej analizy, która doprowadziła do odkrycia struktury nukleosomowej.

Odkrycie struktury nukleosomowej - I połowa lat `70 ubiegłego wieku. Jedną z głównych osób zaangażowanych w odkrycie i postulat struktury nukleosomowej był tegoroczny laureat Nobla, Roger Kornberg. On tego Nobla dostał za strukturę krystalograficzną kompleksu polimerazy II i asocjacji z DNA. To osiągnięcie pozwoliło na wniknięcie w mechanizm transkrypcji, ale przyczynił się też walnie do wyjaśnienia struktury nukleosomowej. Tylko, że

Nobla za nukleosomy dostał kto inny, Aron Clug ??? który później podał pełniejszą strukturę

Tego typu wzory trawienia nosiły nazwę drabinek. Powstają one wtedy, kiedy istnieje jakaś periodyczność. To są drabinki, które powstają z trawienia jąder komórkowych. Pierwszy raz zaobserwowali te drabinki australijscy biochemicy (podaje nazwiska, ale mówi niewyraźnie ). Oni nie dodawali nawet żadnej nukleazy, tylko po prostu inkubowali wydzielone jądra komórkowe w 37 stopniach. Później ekstrahowali DNA i rozdzielali je w żelu agarozowym.

Zobaczyli dziwny wzór, wtedy trudny do wyjaśnienia, który się składał z takiej drabinki,
w której istniało pewne pasmo podstawowe, najmniejsze (miało ono około 200 par zasad), natomiast wszystkie pozostałe, to były jego wielokrotności: 400, 600, 800, 1000, 1200 itd. Par zasad, w zależności od rozdziału i czytelności można było otrzymać aż kilkanaście takich szczebelków.

Pierwsze wrażenie jakie odnoszono, było takie, że to jakiś artefakt. I tak to na początku traktowano. Dopiero potem się zorientowano, że to nie są artefakty, tylko, że to musi być odbicie jakiejś periodycznej struktury wewnątrz jądra. To były czasy, kiedy jeszcze zupełnie sobie nie wyobrażano jak wygląda struktura chromatyny. Było wiadomo, że istnieją histony ( i analizowano je na wszystkie możliwe sposoby - wydzielano je z jąder, ponieważ one się łatwo ekstrahują rozcieńczonymi kwasami), wiedziano, że istnieją one w stosunku stechiometrycznym 1:1 z DNA w jądrze, oraz, że stanowią najbliższe białka materiałowi genetycznemu, dzięki fizycznej asocjacji. Natomiast nie było żadnego pomysłu, jak ta struktura jest zorganizowana. Na początku lat '70 krążyły najrozmaitsze modele, które były niesłychanie skomplikowane i wyszukane, które pokazywały nieprawdopodobną złożoność tej struktury chromatyny.

Autorem paru takich modeli byli Watson i Crick. Nikt nie wpadł na to (dopóki te struktury się nie pojawiły) , że w zasadzie ten system ma cechy periodyczności, że tam jest jakaś podstawowa struktura, która się powiela.

Cecha periodyczności była nieuchwycona przez długi czas. Dopiero te drabinki a także badania Cornberga prowadzone w latach '70 w Cambridge, które pokazywały, że histony oddziałują z sobą też w stechiometrycznych stosunkach.

Zrobili oni ………… jąder, później ekstrahowali białka, potem okazywało się, że relacje między histonami są stechiometryczne.

Połączenie tych wszystkich rzeczy doprowadziło do podania tego postulatu struktury nukleosomowej.

Teraz uzyskuje się wyższą rozdzielczość struktury niż tą, którą uzyskał Clug.

W DNA otaczającym Nukleosom są miejsca, kanały, którymi wydostają na zewnątrz się te

nieustrukturalizowane ogony histonów (co ma duże funkcjonalne znaczenie). Wcześniej to było trudne do zaobserwowania, ponieważ struktury były one robione z rekonstytuowanych, odtwarzanych, z których odcinano te końce.

Dziś wiemy jak Nukleosom powstaje. W jego składanie jest zaangażowana skomplikowana maszyneria komórkowa. Po redukcji tej maszynerii są składane osobno heterodimery H3 i H4 oraz heterodimery H2A i H2B.

W tym procesie biorą udział białka wspomagające, które stabilizują heterodimery.

Dimery H3 i H4 wytwarzają tetrametry H3 H4, do którego z każdej strony dołączane jest po jednym heterodimerze H2A i H2B. Dopiero na takim oktamerze histonowym następuje owijanie DNA.

To się dzieje tuż po replikacji. Tam DNA musi być powtórnie skondensowane czyli ułożone w strukturę chromatyny.

Ta piękna upraszczająca idea nukleosomowej budowy chromatyny, która wyjaśnia mnóstwo rzeczy, ma jednak mnóstwo ………………….. Diabeł tkwi w szczegółach.

Wewnątrz jądra komórkowego widać było, że chromatyna występuje w wyraźnie zróżnicowanej postaci strukturalnej. Podstawowy podział chromatyny w jądrze na

Euchromatynę - obszary chromatyny rozluźnionej

Heterochromatynę - obszary skondensowanej, gęstej optycznie chromatyny. Często występuje przy błonie jądrowej, poza miejscami porów jądrowych.

Bliższe badania tego, co leży u podłoża podziału na hetero- i euchromatynę, bo przecież obie mają strukturę nukleosomową, pokazały, że istnieje kilka elementów tej struktury związanych z dwoma stanami chromatyny.

Histon H1

Jego obecność ma istotne znaczenie dla struktur wyższego rzędu chromatyny. Pierwotnie w ogóle uważano, że to tylko histon H1 jest odpowiedzialny za układanie się nukleosomów w struktury wyższego rzędu, we włókna nukleosomowe. One mogą być w tym włóknie w różnych postaciach. Mogą być zupełnie zdezorganizowane, mogą się jakoś kondensować, czyli organizować. Pierwsze podstawowe dane na temat tego co się dzieje powyżej nukleosomu uzyskano w końcu lat '70. I to była tak zwana struktura solenoidu, którą proponowano. Miała się ona zasadzać na spiralnym skręcaniu się włókna nukleosomowego

w strukturę solenoidu, w której w środku jest pusty rdzeń, a wokół są skręcone włókna nukleosomowe. Pomiędzy nukleosomami jest łącznikowy DNA, który je łączy. Podstawową jednostką tej spirali miało być 6 nukleosomów ułożonych w ……….pełny, o przekroju ok. 30 nm. Tak to miało wyglądać w wyidealizowanej postaci. Spirala zwana solenoidem miała być następnym stopniem kondensacji DNA.

Uważano, że euchromatyna to jest przede wszystkim taki solenoidowy układ. Tutaj chromatyna jest skrócona 40-60 razy.

I pokazywano, używając różnych technik mikroskopowych (mikroskopia skaningowa która umożliwia analizę efektu naprężeń we włóknie), że obecność lub nieobecność histonu H1 (analizowano też dla innych histonów) daje różnicę w stopniu skondensowania i średnicy włókna, z czego wyciągano wniosek, że Histon H1 jest ważny dla stabilizacji tych struktur.

Potem się okazało, że końce histonów rdzeniowych, nieutruktalizowane, są też bardzo ważne, w szczególności ogon histonu H3. Po jego usunięciu, chromatyna też ulegała dekondensacji.

Dzisiaj wiemy, że idealny solenoid nie występuje w rzeczywistości, chociaż częściowe włókna tego typu się pojawiają. Rzeczywiste ułożenie nukleosomów we włóknie skondensowanym jest mniej typu zwijania wokół pustego rdzenia, a bardziej zygzakowatego składania jednego na drugie jak harmonijka, co też daje efekt kondensacji, więc nie jest to tak do końca regularne.

Histon H1 ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia regularności składania w harmonijkę, bo decyduje on o kącie między wchodzącym i schodzącym DNA. Coś co decyduje o kącie DNA w podstawowej jednostce musi decydować o wyglądzie struktury wyższego rzędu. Ten kąt się powiela przy kolejnych nukleosomach.

Kluczowe dla oddziaływań ( i kondensacji) są ogony histonowe, które mają taką funkcję, że neutralizują ładunki na DNA. One są bardzo zasadowe. A fosforany na DNA są ujemne, kwasowe. Normalnie 2 łańcuchy DNA na sąsiadujących nukleosomach się odpychają. Jeżeli jest między nimi zasadowy ogon histonu, to neutralizuje on ujemne fosforany, i DNA mogą się do siebie zbliżyć. To jest też kluczowe dla tej kondensacji.

Z tego wynikają konsekwencje dotyczące przede wszystkim funkcji ogonów. Te ogony okazały się być celami bardzo złożonego systemu modyfikacji. Na przykładzie acetylacji. Podlegają jej przede wszystkim aminokwasy zasadowe (lizyna i arginina).

Na lizynę działa enzym acetylaza histonowa. Korzystając z acetylo Co-A przenosi ona grupę acetylową. I w wyniku mamy acetylowaną lizynę.

Efekt netto acetylacji to jest zniknięcie ładunku dodatkowego na grupie amiowej lizyny.

Z tego bardzo zasadowego aminokwasu po acetylacji robi się mniej zasadowy aminokwas.

In vivo ta akurat reakcja jest odwracalna.

Efekt acetylacji można łatwo obserwować na żelach, analizując białka.

Efekty acetylacji to jest ogromna zmiana zdolności do kondensacji DNA. DNA jest zdolny do kondensacji, dlatego, że reszty histonów ekranują od siebie DNA i ta struktura może się kondensować. Po acetylacji one przestają oddziaływać z fosforanami, oddalają się od tej powierzchni i przestają ekranować DNA. Taka struktura się rozsuwa, pęcznieje, robi się luźniejsza i jest przez dużo bardziej dostępna dla rozmaitych faktorów czynników, które pośredniczą w obrabianiu, przetwarzaniu DNA i wydobywania z niego informacji, czy też enzymów, niż struktura skondensowana, która jest niedostępna. Od razu widać tu znaczenie tej modyfikacji. Można dowolnie albo otwierać albo zamykać tę strukturę.

W komórkach histony nie są zupełnie jednorodne. Nie mamy do czynienia tylko z jedną formą histonu np H2A lub jedną formą histonu H3. Istnieją warianty histonów. W przypadku histonu H2A mamy największą ilość wariantów, m. in. histon H2Az, H2Ax. Te warianty różnią się drobnymi modyfikacjami. Niektóre mają przyłączone do C-końca dodatkowe fragmenty peptydowe. W zależności, który wariant wejdzie do nukleosomu, ten nukleosom będzie trochę inny. Ta inność się przejawia w tym, że jest on mniej lub bardziej podatny na te kondensację. Czyli w zależności od rodzaju wariantu (i to jest nowy obszar badań, który pokazuje na czym polega sposób wybierania tych wariantów - one zwykle włączane są przy replikacji, ale mogą być wymieniane po transkrypcji), nukleosomy mogą być bardziej lub mniej otwarte na oddziaływanie z różnymi białkami. Okazuje się, że te warianty
w chromosomie też są rozmieszczone w charakterystyczny sposób w specyficznych rejonach chromosomów (niektóre w centromerach, niektóre bliżej telomerów).

Jest to dodatkowy element zmienności w strukturze chromatyny.

Jakie jest podłoże uorganizowania chromatyny?

To, że DNA, który teoretycznie występuje w rozciągniętej strukturze, ostatecznie w jądrze występuje bardzo złożona struktura eu- i heterochromatyny, w międzyczasie przechodzi
w wyższe formy kondensacji. O tych wyższych formach niewiele wiemy. Nasza wiedza praktycznie kończy się na solenoidzie.

Wiemy znacznie więcej o włóknie nukleosomowym, o modyfikacjach Nukleosomu.

Wiemy, że jest tu ogromna różnorodność wynikająca z modyfikacji ogonów histonowych
i istnienia wariantów histonowych. Wiemy, że to wszystko jest platformą do regulacji ekspresji genów.

12

---