Techniki w biologii molekularnej 20.11

Praktyki, praktyki, praktyki, praktyki

ENYMY RESTTRYKCYJNE

• enzymy z klasy endonukleaz (hydrolaz), wykazuje powinowactwo do speyficznych fragntow dwuniciowych czasteczek DNA i hydrolizuje wiazana fosfodiestrowe w obu niciach - enzym, ktory utworzy kompleks z DNA wtedy, i tylko wtedy, kiedy rozozna konkretna sekwencje DNA

• naturalnie produwane sa przez bakterie (ich rola jest "wycinanie" DNA bakteriofagow)

• aktywnosc enzymu wyrazona jet w jednostce aktywnosci enzymu restrykcyjnego (U) to taka jego ilosc, ktora trawi kopletnie 1 mg DNA faga [lambda] (okolo 50 kb) w czasie 1 godz. w temperaturze 37 st

  nazewnictwo: EcoRV

  - pierwsza litera - rodzaj bakterii

  - druga i trzecia - gatunek

  - nastepna litera oznacza szczep lub typ

  - kolejne enzymy izolowane z danego szczepu lub typu otrzymuja cyfry rymskie

  np. Escherichia coli, szczep RY13, piaty enzym wyizolowany z tego szczepu

  Czym rozniasie poszczegolne enzymy?

1. budowa, miejscem utworzenia kompleksu z DNA po ropozaniu sekwencji raz mechanizmem enzymatycznym

2. rozpoznawna sekwencja (jej dlugoscia i sladem nukleotydowym)

3. miejscem hydrolizy w obrebie sekwencji

   TYP I

   Enzymy zbdowane z trzech podjednostek struturalno - funkcjonalnym

• podjednostka S - rozpoznaje Sekwecje DNA

• podjednostka M - Modyfiuje DNA

• podjednostka R - posiada aktywnosc Restrykcyjna

  Kompleks podjednostek R2M2S1 jest enzymem restrykcyjnym,gdy napotka niezmodyfikowany DNA - podjednostki S i M tworza metylaze, ktora rozpoznaje i modyfikuje DNA w obrebie okreslonej sekwencji, czyli metylacja DNA przed dzialaniem enzymu

  Wymaga ATP i S-adenozylo-L-metioniny.

  Ciecie nastepuje w roznych niezdefiniowanych odleglosciach od miejsca rozpoznania, zwykle kilkase do kilku tysiecy par zasad.

  TYP II

  Eznymy, ktorych aktywnosci metylazy i endonuleazy rozdzieone sa miedzy dwa odrebne bialka kodowane przez rozne geny - nie metyluja nici DNA przed trwieniem

• nie wymaga ja obecnosci ATP

• ale bardzo potrzebuja MgCl2 - magnez wyplywa na tworzenie sie kompleksu enzymu z helia DNA

• trawia DNA w brebie sekwencji rozpoznania lub w nieduzej, scisle okreslonj odlugosci od niej, dajac na ogol powarzalne produkty trawienia (maja dbre hamulce)

• rozpoznaja krotki, najczesciej palindromiczne sekwencje 4-8 pz

• wyroznia sie kilka klas w obrebie typu

  • homodimery rozpoznaja sekwencje asymetryczne, trawia w odeglosci 1-20 pz od mejsca rozpoznania

  • homotetramery rozpoznaja sekwencje asymetryczne, trwia w miejscu rozpoznania

    TYP III

    Enzymy zbudowane z dwoch podjednostek strukturalno - funkcjonalnych

• podjednostka M - modyfikuje DNA

• podjednostka R - posiada aktywnosc retrykcyjna

  Kompleks podjednostek R2M2 jest enzymem restrykcyjnym wymagaacym do aktywnosci ATP i S-adenozylo-L-metioniny

  Podzial ze wzgleu na rozpoznawane sekwencje

  - sekwencje czteronukleotydwe - moze trawic DNA co 256 pz (4^4)

  - sekwencje szescionuleotydowe - moze trawic DNA co 4096 pz (4^6)

  - sekwencje osmionukleotydoowe - moze trawic DNA co 4^8

  - sekwencje niespecyficne - wykazuja znacnie wiecej miejsc restrykcyjnych nz enzymy rozpoznajae sekwencje specyficzne

  Podzial ze wzgledua same trawienie/miejsce hydrolizy:

  - enzymy hydrolizujace obie nici DNA w tym samym miejscu - tepe konce (blunt ends) - jakby ciachnal ktos nozyczkami, ciezko je potem ze saba polaczyc

  - enzymy hydrolizujace kaza z nici DNA w inym miejscu - powstaja lepkie konce 3' (sticky ends) - szybko je mozna potem ze soba polaczyc

  - neoschizomery - rozpoznaj taka sama sekwencje DNA lecz przeciaja ja w inny sposob np SmaI, XmaI

  NIESPECYFICZNA AKTYWNOSC (STAR ACTIVITY)

• aktywnosc niespecyficzna, pojawia sie gdy warunki reakcji znacznie roznia si od optymalnych, efete jest zmiana spcyficznosci enzymu

• wysoka koncetracja glicerolu ww mieszaninie reakcyjnej - enzym nie trawi

• wysokie stezenie enzymu

• niezoptymalizowany bufor (zasadowe ph, za wysoka wartosc jonow)

• przedluzony czas reakcji enzymatycznej - przeprowadzane w ak najkrotszmczasie

• obecnosc zwiazkow organicznych takih jak: DMSO, etanol, glikol etylenowy

• zastapienie (lub zwiekszona koncentracja0 jonow magnezu innymi dwudodatnimi jonami: Mn, Cu, Co lub Zn

• gicerol - zawiesza sie w nim enzymy do przechowywani ( mrozimy ale nie zamarzaja)

• DMSO - wplywa na zywotoc enzymu