1

Brachiocephalis

Podstawy biologii

molekularnej

dla studentów kierunku lekarskiego

Zabrze 2013

2

3

Spis treści

Struktura jądra komórkowego i chromatyny

4

Mutacje i mechanizmy naprawy DNA

13

Wpływ leków Cytostatycznych na kwasy nukleinowe

22

Cytogenetyczne i bakteryjne testy monitorowania skutków
zanieczyszczeń środowiska.

26

Rola komórek macierzystych i inżynierii tkankowej w regeneracji.

29

Metody stosowane w biologii molekularnej

34

Regulacja ekspresji genów u eucaryota

37

Epigenetyka

42

Molekularnej podstawy starzenia się

46

Kontrola genetyczna determinacji płci

50

Podstawy cytogenetyki człowieka

54

Podstawy mechanizmów zmienności i dziedziczenia

59

Mechanizmy patogenetyczne powstawania wad wrodzonych

68

Wektory i terapia genowa

76

4

Struktura jądra komórkowego i chromatyny

Jądro komórkowe: najczęściej jest kształtu kulistego i występuje jako

pojedyncze organellum. Składa się z trzech części: macierzy jądrowej,
chromatyny i jąderka.

1.

Macierz jądrowa: jest roztworem białek, cukrów, jonów i nukleotydów.
Zawieszone w niej są chromatyna i jąderko. Zanurzony w niej jest także
białkowy szkielet usztywniający i utrzymujący kształt jądra. Jest on zbudowany
z różnych białek, spośród których największym wrzodem na dupie każdego
studenta są laminy. Odkryto je w 1974r. poprzez stopniową ekstrakcję
elementów jądra przy udziale detergentów (metoda Berezneya i Coffeya).
Częśćchromatyny pozostaje w ścisłym związku z białkami otoczki. Nielaminowe
białka, wchodzące w skład wewnątrzjądrowej sieci włóknistej nazywa się
matrynami. Matryny mają strukturę włóknisto-ziarnistą. Oznacza się je
symbolami literowymi lub cyfrowymi (np. 1,2,3…). Mają one różne właściwości
w zależności od typu komórki e.g. matryna F/G wiąże się z DNA przy pomocy
palców cynkowych (p. regulacja ekspresji genów). Analiza składu peptydowego
macierzy jądrowej może być pomocna w diagnostyce nowotworowej.
DNA macierzy jądrowej: w jądrze wyróżnia się dwie klasy DNA: główną
(75%) i stowarzyszoną z macierzą białkową (sami zgadnijcie ile%). DNA
stowarzyszony z macierzą można rozdzielić na rozpuszczalny oraz
resztkowy, stanowiący ok. 1% całości DNA, związany ze strukturą macierzy
jądrowej, tworzący z nią sieć włókien. Prawdopodobnie umożliwia on
prawidłowe rozmieszczenie długiej nici DNA w jądrze.
RNA macierzy jądrowej: w jądrach występuje hnRNA (niejednorodny
jądrowy), sarna (mały jądrowy) i śladowe ilości rRNA. W macierzy wykryto
duże ilości prekursorowego rRNA i mRNA.

2.

Chromatyna: zbudowana jest z nici DNA związanej z białkami pistonowymi i
niehistonowymi. Dzieli się ją na:

•

Euchromatynę: występuje pod postacią bardzo cienkich nici, składa się
z

rozwiniętych

odcinków

chromosomów,

niewidocznych

pod

mikroskopem świetlnym. Jest czynna transkrypcyjnie i zajmuje 7-10%
całej chromatyny jądrowej. Występujące w niej sekwencje unikatowe
kodują geny strukturalne. Ilość DNA zależy od zaawansowania
ewolucyjnego organizmu, aczkolwiek jest bardzo zmienna ze względu na
występowanie

sekwencji

powtarzalnych,

które

dzielimy

na

tandemowe i rozproszone. Sekwencje tandemowe ulegające
transkrypcji to odcinki kodujące rRNA, 5S RNA i tRNA. Pozostałe
sekwencje

tandemowe

to

DNA

satelitarny,

nietranskrybowany.

Euchromatyna w stanie nieaktywnym występuje między innymi w
plemnikach, jądrach ptasich erytrocytów lub jako ciałko Barra w żeńskich
komórkach ssaków. W przeciwieństwie do heterochromatyny, która
zawsze pozostaje nieaktywna, euchromatyna skondensowana może
odzyskać zdolność tranksrypcyjną.

5

•

Heterochromatynę: zbudowaną z krótkich sekwencji ułożonych
tandemowo i powtórzonych w każdym genomie milion i więcej razy. Nie
zawiera

sekwencji

kodujących,

poza

nielicznymi

wyjątkami

(transpozony). W chromosomach znajduje się ona w ściśle określonych
miejscach, np. w okolicach centromerów lub telomerów.

Nukleosomowa budowa chromatyny: chromatyna jest zbudowana z
dwóch splecionych nici DNA, tworzących helisę o średnicy 2 nm,
nawiniętych na oktamery histonowe. Podstawową jednostką strukturalną
chromatyny jest nukleonom złożony z rdzenia pistonowego o średnicy
10nm i owiniętej wokół niego cząsteczki DNA o długości 166-200 pz.
Pomiędzy nukleosomami znajduje się DNA łącznikowy o długości 10-95pz.
W rejonach łącznikowych występują histony H1, stabilizujące nić. Kolejnym
poziomem organizacji jest układanie się nukleosomów w splot o skoku 6
nukleosomów i grubości 11nm. Następnie włókno to wytwarza pętle
(domeny), które skracają je i pogrubiają do 300nm. Zespoły domen tworzą
następnie grona I i II rzędu i długości 10

4

-3*10

5

pz. Tak uorganizowane

włókno ulega dodatkowej kondensacji i skróceniu, tworząc chromosomy.

3.

Otoczka jądrowa: odgradza jądro od cytoplazmy. Zbudowana jest z dwóch
błon i wyściółki podosłonkowej (laminy). Osłonka jądrowa perforowana jest
licznymi porami jądrowymi, w których znajdują się złożone kompleksy
białkowe poru. Zewnętrzna błona osłonki jest podobna do siateczki
śródplazmatycznej, z kolei wewnętrzna cechuje się odmiennym składem
białkowym. Na szczególną uwagę zasługują białka receptorowe dla białek
laminy B: emeryny i murimy i wiele innych. Błonę zewnętrzną oddziela od
wewnętrznej przestrzeń zwana cysterną perynuklearną o szerokości 20-
40nm. Wewnętrzna wyściółka białkowa osłonki zbudowana jest z trzech typów
białek: Laminy A, B1 i B2. wyściółka stanowi szkielet oraz miejsce kotwiczenia
chromosomów. Jej białka ulegają w późnej profazie fosforylacji, stając się
rozpuszczalne (p. regulacja cyklu kom.).
Pory osłonki jądrowej: są hydrofilową drogą transportu substancji między
cytoplazmą i jądrem. Ilość porów w osłonce jest różna i zależy od gatunku, typu
komórki i jej stanu fizjologicznego. Jądra plemników nie mają porów. W
miejscu tworzenia się poru łączy się błona zewnętrzna i wewnętrzna, formując
otwór, w którym tkwi kompleks białkowy poru o średnicy zewnętrznej 120-
140nm, przebity kanałem o średnicy 9nm. Białka tworzące kompleks nazywa
się nukleoporynami. Kompleks składa się z trzech pierścieni białkowych
połączonych pionowo i poziomi ośmioma włóknami. Środek pierścienia zajmuje
kompleks transportujący, w którym przebiega kanał porowy wypełniony
bezpostaciową substancją. Jądrowa część kompleksu ma formę zwężającego się
ku końcowi kosza złożonego z ośmiu filamentów. Kompleksy te ulegają
rozpadowi w czasie mitozy i odbudowie w późnej telofazie.
Transport jądrowo cytoplazmatyczny: można go podzielić na dwie
kategorie:
1. Makrocząsteczki wchodzące w interakcje z białkami kompleksu porowego

6

2. makrocząsteczki wchodzące w interakcje z białkami kompleksu porowego za
pośrednictwem innych białek.
Pierwotnie podejrzewano, że szybkość transportu zalezy od masy cząsteczki, a
jej wartość rzędu 50 kDa jest graniczna i wszystkie cięższe transportowane są
bardzo długo, aż 24godziny. Okazuje się jednak że istotną rolę w szybkośc
transportu odgrywa rola białka transportowanego w procesach jądrowych.
Transport białek z cytoplazmy do jądra (import) odbywa się z udziałem
sekwencji lokalizującej NLS, z kolei cząsteczki eksportowane (głównie RNA)są
wyposażone w sekwencje NES. Obie sekwencje rozpoznawane są przez białka z
grupy importyn. Transport jądrowy uzależniony jest także od cyklicznej
przemiany GTP w GDP z udziałem białka Ran-GTP.
Etapy transportu jądrowo-cytoplazmatycznego
1.

Importyny alfa i beta rozpoznają sekwencję NLS, przyłączoną do białka
importowanego.

2.

Importowany kompleks przesuwa się w kierunku kanału porowego.

3.

kompleks jest transportowany do jądra z udziałem Ran-GTP. W
nukleoplazmie czynniki transportujące oddysocjowują.

4.

Importyna beta zostaje przejściowo połączona z kompleksem porowym, by
wrócić do cytoplazmy

5.

Importyna alfa wraca do cytoplazmy.

Transport przy udziale importyn jest aktywny ze względu na ich znaczne
rozmiary. na przebycie tej drogi zużyta zostaje energia z ok. 10cz. GTP,
aczkolwiek są to jedynie domysły, gdyż niektórzy naukowcy dowodzą, że
transport ten tak naprawdę wcale nie wymaga energii, i zużywana jest ona
jedynie do odnowienia nośników białkowych.

4.

Jądra dodatkowe: poza opisanymi powyżej strukturami w jądrach
komórkowych spotyka się czasami także kilka innych. Zalicza się tu włókna
okołochromatynowe, ziarnistości okołochromatynowe, ziarnistości
międzychromatynowe i ciała jądrowe. Te ostatnie dzielimy na dwie klasy;
proste i zwinięte. Na szczególną uwagę zasługują ciała jądrowe zwinięte,
posiadające białko p80-koilinę, a także czynniki odpowiedzialne za składanie
mRNA, czynniki regulujące dojrzewanie rRNA i formowanie końca 3’mRNA
histonów. Mają one postać włóknistą, kolisto zwiniętą, o średnicy o.1-10 µm.
Wyższą klasą od ciał jądrowych są jądra dodatkowe. Są one zamknięte w
osłonce jądrowej i posiadają pory. Wewnątrz znajdują się zbudowane z
ziarnistego materiału zawierającego RNA i białka kuliste pseudojąderka.
Jądra dodatkowe powstają przez pączkowanie z jądra komórkowego wraz z
osłonką. Po uformowaniu jądra dodatkowe umiejscawiają się w pobliżu błony
cytoplazmatycznej. Na dzień dzisiejszy na temat ich funkcji w komórce gówno
wiemy.

5.

Jąderko: występuje u większości komórek eukariotycznych za wyjątkiem
plemników i ptasich erytrocytów. Ich wielkość zależy od intensywności syntezy
białek w komórce. Ich zadaniem jest synteza prekursorowego rRNA na matrycy
rDNA, a następnie formowanie jednostek tworzących rybosomy. Powstają one z
odcinków chromosomów zwanych organizatorami jąderkowymi, a ich

7

liczba nigdy nie przekracza liczby organizatorów. U człowieka może występować
do dziesięciu jąderek, albowiem posiada on 5 par chromosomów jąderkowych.
Większa ilość jąderek jest wynikiem amplifikacji genów kodujących rRNA.
Jąderko składa się w 80-90% z białek, do których należą:

•

Polimeraza RNA I

•

Nukleolina (aktywizuje proces transkrypcji rDNA i bierze udział w
formowaniu podjednostek rybosomowych)

•

Fibrylaryna (uczestniczy w dojrzewaniu pre-rRNA)

•

Rybocharyna (bierze udział w dojrzewaniu dużych podjednostek
rybosomów)

•

Jąderko składa się z trzech rejonów: włóknistego, gęstego
włóknistego i ziarnistego. Wszystkie trzy zawieszone są w macierzy
jąderkowej zbudowanej ze zrębu białkowego

8

Regulacja cyklu komórkowego

Cykl rozwojowy u Eucaryota podlega niezwykle skomplikowanej regulacji. Jego

prawidłowy przebieg możliwy jest tylko dzięwki obecności dwóch punktów
restrykcyjnych.

Punkt 1: granica G1 i S. tutaj odbywa się kontrola integralności

materiału genetycznego. Wykrycie uszkodzenia DNA powoduje uruchomienie
mechanizmów naprawczych oraz zatrzymanie cyklu do czasu zakończenia
naprawy.

Punkt 2: granica faz G2 i M. w tym miejscu odbywa się kontrola

prawidłowości kondensacji i segregacji materiału genetycznego oraz
tworzenie wrzeciona podziałowego.

Regulacja cyklu odbywa się poprzez uruchamianie kaskadowych reakcji

fosforylacji i defosforylacji białek, przeprowadzanych przez odpowiednie kinazy i
fosfatazy. Najczęściej fosforyzowanymi aminokwasami są Thr i Ser. Aktywacja
kinaz zachodzi w obu punktach restrykcyjnych.

1.

Czynnika dojrzewania MPF

MPF (maturation promoting factor) powoduje, że komórki jajowe, w których

mejoza uległą zatrzymaniu w profazie I, wchodzą w mejozę II i dojrzewają do
zapłodnienia. Wykazano, że jaja Xenopus mimo usunięcia jądra i innych organelli
ulegają cyklicznym zmianom, co dowodzi istnienia biochemicznego oscylatora
regulującego cykl komórkowy. MPF jest heterodimerem białkowym, ulegającym w
czasie cyklu komórkowego licznym zmianom, pod wpływem różnych czynników.
Jednym ze składników MPF jest produkt genu cdc2, białko o masie cząsteczkowej
34 000, nazywane p34. białko p34

cdc2

(obecnie kinaza cdk1). Jest kinazą

przenoszącą grupy fosforanowe z ATP na różne białka. Jego obecność wykryto we
wszystkich organizmach, a jego geny wykazują znaczną zachowawczość w
przebiegu ewolucji (63% między ludzką a drożdżową cdc2). U człowieka gen ten
zlokalizowany jest na długim ramieniu chromosomu 10. jej poziom w różnych
etapach cyklu nie ulega zmianie, co wyklucza jej działanie jako oscylatora. Na
szczęście drugi składnik MPF, kochana przez studentów medycyny cyklina
potrafi ulegać rytmicznej syntezie w interfazie i degradacji w fazie M. obecnie, żeby
studentom się nie nudziło, wyróżnia się 5 rodzin cyklin, obejmujących 10 białek.
Najlepiej poznany jest wpływ kompleksu cyklina B- cdk1 na rozpad otoczki
jądrowej. Po ufosforylowaniu włóknistych białek otoczki (lamin) stają się one
rozpuszczalne, a po defosforylacji odtwarzają otoczkę.

2.

Rola kinazy p34

cdc2

(cdk1) i kinaz rodziny cdk w regulacji cyklu

komórkowego.

Kinaza cdk odgrywa kluczową rolę w regulacji cyklu komórkowego.

Fosforyzowane w niej są: Tyr, Thr i Ser. U organizmów wyższych fosforylacja
zachodzi w różnych kinazach cdk, w zależności od fazy cyklu. W fazie S i G1
fosforylowane sąTyr15 i Thr14. Ser277 w fazie G1, a Thr161 w fazie G2. w fazie M
wszystkie poza Thr161 są defosforylowane. W kinazach cdk Tyr15 i Thr14 znajdują
się w domenie wiążącej ATP, z kolei Thr161 w domenie wiążącej cykliny, co

9

stabilizuje ich kompleksy. W początkowej fazie G1 białko p34

cdc2

nie jest związane

z cykliną, przez co pozostaje nieaktywne. W miarę akumulacji cyklin D i E i
połączeniu ich z kinazą następuje jej aktywacja, co doprowadza do startu cyklu
(indukcji replikacji, faza S) i organizacji centrum mikrotubul (MTOC). Po przejściu
punktu restrykcyjnego komórki zaczynają produkować różne cykliny (jednakowoż
głównie B), które tworzą kompleksy z kinazą p34

cdc2

. kompleksy te (pre-MPF)

pozostają nieaktywne z powodu fosforylacji Ty15 i Thr14. defosforylacja Tyr15 w
późnej G2 pozwala na aktywację MPF, co skutkuje przejściem do mitozy. Przejście
pre-MPF w MPF kontrolowane jest przez produkt genu wee1, mik1 i cdc25,
kodujących enzymy o przeciwnym działaniu. Kinazy wee1 i mik1 powodują
fosforylację Tyr15 i są inhibitorami mitozy, z kolei fosfataza tyrozynowa cdc25 jest
jej aktywatorem. U człowieka występuje wiele kinaz cdk, pokrewnych do p34cdc2.
obecnie znamy ich ponad 10.

3.

Rola cyklin w regulacji cyklu komórkowego

Regulacja aktywności kinaz cdk odbywa się nie tylko drogą fosforylacji, ale

także poprzez łączenie ich w kompleksy z cyklinami. Są one białkami
zbudowanymi z ok. 400 aminokwasów. Ich domena funkcjonalna (kaseta
cyklinowa) wykazuje duży stopień konserwatywności sekwencji. Każda cyklina
zawiera także sekwencję biorącą udział w jej degradacji przy udziale proteasomów
sprzężonych z ubikwityną. Bierze ona udział w wiązaniu cyklin z cdk. Cykliny
można podzielić na:

•

Cykliny mitotyczne (A i B)

•

Cykliny fazy G1 (D i E)

4.

Cykliny mitotyczne

Cykliny mitotyczne zgrupowane są w dwie klasy (A i B) w zależności od funkcji.

Dodatkowo cykliny B dzieli się na B1 i B2. Obie klasy cyklin mitotycznych różnią
się funkcją i czasem degradacji. Proteoliza Cykliny B na granicy metafaza/anafaza
powoduje inaktywację MPF, co prowadzi do zakończenia mitozy i przejścia do
interfazy z dekondensacją chromosomów, reorganizacją otoczki jądrowej i
cytokinezą. Obecność zmutowanej cykliny B powoduje zablokowanie cyklu w
mitozie. Cyklina B jest produkowana podczaf fazy G2 i stopniowo ulega akumulacji
w komórce, związana przez struktury błoniaste i w postaci ziarnistości. Razem z
białkiem p34

cdc2

tworzy kompleks pre-MPF. Na początku profazy ulega

translokacji do jądra komórkowego. W odróżnieniu od cykliny B, cyklina A bierze
udział już w przebiegu fazy S, gdzie jest niezbędna do inicjacji replikacji DNA.
Gromadzi się ona głównie w jądrze, a częściowo także rozpuszczona w
cytoplazmie. Jej aktywność wzrasta stopniowo w miarę akumulacji. Z kolei
aktywność cykliny B pozostaje niska pomimo jego wysokiego poziomu aż do
zadziałania produktu genu cdc25. szczyt aktywności kompleksu kinaza-cyklina A
występuje, gdy aktywność kompleksu kinaza-cyklina B dopiero zaczyna rosnąć.
Także degradacja cykliny A następuje wcześniej niż B, bo już w momencie rozpadu
otoczki jądrowej.

10

5.

Cykliny fazy G1

Są one aktywne we wczesnych fazach cyklu komórkowego. Do grupy tej zalicza

się trzy cykliny klasy D (D1, D2, D3) oraz cyklinę E, a także bardzo słabo poznaną
cyklinę C. każda z cyklin fazy G1 tworzy kompleksy z odpowiednią kinazą:

•

Cykliny D z cdk4 i cdk6

•

Cykliny E z cdk2

•

O cyklinie C gówno wiemy

Kinazy cdk4 i cdk6 w kompleksach z cyklinami klasy D działają w początkowym

etapie fazy G1, aktywność kompleksu cdk2-cyklina E pojawia się później, a
maksimum osiąga na granicy faz G1/S. w komórkach fazy G1 występują też liczne
inhibitory cyklin oraz antygen proliferujących komórek PCNA. Nadekspresja
genów cyklin klasy D umożliwia komórkom włączenie się do cyklu podziałowego,
skracając fazę G1. z kolei spadek poziomu cykliny D1 powoduje zahamowanie
komórek w fazie G1 cyklu. Także Nadekspresja genu cykliny E, a czasami również
cykliny D2, skraca fazę G1 i przyspiesza rozpoczęcie fazy S. wysoki poziom cykliny
D1 może spowodować blok w fazie G1, dając czas na naprawę DNA z udziałem
PCNA. W hamowaniu cyklu komórkowego przez cyklinę D1 bierze udział białko
p53 i indukowane przez nie białko p21 oraz inhibitor cdk. W warunkach
fizjologicznych aktywność p53 podlega regulacji ze strony mdm2 na zasadzie
ujemnego sprzężenia zwrotnego.

Białko p53 nasila ekspresję genu mdm2, którego produkt tworzy z kompleksy

p53-mdm2, pozbawiony aktywności indukcji genów. Białko mdm2 wykazuje w
tym dimerze aktywność ligazy ubikwitynowej, co prowadzi do degradacji p53.
aktywność mdm2 kontrolowana jest z kolei przez białko p19. kompleks mdm2-p19
nie wykazuje aktywności ligazy, co prowadzi do stabilizacji poziomu p53.

Cyklina D1 może brać udział zarówno w indukcji jak i inhibicji cyklu

komórkowego, mniej wiadomo o cyklinach D2 i D3, aczkolwiek prawdopodobnie
także biorą one udział w regulacji cyklu, zwłaszcza przy różnicowaniu mioblastów i
komórek układu krwiotwórczego.

Cyklina E ma związek z aktywnością kinazy histonu H1, która jest najwyższa w

późnej G1 i wczesnej S. cyklina E może tworzyć kompleks z cdk1, jednakże nie
wykazuje on aktywności kinazowej.

Cyklina C jest najsłabiej poznana. Wiemy jedynie, że jej mRNA osiąga

najwyższy poziom we wczesnej G1 i że najbardziej różni się od cyklin
mitotycznych.

6.

Degradacja cyklin przy udziale systemu ubikwitynowego

Szybka degradacja cyklin mitotycznych przebiega przy udziale białkowych

kompleksów zwanych proteasomami (konkretnie proteazy 26S proteasomu).
Degradacji ulegają jednak jedynie cząsteczki odpowiednio oznaczone. Rolę
znacznika pełni tu małe białko; ubikwityna, która zostaje przy udziale ATP
przyłączona do cząsteczki cykliny, tworząc kompleks zwany cyklosomem.
Bezpośrednio przed degradacją dochodzi do modyfikacji cykliny, zwiększającej jej
powinowactwo do enzymów przenoszących ubikwitynę. W degradację cyklin są

11

zaangażowane co najmniej dwie kinazy: p34

cdc2

oraz kinaza białkowa p39

mos

.

Bezpośrednio przed mitozą stwierdza się wzrost stężenia jonów Ca

2+

i

kalmoduliny, od których zależy aktywność kinazy II. Obecność zmutowanej, stale
aktywnej kinazy II powoduje blok w fazie G2, pomimo wzrostu aktywności MPF.
Degradację cyklin pod koniec mitozy wywołuje rozpad kompleksu kinazy p34

cdc2

-

cyklina, w którym Thr161 jest nadal ufosforylowana. Dopiero degradacja cyklin
powoduje defosforylację tego aminokwasu, powodującą całkowity zanik
aktywności kinazowej, gwarantujący prawidłowy przebieg cyklu komórkowego.

7.

Inhibitory kinaz zależnych od cyklin (CKI)

W komórkach somatycznych odok cdk i cyklin występują dodatkowe czynniki

białkowe, wywierające hamujący wpływ na aktywność tych kompleksów takie jak:

•

Białko p21 WAF1: produkt genu CIP1. hamuje aktywność
enzymatyczną cdk w kompleksach z cyklinami. Najsilniej działa na
kompleksy cdk2-Cyklina A, a najsłabiej na cdk2-Cyklina B. poziom jego
mRNA jest w komórkach starzejących się i zahamowanych w G0
podwyższony 10-29krotnie. W komórkach G0 przechodzących do cyklu
następuje częściowy wzrost poziomu mRNA dla genu pic1. regulacja
białka p21 odbywa się na drodze zależnej i niezależnej od p53.

•

Białko p16 INK4A: kodowane przez gen CDKN2A. wiąże się głównie z
cdk4, gdy inaktywacji ulega Rb i pokrewne mu białka. W komórkach o
zmutowanym białku pRb wzrasta ekspresja genu dla białka p16 i
następuje inaktywacja cdk4, co jednak nie wpływa na postęp cyklu, gdyż
zmutowane pRb znajduje się w stanie ciąglej hiperfosforylacji.

•

Białko p27 KIP1: produkt genu KIP1. jest uniwersalnym inhibitorem
cdk. Pośredniczy ono w transdukcji sygnału pochodzącego z TGF-β,
blokującego komórki w późnej G1. białko p27 wiąże się z kompleksem
cdk2-cyklina E, zwiększając poziom cykliny E potrzebny do aktywacji
cdk2. z kolei wiązanie p27 z kompleksem cdk4-cyklina D2 umożliwia
aktywację kompleksu cdk2-cyklina E. W komórkach nie znajdujących
się pod wpływem TGF-β białko p27 jest obecne, ale pozostaje związane
w kompleksy z innymi białkami, przez co staje się nieaktywne.

8.

Mechanizmy kontrolujące cykl komórkowy

Regulacja transkrypcyjna: większość genów aktywna jest podczas całego

cyklu komórkowego, jednak część ulega jedynie okresowej aktywacji w
określonych fazach. Są to na przykład:

•

Geny DHFT, TK, TS, c-myb- w fazie G1/S.

•

Geny histonów: H1,H2A, H2B, H3, H4- w fazie S.

•

Geny Cyklin A, cdc 25, HSP70 (białko szoku cieplnego)- w

późnej S/G2.

•

Geny GKSHs1 i GKSHs2: dla białek wiążących kinazę p34

cdc2

w

fazie G2/M.

Kontrola przez ujemne sprzężenie zwrotne (zobaczyć w Drewie, zero
konkretów w tym temacie, więc się nie rozpisuję).

12

Kontrola przez czynniki spoza cyklu: komorki mogą być aktywowane do
cyklu przez czynniki pozakomórkowe, takie jak hormony i czynniki wzrostu i
różnicowania, wpływ układu nerwowego i inne podobne, które dzielimy na
mitogenne i hamujące proliferację.

•

Czynniki wzrostu i różnicowania (CWR): składa się na nie ok. 40
polipeptydów i leukotrienów, których działanie ma miejsce przy stężeniu
zaledwie 10

-10

mol/litr. Oddziałują one na komórkę za pomocą błonowych

receptorów, pobudzając do wzrostu (wejście do cyklu), bądź przerostu
(zwiększania masy). Należą tutaj między innymi: naskórkowy czynnik
wzrostu, interleukiny 1-9, czynnik wzrostu nerwów oraz w ch*j i trochę
innych.

•

Białko p110Rb: jest to fosfoproteina posiadająca 10 miejsc fosforylacji
reszt Ser i Thr. Jego fosforylacja odbywa się przy udziale kinaz cdk w
określonych fazach cyklu komórkowego. Inicjacja jego fosforylacji następuje
pod wpływem cykliny E, synteza kolejnych cyklin utrzymuje je w stanie
kiper- lub hipofosforylacji. Hipofosforylowana postać białka(faza G1)
zapobiega proliferacji komórek, podczas gdy hiperfosforylowana (fazy S, G2,
M) powoduje jej wzmożenie, uwalniając szereg czynników transkrypcyjnych,
mogących wchodzić w kompleks z białkiem p33

cdc2

.

•

Białko p53: składa się z 393 aminokwasów i jest fosfoproteiną. Prawidłowa
jego postać występuje w jądrze, podczas gdy zmutowaną obserwuje się w
cytoplazmie. Wykazuje zdolność wiązania z produktami onkogennych
wirusów (np. SV40, Papilloma E6), a także produktem genu mdm2 o dużej
aktywności transformacyjnej. Związane z produktem Papilloma E6 podlega
degradacji przy udziale systemu ubikwitynowego. Posiada ono zdolność
wiązania się z dwuniciowym DNA i zatrzymywać cykl w późnej G1 w
przypadku uszkodzeń DNA, dając czas na pracę enzymów naprawczych
przed fazą S. zatrzymując cykl na przełomie G2/M zapobiega utracie
materiału genetycznego wskutek złamań chromosomów. Prawidłowa jego
forma ma zdolność indukowania apoptozy, podczas gdy zmutowane hamuje
ten proces, stając się onkogenem. Jego zmutowaną postać wykrywa się w
licznych nowotworach (jelita, płuc, przełyku).

13

Mutacje i mechanizmy naprawy DNA

Mutacja- Zmiana dziedziczna powstająca wskutek zmiany genu w jego nowy allel
(mutacja genowa), zmiany struktury chromosomu (mut. Chromosomowa
strukturalna),

zmiany

liczby

chromosomów

(mut.

liczbowa),

bądź

zwielokrotnienie haploidalnego zestawu chromosomów (mut. genomowa).

1.

Mutacje genowe

•

Mutacją genową nazywamy zmianę sekwencji nukleotydów w obrębie
genu na inną od sekwencji nukleotydów genu wyjściowego.

Najprostszym przykładem mutacji genowej jest mutacja punktowa,
czyli obejmująca 1 parę zasad:

•

Tranzycja: zmiana jednej zasady purynowej na inną purynową
(pirymidynowej na pirymidynową)

•

Transwersja: zmiana zasady purynowej na pirymidynową
lub odwrotnie

•

Delecja: wypadnięcie jednej lub większej liczby par nukleotydów
z danego genu

•

Insercja: wstawienie pojedynczej lub większej liczby par
nukleotydów do danego genu.

Mutacje genowe mogą doprowadzać do różnych, mniej lub bardziej
poważnych następstw:

•

Zmiany sekwencji aminokwasów w polipeptydzie kodowanym przez
zmutowany gen. Takie zjawisko nazywamy mutacją zmiany
sensu

•

Przerwania syntezy łańcucha polipeptydowego jeśli powstanie
triplet nonsensowny (kodon STOP); mutacja nonsensowna

•

Do mutacji niemej, jeśli powstanie triplet synonimiczny

W wyniku delecji lub insercji pewnej liczby nukleotydów, innej
niż wielokrotność trzech następuje zmiana ramki odczytu i
powstający produkt ma zmienioną sekwencję aminokwasów od miejsca
wystąpienia mutacji do C- końca.

Skutkiem mutacji nonsensownych są takie choroby jak: mukowiscydoza,
fenyloketonuria, alkaptonuria, retinoblastoma.

14

2.

Mutacje (aberracje) chromosomowe

Wszelkie zmiany w strukturze i liczbie chromosomów. Mogą powstawać
zarówno w komórkach somatycznych, jak i w gametach. Mogą być dziedziczne
lub powstawać de novo.

Aberracje strukturalne: mogą dotyczyć pojedynczej lub obydwu
chromatyd. Ich przyczyną jest przerwanie ciągłości chromatydy lub
chromosomu. Mogą prowadzić do:

•

Delecji (usunięcia/ deficjencji) fragmentu chromosomu. Gdy dotyczy
odcinka końcowego mówimy o delecji terminalnej, jeśli z kolei
chodzi o fragmenty ze środka chromosomu stosujemy termin Delecja
interstycjalna. Delecja dotyczyć może nawet bardzo dużych
fragmentów chromosomu. Niektóre chromosomy posiadają odcinki
wykazujące szczególną podatność na złamania (kruche miejsca
genomu). Miejsca takie u człowieka występują m.in. na chromosomie
2, 6, 9 12, 20 oraz X (jego złamanie skutkuje upośledzeniem
umysłowym u mężczyzn, u kobiet bezobjawowe nosicielstwo). Delecje
dużych fragmentów są z reguły letalne.

•

Inwersji: odwrócenia odcinka chromosomu o 180

o

co powoduję

zmianę pozycji genów, mogącą mieć wpływ na zmianę ich ekspresji.
Jeśli inwersja dotyczy fragmentu chromosomu wraz z centromerem
nazywamy ją eucentryczną, jeśli zaś inwertowany fragment nie
zawiera centromeru używamy terminu acentryczna.

•

Translokacji:

przeniesienia

części

chromosomu

na

inny.

Translokacje

polegające

na

wymianie

odcinków

między

chromosomami

niehomologicznymi

nazywamy

translokacją

wzajemną. W takim przypadku nie zmienia się liczba chromosomów,
lecz zmianie ulega ich budowa. Innym typem translokacji są
translokacje

robertsonowskie

(u człowieka

dot.

tylko

chromosomów akrocentrycznych). Polega ona na łączeniu się całych
lub prawie całych ramion długich dwóch różnych chromosomów
(połączenie centryczne). Miejscem połączenia jest rejon centromeru.
Dochodzi do utraty funkcjonalnie nieistotnej części mat. Genetycznego
(ramion krótkich). W konsekwencji translokacji zrównoważonych nie
zmienia się ilość mat. Genetycznego, ale następuje zmiana jego
lokalizacji

(45

chromosomów

metafazowych).

W translokacji

niezrównoważonej następuje powiększenie ilości mat. Genetycznego o
dodatkową kopię translokowanego chromosomu (dwa homologiczne
chromosomy

teocentryczne

mogą

koniugować

z

jednym

metacentrycznym wskutek czego powstaje triwalent), chociaż liczba
chromosomów wynosi 46. w takim przypadku zawsze dochodzi do
ujawnienia się choroby.

15

•

Duplikacji: podwojenia fragmentu chromosomu, co może mieć
istotne znaczenie ewolucyjne (duplikacja sekwencji hemoglobiny).
Duplikowane kopie genów mogą występować jako bezpośrednie
powtórzenia (tandemowe) lub jako odwrócone względem siebie

•

Utworzenia chromosomu kolistego (wskutek tworzenia się lepkich
końców

w

miejscach

pęknięć

chromosomów.

Na

końcach

prawidłowych chromosomów znajdują się telomery zabezpieczające
przed ich wzajemnym łączeniem się), dwucentromerowego lub
izochromosomu

(postaje

wskutek

poprzecznego

podziału

centromeru chromosomu metafazowego i składa się z połączonych
ramion krótkich lub długich; jego powstanie skutkuje ubytkiem genów
zawartych na utraconych ramionach i podwojenie liczby w ramionach,
które go utworzyły). U człowieka chromosom kolisty najczęściej
powstaje z chromosomów 4, 13, 18 oraz X. powodują liczne zaburzenia
rozwojowe, najczęściej jednak nie tworzą zdefiniowanych zespołów
chorobowych.

Aberracje liczbowe chromosomów powstają najczęściej wskutek

nondysjunkcji par chromosomów homologicznych podczas podziałów.
Wyróżniamy dwie ich kategorie:

•

Aneuploidie: powstają w wyniku zwiększenia lub zmniejszenia 2n
liczby chromosomów o pojedyncze chromosomy. Najczęściej wskutek
nondysjunkcji. Nondysjunkcji może wystąpić zarówno w oogenezie jak
i spermatogenezie. Skutkuje powstaniem gamet disomicznych lub
nullisomicznych. Do aneuploidii zalicza się aberracje liczbowe
zarówno chromosomów homologicznych, jak i płciowych. Może
skutkować powstaniem disomii uniparentalnej; występowaniem
w organizmie pary chromosomów pochodzących od jednego rodzica
(patrz zespół Angelmana i PW)

•

Euploidiy mają zwielokrotniony cały zestaw chromosomów.
Wyróżnia się 2 typy poliploidii; autopoliploidia i allopoliploidia.
W autopoliploidiach garnitur chromosomów jest zwielokrotniony o
ten sam zestaw chromosomów, są one z reguły letalne. Allopoliploidy
mają z kolei 2 lub więcej niehomologicznych zespołów chromosomów,
nie występują u człowieka.

16

3.

Czynniki mutagenne

Czynniki mutagenne dzielimy na

•

Fizyczne

1.

promienie X

2.

promienie alfa beta i gamma

3.

protony i neutrony emitowane przy rozpadzie promieniotwórczym

4.

promieniowanie kosmiczne

5.

promieniowanie niejonizujące (UVA i UVB)

•

Chemiczne

1.

kwas azotowy III

2.

hydroksylamina

3.

związki alkilujące (sulfonian dietylowy, iperyt azotawy)

4.

analogi zasad azotowych (2-aminopuryna 5-bromouracyl)

5.

barwniki akrydynowe (proflawina)

6.

wolne rodniki tlenowe

7.

nadtlenki

8.

policykliczne węglowodory aromatyczne

9.

cytostatyki (busulfan, cyklofosfamid, aminopteryna winkrystyna)

10.

niektóre

antybiotyki

o

właściwościach

cytostatycznych

(aktynomycyna, daunomycyna)

11.

produkty pirolizy aminokwasów

•

Biologiczne

1.

wirusy (Herpes virus, Papilloma virus)

Mutagenne działanie związków chemicznych. Zmiana w budowie
chemicznej zasad azotowych prowadzi do zmiany par zasad w łańcuchu
DNA. Np. dezaminacja Adeniny prowadzi do powstania hipoksantyny
posiadającej 3 wiązania wodorowe, co prowadzi do zamiany pary AT na CG
w dwóch kolejnych cyklach replikacyjnych. Hydroksyloamina reaguje z
cytozyną zmieniając ją w uracyl, co prowadzi do Tranzycja C->T. Związki
alkilujące wprowadzają w różnych miejscach zasad azotowych grupy
metylowe. Alkilacja Guaniny w pozycji N7 powoduje osłabienie wiązania z
pentozą co z kolei skutkuje depurynizacją DNA. W pustym miejscu może
dojść do tranzycji lub transwersji.

Barwniki akrydynowe wnikają między pary zasad powodując ich
rozsunięcie, co może prowadzić do błędów replikacji wskutek delecji lub
insercji pojedynczych nukleotydów, co skutkować może zmianą ramki
odczytu.

Wolne rodniki pochodzenia tlenowego powodują uszkodzenia zasad
azotowych, reszt cukrowych i rozerwanie wiązań fosfodiestrowych i
utworzenie wiązań poprzecznych DNA-białka chromatyny. Uszkodzenie
rodnikami indukuje powstawanie autoprzeciwciał, co ma znaczenie w
chorobach autoimmunologicznych. Mogą także wywoływać pęknięcia
łańcucha (patrz aberracje chromosomowe)

17

Produkty pirolizy aminokwasów powstają np. wskutek smażenia mięs
w temperaturze powyżej 150

o

C. powstają z połączenia kreatyniny cukru

i aminokwasu (najczęściej Gly Trp Phe Glu). Mają działanie kancero-
i teratogenne

Mykotoksyny (np. aflatotoksyna) produkowane przez niektóre grzyby
(aspergillus,

fusarium)

które

rozwijają

się

na

nieprawidłowo

przechowywanej żywności.

Mutagenne działanie czynników fizycznych

Promienie jonizujące zwiększają częstość występowania uszkodzeń DNA.
Wybija ono elektrony z atomów i cząsteczek, co prowadzi do powstania
jonów i wolnych rodników inicjujących różne reakcje chemiczne. Efekt
promieniowania jonizującego zależy od stężenia tlenu w środowisku (wraz z
jego wzrostem wzrasta częstość mutacji). Powoduje ono: zerwanie w.
fosfodiestrowych, modyfikacje zasad, uszkodzenie pentozy, powstanie w.
krzyżowych DNA (sieciowanie). Szczególnie narażone na nie są komórki
szybko dzielące się.

Promieniowanie UV jest mniej przenikliwe niż jonizujące, ale
intensywnie pochłaniane przez DNA. Prowadzi do wytwarzania wiązań
kowalencyjnych między leżącymi obok siebie pirymidynami, powodując
transwersje, tranzycje, rzadko zmiany ramki odczytu.

4.

Mechanizmy naprawy uszkodzeń DNA

Pozwalają

przywrócić

pierwotny

stan

materiału

genetycznego.

Do

najważniejszych enzymów biorących udział w naprawie DNA należą:

•

Polimerazy DNA jądrowe (α, β, δ, ε) i mitochondrialna γ

•

Ligazy DNA

•

Glikozydazy DNA

•

Endonukleazy purynowe/pirymidynowe 5’-AP i 3’-AP

•

Białka pomocnicze

•

Fotolizy DNA

•

Metylotransferaza-O

6

-metyloguanina (MGMT)

Naprawa DNA w komórce może być kompletna lub niekompletna, co prowadzi
do mutacji i aberracji chromosomowych. Jeżeli enzymy naprawcze nie zdołają
naprawić uszkodzeń, to komórka może przejść na szlak apoptozy.
Procesy naprawy DNA zachodzą w okresie przedreplikacyjnym, podczas
replikacji DNA lub w okresie poreplikacyjnym. Duży wpływ na nie ma struktura
chromatyny. Nić DNA łącząca chromosomy jest naprawiana szybciej niż nić

18

nawinięta (DNA rdzeniowy). Szybkość naprawy euchromatyny jest większa niż
heterochromatyny.

Naprawa DNA przez bezpośrednią rewersję uszkodzenia. Polega
na odwróceniu reakcji, w wyniku której doszło do uszkodzenia. Biorą w niej
udział metylotransferaza MGMT oraz fotoliazy DNA.

Metylotransferaza

MGMT

naprawie błędną

metylację.

Katalizuje

przeniesienie grupy alkilowej z atomu O

6

Guaniny na cysteinę, w wyniku czego

następuje inaktywacja MGMT. Ekspresję MGMT w różnych tkankach cechuje
zróżnicowany poziom. U ludzi najwyższy w komórkach wątroby, zaś najniższy w
szpiku (w komórkach nowotworowych ulega zmniejszeniu o 20-30%). Reakcja
ta jest kosztowna dla komórki, gdyż naprawa każdej metyzacji pociąga za sobą
utratę jednej cząsteczki enzymu. MGMT występuje u wszystkich żywych
organizmów.

Fotoliaza to enzym odpowiedzialny za fotoreaktywację, czyli rozłączanie
dimerów pirymidynowych przy udziale fal elektromagnetycznych o długości
300-600 nm. Proces ten nazywamy również naprawą na świetle. Każda
fotoliaza zawiera dwa chromofory, odpowiedzialne za absorpcję fotonów:
FADH

-

oraz metynylo-tetrahydrofolian (MTHF) lub 8-hydroksy-deazoflawina

(8-HDF). MTHF lub 8-HDF absorbują energię świetlną, którą przekazują
potem do FADH

-

. energia ta jest używana do rozdzielania dimerów.

Innym przykładem rewersji uszkodzenia jest działanie ligazy, która łączy
pęknięcia w łańcuchu DNA. Jej aktywność ogranicza się jedynie do pęknięć
pomiędzy grupą 5’fosforanową a 3’hydroksylową.

Usuwanie błędnie sparowanej zasady (missmatch repair- MMR).
Dotyczy usuwania błędów replikacyjnych nie naprawionych przez Polimerazy,
wywołanych przez czynniki chemiczne oraz błędy w parowaniu zasad powstałe
przy rekombinacji DNA. Istotne jest rozpoznanie, która z dwóch nici DNA
została prawidłowo zsyntetyzowana, a która zawiera błąd. Badania na E. Coli
wykazują, że dużą rolę w tym zakresie odgrywa stopień metylacji DNA. W
sekwencjach GATC E. Coli etylowana jest adenina, ale metylacja nie zachodzi
bezpośrednio po replikacji, lecz jakiś czas później. Dzięki temu możliwa jest
identyfikacja nowej nici (niezmetylowana adenina). U Eucaryota nić potomna
jest rozpoznawana dzięki przerwom między fragmentami Okazaki nici
opóźnionej. Białka uczestniczące w rozpoznawaniu i naprawie uszkodzenia
kodowane są przez zespół genów zwanych mutatorowymi.

19

Przebieg procesu u E. Coli

1.

Rozpoznanie i przyłączenie się do miejsca pomyłki białka MutS
(zdolnego rozpoznać nie tylko błędnie sparowane zasady, ale także
insercje i delecje obejmujące do 4nukleotydów).

2.

stabilizacja

kompleksu

MutS-DNA

przez

białko

MutL

(odpowiedzialnego także za połączenie z białkiem MutH)

3.

białko MutH przyłącza się naprzeciw najbliższej metylowanej
adeniny w nici rodzicielskiej i nacina nić potomną.

4.

Wycięcie nieprawidłowej nici i dosyntetyzowanie nowej przy
udziale:

•

UvrD (helikaza II; rozkręca nić DNA od miejsca nacięcia
przez MutH do miejsca pomyłki)

•

Egzonukleaza o odpowiedniej polarności wycinająca
błędnie sparowany fragment

•

Polimeraza DNA III dosyntetyzowująca odpowiednią
sekwencję zasad

•

Ligaza DNA łącząca nowo powstały fragment z nicią
macierzystą

U eucaryota ten mechanizm naprawy nie został całkowicie poznany, ale
przypuszczalnie jest on bardzo podobny do tego u E. Coli.
W organizmach eukariotycznych brakuje homologów MutH i UvrD, ale jest wiele
homologów MutS i MutL.
Zaburzenie funkcji genów mutatorowych jest przyczyną powstania między innymi
raka jelita grubego.

Naprawa przez wycinanie zasad azotowych. (Base excision repair-
BER )
Jest to mechanizm stosowany głównie do usuwania uracylu lub alkilowanych
zasad. W procesie tym wyróżniamy 3 etapy:

1.

usunięcie nieprawidłowej zasady przez specyficzną N-glikozylazę i
wytworzenie miejsca purynowego/pirymidynowego (AP)

2.

nacięcie przez Endonukleazy AP wiązania fosfodiestrowego powyżej
AP

3.

wypełnienie miejsca AP przez polimerazę DNA

Naprawa przez wycinanie nukleotydów: bierze udział w usuwaniu
większości uszkodzeń DNA. U każdego organizm przebiega według identycznego
schematu:

1.

rozpoznanie uszkodzenia

2.

przyłączenie kompleksu białkowego w miejscu uszkodzenia

3.

podwójne nacięcie uszkodzonej nici w pewnej odległości od
uszkodzenia

4.

usunięcie zawierającego uszkodzenie oligonukleotydu

5.

uzupełnienie luki przez polimerazę DNA

20

6.

połączenie wolnych końców przy udziale ligazy DNA

Naprawa rekombinacyjna bierze udział w naprawie pęknięć dwuniciowych.
System ten jest dokładnie poznany i opisany u bakterii. U eucaryota wyróżnia się
trzy szlaki naprawy: rekombinacja homologiczna, dopasowanie pojedynczej nici
oraz rekombinacja niehomologiczna. U ssaków różne mechanizmy dominują w
zależności od pozycji w cyklu komórkowym:

•

podczas fazy G1 i wczesnej S rekombinacja niehomologiczna

•

podczas późnej S i G2 rekombinacja homologiczna

W rekombinacji homologicznej do odtworzenia struktury chromosomu
wykorzystywany jest jego nieuszkodzony homolog. W pierwszym etapie system
naprawczy rozpoznaje powstały wskutek pęknięcia dwuniciowego fragment DNA.
Jedna z jego nici zostaje strawiona przez egzonukleazy. Pozostała nić z wolnym
końcem 3’ łączona jest z nieuszkodzonym odcinkiem homologicznym. Na
podstawie informacji z nieuszkodzonego DNA zostaje odtworzony przebieg
naprawionej cząsteczki. W mechanizmie dopasowania nici DNA białka
wykorzystują sekwencje powtórzone w najbliższym sąsiedztwie pęknięcia.

W rekombinacji niehomologicznej największy udział ma kinaza białkowa
zależna od DNA (DNA-pk). Dokładny przebieg procesu nie został jeszcze poznany.

Odpowiedź SOS dotyczy komórek bakteryjnych i uruchamiana jest
przypadkach, gdy w DNA nastąpiły liczne mutacje lub zatrzymana została
replikacja. Bierze w niej udział ok. 20 różnych genów, spośród których liczne
kodują enzymy naprawy DNA. W odróżnieniu od innych metod naprawczych,
system SOS może pozostawiać liczne błędy (system mutagenny). Jest on próbą
uratowania komórki za cenę ewentualnej mutacji. Uruchamiany jest przy
uszkodzeniach zbyt rozległych, by mogły je naprawić poprzednie mechanizmy.
Jego uruchomienie powoduje zahamowanie podziału, co daje dodatkowy czas na
naprawę. Uszkodzenia DNA indukują aktywność proteazową białka RecA, które
rozkłada represorowe białka LexA i lambda, blokujące geny enzymów naprawy
DNA, dzięki czemu wzrasta transkrypcja tych genów. Do mutacji dochodzi,
ponieważ produkty genów UmuDC umożliwiają elongację łańcucha tuż za
miejscem uszkodzenia lub pomimo błędnie wbudowanej zasady (naprawa ze
skłonnością do błędu). Po dokonaniu naprawy poziom białka RecA obniża się,
zwiększając syntezę LexA i lambda, które ponownie blokują ekspresję genów
mechanizmu SOS.

Naprawa DNA jest niezwykle ważnym dla komórki i organizmu procesem. Istnieją
choroby związane z obniżeniem aktywności lub zupełnym brakiem jednego
z enzymów naprawczych takie jak:

•

Xeroderma pigmentosum

•

Zespół Blooma

•

Anemia Fanconiego

•

Atalia teleangiectasia

21

Obniżenie zdolności naprawy zwiększa także ryzyko zachorowania na nowotwory,
oraz przyspiesza starzenie. Naprawa uszkodzeń jest też niezwykle istotna w
układzie nerwowym a jej upośledzenie obserwuje się między innymi w chorobie
Alzheimera i Huntingtona.

Naprawę DNA spowalnia hipertermia, spadek poziomu ATP, palenie tytoniu, picie
alkoholu oraz teofilina.

Mutacje niestabilne (dynamiczne)- ekspansja tripletów. Ekspresja takich
mutacji zmienia się w kolejnych pokoleniach. W ich wyniku powstają takie
choroby jak:

•

Zespół łamliwego chromosomu X

•

Dystrofia miotoniczna

•

Choroba Huntingtona

Mutacje dynamiczne powstają w wyniku wydłużania lub skracania sekwencji DNA.
Prawdopodobieństwo wystąpienia takiej mutacji zależy od długości niestabilnej
sekwencji DNA. W przypadku wymienionych trójek, w zależności od liczby
powtórzeń wyróżnia się osoby zdrowe, nosicieli i chorych. Najczęściej są to
powtórzenia zwielokrotnionych trójek nukleotydów. Gdy liczba powtórzeń
wzrasta, wzrasta też ryzyko zachorowania. Np. w pląsawicy Huntingtona liczba
powtórzeń fragmentu CAG w ramieniu krótkim 4 chromosomu u zdrowych waha
się między 4-35. u chorych wynosi od 36 (wystąpienie objawów w wieku średnim),
powyżej 50 (choroba w młodym wieku). W chorobie Huntingtona liczba trójek u
potomstwa zwiększa się tylko, gdy mutacja zostanie przekazana przez ojca.
Zjawisko pojawiania się objawów w coraz młodszym wieku u kolejnych pokoleń
wskutek zwielokrotnienia trójek nukleotydów nazywamy antycypacją. W
przypadku zespołu łamliwego chromosomu X prawdopodobieństwo choroby u
rodzeństwa nosiciela jest mniejsze niż wśród jego wnuków (paradoks Shermana)

Mutacje letalne występujące w układzie homozygotycznym powodują śmierć
organizmu, natomiast w układzie heterozygotycznym mogą być utrzymywane
w populacji przez wiele pokoleń, wskutek czego w populacjach gromadzą się liczne
geny letalne.

22

Wpływ leków Cytostatycznych na kwasy nukleinowe

1.

Pochodne zasad azotowych

•

Fluorouracyl: stosowany

jako

lek

cytostatyczny w

litych

nowotworach żołądka, trzustki, jelita grubego oraz sutka. Ulega
przemianie

do

postaci

aktywnej

biologicznie;

fosfodeoksyrybonukleotydu oraz trifosforanu fluorourydyny (FUTP).
W takiej postaci blokuje aktywność syntetazy tymidylowej, prowadząc
do zahamowania syntezy DNA, za czym idzie śmierć komórki. FUTP
jest także wbudowywany do RNA, powodując zablokowanie fosfatazy
uranylowej i zaburzenie przekształcania uracylu, co prowadzi do
powstania RNA o nieprawidłowej budowie.

•

Cytarabina: analog 2-deoksycytydyny, posiadający arabinozę w
miejscu deoksyrybozy. Stosowana w ostrych białaczkach, a także jako
lek

immunopresyjny.

Hamuje

aktywność

Polimerazy

DNA.

Wbudowuje się do DNA i RNA

•

Merkaptopuryna: pochodna zasad purynowych. Posiada grupę –SH
zamiast aminowej. Hamują syntezę DNA, powodując przy tym
niedokrwistość, limfocytopenie i zaburzenia żołądkowo jelitowe .

•

Azatopiryna: pochodna merkaptopuryny. Wykazuje działanie
cytostatyczne i immunopresyjne. Stosowana po przeszczepach
narządów oraz w chorobach autoimmunologicznych takich jak Toczeń
rumieniowy.

2.

Pochodne nukleozydów

•

Aciklovir: działa przeciwko wirusom opryszczki zwykłej i półpaśca.
Biologicznie aktywny staje się po licznych przekształceniach. W
zarażonej komórce reaguje z polimerazą DNA powodując jej
zablokowanie.

•

Zidowudyna: stosowana w leczeniu AIDS. Jest inhibitorem
retrotranskryptazy wirusa HIV. Hamuje namnażanie wirusa. Przedłuża
czas życia chorego i poprawia jego stan.

•

Izoprinozyna: działa przeciwwirusowo, hamując rozwój wirusów
DNA i RNA oraz wzmaga proliferację limfocytów i komórek NK.
Stosowana w leczeniu półpaśca, ospy wietrznej, grypy, odry i
wirusowego zapalenia mózgu. Wykazuje niewielkie działania uboczne,
np. zaburzenia żołądkowe.

23

3.

Cisplatyna: [Pt(NH3)2]Cl2 nieorganiczny kompleksowy związek platyny
o działaniu przeciwnowotworowym, cytotoksycznym, cytostatycznym i
immunopresyjnym.

Powoduje

wytworzenie

dodatkowych

wiązań

poprzecznych między nićmi DNA. Kumuluje się w tkankach, jej okres
półtrwania wynosi 8 do 10 dni. Objawem ubocznym jest neurotoksyczność.

4.

wpływ niektórych antybiotyków i leków bakteriobójczych na
kwasy nukleinowe.

•

Aktynomycyna D: antybiotyk przeciwnowotworowy wytwarzany
przez streptomyces antibioticus. Wiąże się silnie z DNA dwuniciowym
na drodze wklinowania pomiędzy pary

C-G., hamując replikację i transkrypcję. Jest wykorzystywana

w leczeniu guza Wilmsa, raka jądra i kosmówczaka.

•

Daunomycyna: blokuje matrycową aktywność DNA, prowadząc do
zahamowania replikacji i transkrypcji. Działa przeciwbakteryjnie i
przeciwnowotworowo.

•

Mitomycyna C: działa jak związek alkilujący. Wiąże się trwale z
helisą DNA, tworząc dodatkowe wiązania poprzeczne, przez co hamuje
replikację i transkrypcję. Stosowana u pacjentów z nowotworami
narządowymi, wysoce toksyczna.

•

Rifamycyny: grupa antybiotyków makrocyklicznych wytwarzanych
przez Streptomyces mediterranei. Inhibitory Polimerazy RNA w
komórkach bakteryjnych. Duże znaczenie z tej grupy ma rifampicyna,
wykazująca działanie immunopresyjne. Bardzo skuteczne w leczeniu
zakażeń bakteriami Gram(+)

•

Chinoliny:

inhibitory

topoizomerazy

II.

Hamują

replikację

i transkrypcję bakteryjnego DNA. Do pochodnych chinolonowych,
hamujących topoizomerazę, należą kwas pipemidowy, nalidyksowy i
oksolinowy.

Kwas

nalidyksowy

hamuje

proces

uzupełniania

nukleotydów po rozcięciu nici DNA. Bardzo skuteczne do leczenia
bakteryjnych zapaleń dróg moczowych.

•

Nitrofurany:

redukowane

w

komórkach

bakteryjnych

z

wytworzeniem wolnych rodników, które z kolei rozrywają nici
bakteryjnego DNA. Stosowane w zakażeniach dróg moczowych.

5.

niektóre antybiotyki i toksyny hamujące syntezę białka.

•

Streptomycyna: łączy się z podjednostką 30S rybosomów
bakteryjnych, co prowadzi do błędnego odczytu mRNA. Poza tym
hamuje

wiązanie

formylometionylo-tRNA

z

rybosomami,

co

24

uniemożliwia

inicjację

syntezy

białka.

Powstałe

białka

są

niefunkcjonalne, przez co bakterie giną. Kumuluje się w ślimaku ucha,
co prowadzi do jego uszkodzenia i głuchoty.

•

Tetracykliny: antybiotyki o szerokim zakresie działania. Wiążą się z
podjednostką 30S rybosomów bakteryjnych, hamując wiązanie się z
nią aminoacylo-tRNA, co blokuje syntezę białka.

•

Chloramfenikol: hamuje aktywność peptydylotransferazy, przez co
dochodzi do zablokowania syntezy peptydu, który pozostaje związany z
rybosomom. Hamuję syntezę białek u bakterii Gram (+) i (-),
riketsjach i niektórych wirusach. Jest bardzo toksyczny i obecnie
rzadko stosowany.

•

Erytromycyna: hamuje przesuwanie się aminoacylo-tRNA z miejsca
akceptorowego na peptydylowe na podjednostce 50S rybosomy
bakteryjnego, co powoduje zahamowanie syntezy białka.

•

Puromycyna: przypomina budową aminoacylo-tRNA. Wiąże się z
rybosomami w miejscu akceptorowym, kończąc przedwcześnie syntezę
łańcucha polipeptydowego w komórkach zarówno pro- jak i
eukariotycznych. Jest bardzo toksyczna, używana jedynie do
doświadczeń na zwierzętach.

•

Toksyna błonicy: wytwarzana przez maczugowca błonicy. Wiąże się
z błoną cytoplazmatyczną komórek chorego. Po wniknięciu do ich
wnętrza dzieli się na 2 fragmenty i ulega przemianom prowadzącym do
powstania dyftamidu; zmodyfikowanego czynnika elongacji eEF-2.
jego modyfikacja uniemożliwia syntezę białka. Wystarczy jedna
cząsteczka toksyny, by inaktywować cały dostępny w komórce eEF-2.

•

Alfa sarcyna: toksyna z grzybów. Rozbija dużą podjednostkę
rybosomów, doprowadzając do inaktywacji tego organellum.

•

Rycyna: N-glikozydaza pochodzenia roślinnego. Odrywa pojedyncze
adeniny od rRNA niszcząc rybosomy.

•

Alfa-amanityna: toksyna muchomora sromotnikowego. Tworzy
trwałe kompleksy z polimerazą RNA II i polimerazą RNA III komórek
eukariotycznych, hamując elongację mRNA. 5-6mg toksyny to dawka
smiertelna.

•

Penicylina: łączy się swoiście z enzymem bakteryjnym, hamując
syntezę peptydoglikanów. Skutkuje to powstawaniem bakterii
pozbawionych ściany komórkowej, łatwo ulegające cytolizie. Nie

25

wpływa na metabolizm człowieka, ale jej stosowanie grozi wstrząsem
anafilaktycznym.

26

Cytogenetyczne i bakteryjne testy monitorowania

skutków zanieczyszczeń środowiska.

1.

Test Amesa: wykorzystuje się do niego szczepy Salmonella typhimurium
pozbawione zdolności syntezy histydyny (his-). Wysiewa się je na pożywkę
zawierającą bardzo małe ilości histydyny oraz badaną substancję wraz z
frakcją S9 (ekstrakt z wątroby szczura, mający na celu aktywację
metaboliczną substancji). Bakterie rosną i namnażają się, dopóki pożywka
zawiera histydynę. Po jej zużyciu na pożywce zostają jedynie te kolonie, w
których

nastąpiła

mutacja,

przywracająca

zdolność

syntezy

aminokwasu(rewersja). Po 72godzinach od rozpoczęcia testu zlicza się
kolonie rewertantów, porównując liczbę rewertantów w próbie kontrolnej.
Jeśli wynik znacznie przewyższa wyniki z kontroli (minimum dwu-,
trzykrotnie), to substancję uznaje się za mutagen bezpośredni. Jest to test
wysoce skuteczny w wykrywaniu substancji rakotwórczych oraz testowania
związków, mających być użytymi jako leki.

2.

Test strukturalnych aberracji chromosomowych: w teście tym
wykorzystuje

się

właściwości

klastogenne

(zdolność

do

łamania

chromosomów)

badanych

mutagenów

fizycznych

i

chemicznych.

Uszkodzenia chromosomów można obserwować w stadium metafazy. Test
można przeprowadzać In vitro lub In vivo. W warunkach In vitro materiałem
mogą być limfocyty krwi obwodowej, fibroblasty, trofoblasty lub komórki
płynu owodniowego. Do przeprowadzeniu testu na limfocytach pobiera się
krew żylną i zakłada hodowle komórkowe. Limfocyty dodaje się do
odpowiedniego medium hodowlanego zawierającego badaną substancję w co
najmniej trzech stężeniach niższych od cytotoksycznego. Jeżeli komórki nie
mają możliwości aktywacji metabolicznej związku dodaje się frakcji S9. po
stymulacji limfocytów do podziału hodowlę utrzymuje się w 37 oC przez 48
godzin. Na ostatnie 2 godziny podaje się inhibitor wrzeciona podziałowego
(kolchicyna).

Następnym

etapem

jest

przeprowadzenie

szoku

hipotonicznego w 0.075 m KCl i utrwalanie komórek w mieszaninie
metanolu i kwasu octowego lodowego. Z uzyskanej zawiesiny sporządza się
preparaty mikroskopowe, które barwi się metodą Giemzy i poddaje analizie.
Do każdej dawki bada się co najmniej 100 metafaz, zapisują liczbę
chromosomów i rodzaj występujących aberracji. W warunkach In vivo tes
przeprowadza się na dojrzałych płciowo myszach. Podaje się dożołądkowo
lub dootrzewnowo badaną substancję w kilku dawkach z zakresu 20-60
DL

50

. grupa kontrolna otrzymuje rozpuszczalnik danej substancji. Związek

podaje się na 30, 18 lub 72 godziny. Na 2-3 godziny przed zakończeniem
myszy uśmierca się, z kości udowej wypreparowuje się szpik, który poddaje
się zabiegom analogicznym do próbek In vitro. Uzyskany materiał nanosi się
na szkiełka i barwi metodą Giemsy. Ocena polega na analizie mikroskopowej
dokonywanej przez dwie niezależne od siebie osoby. Za kryterium

27

mutagenności środka uznaje się znaczący procent aberracji w próbie
badawczej w porównaniu z kontrolną.

3.

Test wymiany chromatyd siostrzanych (SCE): znalazł zastosowanie w
ocenie In vitro oraz In vivo. Podstawą badania jest semikonserwatywna
replikacja DNA. Jeśli do środowiska doda się analog tyminy, 5-
bromodeoksyurydynę (BrdU) to następuje jej wbudowanie w miejsce
tyminy. Prowadzi to do różnego wybarwienia chromatyd po dwóch cyklach
komórkowych. Chromatydy zawierające BrdU barwią się słabiej niż
normalne. W wybarwionych w ten sposób chromosomach obserwujemy
przemieszczenia się odcinków homologicznych między chromosomami,
reprezentowanych przez różnie zabarwione odcinki jednej chromatydy, co
określa się nazwą wymiana chromatyd siostrzanych. Test wykonywać można
na

różnych

rodzajach

komórek.

Celem

określenia

własciowości

genotoksycznych związku wykonuje się test In vitro na limfocytach krwi
obwodowej i In vivo na myszach. Analiza polega na liczeniu punktów
pęknięć i przemieszczeń fragmentów chromatyd siostrzanych. Wyniki
zestawia się w tabelach. Badany związek który powoduje istotny wzrost
częstości SCE uznaje się za genotoksyczny.

4.

test mikrojądrowy: jest jedną ze standardowych metod wykrywania
narażenia na czynniki mutagenne. Z jego pomocą wykrywa się skutki
działania czynników chemicznych i fizycznych, powodujących złamania
chromosomów oraz uszkodzenia wrzeciona podziałowego. Na skutek
zaburzeń wrzeciona chromosomy nie przesuwają się do biegunów komórki,
lecz zostają w cytoplazmie tworząc mikrojądra, które powstawać mogą także
z odłamanych fragmentów chromosomów lub chromatyd nie posiadających
centromerów. Mikrojądra obserwuje się w komórkach interfazowych. Test
wykrywa działanie mutagenów bezpośrednich i wymagających systemu
aktywacyjnego (frakcja S9). Można go przeprowadzać In vitro i in vivo. In
vivo najczęściej wykorzystuje się erytrocyty polichromatyczne szpiku
kostnego lub śledziony dojrzałych myszy. Badaną substancję podaje się w
trzech dawkach dootrzewnowo lub dożołądkowo. Po określonym czasie
wykonuje się rozmazy komórkowe, które poddaje się barwieniu metodą
Giemsy i analizie mikroskopowej. Ocena preparatu polega na określeniu:

•

liczby erytrocytów polichromatycznych z mikrojądrami na 1000
badanych.

•

Liczby

erytrocytów

polichromatycznych

na

200

normochromatycznych.

Otrzymane wyniki poddaje się analizie statystycznej. Jeśli substancja
wywołuje

statystycznie

powtarzalny

znamienny

wzrost

częstości

występowania erytrocytów polichromatycznych z mikrojądrami, zostaje
uznana za genotoksyczną. W warunkach In vitro test wykonuje się na
limfocytach krwi obwodowej. Do hodowli dodaje się cytocholazynę B, która
zatrzymuje cytokinez, nie zakłócając podziału jądra. W efekcie otrzymuje się
komórki dwujądrzaste, a także wielojądrzaste. Analiza preparatu polega na

28

ocenie 500-1000 komórek dwujądrzastych z dobrze widoczną błoną
komórkową i zachowaną cytoplazmą pod kątem występowania mikrojąder,
barwiących się jak normalne jądro. Jeżeli substancja powoduje znaczny
wzrost ich występowania zostaje uznana za genotoksyczną.

29

Rola komórek macierzystych i inżynierii tkankowej w

regeneracji.

1.

Komórki macierzyste zdolne są do niemal nieograniczonej liczby
podziałów i posiadają możliwość różnicowanie się we wszystkie inne
komórki ustroju. Uzyskiwać można je między innymi z embrionów
wyhodowanych In vitro, drogą klonowania, z krwi pępowinowej, z tkanki
płodu. Ich zastosowanie niesie ogromne nadzieje w leczeniu chorób
degeneracyjnych czy produkcji sztucznych narządów. Po wyróżnicowaniu
tracą swoją pluripotencję, w związku z czym spada ryzyko nowotworzenia. W
ostatnich latach naukowcom udało się opracować obiecującą metodę
pobierania z embrionu w stadium moruli pojedynczych komórek, bez jego
uszkodzenia. Metoda ta daje obiecujące efekty w fazie doświadczeń na
ludzkich

embrionach,

choć

nadal

istnieją

obawy,

iż

zmniejsza

prawdopodobieństwo implantacji. Pobrane komórki umieszcza się w
hodowli, gdzie rozwijają się w linie komórek macierzystych. Nieznane na
razie są także długoterminowe efekty takiego działania dla zdrowia
człowieka. Wątpliwości budzi także strona moralna takich zabiegów, gdyż
pobrane komórki stać się mogą nowym życiem, na co pozwala im
totipotencjalny charakter. Inną możliwością jest klonowanie metodą
wymiany jądra, która eliminuje bariery zgodności tkankowej, nawet po
zastosowaniu komórek odzwierzęcych, co także budzi pewne wątpliwości
natury moralnej.

Bardzo ważnym dokonaniem w zakresie komórek macierzystych było
odkrycie ich obecności w układzie nerwowym dorosłego człowieka. Niesie to
niezwykłe możliwości regeneracyjne i jest obiektem intensywnych badań.
Obecność komórek macierzystych u człowieka dorosłego odkryto dopiero w
latach 60tych XX wieku, a ich wykorzystanie niesie z sobą ogromny
potencjał. Udowodniono, że komórki hemopoetyczne mogą różnicować się
we wszystkie 3 listki zarodkowe i dawać początek neuronom,
kardiomiocytom i hepatocytom, co stawia je na poziomie komórek
embrionalnych, nie stwarzając przy tym pola do wątpliwości moralno-
etycznych. Źródłem komórek macierzystych jest także krew pępowinowa, a
ich izolowanie jest obecnie powszechnym zabiegiem. Problemy nadal
sprawia ich izolacja z krwi i namnażanie In vitro.

2.

Typy i źródła pozyskiwania komórek macierzystych.

•

Komórki embrionalna: komórki wewnętrznej masy blastocysty

•

Płodowe: łożyskowe, płynu owodniowego, krwi pępowinowej,
tkankowo specyficzne.

•

Dorosłe: szpiku kostnego, tkanki tłuszczowej, tkankowo specyficzne

3.

Przykłady zastosowań inżynierii tkankowej w regeneracji.

30

•

Inżynieria tkankowa w ortopedii: choroby chrząstki stawowej
(chondropatie) są poważnym problemem milionów ludzi. Chrząstka
stawowa nie posiada zdolności regeneracyjnych, a jej uszkodzenia
prowadzą

do

degeneracji

stawu.

Tradycyjne

metody

leczenia(artroskopia,

nawiercanie,

przeszczepianie

autogennej

chrząstki) nie są wystarczające. Duże nadzieje wiąże się z implantacją
autologicznych chondrocytów (ACI) hodowanych In vitro. Technika ta
polega na wyizolowaniu z próbki tkanki chrzęstnej komórek i ich
hodowli

w

warunkach

laboratoryjnych.

Usuwanie

macierzy

pozakomórkowej następuję poprzez jej trawienie enzymatyczne. W
hodowli komórkowej chondrocyty ulegają odróżnicowaniu i wykazują
cechy komórek fibroblastopodobnych. Celem przywrócenia im
odpowiednich właściwości stosuje się nośniki z biomateriałów.
Komórki te mają szerokie zastosowanie m.in. w regeneracji chrząstki
rzepki, a także osteoporozy, zapalenia kości i stawów czy reumatyzmu.
Dalsze badania dotyczą technik leczenia uszkodzeń chrząstki przy
pomocy komórek macierzystych szpiku.

•

Inżynieria tkankowa w chirurgii plastycznej opiera się na
możliwościach

stworzonych

przez

zastosowanie

komórek

tłuszczowych. Tkanka tłuszczowa jest niezbędna przy zabiegach
rekonstrukcyjnych i korekcyjnych twarzy i reszty ciała. Dużym
problemem jest utrata tkanek wskutek defektów wrodzonych, urazów
lub po resekcji nowotworów. Na tym polu stosowane dotychczas
techniki przeszczepu tłuszczu, implantów silikonowych czy produktów
na bazie kwasu hialuronowego nie przyniosły zadowalających efektów.
Obiecujące jest połączenie komórek tłuszczowych lub macierzystych
(np.

mezenchymalnych)

z

biodegradowalnymi

polimerowymi

skafoldami (rusztowaniami). Wytworzone tą drogą substytuty tkanki
tłuszczowej są bardzo zbliżone do naturalnych. W chirurgii głowy i szyi
dużym problemem jest utrata chrząstki i kości. Przyszłością jest
stworzenie In vitro autologicznej chrząstki lub elementu kostnego
metodami inżynierii tkankowej. Autologiczna chrząstka staje się
standardem w rekonstrukcji nosa i uszu. Chondrocyty namnaża się z
fragmentów pobranych z chrząstki ucha, żebrowej lub przegrody nosa.
Metoda ta wymaga jednak interwencji chirurgicznej i grozi zakażeniem
ogólnoustrojowym. Dotychczas stworzono tą droga implanty ucha,
tchawicy, stawu szczękowego i przegrody nosa. Niezwykle pożądanym
celem staje się także odkrycie metody hodowli tkanki kostnej, gdyż
pobieranie dużych ich fragmentów z innych części ciała wiąże się z
bólem i poważnymi komplikacjami.

•

Inżynieria tkankowa w transplantologii. Co roku tysiące ludzi
umiera czekając na transplantację nerek, serca, płuc czy wątroby.
Uszkodzenia tkanek i narządów najczęściej leczy się farmakologicznie,

31

chirurgicznie, poprzez transplantację organów lub wszczepienie
biomateriałów. Coraz większą nadzieję wiąże się w ostatnich latach z
inżynierią tkankową. Komórki pobrane do rekonstrukcji mogą być
autologiczne (dawca i biorca to ten sam organizm), allogeniczne
(dawca i biorca należą do jednego gatunku) lub ksenogeniczne (dawca
i biorca z różnych gatunków). W celu wytworzenia nowych tkanek
poprzez namnażanie komórki łączy się z matrycami naturalnymi lub
syntetycznymi i umieszcza w bioreaktorach. Sztuczny zrąb z
komórkami przeszczepia się do uszkodzonego miejsca, gdzie komórki
namnażają się i grupują, tworząc nową tkankę. Polimer ulega w
międzyczasie stopniowej degradacji. Wielkie nadzieje wiąże się z
różnicowaniem i namnażaniem komórek macierzystych. Dotychczas
nie wyhodowano w całości funkcjonalnego narządu, poza pęcherzem
moczowym.

•

Inżynieria tkankowa w dermatologii. Metodami inżynierii
tkankowej wyprodukowano substytuty skóry, pomocne m.in. w
leczeniu żylnych owrzodzeń stóp, poparzeń oraz ran pooperacyjnych.
Produkt powinien stanowić barierę chroniącą przed infekcjami i utratą
wody. Dostępnych jest wiele żywych i sztucznych substytutów skóry.
Do żywych zaliczamy auto- i allogeniczne substytutu złożone z
fibroblastów i keratynocytów, czy też dwuwarstwowe konstrukty skóry,
złożone zarówno z epidermy, jak i żeli kolagenowych zasiedlonych
fibroblastami. Zaletą żywych substytutów jest ich zdolność do
wydzielania cytokin, chemokin i czynników wzrostu, niezbędnych
podczas gojenia. Jeżeli duża część ciała chorego uległa uszkodzeniu
tkanki nie da się wytworzyć z jego własnych komórek. Wówczas stosuje
się substytuty sztuczne, jak integraf, złożona z kolagenu, siarczanu
chondroityny i silikonu, zapobiegającego wysychaniu. Produkt ten
pokrywa ranę, przyczynia się do angiogenezy, przygotowując skórę do
przeszczepu wyhodowanego In vitro naskórka. implanty tworzy się
poprzez pobranie fragmentu skóry, hodowanego następnie przez 2-
3tygodnie w laboratorium, aż do uzyskania wystarczającego fragmentu
do przeszczepu. Pozwala to na trwałe pokrycie rany bez ryzyka odrzutu
i odtworzenia skóry właściwej. Efekt kosmetyczny także jest
zadowalający. Inżynieria tkankowa ma znaczenie także w leczeniu
bielactwa nabytego drogą przeszczepu melanocytów. Coraz częściej
udaje się uzyskać z komórek skóry, a także mieszków włosowych,
somatycznych komórek macierzystych.

4.

Typy regeneracji fizjologicznej

Regeneracja fizjologiczna dotyczy naturalnej odnowy tkanek nie wynikającej z
doznanych obrażeń. Dzieli się na trzy rodzaje:

•

Regeneracja stała: włosy, paznokcie, plemniki, gruczoły łojowe,
krwinki

32

•

Regeneracja cykliczna: śluzówka macicy, gruczoły mleczne

•

Jednorazowa: wymiana uzębienia mlecznego na stałe

5.

Typy regeneracji pourazowej

•

Regeneracja przerostowa: dotyczy uszkodzonych narządów
wewnętrznych ssaków. W przypadku urazu i utraty części narządu,
wszystkie jego komórki zaczynają powiększać się i wykazywać
wzmożoną aktywność mitotyczną, zachodzi więc hipertrofia
(przerost) oraz hiperplazja. Nazwa tego typu odnowy wynika z
faktu, iż proces ten jest bardzo podobny do kompensacji, tj.
przerostu nieuszkodzonego narządu parzystego po usunięciu drugiego
narządu z pary. Proces ten jest podstawą chirurgicznego leczenia
złamań kości i gojenia ran pooperacyjnych. Usunięcie pewnej części
wątroby szczura powoduje jej wzrost, który ustaje po osiągnięciu
pierwotnych rozmiarów, co dowodzi istnienia pewnych czynników
kontrolujących regenerację.

•

Metaplazja: jest to możliwość przejścia zróżnicowanej komórki w
inną, należącą do tej samej tkanki. Przykładem jest przemiana
nabłonka walcowatego w odporniejszy wielowarstwowy wskutek
ucisku kamieni żółciowych na ściany woreczka. Zjawiska tego nie
obserwuje się w obrębie tkanki mięśniowej.

•

Epimorfoza: polega na odtworzeniu brakujących części ciała w
wyniku mnożenia się komórek i wzrostu nowej tkanki.

•

Morfalaksja: polega na rekonstrukcji części ciała poprzez zmianę
specyfikacji pozostałej tkanki, przykładem jest regeneracja kończyny u
płazów.

6.

Regeneracja kończyny u płazów

U płazów ogoniastych występuje niespotykana wśród kręgowców zdolność
do regeneracji kończyny. Odcięta w regionie zonoszkieletu kończyna
regeneruje się w 2-3 miesiące.
Etapy regeneracji:

•

Proliferacja

komórek

entodermalnych

w

rejonie

amputacji,

nakrywająca ranę grubą czapeczkę ektodermalną (AEC).

•

AEC indukuje leżące pod nią komórki do utworzenia zespołu komórek
mezenchymatycznych (blastemy regeneracyjnej), która pochodzi ze
wszystkich

typów

komórek

mezodermalnych,

uległych

odróżnicowaniu.

•

Komórki blastemy odtwarzają kończynę.

Duże znaczenie w regeneracji ma unerwienie kończyny. Wykazano, że
usunięcie nerwów kończyny przed rozpoczęciem regeneracji uniemożliwia
regenerację, a ich usunięcie po zainicjowaniu procesu prowadzi do jego

33

spowolnienia. Na uwagę zasługuje fakt, iż kończyny gadów są najbardziej
unerwione spośród wszystkich kręgowców. Regeneracja zawsze postępuje w
kierunku dystalnym, niezależnie od miejsca przecięcia.

Molekularne podstawy specyfikacji regionalnej

W blastemie specyfikacja regionalna może obejmować działanie kwasu
retinowego i ekspresję genu HoxA. Naskórek rany jest bogatym źródłem
kwasu retinowego, który może tworzyć gradient w blastemie krótko po jej
powstaniu. Dowodem na działanie kwasu retinowego jest fakt, że po
wprowadzeniu dużych jego ilości do regenerującej na poziomie nadgarstka
kończyny, prócz nadgarstka powstanie cała kończyna.

Organizm płaza nie tylko potrafi odtwarzać utracone części dystalne, ale
także utracone elementy pośrednie kończyn, co nazywamy regeneracją
interkalarną.

Komórki płazów wyposażone są w informacje pozycyjne w formie
współrzędnych biegunowych na trójwymiarowej mapie. Pozwala to na
zachowanie orientacji proksymalno- dystalnej przy odtwarzaniu elementów
kończyn.

34

Metody stosowane w biologii molekularnej

1.

Izolacja DNA: polega na oddzieleniu DNA od innych struktur
komórkowych, a także cząsteczek RNA i białek związanych z DNA. W
zależności od rodzaju materiału, z którego izoluje się materiał genetyczny, i
jego przeznaczenia stosuje się różne metody izolacji. Materiałem
biologicznym może być

•

krew obwodowa

•

plemniki (nasienie)

•

wymazy komórkowe

•

mocz

•

mleko

•

plwocina

•

wycinki tkanek

•

płyn mózgowo rdzeniowy

•

hodowle bakteryjne i tkankowe

metody izolacji DNA dzielimy na dwie główne grupy

•

izolacja klasyczna z użyciem fenolu i chloroformu

•

stosowanie gotowych zestawów do szybkiej i uproszczonej izolacji DNA

Każda procedura izolacji DNA powinna się zakończyć ocenją jego ilości i
jakości przy pomocy pomiaru spektrofotometrycznego przy długości fali
260-280nm. Zawartość wyizolowanego DNA w roztworze podaje się w
µg/ml. Wyliczana jest ona ze wzoru

Z=A

260

x 50 x R

Gdzie:
50- stały współczynnik
R- rozcieńczenie
Czystość izolowanego DNA podawana jest w % wyliczanego ze stosunku
absorbancji 260/280nm (1,8 = 100% czystości DNA).
Izolowany DNA przechowuje się do miesiąca w temp. 4-8

o

C lub zamrożony

w -20

o

C do usranej śmierci.

2.

metoda PCR: polega na powieleniu In vitro fragmentu genomowego DNA
wielkości od kilkudziesięciu do kilkudziesięciu tysięcy par zasad. Początkowo
w procesie wykorzystywano termolabilną polimerazę od E. Coli, ale
wymagało to dodawania kolejnej jej porcji po każdej denaturacji. Przełomem
w tej technice było wprowadzenie termostabilnej Polimerazy Taq
pochodzącej od bakterii termofilnych. Reakcję przeprowadza się w
sterowanym elektronicznie bloku grzejnym (termocykler), a produkty ocenia
za pomocą elektroforezy. Reakcja następuje w trzech etapach:

•

denaturacja dwuniciowego DNA przeprowadzana przez ogrzanie
do 90-95

o

C na 0.5- 2 min.

35

•

przyłączanie starterów; oligonukleotydów hybrydyzujących z
3’końcem każdej nici w temp 50-60

o

C w ciągu 30-60 s.

•

polimeryzacja DNA przeprowadzana w 72

o

C

pod koniec pierwszego cyklu otrzymujemy dwie kopie DNA z regionem,
który chcieliśmy zwielokrotnić. Nastepnie proces się powtarza. Liczba kopii
DNA rośnie wykładniczo. Zwykle przeprowadza się 20 do 40 cykli. Metoda ta
pozwala na uzyskanie dużej ilości DNA nawet z bardzo małej próbki (1 µg) co
ma istotne znaczenie na przykład w kryminalistyce (starczy jeden włos
z cebulką). Technikę PCR stosuje się do wykrywania nosicielstwa
zmutowanego genu w rodzinach obciążonych ryzykiem np. mukowiscydoza
czy fenyloketonuria, badań na embrionie w zapłodnieniu In vitro,
antropologii i diagnostyce chorób zakaźnych.
Innym rodzajem metody jest PCR „multipleks”, w której stosuje się kilka
starterow dla różnych genów. Natomiast w reakcji odwrotnej trankryptazy-
PCR (RT-PCR) proces poprzedzony jest przepisaniem informacji z mRNA na
komplementarny cDNA w obecności startera, najczęściej uniwersalnego
oligo dT. Produkty PCR są najczęściej badane pod kątem mutacji drogą
sekwencjonowania lub metodami pośrednimi (SSCP)

3.

SSCP: metoda, wykorzystująca unikalną właściwość kwasów nukleinowych,
polegającą na tworzeniu przez pojedyncze nici DNA konformerów, których
kształt zależy od sekwencji DNA. zmiany struktury DNA takie jak mutacjie
punktowe powodują zmianę konformacji pojedynczej nici DNA, co wykrywa
się przy pomocy elektroforezy.

4.

RFLP jest to polimorfizm fragmentów DNA powstających wskutek działania
endonukleaz restrykcyjnych na nić DNA. Może on być następstwem
tranzycji, transwersji, insercji lub delecji, prowadzących do zaniku miejsca
rozpoznawanego przez enzymy restrykcyjne. Metoda ta pozwala ma
mapowanie genów. Dzięki analizie polimorfizmu odkryto między innymi
lokalizację na chromosomei X genu odpowiedzialnego za dystrofię mięśni
Duchenne’a.

5.

Fingerprint:

polega

na

badaniu

polimorfizmu

sekwencji

mikrosatelitarnych (STRP) i minisatelitarnych (VNTR). Zmienność
sekwencji VNTR polega na różnej liczbie powtórzeń motywu w danym locus.
Analiza kilku loci danego osobnika daje charakterystyczny dla niego wzór
fragmentów DNA (profil), tzw. Genetyczny odcisk palca. Obraz ten jest
unikatowy niczym linie papilarne. Im bliżej dwie osoby są spokrewnione tym
bardziej podobny jest ich profil DNA. Badania profili DNA obejmują
najczęściej analizę markerów minisatelitarnych, nie tylko pod kątem liczby
kopii, ale także nieznaczne różnice sekwencji nukleotydów. Sekwencje są
wykrywane najczęściej metodą Southerna po uprzednim namnożeniu
materiału metodą PCR. Metodę tą szeroko stosuje się w kryminalistyce, a
także w badanu pokrewieństwa i ustalaniu ojcostwa.

36

6.

Metoda Southerna: opisana po raz pierwszy w 1975r. . pozwala
identyfikować fragmenty restrykcyjne przy użyciu elektroforezy żelowej i
sond molekularnych. Mieszaninę fragmentów restrykcyjnych rozdziela się na
żelu agarozowym, denaturuje celem podzielenia na fragmenty jednoniciowe i
przenosi na filtr nitrocelulozowy. Jednoniciowy DNA poddaje się
hybrydyzacji ze specyficzną sondą DNA lub RNA, znakowaną radioizotopem
(

32

P). metodą autoradiograficzną można wykryć fragmenty DNA

komplementarne do znakowanej sondy. Podobnie identyfikować można
cząsteczki RNA lub białka poprzez badanie wiązanai znakowanych
przeciwciał przeciw poszukiwanym grupom antygenów.

7.

Sekwencjonowanie DNA: metoda polegająca na ustaleniu rodzaju i
kolejności nukleotydów w DNA, która przeprowadza się przy użyciu
specjalnych aparatów. stosuje się następujące metody sekwencjonowania:
Maxama, Gilberta i enzymatyczną Sangera. Metody Maxima i Gilberta
polegają na przeprowadzeniu 4 reakcji chemicznych w odrębnych
mieszaninach, w wynikó których cząsteczka DNA przecinana jest w miejscu
występowania jednej z 4 zasad, zależnie od użytego odczynnika. produkty
tych reakcji, różniące się długością, są następnie rozdzielane przez
elektroforezę na żelu. Obecnie częściej stosuje się metodę Sangera. Polega
ona na enzymatycznym wydłużaniu nowych łańcuchów na matrycy
badanego DNA. Począwszy od wyznakowanego radioizotopowo startera.
Reakcję przeprowadza się w czterech odrębnych mieszaninach zawierających
niezbędne substraty. Reakcję zatrzymuje się po pewnym czasie przez
dodanie pochodnej odpowiedniego dideoksyrybonukleotydu w małym
stężeniu. Dideoksy-NTP terminuje wydłużanie łańcucha w miejscu
włączenia, gdyż brak grupy OH przy 3’węglu uniemożliwie utworzenie
kolejnego wiązania. Powstaje mieszanina fragmentów DNA różnej długości,
które można analizować drogą elektroforezy i autoradiograficznie.
Elektroforeza porządkuje elementy według wielkości. Rezultatem metod jest
seria prążków w żelu, z których można bezpośrednio odczytać sekwencje
DNA.

8.

Metoda ASO: wykorzystuje się w niej dwa różne oligonukleotydu, jeden
komplementarny do sekwencji prawidłowego genu, drugi komplementarny
do zmutowanego. W odpowiednich warunkach sondy ASO hybrydyzują tylko
z komplementarną sekwencją DNA. Wykorzystuje się ją do badań
przesiewowych anemii sierpowatej. W badaniach wykorzystuje się krwinki
białe; poddaje się je ogrzaniu aż do denaturacji DNA, następnie namnaża
region β-globiny przy pomocy PCR. Namnożony DNA nanosi się na filtry
połączone z odpowiednimi oligonukleotydami. Po uwidocznieniu prązków
genotyp odczytać można bezpośrednio z filtrów, gdyż tam, gdzie nastąpi
hybrydyzacja oligonukleotydu pojawi się zaciemnienie filtra.

37

Regulacja ekspresji genów u eucaryota

W komórce eukariotycznej aktywnych jest jedynie 15% genów, reszta pozostaje

dezaktywowana. Wybór genów podlegających ekspresji jest wieloetapowy.
Regulacja odbywa się już na poziomie modyfikacji upakowania chromatyny, a
kończy na regulacji posttranslacyjnej.

1.

Regulacja na poziomie matrycy DNA
DNA może istnieć w trzech formach

••••

Forma I; superzwinięta. Naprężenia nici wywołane dodatkowymi
obrotami powodują, że przybiera ona kształt warkocza

••••

Forma II; odpowiada rozluźnionej postaci DNA, który przybiera kształt
kolisty.

••••

Forma III;

liniowa postać DNA.

Podstawową formą przestrzenną DNA jest forma I, umożliwiająca najlepszy

dostęp do helisy różnym białkom. Interakcja DNA-białko jest podstawą
regulacji ekspresji. Zmiana stopnia skręcenia zmienia możliwości dostępu
białek do DNA, stanowiąc tym samym czynnik regulujący ekspresję.

Mutacje w genach topoizomeraz (enzymy usuwające lub tworzące

superzwoje) zmniejszające ich aktywność, prowadzą do zmniejszenia
transkrypcji wielu genów.

Obszar DNA otaczający gen lub grupę genów ulegających ekspresji nazwano

domeną funkcjonalną. Domenę taką można znaleźć poprzez trawienie
fragmentów chromatyny DNA-zą I, która wyszukuje „wyeksponowanych”
odcinków DNA, do których ma uprzywilejowany dostęp.

Miejsca wrażliwe na DNA-zę I: odpowiadają one genom aktywnym, także

tym, które były aktywne w przeszłości (np. kodujące białka płodowe). Dowodzi
to, że geny te znajdują się w konformacji ułatwiającej DNA-zie I dostęp.
Dostępność ta odnosić się będzie prawdopodobnie także do innych białek takich
jak polimeraza RNA. Specyficzna struktura przestrzenna jest najwyższym
poziomem egulacji ekspresji, na którym odbywa się selekcja genów, które mają
być transkrybowane.

Miejsca nadwrażliwe na DNA-zę I: niektóre miejsca genomu są jeszcze

bardziej wrażliwe na enzym. W miejscach tych nie ma nukleosomów, tak więc
białka wiążące mają tu najłatwiejszy dostęp do DNA. Geny te w kontakcie z
DNA-zą nie są niszczone. Wykonuje ona tylko kilka precyzyjnych cięć, które
mogą zostać ponownie połączone. Pełni więc ona rolę restryktazy. Miejsca
nadwrażliwe najczęściej zlokalizowane są w promotorach genów aktywnych.

38

2.

Regulacja ekspresji na drodze metylacji

Metylacja DNA polega na enzymatycznym przyłączeniu grup metylowych do

nukleotydów. U eucaryota dotyczy ona wyłącznie cytozyn wchodzących w skład
nukleotydu CpG. Metylacja wiąże się ze spadkiem aktywności transkrypcyjnej
genów. Jest ona procesem odwracalnym. Obecnie wiadomo że proces ten
odgrywa zajebiście dużą rolę w różnicowaniu się komórek.

3.

Regulacja na poziomie transkrypcji

Białka regulatorowe; zwane inaczej czynnikami transkrypcyjnymi. Są to

białka oddziałujące z polimerazą RNA (np. TF II D, TF II B). są one zdolne
przyłączać się do specyficznych sekwencji DNA, mogąc regulować poziom
transkrypcji. Niektóre występują tylko w określonych typach komórek, Inne we
wszystkich. Są one kodowane przez geny regulatorowe, stanowiące 5-10%
genomu człowieka. Mają one budowę modularną i składają się z pełniących
określone funkcje domen białkowych. Powszechnie występują 3 typy domen:
(1)domeny wiążące DNA (2)domeny odpowiedzialne za dimeryzację (3)domeny
transaktywujące. Domeny wiążące DNA i odpowiedzialne za dimeryzację
zawierają

charakterystyczne

struktury

białkowe,

zwane

motywami.

Scharakteryzowano trzy typy domen wiążących:

Helisa-zwrot-helisa (HTH): białko HTH posiada dwa krótkie fragmenty

tworzące helisę, rozdzielone odcinkiem tworzącym zwrot. Jedna z dwóch helis
(rozpoznawcza) lokalizuje w cz. DNA specyficzne zasady i łączy się z nimi
słabymi wiązaniami. Połączenie helisa rozpoznawcza-DNA zależy od
pozostałych części białka. W momencie związania obie cząsteczki ulegają
zmianom konformacji.

Palce cynkowe: motyw ten zawiera atom cynku otoczony 4 aminokwasami.

Istnieją dwie formy „palców”: Cys

2

His

2

oraz Cys

4

. motyw ten jest wielokrotnie

powtórzony w domenie wiążącej DNA. Oddziaływanie zachodzi między
aminokwasy zasadowe a dużym rowkiem helisy DNA. Przykładem
występowania tego motywu jest czynnik transkrypcyjny Sp1 powszechnie
występujący u eucaryota. Palce cynkowe występują w czynnikach, będących
receptorami hormonów steroidowych. Białka GATA, istotne w rozwoju linii
erytrocytalnej (GATA-1) i innych w układzie krwiotwórczym.

Domena zasadowa zawiera motywy: helisa-pętla-helisa oraz suwak

leu-cynowy.

Suwak leucynowy: jego charakterystyczną cechą jest występowanie leucyny

w co siódmej pozycji w obrębie 35 reszt aminokwasowych. Białka suwaka
tworzą dimer złożony z dwóch skręconych łańcuchów. Leucyny, które znajdują
się wewnątrz superhelisy, stabilizują ich strukturę. W pobliżu N- końca
dimerów znajduje się 30- aminokwasowa domena wiązania DNA.

Helisa-pętla-helisa: składa się z dwóch hydrofobowych helis, oddzielonych

pętlą. W skład pętli wchodzi 12-28 aminokwasów. Przypuszczalnie helisy biorą
udział w tworzeniu heterodimerów białkowych, a pętla oddziałuje z DNA.

Regulacja ekspresji w pozycji cis i trans: wydajność transkrypcji może

być kontrolowana przez sekwencje DNA, zwane wzmacniającymi (enchancer),
które mogą się znajdować w odległości tysięcy pz od wzmacnianego genu. Mają

39

one z reguły długość 100-200 pz i są w stanie wiązać czynniki transkrypcyjne.
Niektóre miejsca wiążą czynniki zmniejszające wydajność transkrypcji
(silencer). Sekwencje wzmacniające posiadają szereg wspólnych właściwości

••••

Wzmacniają znacznie poziom transkrypcji danego genu.

••••

Ich inwersja nie zmienia właściwości, a jedynie lekko je osłabia (tj.
można sobie je obracać na wszystkie strony świata a Itak działają)

••••

Utrzymują swe właściwości nawet przemieszczone o kilka tys. Pz,
ale do pewnego punktu, kiedy je tracą.

••••

Mogą modyfikować strukturę przestrzenną DNA i stopień
spiralizacji.

4.

Regulacja postranskrypcyjna

Wycinanie intronów- system alternatywny. Wycinanie poszczególnych

intronów jest od siebie niezależne. Może także dochodzić do usuwania
niektórych eksonów, przez co powstają białka zupełnie odmienne. Przykładem
na to jest synteza kalcytoniny w tarczycy. Produkt tego samego, co kalcytonina
genu, wytwarzany w mózgu i dojrzewający w sposób odmienny staje się
neurotransmitterem.

Redagowanie RNA. Dotyczy między innymi syntezy apolipoproteiny Apo-

B100 w wątrobie i Apo-B48 w jelicie cienkim (co to takiego ta apolipoproteina
dowiecie się na biochemii i pewnie pożałujecie swojej ciekawości). Obie
apolipoproteiny różnią się masą. Sekwencja ich RNA jest identyczna, gdyż są
kodowane przez jeden gen, ale w Apo-B48 w przepisanym mRNA następuje
zastąpienie cytozyny uracylem w pozycji 2153, co powoduje pojawienie się
kodonu STOP i wcześniejszy koniec translacji.

Regulacja przez zmianę stabilności mRNA. Stabilność mRNA określa

się używając terminu „czas półtrwania”. U bakterii wynosi on 2 minuty, a w
kom. zwierzęcych 4-24h. przykładem takiej regulacji są onkogeny c-myci c-fos,
kodujące białka, które wzmacniają ekspresję niektórych genów regulujących
przebieg cyklu komórkowego. Stabilizacja mRNA tych onkogenów powoduje
wzrost stężenia kodowanych przez nie białek, co prowadzi do wzmożonej
proliferacji. Za niestabilność prawidłowego mRNA c-mych odpowiedzialny jest
region 51 nukleotydów, głównie AT, znajdujący się w części 3’ mRNA. Delecja
tego regionu powoduje znaczne wydłużenie czasu półtrwania, czyniąc go
jebanym onkogenem.

Regulacja przez magazynowanie mRNA. Ma ono bardzo istotny wpływ

na kontrolowanie ekspresji. mRNA wielu genów zostaje zaraz po przepisaniu
zmagazynowany w jądrze lub cytozolu i nigdy nie pojawia się jakikolwiek
produkt ich translacji. W trakcie działania sygnałów takich jak hormony zmiana
stężeń białek i mRNA jest bardzo szybka, podczas gdy transkrypcja ulega tylko
nieznacznemu przyspieszeniu. W takich właśnie przypadkach uwolnione
zostają te zmagazynowane rezerwy mRNA. Dobrym przykładem tego zjawiska
jest składowanie mRNA w komórce jajowej, które nie ulega translacji. Dopiero
po pewnej liczbie podziałów zostaje użyte do produkcji białek indukujących
różnicowanie komórek. Rozmieszczenie tego mRNA w komórce jajowej nie jest
jednolite, co sprawia, że różne komórki potomne dziedziczą różną jego ilość.

40

5.

Regulacja na poziomie translacji

Jest to etap o którym na dzień dzisiejszy gówno wiemy. Prawdopodobnie

mechanizmy kierujące tą regulacją odgrywają rolę w magazynowaniu mRNA
opisanym powyżej. Przykładem na to jest regulacja ekspresji genów globiny
przez hem. Jeżeli nie dotrze on do środowiska, bądź zostanie wyczerpany, to
translacja genów globin bardzo szybko się zatrzymuje. Hem działa za
pośrednictwem białka posiadającego aktywność kinazową wobec czynnika
inicjacji eIF-2. elementem regulacyjnym może być także obróbka nowo
powstałych białek, do której należą: glikozylacja, fosforylacja, acetylacja.

6.

Regulacja pod wpływem temperatury- białka HSP

Komórki eukariotyczne reagują na nieznacznie podwyższoną temperaturę

wzmożoną syntezą polipeptydów zwanych białkami szoku cieplnego. Do ich
syntezy może dochodzić także w przypadku infekcji wirusowej, etanolu lub
innych stresorów. Wiele z HSP pełni funkcje białek opiekuńczych inne są
protezami. Występujący w komórkach zwierząt czynnik HSF, który wiązać się
może z sekwencją DNA zwaną HSE, zlokalizowanej 80-200 pz od początku
transkrypcji mRNA indukując odpowiedź szoku termicznego. Aktywacja genów
szoku cieplnego jest jedną z form odpowiedzi na stres. Aktywność jądra
komórkowego należy do najbardziej wrażliwych na stres. Synteza DNA ulega
spowolnieniu, kumulują się prekursory rRNA i zahamowane zostaje usuwanie
intronów. Nawet krótki szok cieplny wywołuje zmiany w funkcjonowaniu jądra.

7.

Białka Chaperonowe

Są one powoli działającymi ATP-azami. Uczestniczą w ATP- zależnym procesie

zwijania polipeptydów oraz tworzeniu kompleksów białkowych. Biorą one
udział w formowaniu oktamerów pistonowych, przenoszenia białek przez błony
mitochondrialna i nadawania im właściwej konformacji wewnątrz organelli.
Blokują one niepożądane reakcje między cząsteczkami i utrzymują w całości
rosnący łańcuch. Kompleks ADP-chaperon ma duże powinowactwo do
niesfałdowanych, nie wykazując go wcale wobec białek natywnych. Związanie
chaperonu z polipeptydem powoduje odłączenie od niego ADP i przyłączenie
ATP. Powstały kompleks formuje kawałek polipeptydu, zużywając energię z
ATP i znowu jako ADP-chaperon przyłącza się do kolejnego niepofałdowanego
segmentu.

41

8.

Regulacja przez hormony steroidowe

Hormony steroidowe odgrywają zajebiście dużą rolę w regulacji ekspresji,

wpływając między innymi na wzrost i różnicowanie się komórek. Sygnał
hormonalny (ligand) jest przekazywany do genu docelowego przez receptory
wewnątrzkomórkowe.

Wiązanie

liganda

uruchamia

interakcję

z

charakterystyczną regulatorową sekwencją DNA w genie docelowym (HRE-
element odpowiedzi hormonalnej). Receptor związany z ligandem ułatwia
tworzenie się kompleksu z innymi czynnikami transkrypcyjnymi i stymuluje
transkrypcję. Wszystkie receptory hormonów steroidowych posiadają
identyczną strukturę ogólną składającą się z:

••••

końca NH

2

- terminalnego specyficznego dla receptora

••••

regionu ok. 65 aminokwasów (domena C), który jest bardzo
konserwatywny. W domenie C występują dwa motywy palców
cynkowych.

••••

Regionu niekonserwatywnego o zmiennej długości.

••••

Zakończenia domeną o różnej długości, wiążącą hormon.

Ze względu na strukturę i funkcję receptory hormonów można podzielić na

dwie grupy; (1)zawierająca receptory glikokortykoidów, progesteronu,
androgenów i mineralokortykoidów (2)zawierającą receptory estrogenów,
hormonu tarczycy, kwasu retinowego i witaminy D

3

.

Element odpowiedzi hormonalnej (HRE). Są to specyficzne sekwencje

DNA, do których wiążą się aktywowane receptory hormonów steroidowych.
Regulują one ekspresję sąsiadujących genów. Badania nad HRE pozwoliły
odkryć palindromowi sekwencje 15 par zasad, mogących znajdować się w
odległości 100- kilka tys. Pz od miejsca startu transkrypcji. HRE dzieli się na 4
klasy:

•

GRE- element odpowiedzi glikokortykoidów

•

ERE- element odpowiedzi estradiolu

•

TRE- element odpowiedzi hormonu tarczycy

•

DRE- wiąże receptory sieroce (takie, których funkcji ani ligandów nie
znamy)

Ligandy aktywują geny poprzez wywoływanie niewielkich zmian w kinetyce

receptorów i jego powinowactwie do HRE, co ułatwia dostęp czynnikom
transkrypcyjnym i polimerazie. Podczas nieobecności liganda większość
receptorów zlokalizowanych jest w cytoplazmie, a kompleks receptor-hormon
migruje do jądra komórkowego aby modulować ekspresję genów. Niektóre
receptory występują w jądrze niezależnie od obecności liganda.

Białko G jest heterotrimerem ulokowanym w błonach komórkowych, który

tłumaczy i wzmacnia sygnały przekazywane do wnętrze komórki, powodując
zmianę aktywności enzymów komórkowych. Posiada ono strukturę IV rzędową
i trzy podjednostki, które wiążą i hydrolizują GTP. Białka G stają się aktywne w
interakcji z kompleksem receptor-hormon w obecności Mg

2+

i GTP. W

momencie aktywacji białka G jego podjednostki dysocjują, a podjednostka alfa
aktywuję cyklazę adenylową. Powoduje to pośrednio syntezę cAMP, biorącego
udział w wielu szlakach metabolicznych.

42

Epigenetyka

Epigenetyka to zmiany funkcji lub ekspresji genów bez zmian w kodzie
genetycznym, ale z modyfikacjami struktury chromatyny.

Rodzaje epigenetycznej modyfikacji genów:

•

Metylacja

•

Imprinting

•

Modyfikacja histonów zasadowych

•

Inaktywacja chromosomu X

•

Interferencja DNA

•

Białka Polycomb i Trithorax

1.

Metylacja to proces przyłączania grup metylowych do zasad azotowych.
Aktywna chromatyna jest z reguły słabo zmetylowana i ma acetylowane
histony, nieaktywna odwrotnie; ma metylowaną cytozynę i nieacetylowane
histony. U kręgowców dinukleotydy cytozyny w sekwencji 5’CpG3’ mogą być
enzymatycznie metylowane, dając w efekcie 5-metylocytozynę. Metylacja z
reguły idzie w parze z dezacetylacją histonów, która skutkuje zwiększeniem
zagęszczenia chromatyny. Geny heterochromatyny zwykle są nieaktywne,
prawdopodobnie zagęszczona struktura chroni je przed dostępem Polimerazy
RNA. Metylowana cytozyna tworzy silniejsze niż zwykła wiązania wodorowe,
co stabilizuje helisę. W procesie replikacji DNA zauważamy, że metylowana
jest tylko nić rodzicielska, co ma ogromne znaczenie dla mechanizmów
naprawy. W nici potomnej pierwszy cel dla metylazy zachowawczej stanowią
połowicznie metylowane palindromy

m

CpG.CpG. Metylacja cytozyny

na nici potomnej (w fazie S) jest komplementarna do metylacji nici
rodzicielskiej. W komórkach ssaków występuje kilka metylaz, spośród nich
DMNT1 występuje najobficiej i wykazuje największe powinowactwo do
połowicznie metylowanego DNA (metylaza zachowawcza). Z kolei DNMT3A i
DNMT3B są głównymi metylazami de novo. Białka wiążące się z
sekwencjami metylo-CpG (MECPs) współdziałają z etylowanym DNA. MECP2
bezpośrednio blokuje czynnik transkrypcyjny IIB, może odłączyć histon H1 i
współdziałać z innymi białkami, wiążąc się z metylo-CpG i deacetylazami
histonowymi, by skondensować strukturę chromatyny. Skondensowana i
nieaktywna chromatyna zawiera także metylowane histony. W kondensacji
udział bierze rodzina białek MBD, która rozpoznaje i wiąże rejony DNA
metylowane. U bezkręgowców metylacja występuje w znacznie węższym
zakresie, niż u kręgowców. Znakowanie ich chromatyny prawdopodobnie
przebiega poprzez połączenie z nią białek lub RNA, oraz modyfikację histonów
w nukleosomach. W utrzymywanie różnicowania tkanek u Drosophila
zaangażowany jest produkt genu Polycomb.

2.

Wyspy CpG: są to skupienia dinukleotydów CpG występujące w pobliżu
wielu genów u ssaków. Spotyka się je przy końcach 5’(mRNA) w rejonie
promotora. Restrykcyjna nukleaza HPaII tnie fragment CCGG, jeśli środkowa

43

zasad C nie jest metylowana. Tnie ona wyspy CpG na małe fragmenty DNA
w komórkach, gdzie dany gen jest aktywny. Badania wykazują, że, że DNA nie
jest cięty w komórkach, w których dany gen nie ulega ekspresji (nieaktywny
DNA jest zmetylowany). Pierwszy ekson ma z reguły większe zagęszczenie
wysp niż pozostałe. Wyspy CpG usuwane są w genomu wskutek dezaminacji
metylowanej cytozyny, która prowadzi do powstania Tyminy. Enzymy
naprawcze lokalizują błędnie sparowane nukleotydy (TpG) i powodują
zamianę G na A, prowadząc do usunięcia wyspy. W ten sposób ok. 80% wysp
CpG zostaje usuniętych z DNA. Pozostają tylko te, które utrzymały się wskutek
selekcji mutacji w niezbędnych kodonach lub w regionach kontrolnych
sąsiadujących z sekwencjami kodującymi. W komórkach szlaku płciowego,
gdzie nie występuje metylacja, nie zachodzi też usuwanie wysp CpG.

Metylacja zachodzi w fazie S, w przypadku komórek szlaku płciowego ma to

miejsce dopiero w zygocie, po zapłodnieniu. Podczas nowotworzenia
obserwujemy hipo- lub hipermetylację.

Hipometylacja skojarzona jest z elementami regionów paromotorowych

onkogenów, powoduje ona nadekspresję genów. Może być przyczyną raka jelita
grubego.

Hiperfosforylacja ma charakter punktowy. Np. hiperfosforylowany gen p16

powoduje guzy piersi, mózgu i pęcherza moczowego.

Choroby związane z zaburzeniami metylacji:

•

Zespół Retta: zaburzenia zaliczane do autystycznych.

•

Zespół ICF: niedobór odporności, anormalna budowa twarzy.

•

Zespół Rubinsteina Taybiego: boczne ustawienie paliczków, wady
serca.

Metylacja DNA może być modyfikowana przez:

•

Witaminę B12

•

Kwas Foliowy

•

Cholinę

•

Metioninę

44

Modyfikacje histonów

•

Powodują remodelowanie chromatyny

•

Kowalencyjne zmiany histonów i proces metylacji są współzależne.

Typy modyfikacji:

•

Acetylacja Lys

•

Fosforylacja Ser

•

Metylacja Lys i Arg

•

Przyłączenie ubikwityny

Modyfikacje histonów mogą powodować choroby takie jak ostra białaczka
(promielocytowa i limfoblastyczna)

3.

Imprinting (rodzicielskie piętnowanie genów) jest to forma aktywacji bądź
inaktywacji genu w zależności od tego, na którym chromosomie
rodzicielskim się znajduje. Ekspresji ulega zawsze tylko jeden allel; matczyny
lub ojcowski. Drugi z nich zwykle jest zmetylowany. Zjawisko to określa się
mianem ekspresji monoallelicznej. We wczesnych stadiach rozwoju allele
jednego z rodziców są wybiórczo inaktywowane, lecz przebieg procesu
selekcji nie został dotychczas wyjaśniony. U ludzi występują dwa duże
regiony podlegające imprintingowi. Jeden z nich znajduje się na
chromosomie 11p15.5, drugi na 15q12. w przypadku 15q12 brak
ojcowskiego chromosomu powoduję chorobę Pradera- Willego, z kolei brak
matczynego zespół Angelmana. Te same mutacje wywołują różne symptomy
w zależności, czy zachodzą na chromosomie matczynym czy ojcowskim.

4.

Inaktywacja chromosomu X: w komórkach ssaków zawsze aktywny jest
tylko jeden chromosom X, drugi X (w przypadku polisomików i poliploidów
także każdy kolejny) u samic pozostaje inaktywowany. Wykorzystywany do
tego jest mechanizm polegający na przyłączeniu dojrzałego RNA
transkrybowanego z chromosomu, który ma być inaktywowany (chromosom
cis). U ssaków kontrolę nad procesem pełni centrum inaktywacji X (Xic)
złożone z kilku elementów:

•

Xist: koduje łańcuch, z którego transkrybowany jest niekodujący
RNA okrywający nieaktywny X podczas heterochromatynizacji.

•

TsiX: jest odwrotnością Xist, przez co jest do niego
komplementarny. Ma początek w okolicy genu DXPas34. Delecja
tegoż genu powoduje trwałą inaktywację chromosomu X, więc
przypuszczalnie oba fragmenty neutralizują działanie Xist.7

•

Xce: odgrywa rolę w wyborze, który X ma być inaktywowany.
Pewne jego allele zwiększają szanse na to, że „ich” X pozostanie
aktywny.

45

5.

Białka Polycomb i Trithorax: są to ogromne kompleksy białkowe
biorące udział w podtrzymywaniu „pamięci komórkowej”. Trithorax to
aktywatory transkrypcji, Polycomb z kolei to jej represory. Ich zasadniczą
rolą jest utrzymanie wzoru ekspresji genów, ustalanego na wczesnych
etapach różnicowania komórek. Po rozpoczęciu różnicowania komórki
realizują ściśle ustalony plan rozwojowy, zapisany w genach i kontrolowany
przez wspomniane białka.

46

Molekularnej podstawy starzenia się

1.

Definicje i teorie starzenia się
Pomimo obiecującego nagłówka muszę was rozczarować… nie ma definicji
starzenia się, aczkolwiek wyróżniamy kilka przemian zachodzących w
organizmie, których opis może od biedy służyć za takową. Są to:

•

Postępujący z wiekiem spadek żywotności organizmu.

•

Zachodzące z upływem czasu nieodwracalne zmiany w organizmie.

•

Suma ubytków biologicznych gromadzących się po okresie dojrzewania

•

Wzrastająca wrażliwość na czynniki szkodliwe powodujące coraz
większe wahania homeostazy

•

Zespół procesów zanikowych w narządach ciała, które pojawiają się z
końcem procesów wzrostowych.

Teorie dot. podstaw starzenia się

1.

Teorie zużycia. Im szybsza przemiana materii, tym krótsze życie. Np.
ryjówka, której serce uderza 750 razy na minutę żyje 1,5 roku, podczas gdy
słoń, który ma 30 razy niższy metabolizm, żyje 80 lat. Organizmy o bardzo
wolnym metabolizmie, jak żółwie, czy krokodyle żyją bardzo długo. W
świetle ostatnich badań teoria ta łączona jest ponadto z teorią
wolnorodnikową (Harmana) i teorią mutacji.

2.

Teorie zatrucia. W komórkach nieulegających podziałom z wiekiem
gromadzi się substancja zwana lipofuscyną. Tempo jej akumulacji jest
bardzo różne u różnych organizmów. Nie jest ona czynnikiem powodującym
starzenie, ale raczej wskaźnikiem szybkości przebiegu tego procesu.
Lipofuscyna jest mocno usieciowanym lipoproteidem, gromadzącym się w
lizosomach, a jej odkładanie świadczy o dużej ilości wolnych rodników
tlenowych, za czym przemawia fakt, że podawanie przeciwutleniaczy
powoduje spowolnienie jej akumulacji, a jak się ma szczęście to nawet jej
zaniku.

Inną teorią zatrucia jest teoria Miecznikowa, mówiąca o zatruwaniu
organizmu przez jady bakteryjne powstające w jelicie grubym oraz teoria
odkładania się soli wapnia lub cholesterolu. Jeszcze głupsza jest teoria
odkładania się w organizmie z wiekiem ciężkiej wody.

3.

Teoria

sieciowania.

W

miarę

upływu

czasu

we

wszystkich

makromolekułach o długim okresie półtrwania dochodzi do wytworzenia się
wiązań poprzecznych, co nazywamy sieciowaniem. Jak zwykle
wszystkiemu winne są wolne rodniki powstające w mitochondriach.
Sieciowaniu ulega między innymi kolagen, białka soczewki oka (zaćma!), a
także kwasy nukleinowe. Proces ten powoduje utratę bądź zaburzenie ich
funkcjonalności.

47

4.

Teoria Hayflicka. Inaczej zwana teorią ograniczonej liczby podziałów.
Opiera się na fakcie, iż większość komórek takich jak: fibroblasty,
chondrocyty, astrocyty czy keratynocyty ma ograniczoną liczbę podziałów.
Jedynie komórki linii zarodkowej, hemopoetyczne szpiku i nowotworowe
wydają się być nieśmiertelne. Fibroblasty różnych organizmów są zdolne do
różnej liczby podziałów. Fibroblasty ludzi cierpiących na progerię cechują się
mniejszą liczbą możliwych podziałów. Najnowsze badania dowodzą, że
wpływ na to ma obecność telomerów na końcach chromosomów, które
ulegają skróceniu po każdym podziale.

5.

Teoria Orgela. Zwana teorią katastrofy błędów. Opiera się na dwóch
postulatach. (1) przenoszenie informacji na drodze DNA-RNA-białko nie
zachodzi ze 100% dokładnością. (2) w przenoszenie informacji genetycznej
zaangażowane są enzymy i regulatory. Nawet niewielkie błędy w ich
strukturze powodują wadliwe funkcjonowanie. Powoduje to wystąpienie
kolejnych błędów, z którymi mechanizmy naprawy w pewnym momencie nie
mogą sobie poradzić. Prowadzi to do zaburzenia funkcjonalności komórki, a
po przekroczeniu punktu krytycznego- śmierci. Szczególnie groźne są
mutacje w genach kodujących enzymy naprawcze DNA. Nienaprawiane
mutacje są przyczyną nie tylko przyspieszonego procesu starzenia, ale także
wielu chorób dziedzicznych czy nowotworów. Liczne doświadczenia dowodzą
prawdziwości tej teorii. Czynniki mutagenne jak promieniowanie jonizujące,
czy różne związki chemiczne przyspieszają starzenie, powodując uszkodzenia
DNA (patrz mechanizmy naprawy i wpływ leków cytostatycznych).
Dowiedziono też, że Polimeraza DNA starych komórek robi znacznie więcej
błędów, niż nówka.

6.

Teoria skracania telomerów. Telomery, jak już wspominałem, są to
końcowe odcinki chromosomów, chroniące je przed zniszczeniem. Nie są
one replikowane z resztą genomu, ale dobudowywane enzymatycznie po
każdym podziale. U ludzi z progerią są one znacznie krótsze niż u zdrowych.
W nowotworach nie ulegają one skróceniu, gdyż występuje w nich enzym
zwany telomerazą, który zawsze odbudowuje je do pełnej długości.

7.

Teoria mutacji somatycznych. W starzejących się komórkach wzrasta
liczba aberracji chromosomowych. Zmienia się także stopień acetylacji,
metylacji i fosforylacji białek chromatyny. Szczególnie intensywnie proces
uszkadzania DNA zachodzi w mitochondriach, gdzie występuje zawsze
w pizdu wolnych rodników. Mechanizmy naprawy w starych komórkach
funkcjonują gorzej niż w młodych, co prowadzi do coraz częstszych mutacji.

8.

Teoria mutacji mtDNA. mtDNA zbudowany jest z ok. 17 kb i zawiera ok.
37 genów. Od jądrowego różnią go następujące cechy; (1)nie jest połączony z
histonami. (2)nie ma enzymów naprawy. (3)dziedziczony głównie po matce.
(4)bardzo narażony ma powstające In situ wolne rodniki. (5)jest
przepisywany i transkrybowany w całości. (6)geny ułożone są w nim w
sposób ciągły. (7)często zachodzą w nim duże delecje. Mitochondria

48

uszkodzone przez wolne rodniki i inne złe rzeczy tracą swą wydolność
energetyczną, przez co komórce zaczyna brakować energii. Uszkodzone
mitochondria tworzą usieciowane kompleksy, odkładane w lizosomach.
Dowodem potwierdzającym wpływ stanu mitochondriów na długość życia
jest ścisła korelacja długości życia potomstwa z długością życia matki, od
której pochodzą prawie wszystkie mitochondria.

9.

Teoria Harmana. Zwana teorią wolnorodnikową. Co to jest wolny rodnik
wie każdy, jak powstaje chyba też. mogą one nieodwracalnie uszkadzać
komórki, reagując z białkami i kwasami nukleinowymi, a także utleniając
fosfolipidy błony komórkowej. Organizm jest przed nimi chroniony przez
dysmutazę ponadtlenkową, katalazę i peroksydazę glutationową. Oprócz
enzymów ważną rolę grają tu antyoksydanty, takie jak: witamina C,
witamina E, beta-karoteny i kwas moczowy. Doświadczanie stwierdzono, że
dodawanie do pożywienia przeciwutleniaczy może mieć istotny wpływ na
długość życia. Teoria ta jest w zasadzie jednoznaczna z wyżej wymienionymi.

10.

Teoria immunologiczna. Zakłada, że przyczyną starzenia się jest

postępujące z wiekiem osłabienie systemu immunologicznego. Układ
immunologiczny jest regulowany przez geny układu MHC, układ dokrewny
oraz nerwowy. W starzejącym się organizmie powstają białka o zmienionej
strukturze, które są traktowane przez układ odpornościowy jak obce
antygeny. Mutacje genów w limfocytach B i T upośledzają ich funkcje, co z
biegiem lat powoduje, że organizm jest bardziej podatny na zakażenia oraz
występowanie komórek nowotworowych, które w normalnych warunkach
powinny były zostać usunięte.

Starzenie się przebiega u różnych osobników jednego gatunku z różną
szybkością, co oznacza, że wiek biologiczny może się różnić od metrykalnego.
Przykładem ilustrującym to zjawisko są osoby cierpiące na progerię, które w
wieku 10 lat mają fenotyp osoby starej i umierają na zawał serca, podczas
gdy niektórzy ludzie w wieku 90 lat zachowują nadal wysoką sprawność.
Sposobem na przedłużenie życia jest ograniczona dieta, gdyż niska
kaloryczność wpływa na mniejsze zużycie tlenu, co niesie ze sobą
wytwarzanie mniejszej ilości wolnych rodników w mitochondriach.

49

Część II

Elementy genetyki

klinicznej

50

Kontrola genetyczna determinacji płci

1.

Chromosomy X i Y

Chromosomy płci (X i Y) powstałe na drodze ewolucji z pary autosomalnej.

Chromosom X pod względem wielkości i położenia centromeru podobny jest do
chromosomów z grupy C. na chromosomie tym zlokalizowanych jest wiele (1094)
genów, w większości nie mających związku z determinacją płci. Na końcu ramion
krótkich chromosomów płciowych X i Y znajdują się fragmenty homologiczne.
Są to regiony pseudoautosomalne (PAR), dzięki którym podczas mejozy w
spermatogenezie może dochodzić do koniugacji tych chromosomów i crossing-
over. W sąsiedztwie regionu pseudoautosomalnego w chromosomie X
zlokalizowane są 2 geny. Ramiona długie chromosomu X zawierają również ważne
geny dla determinacji i różnicowania płci. Są to geny kodujące białkowe receptory
cytoplazmatyczne i jądrowe, odpowiedzialne za reakcję komórek na działanie
testosteronu i dihydrotestosteronu. Chromosom Y jest małym chromosomem
akrocentrycznym podobnym do chromosomów grupy G; stanowi on ok. 1% DNA.
W ludzkim kariotypie cechuje się on szczególnym polimorfizmem. Badania
wykazują, że jego rozmiary różnić się mogą w szerokim zakresie, mogąc osiągać
rozmiary chromosomów grupy G(mniejsze), jak i grupy E (większe). Szczególną
jego cechą jest brak nitek satelitonośnych w odróżnieniu od akrocentryków
autosomalnych. Największą część chromosomu Y stanowią powtarzalne sekwencje
satelitarne. Satelitarne DNA Bq składa się z dwóch powtarzalnych klonów DYZ1 i
DYZ2, które stanowią 50-57% całkowitego DNA chromosomu Y. region
euchromatynowy obejmuje całe ramię krótkie, okolicę przycentromerową i
proksymalną część ramienia długiego. W ramieniu krótkim zlokalizowany jest
region PAR, obejmujący koniec ramion krótkich chromosomu Y. bardzo blisko
regionu PAR znajduje się gen SRY, determinujący powstanie jąder. Jest to jedyny
gen swoisty wyłącznie dla chromosomu Y. następnie leżą geny homologiczne dla
obydwu chromosomów płciowych. W regionie przycentromerowym zlokalizowano
grupę genów odpowiedzialnych za spermatogenezę (AZF). W porównaniu z
chromosomem X; liczba genów na Y jest niewielka (dotychczas zlokalizowano 57
cech zlokalizowanych na Y).

2.

Chromatyna płciowa

Termin „chromatyna płciowa” odnosi się do odpowiednio wybarwionych struktur

chromatyny

widocznych

w

jądrze

interfazowym,

odpowiadających

skondensowanym chromosomom X i Y, które wykryć można w komórkach niemal
wszystkich tkanek.

Chromatyna X (ciałko Barra). Odkryte w 1949. W jądrach interfazowych

komórek żeńskich wybarwia się ciemniejsza grudka zasadochłonnej chromatyny,
dyskowato przylegająca do błony jądrowej. U człowieka najczęściej bada się je w
rozmazach nabłonka jamy ustnej i komórkach płynu owodniowego. W
granulocytach obojętnochłonnych uwidacznia się ono w postaci wyrzuconej poza
obręb jądra, ale pozostającej z nim w kontakcie grudki zwanej pałeczką
dobosza. Ciałko Barra to ta część chromatyny jądrowej, która w pierwszych
dniach rozwoju zygoty uległa inaktywacji (kondensacji) określanej obecnie jako

51

lionizacja. Z tej lionizowanej chromatyny w czasie podziału komórki powstanie
jeden z dwóch obecnych chromosomów X. inaktywacja tego chromosomu jest
mechanizmem wyrównującym ilość informacji genetycznej zawartej w dwóch
chromosomach X u kobiety w stosunku do jednego u mężczyzny. Inaktywacja
obejmuje większość, ale nie wszystkie geny. Inaktywacji nie podlegają geny
zlokalizowane na końcach ramion krótkich, leżących w rejonie PAR oraz niektóre
geny zajmujące bardziej proksymalną część ramienia krótkiego i proksymalną
część ramienia długiego. W prawidłowej komórce żeńskiej o kariotypie 46 XX
obecne jest jedno ciałko Barra. Liczba ciałek zawsze jest o jeden mniejsza od liczby
chromosomów X. w rozmazie komórek nabłonka jamy ustnej obecność ciałek
Barra waha się między 20-60%. W tkankach niedzielących się notuje się względnie
stały odsetek ciałek Barra (w neurocytach 90%). W przypadku delecji chromosomu
X niekiedy obserwuje się mała grudkę chromatyny, natomiast w przypadku dużego
chromosomu X (izochromosom ramion długich) obserwuje się grudkę dużą. W
zespołach

chorobowych

przebiegających

z

aberracjami

strukturalnymi

chromosomów X unieczynnia się z reguły chromosom nieprawidłowy. Badanie
chromatyny X jest najprostszą pośrednią metodą wykrywania aberracji liczbowych
chromosomu X. badanie chromatyny X ma zastosowanie także w medycynie
sądowej.

3.

Teoria Lyon

W komórkach zarodka żeńskiego około 16 dnia życia zarodkowego dochodzi do

inaktywacji jednego z chromosomów X. czas trwania tego procesu jest różny w
zależności od rodzaju tkanki embrionalnej. Ponieważ komórki potomne żeńskie
mają jeden chromosom X ojcowski i jeden X matczyny, w poszczególnych
tkankach inaktywowana zostaje losowo jeden z nich. Tak więc organizm kobiety
pod względem chromosomów X jest mozaiką złożoną z komórek zawierających
nieaktywny X ojcowski lub matczyny. Losowa inaktywacja zachodzi w różnych
proporcjach. W pewnych przypadkach może dochodzić do preferencyjnej
inaktywacji matczynego lub ojcowskiego X. przyczyny takiej sytuacji mogą być
różne, np. mutacje genu XIST lub innych zlokalizowanych na X. molekularne
podłoże inaktywacji X nie jest dokładnie poznane. Wiadomo, że jednym z ogniw
procesu jest modyfikacja metylacji. Proces inaktywacji inicjowany jest w miejscu
XIC, w którego obrębie leży gen XIST. XIST produkuje RNA, które
rozprzestrzeniając się wokół chromosomu powoduje jego inaktywację. Spośród
zlokalizowanych na X genów niektóre pozostają aktywne. Są to geny mające
odpowiedniki na chromosomie Y. nieaktywny X jest bardzo odporny na działanie
mutagenów. Uszkodzić może go jedynie niewiele czynników, np. 5-azacytydyna
powodujaca demetylację DNA. Unieczynniony X charakteryzuje się opóźnioną
replikacją, zachodzącą w późnej fazie S.

4.

Ciałko Y

W interfazowym jądrze komórek męskich wybarwionych barwnikami

fluorescencyjnymi uwidacznia się chromatyna Y, którą stanowi dystalne
skondensowana część długich ramion Y uwidocznionej w postaci fluoryzującej
grudki. W przypadku małego chromosomu Y lub delecji jego regionu
heterochromatynowego ciałko Y jest niedostrzegalne. Obecnie metoda ta nie ma

52

znaczenia diagnostycznego, tak więc spodziewajcie się, że będzie bardzo dokładnie
omawiana i powtarzana na kolosie.

5.

Rola chromosomów płciowych w determinacji gonad

Proces różnicowania jąder z gonady pierwotnej zachodzi jedynie w obecności

chromosomu Y. zakłada się że zlokalizowany na nim jest hipotetyczny czynnik
TDF ukierunkowujący proces. Po długich poszukiwaniach odkryto, że rolę TDF
pełni gen SRY zlokalizowany w obrębie ramion krótkich Y. SRY koduje białkowy
czynnik transkrypcyjny zawierający motyw wiążący z DNA (HMG-box). Kompleks
taki może swoiście aktywować lub hamować funkcje innych genów, pośrednio
prowadząc do różnicowania jąder. SRY należy do dużej grupy białek zwanej SOX.
Wzmożona ekspresja SRY jest prawdopodobnie sygnałem do różnicowania się w 7
tygodniu rozwoju komórek Sertoliego z komórek nabłonkowych grzebienia
płciowego. W tym samym czasie zwiększa się ekspresja genu SOX9, biorącego
udział w aktywacji genu SRY. Z kolei SOX9 jest aktywowany przez gen SF1,
natomiast zlokalizowany na chromosomie X gen SOX 3 jest jego inhibitorem. W
warunkach prawidłowych ekspresji SOX 3 zapobiega gen SRY. Zaburzenia
ekspresji SOX9 powodują zaburzenia różnicowania jądra. W interakcjach między
tymi genmi dużą rolę odgrywa zlokalizowany na X gen DAX1. jego ekspresję

stwierdza się w komórkach grzebienia moczopłciowego, podwzgórza i przysadki.
Jego ekspresja następuje równolegle z SRY. Zakłada się że SRY blokuje DAX1, a
ten wówczas nie może hamować ekspresji SF1, co umożliwia ekspresję SOX9.
duplikacja DAX1 powoduje zahamowanie rozwoju jąder u płodów XY, gdyż
prowadzi do nadekspresji. Podobne komplikacje mają miejsce w przypadku
zlokalizowanego na 1. chromosomie geny WNT4, normalnie blokowanego przez
SRY. Gen ten u płodów XX powoduje rozwój żeńskich narządów płciowych.

Na temat genetycznego podłoża różnicowania jajników wiemy bardzo niewiele.

Dogmatem jest stwierdzenie, że ich powstanie zachodzi w przypadku braku
czynników stymulujących powstanie jądra (nasuwa się więc od razu, że w
zabranym Adamowi żebrze doszło do inaktywacji SRY). Struktury gonady żeńskiej
pojawiają się ok. 12 tygodnia, czyli później niż męskie. Prawidłowemu rozwojowi

Schemat współzależności poszczególnych genów w warunkowaniu
płci

53

jajnika muszą towarzyszyć dwa chromosomy X, w przypadku jednego (45 X) układ
staje się zdegenerowany. Przedwczesne wygasanie jajników może mieć też miejsce
w przypadku uszkodzenia genu FMRP na chromosomie X. podobne znaczenie
mogą mieć mutacje genów CGA, FSHB, FSHR. Wniosek z całego tego pierdolenia
płynie taki, że w warunkach prawidłowych bez chromosomu Y i genu SRY nie
może nastąpić różnicowanie jądra i nie jest możliwe zachowanie sprawności
jajnika bez dwóch zdrowych chromosomów X. Amen.

54

Podstawy cytogenetyki człowieka

Wstęp

Cytogenetyka człowieka jest nauką młodszą od cytogenetyki innych organizmów,

gdyż o jej istnieniu mówić można dopiero od roku 1956, kiedy to po długich i
ciężkich badaniach komuś mądremu udało się wreszcie stwierdzić, że człowiek ma
nie 48, a 46(!) chromosomów, co jak wiemy wymagało zastosowania obliczeń o
wprost niewiarygodnym stopniu złożoności.

Z początku badania cytogenetyczne przeprowadzane były stosunkowo rzadko,

gdyż głównym źródłem komórek były punkcyjne nakłucia szpiku czy jąder, a
takowe nakłucia niosą ze sobą dość duże ryzyko dla pacjenta, a poza tym mało
który mężczyzna da sobie nakłuć… kość udową celem pobrania szpiku. Przełomem
na tym polu było opracowanie prowadzenia hodowli limfocytów krwi obwodowej,
co jest możliwe przy dodaniu do hodowli tzw. Fitohemaglutyniny, która to
powoduje odróżnicowanie limfocytów do form młodocianych, które zaczynają się
intensywnie dzielić. Hodowlę taką przeprowadza się na odpowiedniej pożywce z
zastosowaniem krwi heparynowanej, następnie dodaje się kolchicyny i odwirowuje
frakcję limfocytów z hodowli. Następnie komórki poddaje się obróbce,
prowadzącej do rozluźnienia odróżnicowanych limfocytów, co poprawia
widoczność chromosomów. Następnie barwi się preparaty met. Giemsy lub
innymi. Analizy dokonujemy na największym powiększeniu mikroskopu,
wykonując mikrofotografie, z których następnie wycina się kawałki zdjęcia z
poszczególnymi chromosomami i odpowiednio układa. Celem poprawienia
dokładności stosuję się metody radiograficzne, znakując nukleotydy pierwiastkami
promieniotwórczymi.

1.

Morfologia chromosomów metafazowych

Chromosom metafazowy jest najbardziej skondensowaną formą chromatyny

jądrowej. Heterochromatyna i euchromatyna, wchodzące w skład chromosomu
różnią się między sobą rodzajem DNA (w heterochromatynie występują krótkie
sekwencje tandemowe). Euchromatyna jest replikowana we wczesnej i średniej S.
Dekondensacja heterochromatyny zachodzi wyłącznie w późnej fazie S. w wyniku
kondensacji długość chromosomu wynosi zaledwie 10

-4

części długości

rozwiniętego DNA. Chromosom składa się z dwóch chromatyd połączonych w
miejscu przewężenia pierwotnego, zwanego centromerem, który jest także
miejscem przyczepu włókien wrzeciona podziałowego. W centromerze występują
różne sekwencje powtarzalne, w większości satelitarny DNA, ale także sekwencje
SINES i LINES. W chromosomach człowieka wyróżnia się 4 główne rodziny takich
sekwencji (p. nowy Drewa str. 433). Wymienione sekwencje łączą się ze
swoistymi białkami, tworząc wielowarstwową strukturę zwaną kinetochorem.
Współdziała on z mikrotubulami wrzeciona podziałowego, ułatwiając podział
chromatyd siostrzanych lub chromosomów w anafazie mitozy czy też mejozy. W
większości komórek kinetochor ma postać trójblaszkowej płytki złożonej z:

•

Zewnętrznej (gęstej)

55

•

Środkowej (mało wyraźnej)

•

Wewnętrznej

Centromer dzieli chromosom na ramiona długie (q) i krótkie (p). na podstawie

położenia centromeru chromosomy dzielimy na trzy grupy:

•

Chromosomy metacentryczne; centromer w środku chromosomu (p=q)

•

Chromosomy submetacentrzyczne; (p<q)

•

Chromosomy akrocentryczne; (p<<q)

•

Chromosomy telocentryczne; centromer na samym końcu chromosomu,
brak ramion długich (u człowieka takich nie ma)

Na końcach chromosomów znajdują się sekwencje telomerowe. Telomerowy
DNA nie jest upakowany w postaci nukleosomów; zamiast histonów występują
białka telomerowe. Połączenie DNA telomerowego z tymi białkami nazywamy
telosomem. telomery mają zwykle strukturę typu „spinka do włosów” o dużej
zawartości guaniny. Każdy chromosom ma 2 telomery, tak więc w komórce jest ich
92. telomer chroni koniec chromosomu przed uszkodzeniem, umożliwia replikację
całego chromosomu, nadzoruje ekspresję genów oraz wspomaga organizację
chromosomów podczas podziału. Ponadto jest swego rodzaju zegarem
biologicznym, skracając się z każdym podziałem nieuchronnie prowadzi do
zaprzestania w pewnym momencie podziałów komórki, co ma ogromny wpływ na
procesy starzenia. Ma to oczywiście pozytywne strony, w pewnym stopniu
chroniąc komórki przed transformacją nowotworową. W pewnych rodzajach
komórek występuje enzym telomeraza, zapobiegający temu skracaniu, co czyni je
niemal nieśmiertelnymi (np. komórki szpikowe). Enzym telomeraza posiada krótki
odcinek RNA, służący do odtwarzania brakującego kawałka telomeru.

Na końcach ramion p chromosomów akrocentrycznych mogą występować

satelity, które są fragmentami chromatyny oddzielonymi od ramion krótkich
chromosomu przez tzw. przewężenie wtórne (nitka satelitonośna). U człowieka
przewężęnie wtórne jest odcinkiem jąderkotwórczym chromosomów 13, 14, 15, 21,
22 (akrocentrycznych), zwany jest on inaczej organizatorem jąderkowym.
Jest to odcinek zawierający tandemowo ułożone geny rDNA dla kodowania rRNA.
W telofazie odcinki te biorą udział w formowaniu się jąderka. U człowieka
występuje 10 organizatorów.

2.

Kryteria klasyfikacji chromosomów

Chromosomy człowieka sklasyfikowano zgodnie z zasadami opracowanymi

na konferencjach w Denver, Londynie, Paryżu, Sztokholmie i Zabrzu (20??, ale
kiedyś na pewno do tego dojdzie). Celem tych konferencji było ujednolicenie
zasady klasyfikacji chromosomów. Dziś podstawą jest system nazewnictwa ISCN z
2005 i 2009r. za kryteria przyjęto:

•

Wielkość chromosomów

•

Położenie centromeru

•

Rozmieszczenie prążków w chromosomach

Na podstawie tych kryteriów wyodrębniono poszczególne pary chromosomów

somatycznych; oznaczone numerami 1 do 22 oraz chromosomów płci

56

wydzielonych jako odrębną parę. Autosomy podzielono na 7 grup- od A do G.
chromosom X zalicza się do grupy C, a chromosom Y do grupy G. Oceny kariotypu
dokonuje się pod mikroskopem świetlnym. Dla dokładniejszej analizy materiału
wykonuje się tzw. kariogram. Jest to zestaw chromosomów przedstawionych
graficznie według ścisłych zasad, który sporządza się, wykonując mikrofotografię
płytek metafazowych wybarwionych prążkowo. Z odbitek wycina się chromosomy i
układa w poszczególne pary homologiczne według wielkości, położenia
centromeru i wzorów prążkowych. Kariogram człowieka przedstawia się w
następujący sposób:

•

Do grupy A zaliczono pary 1-3; 1 i 3 to duże chromosomy
metacentryczne; 2 jest submetacentryczny.

•

Do grupy B parę 4 i 5; duże chromosomy submetacentryczne.

•

Do grupy C pary 6-12 oraz X; wszystkie submetacentryczne średniej
wielkości

•

Do grupy D pary 13-15; mogą zawierać nitki satelitonośne i satelity

•

Do grupy E pary 16-18 16 to małe i prawie metacentryczne, natomiast 17
i 18 to małe submetacentryki.

•

Grupa F obejmuje pary 19 i 20; najmniejsze chromosomy
metacentryczne.

•

Grupa G obejmuje pary 21 i 22 oraz zbliżony do nich rozmiarami
chromosom Y. pary 21 i 22 to małe chromosomy, mogące zawierać nitki
satelitonośne i satelity. Chromosom Y satelit nie posiada nigdy.

Zestaw

chromosomów

występujących

w

komórce

somatycznej,

o

charakterystycznej liczbie i morfologii zwiemy kariotypem.

3.

Wskazania do analizy kariotypu

Badanie cytogenetyczne przeprowadza się tylko wtedy, gdy istnieje podejrzenie,

że obraz kliniczny choroby może być spowodowany obecnością aberracji
chromosomowej.

Wskazania do postnatalnego oznaczania kariotypu

1.

występowanie cech genotypowych charakterystycznych dla określonego
zespołu chromosomowego

2.

występowanie wad rozwojowych i/lub cech dysmorfii z wystąpieniem
opóźnienia psychoruchowego

3.

niepowodzenie rozrodu0 2 lub więcej poronienia samoistne w I trymestrze
lub urodzenie dzieci z wadami o nieznanej etiologii

4.

brak cech dojrzewania płciowego

5.

pierwotny lub wtórny brak miesiączki

6.

znaczny niedobór wzrostu o nieznanej etiologii u kobiet

7.

nieprawidłowa budowa zewn. Narządów płciowych, obojnactwo

8.

występowanie aberracji strukturalnych w rodzinie

57

Metody badania chromosomów

Najczęstszą metodą uzyskiwania chromosomów do badań cytogenetycznych jest

hodowla limfocytów krwi obwodowej zgodnie z metodą podaną we wstępie.
Obecnie w badaniach cytogenetycznych stosuje się metody wybarwiania
pozwalające stwierdzić na chromosomach prążki G, Q, R oraz C. praktyce
najczęściej bada się chromosomy metafazowe wybarwione na prążki G, których
liczba związana jest ze stopniem kondensacji chromatyny. W haploidalnej liczbie
chromosomów o średnim stopniu kondensacji wyróżnić można 300-400 prążków,
w chromosomach prometafazowych 550-580, a w profazowych nawet do 850.
metoda uzyskiwania chromosomów o zwiększonej rozdzielczości obrazu
prążkowego (prometafazowe i profazowe) nazywana jest HRT. Zmniejszenie
stopnia kondensacji osiąga się przy pomocy odpowiednich środkó9., jak na
przykład BrdU. W badaniach rutynowych stosowany poziom rozdzielczości nie
przekracza 550-580 prążków. Wartości liczbowe prążków przyporządkowane
ramionom krótkim i długim maleją w kierunku od cz. dystalnych do centromerów.
Odcinek najbliższy centromeru określa się cyfrą 1, następnie 2,3…

Prążki G; wybarwia się je najczęściej traktując preparaty enzymami

proteolitycznymi takimi jak trypsyna, czy pronaza, a następnie barwi metodoą
Giemsy. W wyniku otrzymuje się chromosomy barwione na prążki ciemne,
poprzedzielane jasnymi. Ciemne prążki G odpowiadają obszarom bogatym w pary
AT z późno replikującym DNA. Regiony te zawierają skondensowaną
heterochromatynę z nielicznymi aktywnymi genami. Od prążków jasnych różnią
się składem białek. Badania wykazały że ta chromatyna jest bogata w białka
zawierające mostki siarkowe, co cechuje występujące w chromosomach białka
niehistonowe. Prążki jasne to obszary bogate w GC, wcześnie replikujące,
zawierające euchromatynę. Wzór prążków G jest unikatowy dla każdej pary
chromosomów; odzwierciedlają one odmienną kondensację chromatyny.

Prążki Q; do ich wybarwienia używa się dwóch rodzajów fluorochromów:

•

zdolnych do jonowego wiązania się z DNA oraz interkalacji między
płaszczyzny zasad (e.g. oranż akrydynowy)

•

fluorochromy interkalujące do podwójnego łańcucha DNA, wykazujące
powinowactwo do pewnych zasad azotowych (e.g. atebryna [Q])

badania wykazują, że silnie fluoryzujące odcinki DNA są bogate w pary AT,
natomiast pary GC wygaszają fluorescencję. Niektóre odcinki chromosomów
człowieka wykazują bardzo silną fluorescencję. , np. okolice centromeru 3.
chromosomu (gr. A), satelity akrocentryków i dystalne odcinki ramion q
chromosomu Y.

Prążki C; wykrywa się dzięki nim regiony chromosomów zawierające

chromatynę konstytutywną. Barwią się barwnikiem Giemsy w obszarze
chromatyny centromerowej i przycentromerowej po uprzedniej inkubacji w r-rze
wodorotlenku Baru. Wybarwiają się rejony zbudowane z powtarzalnych sekwencji
satelitarnego DNA; silnie związane ze swoistymi białkami niehistonowymi, które

58

chronią DNA. Barwienie tą metodą u człowieka ukazuje na ciemno rejony
centromerów oraz okolice przycentromerowe. U człowieka wielkość chromatyny
przycentromerowej chromosomów pary 1, 9, 16 jest cechą polimorficzną.

Prążki R; są odwrotnością prążków G. ciemne prążki G reprezentują obszary

bogate w GC, natomiast jasne w AT. Barwienie to uzupełnia analizę kariotypu,
ukazują aberracje niedostrzegalne w wybarwieniu prążków G i Q.

Hybrydyzacja fluorescencyjna In situ (FISH); jest to metoda, pozwalająca

na lokalizowanie swoistych sekwencji DNA bezpośrednio w materiale
biologicznym. Stosuje się w niej sondy molekularne znakowane radioaktywnie
(metoda ISH), które obecnie są wypierane przez sondy fluorescencyjne (FISH).
Stosuje się sondy sprzężone z innymi cząsteczkami, wykazującymi powinowactwo
do DNA (np. biotyna). Metoda ta pozwala wykryć amplifikacje, Delecje lub
duplikacje oraz zmiany w liczbie i strukturze chromosomów, wykrywalne zarówno
w metafazie, jak i interfazie(!). do badań cytogenetycznych wykorzystuje się sondy
wiążące regiony centromerowi (sondy centromerowi) poszczególnych par
chromosomów w płytkach metafazowych, ale także w interfazowych jądrach
komórek.

Zastosowanie kliniczne FISH

•

diagnostyka zespołów mikrodelecyjnych

•

diagnostyka przyczyn niepełnosprawności intelektualnej

•

szybkie wykrywanie aneuploidii

•

diagnostyka nowotworów

podobna do FISH jest metoda hybrydyzacji porównawczej CGH. Specyficzną cechą
techniki jest to, że materiał pobrany od pacjenta jest hybrydyzowany do
prawidłowych chromosomów metafazowych w preparacie cytogenetycznym. Do
mieszaniny hybrydyzacyjnej dodaje się referencyjny DNA komórki prawidłowej
oraz DNA badany w równych ilościach. Wyznakowuje się je odpowiednimi
fluorochromami (czerwonymi i zielonymi). Następnie wyznakowane DNA
przyłącza się w procesie hybrydyzacji do chromosomów na preparacie kontrolnym.
Analiza wyników polega na pomiarze i porównaniu natężeń obydwu fluorescencji
(zieleń:czerwień) wzdłuż wszystkich chromosomów i odniesienia uzyskanych
profili do wzorców (ideogramów chromosomów). Profil fluorescencyjny w
przedziale 0.75-1.25 uznaje się za prawidłowy. Wartości poniżej lub powyżej tego
zakresu w określonym rejonie chromosomu wskazują na nieprawidłowe liczby
kopii sekwencji DNA. Wadą metody jest stosunkowo mała rozdzielczość oraz brak
możliwości wykrywania mozaikowatości chromosomowej. Metodę tą stosuje się do
diagnostyki aberracji niezrównoważonych w komórkach nowotworowych oraz jako
uzupełnienie cytogenetyki klasycznej.

Zapisywanie wyników badań cytogenetycznych

do doczytania w podręczniku.

59

Podstawy mechanizmów zmienności i dziedziczenia

1.

Podstawowe pojęcia genetyczne:

•

Gen: podstawowa jednostka dziedziczności

•

Allel: jedna z wersji genu w określonym miejscu (locus) na danym
chromosomie homologicznym.

•

Geny letalne: geny, których ekspresja powoduje śmierć organizmu

•

Genotyp: zespół genów danego osobnika warunkujących jego
właściwości dziedziczne.

•

Fenotyp: zespół cech organizmu, włączając w to nie tylko morfologię,
lecz również np. właściwości fizjologiczne.

•

Homozygota: organizm posiadający identyczne allele danego genu
(np. aa lub AA) w chromosomach.

•

Heterozygota: organizm posiadający różne allele tego samego genu

•

Cecha dominująca: allel ujawniający się w fenotypie organizmu
diploidalnego zarówno w przypadku genotypu homozygotycznego
(gdy obydwa chromosomy homologiczne zawierają dany allel) jak i w
przypadku heterozygoty.

•

Cecha recesywna: allel, którego działanie ujawnia się fenotypowo
jedynie w przypadku homozygoty recesywnej.

•

Dominacja zupełna i niezupełna: w dominacji zupełnej jeden allel
całkowicie maskuje drugi, z kolei w niezupełnej maskuje go jedynie
częściowo.

•

Krzyżówka testowa- za jej pomocą sprawdza się genotyp osobnika
badanego, o którym nie wiadomo czy jest homo- czy heterozygotą.
Polega na skrzyżowaniu badanego osobnika z homozygotą aa. Jeśli w
pokoleniu F1 pojawią się same osobniki o cechach dominujących
mieliśmy do czynienia z homozygotą dominującą, jeśli z kolei
otrzymamy

rozszczepienie

pod

względem

danej

cechy,

z heterozygotą.

•

Krzyżówka wsteczna- polega na kojarzeniu heterozygot pokolenia F1
z którymkolwiek z typów rodzicielskich zarówno z cechą dominującą
jak i recesywną.

60

2.

I i II prawo Mendla, chromosomowa teoria dziedziczenia

•

I prawo Mendla (p. czystości gamet): podczas podziału mejotycznego
komórki następuje rozdział odpowiadającej sobie pary genów (alleli).
Do każdej gamety przechodzi tylko jeden allel danej pary. Mendel
sformułował to prawo w oparciu o swoje doświadczenia wyniesione z
hodowli i krzyżowania między sobą różnych odmian grochu.

•

II prawo Mendla: Cecha uwarunkowana jedną parą genów
dziedziczona jest niezależnie od cechy uwarunkowanej drugą parą
genów, w związku z czym w pokoleniu F2 obserwuje się
rozszczepienie fenotypów w stosunku 9:3:3:1. dwie cechy
dziedziczone są niezależnie wówczas, gdy geny warunkujące te cechy
znajdują się na różnych parach chromosomów homologicznych
(geny niesprzężone). Jeśli dwa geny leżą na jednym chromosomie,
wówczas dziedziczone są one zależnie.

•

Chromosomowa teoria dziedziczenia: Na przykładzie Drosophila
melanogaster T. Morgan wykazał związek pomiędzy przekazywaniem
cech dziedzicznych a chromosomami. Garnitur chromosomowy
muszki składa się z 2n= 8 chromosomów; 6 autosomów i 2
chromosomów płci. Samica ma dwa chromosomy X, a samiec jeden X
i jeden Y. Morgan krzyżował muszki szczepu dzikiego o czerwonych
oczach z muszkami zmutowanymi i oczach innego koloru. Krzyżował
homozygotyczną samicę czerwonooką z samcem o oczach białych. W
pokoleniu F1 wszystkie muszki miały oczy czerwone. W pokoleniu F2
wszystkie samice były czerwonookie, a wśród samców połowa miała
czerwone, a połowa białe oczy. Stosunek fenotypów bez
uwzględniania płci wynosił w F2 3:1. wykonanie krzyżówki odwrotnej
jednoznacznie dowodzi, że gen warunkujący barwę oczu znajduje się
na chromosomie X. Morgan zauważył, że segregacja genów podczas
rozdziału chromosomów następuje zgodnie z I prawem Mendla, z
kolei drugie prawo Mendla spełnione jest dla cech znajdujących się
na różnych chromosomach. Morgan wykazał także, że geny
znajdujące się na jednym chromosomie tylko w niektórych
warunkach są zupełnie sprzężone. Jest to związane z procesem
wymiany odcinków chromosomów (crossing-over). U muszki c-over
zachodzi tylko u samic, gdyż chromosomy samców nie tworzą
chiazm. Na podstawie opisanych odkryć sformułowano kilka
podstawowych tez chromosomowej teorii dziedziczenia:
-geny zlokalizowane są na chromosomach liniowo w określonej
kolejności

61

-geny alleliczne znajdują się w tych samych loci chromosomów
homologicznych

-poszczególne chromosomy zawierają różną liczbę genów; zestaw ich
jest charakterystyczny dla danego chromosomu

-geny leżące bisko siebie w chromosomie są ze sobą sprzężone i
dziedziczone łącznie

-częstość występowania c-over zależy od odległości między genami

-częstość c-over między genami w obrębie tej samej pary
chromosomów jest stałą dla danego gatunku

-organizmy powstałe z rekombinacji po c-over noszą nazwę
rekombinantów

•

Epistaza: jest to oddziaływanie jednego genu na ujawnienie się
innego genu, niebędącego jego allelem. Gen hamujący nazywamy
epistatycznym, a maskowany hipostatycznym. W zależności od
właściwości genu tłumiącego mówimy o epistazie dominującej lub
recesywnej.

•

Penetracja i ekspresja: penetracja genu, jest częstością, z jaką
dany gen (allel) dominujący lub allele recesywne w układzie
homozygotycznym ujawniają się w fenotypie jego nosicieli. Jeżeli
wszyscy nosiciele mają fenotyp charakterystyczny dla danego genu,
penetracja jest pełna, jeśli nie wszyscy, to niepełna. Penetracja,
podobnie jak ekspresja zależy zarówno od genotypu jak i środowiska.
Penetracja może być ograniczona do jednej płci. Przykładem
penetracji niepełnej jest choroba Huntingtona. Przy penetracji
niepełnej choroba może się nie ujawnić, gdyż penetracja
patologicznego genu zależy od wieku. Całkowitą penetrację
obserwujemy w chorobie Reclinghausena. Ekspresja to stopień
ujawnienia się produktu danego genu, odpowiedzialnego za jakąś
cechę. Określa się ją na poziomie mRNA lub białka. Niektóre geny
dominujące

wykazują

zmienną

ekspresję.

Przykładem

jest

polidaktylia, objawiająca się wystąpieniem dodatkowych palców na
kończynach. Zmienność tej cechy łatwo prześledzić można w obrębie
członków jednej rodziny.

•

Poligeny: inaczej geny kumulatywne. Należą do róznych par alleli,
zajmują różne loci na chromosomach, ale wpływają na wytworzenie
tej samej cechy. Efekty ich działania się sumują, stąd nazwa(!). u
człowieka warunkują barwę skóry, a także iloraz inteligencji.

•

Plejotropia: polega na warunkowaniu przez jeden gen kilku
pozornie niezwiązanych ze sobą cech genotypowych. Przykładem
może być zespół Marfana. Dochodzi w nim do uszkodzenia włókien

62

sprężystych i zaburzenia tworzenia kolagenu wskutek patologicznego
genu

dominującego.

Charakterystyczną

cechą

zespołu

jest

pająkowatość palców.

•

Komplementacja: polega na dopełniającym działaniu produktów
różnych genów. Produkt jednego genu wpływa na produkt drugiego.
U człowieka działanie komplementarne wykazują genu decydujące o
zabarwieniu włosów i skóry.

•

Cechy dziedziczone ilościowo: zmieniają się w sposób ciągły i
można je wyrazić liczbowo. Należą do nich liczne, zarówno
prawidłowe jak i patologiczne cechy fenotypu; między innymi:
pigmentacja skóry, masa ciała, podatność na choroby zakaźne,
ciśnienie krwi, liczba krwinek, inteligencja. Do patologicznych należy
otyłość i nadciśnienie tętnicze.

3.

Mechanizmy powstawania zmienności wśród organizmów

•

Zmiennością

nazywamy

występowanie

dziedzicznych

lub

niedziedzicznych różnic pomiędzy komórkami danego organizmu
(wewnątrzosobnicza), między osobnikami należącymi do tej samej
populacji (osobnicza) lub pomiędzy populacjami (grupowa). W
przypadku człowieka istotna jest zmienność osobnicza, której znaczną
część stanowią różnice w sekwencji DNA polegające na zamianie
pojedynczego nukleotydu u osób niespokrewnionych. Badania
dowodzą, że różnice między dwiema niespokrewnionymi osobami
wynoszą 1:1000 nukleotydów. Zmienność fenotypowa może mieć
charakter ciągły (fluktuacyjna), jak np. wzrost, masa, IQ, pigmentacja
włosów. Przykładem zmienności alternatywnej u człowieka jest
układ grupowy Rh. Analizując zmienność osobniczą należy pamiętać,
że ten sam zespół genów w różnych warunkach może dać różne efekty
fenotypowe.

•

Rekombinacje: pod tym terminem kryje się każdy proces, w którym
dochodzi do pęknięcia nici DNA i wymiany jego fragmentów między
chromosomami

homologicznymi.

Wyróżnia

się

rekombinację

homologiczną,

zlokalizowaną

i

transpozycyjną.

Rekombinacja

homologiczna następuje, gdy rekombinujące cząsteczki mają mają
identyczną

lub

bardzo

podobną

sekwencję

nukleotydową.

Rekombinacja niehomologiczna obejmuje fragmenty o niewielkiej
homologii. U prokaryota rekombinacja zajść może w wyniku losowego
doboru konigatów. U eucaryota następuje wskutek losowego doboru
osobników rodzicielskich, losowej segregacji chromosomów w mejozie
oraz losowego łączenia się gamet i c-over. Rekombinacja
transpozycyjna dotyczy ruchomych odcinków DNA (transpozonów),
będących cechą charakterystyczną eucaryota.

(temat o rekombinacjach bakterii pozwalam sobie pominąć,
zakładając z p=1, że nie należy do istotnych w świetle tematyki z
rozpiski na katedrze. Jeśli ktoś chce nauczyć się 50 dodatkowych
bialek odsyłam do Drewy, str. Ok. 380)

63

Mutacje: są to zmiany zachodzące w DNA na różnych poziomach,
które, jeśli nie zostaną naprawione, to zostaną przekazane komórkom
potomnym lub potomstwu. (rodzaje mutacji opisywałem już w
temacie o naprawie DNA i tam też odsyłam)

4.

Dziedziczenie u człowieka

•

Układ ABO; antygeny układu AB0 wykrywane są na powierzchni
krwinek czerwonych, gdzie są związane z glikoproteinami i glikolipidami
błony erytrocytów. Antygeny te występują także na powierzchni innych
komórek krwi oraz wielu narządów, obecne są także w płynach
ustrojowych i wydzielinach ludzi. jedynie tkanka nerwowa nie posiada
antygenów AB0. pojawiają się w 5-6 tygodniu rozwoju płodowego, a do
ich pełnej ekspresji dochodzi w 6-18 miesiacu po urodzeniu. W locus
AB0 na ramieniu długim chromosomu 9 występują 3 allele: A, b i 0.
każdy człowiek ma w parze chromosomów zawsze 2 allele. A i B są
dominujące wobec 0, a względem siebie kodominujące. Alloprzeciwciała
układu należą głównie do klasy IgM. Ich wytwarzanie następuje bez
uprzedniego kontaktu z antygenem, rozpoczyna się tuż po urodzeniu i
rośnie, osiągając maksimum w młodym wieku. Alloprzeciwciała
znajdujące się w osoczu krwi aglutynują krwinki czerwone z antygenami,
których nie ma w organizmie. Dlatego osoby z grupą A mają antygen A
na erytrocytach, a w surowicy przeciwciała anty-B. osoby z grupą B mają
odwrotnie. W osoczu ludzi z grupą 0 występują oba rodzaje przeciwciał i
żadnego antygenu na krwinkach, z kolei w układzie AB nie ma
przeciwciał w osoczu a na krwinkach są oba antygeny.
Geny A, B i 0 mają długość 18-20kb i składają się z siedmiu eksonów.
Geny A i B są wysoce homologiczne, a różnice między nimi dotyczą 7
nukleotydów, przez co produkty genów A i B różnią się między sobą
zaledwie 4 spośrób 353 aminokwasów. Decydujący wpływ na swoistość
A i B mają aminokwasy 266 i 268. Najczęściej występujący allel 0, w
porównaniu z allelem A nie ma jednego nukleotydu w eksonie 6.
wynikiem tego jest przesunięcie ramki odczytu, co prowadzi w pozycji
117 do powstania kodonu STOP. Powstały polipeptyd nie zawiera
miejsca aktywnego, bo jest za krótki (choć podobno rozmiar nie gra
roli…). Tak więc gen 0 jest genem amorficznym. Rzadsza jest odmiana
allelu 0, której produkt wskutek substytucji jednego aminokwasu nie ma
aktywności enzymatycznej. Allel A także posiada 2 odmiany, różniące się
długością o 21 aminokwasów (2 jest dłuższa i mniej aktywna). Tak więc
osoby z grupą krwi A2B lub A2 mają słabszą odmianę antygenu A. ich
krwinki aglutynują słabiej niż przy występowaniu odmiany A1. osocze
osób A2 i A2B może zawierać przeciwciała Anty-A1, aglutynujące
erytrocyty z antygenem A1. Antygeny grupowe AB0 są niejednorodne,
tak więc poza normalnymi grupami krwi wyróżnia się wiele podgrup,
różniących się głównie liczbą antygenów na krwinkach. Różnorodność ta
wynika z mutacji w genach kodujących odpowiednie transferazy, które
zmieniają aktywność enzymu i przekładają się na ilościową zmianę

64

ekspresji antygenu. Na tej podstawie zidentyfikowano wiele odmian
głównych grup krwi. W obrębie grupy A wyróżnia się A1, A2, A3, Ax i
Ael, które wykazują kolejno coraz słabszą ekspresję antygenu A. Antygen
B ma odmiany B1, Bx, Bel, wśród których także obserwuje się malejącą
aktywność. Zidentyfikowano także polimorficzne allele 0, wykazujące
znikomą aktywność transferazy A. dziedziczenie grup krwi odbywa się
zgodnie z prawami Mendla.
Układ Rh został odkryty u małpy. Jest to układ antygenowy złożony z
49 serologicznie zdefiniowanych antygenów. Wśród nich wyróżnia się 5
istotnych klinicznie antygenów: D, C, c, E, e, (pozostałych 44 można się
spodziewać na kolokwium). Ich biosynteza zaczyna się w 6 tygodniu
życia płodowego. Geny Rh znajdują się na ramieniu krótkim
chromosomu 1. W locus tym zidentyfikowano geny RHD i RHCE,
powstałe w wyniku duplikacji i wyróżniają się 96% homologią. Obydwa
składają się z 10 eksonów, kodują polipeptydy RHD i RHCE o długości
416 aminokwasów, zawierające determinanty antygenowe układu Rh.
Geny RHD i RHCE zorientowane są wobec siebie przeciwstawnie.
Między nimi znajduje się gen SMP1, którego funkcji dotąd nie poznano.
Gen RHD koduje antygen D, natomiast RHCE antygeny C, c, E, i e. u ok.
85% rasy kaukaskiej (białej) na krwinkach obecny jest antygen D (Rh+),
a u około 15% brak antygenu D (Rh-). Brak ten jest w większości
związany z delecją genu RHD, wskutek nierównomiernego crossing-
over. Antygeny Rh zlokalizowane są na powierzchni błony erytrocytu. W
odróżnieniu od innych układów grupowych polipeptydy te nie zawierają
reszt cukrowych, ale charakterystyczna jest obecność reszt kwasu
palmitynowego. Ekspresja RHD i RHCE następuje jedynie w obecności
glikoproteiny RhAG o strukturze podobnej do tych białek. Wszystkie 3
tworzą kompleks z innymi białkami i glikoproteinami. Brak lub
zredukowana ilość białek tego kompleksu prowadzą do pojawienia się
rzedkiego fenotypu Rh

null

i Rh

mod-

. Funkcja kompleksu białek układu Rh

jest nieznana, ale pewne jest, że pełni on istotną rolę w utrzymaniu
struktury krwinek czerwonych. Brak polipeptydów Rh prowadzi do
skrócenia ich życia, co objawia się niedokrwistością hemolityczną. Geny
warunkujące występowanie antygenów Rh są dziedziczone w postaci
dwóch haplotypów, po jednym od każdego rodzica. Najczęstszymi
haplotypami u rasy białej jest CDe (ok. 40%) i cDE (ok. 15%), pozostałe
występują z częstością poniżej 4%. Antygeny układu Rh występują w
wielu wariantach, czemu winne są punktowe mutacje w obrębie tych
genów. Najsilniejsze właściwości immunogenne ma antygen D. osoby z
genotypem DD lub Dd mają na erytrocytach antygen D, tak więc ich
fenotyp to Rh+. Osoby z genotypem dd określamy jako Rh-. Zaznaczyć
należy jedynie, że allel d nie istnieje, jest to jedynie oznaczenie
utraconego wskutek delecji allelu RhD. Przeciwciała układu Rh (anty-D,
anty-C, anty-c, anty-E i anty-e) są w większości przeciwciałami
odpornościowymi klasy IgG i mogą przechodzić przez łożysko. W
przeciwieństwie do przeciwciał AB0 wytwarzanie przeciwciał anty-Rh
jest stymulowane przez sam antygen Rh. Przeciwciała te są więc

65

wyrazem odpowiedzi immunologicznej na zetknięcie z obcym Rh. Osoby
Rh- nie mają przeciwciał anty-D w osoczu. Powstają one w wyniku
przetoczenia krwi Rh+ lub immunizacji matki-Rh- antygenami Rh+
płodu.

5.

Dziedziczenie mitochondrialne odbywa się po linii matczynej. Uważa
się, że wszystkie mitochondria dziedziczone są po matce z komórki jajowej.
Wskutek tego mutacje matczynego modna są przekazywane całemu
potomstwu.

Należy

zauważyć,

że

ryzyko

wystąpienia

choroby

mitochondiralnej zależy od segregacji mitochondriów do komórek
potomnych. Komórki jajowe kobiety także różnią się zawartością
zmutowanego modna (heteroplazmia). Tak więc nasilenie objawów
klinicznych i ich rodzaj będą odmienne w zależności od liczby i
rozmieszczenia nieprawidłowych mitochondriów w tkankach. Przykładem
choroby związanej z punktową mutacją modna jest dziedziczna neuropatia
nerwu wzrokowego Lebera, powodująca utratę wzroku w centrum pola
widzenia. Chorują najczęściej młodzi mężczyźni, u kobiet objawy pojawiają
się później i są łagodniejsze. W przebiegu choroby na dnie oka obserwuje
się zmiany naczyniowe (teleangiekazje). Utrata wzroku następuje w wieku
10-20lat w ciągu kilku tygodni od wystapienia pierwszych objawów.

Niektóre zespoły aberracji chromosomowych

1.

Aberracje liczbowe chromosomów somatycznych

•

Zespół Downa: trisomia chromosomu 21. występuje raz na 700
urodzeń, kobiety powyżej 35 lat ryzyko wzrasta do 1: 360 i do 1: 100
w wieku 40 lat. Do głównych cech genotypowych należą: olbrzymia
okrężnica (choroba Hirschsprunga), obniżone napięcie mięśniowe,
opuszczone kąciki ust, krótka szyja, wystający język, wrodzone wady
serca, spowolniony rozwój ruchowy i umysłowy, zaburzenia rozwoju
mowy, czasami ADHD lub autyzm dziecięcy. Większość chorych ma
IQ w granicach 35-49, co świadczy o upośledzeniu w stopniu
umiarkowanym.

•

Zespół Patau: trisomia chromosomu 13. występuje w od 1:8000 do
1:12 000 urodzeń. Istnieje zależność między ryzykiem wystąpienia a
wiekiem matki. Występują liczne cechy dysmorficzne i wrodzone
wady rozwojowe takie jak małogłowie, ubytki skóry na głowie,
małoocze, częściowy ubytek siatkówki i naczyniówki oka, płaski
grzbiet nosa, rozszczep podniebienia, poli- i syndaktylia. Tetralogia
Wallota, wodonercze, wnętrostwo u chłopców. Tylko 5-10% dzieci
przeżywa do 1r.ż., większość umiera w okresie noworodkowym.

•

Trisomia chromosomu 8: niewielki lub średni stopień
zahamowania wzrostu, zaburzenia w budowie twarzoczaszki,

66

anomalie kostno- stawowe, wysokie czoło, mała cofnięta żuchwa,
nadliczbowe kręgi i żebra, zez i pogłębione bruzdy w obrębie skóry
dłoni i stóp oraz upośledzenie umysłowe niewielkiego stopnia.

67

•

Zespół Edwardsa: trisomia chromosomu 18, występuje raz na
8 000 urodzeń. Duży wpływ na ryzyko ma wiek matki. Większość ciąż
z trisomią zostaje poronionych w 1 trymestrze. Wady rozwojowe
dotyczą serca (niezrośnięty przewód tętniczy), wystąpienia uchyłków
Meckela, nerki podkowiastej, krótkiego szerokiego mostka,
olbrzymiego pęcherza moczowego, wad kończyn. Występuje
utrudnione oddychanie, napady drgawek i ciężkie zaburzenia
psychoruchowe. 5-10%dzieci przeżywa do 1r.ż

68

Mechanizmy patogenetyczne powstawania wad

wrodzonych

•

Deformacje- wady powstające w ostatnim trymestrze ciąży pod wpływem
czynników mechanicznych działających na rosnący płód. Przyczyną mogą
być nieprawidłowości budowy macicy lub miednicy, a także w przypadku
ciąż mnogich. Do czynników płodowych należą: nieprawidłowe ułożenie
płodu, falowodzie, pierwotne choroby mięśni ograniczające ruchy płodu.
Deformacje dotyczące kości stawów mogą stanowić poważny problem
zdrowotny. Zniekształcenia tkanek miękkich z reguły ustępują po zaniku
czynnika deformującego.

•

Przerwania- dotyczą struktur początkowo prawidłowo rozwijających się.
Mogą być spowodowane niedotlenieniem, wylewem krwi lub zrostem
tkanek. W miejscu przerwania uszkodzone zostają wszystkie struktury, bez
względu na pochodzenie. Występują one sporadycznie, a ich następstwa
zależą od czasu, w którym nastąpiły.

•

Malformacje- są to zaburzenia rozwoju pierwotne, powstałe w okresie
zarodkowym. Dotyczą zaburzeń migracji, proliferacji, apoptozy i
różnicowania. Mogą być efektem nieprawidłowej morfogenezy. Są zwykle
złożone i mają poważne konsekwencje kliniczne. Przykładem jest
holoprosencefalia.

•

Dysplazje- są skutkiem nieprawidłowego różnicowania się komórek tkanki,
co prowadzi do zmian budowy organizmu. Większość dysplazji to choroby
monogenowe; należą tu również naczyniaki i znamiona naczyniowe. Cechy
morfologiczne składające się na dysplazję mogą być widoczne zaraz po
urodzeniu albo u starszych pacjentów.

Duże wady wrodzone

Do wad dużych należą zaburzenia rozwojowe istotnie upośledzające czynność
organizmu, niejednokrotnie skracając życie. Około 2/3 wad z tej grupy to wady
pojedyncze. Należą do nich głównie zmiany w obrębie OUN, takie jak:
małogłowie, przepuklina mózgowa, przepuklina oponowo-rdzeniowa. Także
wady układu pokarmowego (rozszczep wargi i podniebienia, niedrożność
dwunastnicy, zrośnięcie odbytu), serca (ubytek przegrody międzykomorowej,
hipoplazja lewego serca, przerwany arcus aorta) oraz układu moczowego
(nerka podkowiasta, agnezja nerek, zastawka cewki tylnej) należą do wad
dużych. Niektóre z nich prowadzą do wczesnego zgonu (anacefalgia). Niektóre
wymagają interwencji chirurgicznej (niedrożność odbytu). W klasyfikacji ICD10
wady wrodzone i choroby genetyczne zaliczamy do kategorii Q00-Q99, ale
niektóre z wad, jak na przykład naczyniaki (D18) i znamiona barwnikowe(D22)
objęte są innymi kategoriami.

69

Wady OUN

Wodogłowie izolowane

Występuje 0.4/1000 ur. Może być efektem infekcji lub
krwawienia w rozwoju płodowym lub dziedziczone
recesywnie (autosomalnie lub na X) rozpoznawanie w II
trymestrze badaniem USG.

Holoprosencefalia

Zaburzenie rozwoju przodomózgowia. Często towarzyszy
małogłowie, hipoteloryzm oczny, obustronny rozszczep
wargi, w skrajnych przypadkach cyklopia. Z reguły
letalna; zgon do 3 mies. życia. Można diagnozować USG.

Lisencefalia (gładkomózgowie)

Wada powstała wskutek nieprawidłowej migracji
neuronów między 9 a 13 tygodniem życia płodowego.
Upośledzone procesy dojrzewania mózgowia (wtórnie
małogłowie). Może prowadzić do agyrii lub pachygyrii
(całkowity lub częściowy brak zakrętów ).

Wielkogłowie

Wymiary

głowy

przekraczające

3

odchylenia

standardowe w stos. do średniej przy prawidłowych
rozmiarach komór mózgu.

Małogłowie

Wymiary głowy poniżej 3 odchyleń standardowych w
stos. do średniej. Występuje raz na 1000 urodzeń.
Wyróżniamy postać pierwotną (błedy neurogenezy)
orazt wtórne (po 32 tyg. Życia płodowego). Obwód głowy
po urodzeniu prawidłowy, odchylenia pojawiają się z
wiekiem.

Wady cewy nerwowej

Bezmózgowie

Stanowi 40% wszystkich przypadków wad cewy
nerwowej. Występuje 0.75 razy na 1 000 urodzeń.
Obserwuje Si e brak skóry, sklepienia czaszki i tkanki
nerwowej (wada otwarta) lub rzadziej brak struktur
OUN przy zachowanych powłokach (wada zamknięta).

Przepuklina mózgowa

Stanowi 5% wszystkich wad cewy nerwowej. W 95%
wada zamknięta. Stopień uszkodzenia układu zależy od
tego, jakie struktury stanowią jej zawartość. Może być
elementem zespołu Meckela, wtedy obserwujemy
hipoplazję płatów węchowych, wady gałek ocznych i
rozszczep wargi.

Rozszczep kręgosłupa

Ok. 55% wad cewy nerwowej. Wyróżnia się kilka postaci:

•

Rozszczep ukryty- rzadko powoduje kalectwo.

•

Rozszczep torbielowaty- w jego obrębie dwie
formy;

przepuklina

oponowa

(worek

przepuklinowy zbudowany z opony rdzeniowej, a
zawartość to płyn M-R) lub przepuklina
oponowo-rdzeniowa (najczęstszy; worek zawiera
płyn M-R oraz rdzeń lub jego korzenie)

Skutki wady zależą od położenia rozszczepu i stopnia
uszkodzenia rdzenia. 80% przypadków dotyczy ok.
lędźwiowej i lędźwiowo-krzyżowej. Powoduje wtedy
zaburzenia funkcji narządów miednicy mniejszej i
kończyn dolnych.

70

Wady kończyn

Wady ubytkowe

Amelia-

brak

kończyny;

fokomelia-

brak

cz.

proksymalnej kończyny. klasycznym przykładem tych
wad jest teratogenne działanie Talidomidu, stosowanego
jako środek przeciwwymiotny w I trymestrze.
Ubytki poprzeczne- występują raz na 5 000 urodzeń
często z powodu amputacji In utero spowodowanej
pasmami owodni.
Występuje też aplazja kości promieniowej; np. w zespole
Holt-Orama

Palce dodatkowe

Mogą występować osiowo (od str. Promieniowej) lub
pozaosiowo (od łokciowej). Izolowana polidaktylia
występuje jako cecha dominująca z niepełną penetracją,
ale obserwujemy ją też w trisomii chromosomu 13.

Palcozrosty

Może mieć różne postacie. Od skórnej syndaktylii aż po
rozległe palcozrosty obejmujące także tkanki miękkie i
kości. Częstość wady wynosi 1 : 1000 urodzeń. Wadę
obserwuje się w zespole Polanda.

Rozszczepy dłoni i stóp

Występuje z częstością 1: 90 000 urodzeń. Etiologia jest
zróżnicowana. W postaci izolowanej obustronnej wada
może być dziedziczona ze zmienną ekspresją jako cecha
autosomalna dominująca. Obserwowana też w zespole
EEC

Wady układu krążenia

Ubytek przegrody

międzykomorowej

Stanowi 25-24% wszystkich wad krążenia. Występuje 1-3
razy

na

1 000

urodzeń.

Wada

o

etiologii

wieloczynnikowej, może też towarzyszyć aberracjom
chromosomowym, w tym trisomiom 13, 21, 18 i 22 pary.
Spotykana także w dziedziczonych autosomalnie
odminująco zespołach Holt-Orama i Aperta.

Ubytek przegrody

międzyprzedsionkowej

3.4-14% ogółu wad. Polega na braku jednej lub dwóch
części przegrody przedsionków. 80% wad dotyczy
ubytków otworu owalnego. Najczęściej spotykany jako
wada izolowana, a także w przypadku trisomii
chromosomu 21 i 22, z zespołem Holt_Orama, Noonan i
Treacher-Collinsa

dziedziczonymi

autosomalnie

dominująco.

Kanał przedsionkowo-komorowy

Stanowi 5-7.5% wad. Może istnieć jako wada izolowana,
często jednak występuje w trisomii chromosomu 21.

Przetrwały przewód tętniczy

Ok. 10% wszystkich wad. Częstość znacznie większa u
wcześniaków, trzykrotnie częściej u dziewczynek.
Występuje w polisemii 49 XXXXY, trisomii 13,18,21 pary
i delecjach 4p i 5p.

Zespół hipoplazji lewego serca

1.4-5.7% wad wrodzonych. Rzadko występuje rodzinnie.
Obserwowany

wśród

pacjentów

z

trisomią

18

chromosomu

Nadastawkowe zwężenie aorty

1-2% przypadków wad serca. Sporadycznie występuje
jako cecha występująca dominująco. Jest najczęstszą
wadą układu krążenia obserwowaną u chorych z
zespołem Williama. Zwężenie narasta z wiekiem
pacjenta.

71

Koarktacja aorty

5-8% wszystkich wad serca. Częściej występuje u
chłopców.

Stosunkowo

często

spotykana

przy

monosomii chromosomu X, obserwowana także w
zespole Aperta.

Wady stożka i pnia naczyniowego

Do tej grupy należy m.in. tetralogia Fallota, atrezja
zastawki tętnicy płucnej z ubytkiem przegrody
międzykomorowej, odejście obydwu tętnic z prawej
komory i wspólny pień tętniczy. Wady tej grupy cechują
zespół DiGeorge’a.

Zastawkowe zwężenie tętnicy

płucnej.

10% ogółu wad. Jako wada izolowana wystepuje z
częstością 2-4% u rodzeństwa. Obserwowana w trisomii
chromosomu 18 i zespole Noonan

Wady układu pokarmowego

Wady przedniej ściany brzucha

Skutkują nieprawidłowym położeniem jelit, często także
wątroby i śledziony. Występują raz na 6000 ciąż.
Możliwe do wykrycia w okresie prenatalnym, możliwe do
korekcji chirurgicznej. Jedną z nich jest przepuklina
sznura pępowinowego, polegająca na obecności worka
przepuklinowego zawierającego wątrobę i/lub jelito, do
którego

wierzchołka

przytwierdzony

jest

sznur

pępowinowy.

Przepuklina przeponowa

Wystepuje 1: 2 000-3 000 urodzeń. Niemal 96%
przypadków dotyczy tylno bocznej przepony, najczęściej
lewostronnie. Mogą być przyczyną wtórnej hipoplazji
płuc. Nawet niewielkie ubytki przepony mogą być groźne
dla życia. W około Połowie przypadków współistnieje z
innymi wadami.

Rozszczep wargi/podniebienia

Występuje raz na 1000 urodzeń jako wada izolowana o
dziedziczeniu wieloczynnikowym, a także towarzysyz
wielu zespołom wad.

Niedrożność przełyku

1: 3 000 urodzeń żywych. U większości współistnieje z
przetoką tchawiczo-przełykową. Wada ta jest groźna dla
życia noworodka, szczególnie w przypadku przetoki.

Wrodzone zwężenie odźwiernika

1: 200 chłopców i 1: 1000 dziewcząt. Do objawów należą
nasilone wymioty i przerost odźwiernika wyczuwany
badaniem

palpacyjnym.

Konieczna

jest

korekcja

chirurgiczna.

Wrodzona niedrożność jelit

Występuje u 1 na 330 noworodków. Może obejmować
każdy odcinek jelita. Zrośnięcie dwunastnicy jest w 60-
70% wadą izolowaną. Rozpoznanie prenatalne może
nastąpić przy badaniu USG i wskazuje na wykluczenie
trisomii chromosomu 21.

Choroba Hirschprunga

1: 5 000 noworodków z przewagą płci męskiej (3:1). Do
objawów należą zaparcia i wzdęcia spowodowane
brakiem zwojów podśluzówkowych i mięśniowych
końcowego odcinka jelita grubego. Choroba ma
heterogenną etiologię

72

Wrodzone wady nerek i układu moczowego

Agnezja nerek

Jednostronny brak nerki nie daje objawów klinicznych i
rozpoznawany jest przypadkowo. Agnezja obustronna
jest wadą o powaznym rokowaniu prowadzącą do zgonu
w okresie noworodkowym. Występuje raz na 3000
urodzeń, częściej u płci męskiej. Brak nerek prowadzi do
małowodzia, które skutkuje sekwencja Potter.

Torbielowatość nerek w postaci

dorosłej

1:

1

000

urodzeń.

Dziedziczona

autosomalnej

dominujaco. Torbiele mogą się umiejscawiać na
nerkach, wątrobie, śledzionie i trzustce; początkowo nie
dając żadnych objawów. W czwartej dekadzie życia wada
ujawnia się w postaci postępującego zaburzenia funkcji
nerek oraz nadciśnienia tętniczego.

Torbielowatość nerek dziecięca

Dziedziczna autosomalnie recesywnie. objawia się obec-
nością licznych torbieli wątroby i nerek. Torbiele nerek
są efektem rozdęcia kanalików zbiorczych. W wątrobie
obserwujemy włóknienie i nieprawidłowy rozwój dróg
żółciowych. Pierwsze objawy w dzieciństwie. Obserwu-
jemy też przebieg ciężki z początkiem objawów w okresie
noworodkowym.

Dysplazja wielotorbielowata nerek Nazywana również uropatią obturacyjną. Występuje

sporadycznie, zwykle jako skutek przeszkody w odpływie
moczu. Najczęstszą przyczyną jest obecność zastawek
cewki moczowej. Występuje znacznie częściej u płodów
płci męskiej. W skrajnej sytuacji prowadzi do zniszczenia
struktur nerki

73

Choroby jednogenowe

Autosomalne dominujące:

•

Achondroplazja: najczęściej występująca niskorosłość, wystepująca raz na
15 000-40 000 urodzeń. Przyczyną jest mutacja w receptorze FGFR3,
powodująca upośledzenie wzrostu. Do objawów należy skrócenie odcinków
proksymalnych kończyn, pogrubienie kości długich, wydatne czoło,
powiększona głowa przy tułowiu normalnych rozmiarów. Obniżony wzrost
(ok. 120-13o cm), małe sześcienne trzony kręgów. Heterozygoty żyją 10-15
lat krócej niż średnia zdrowych ludzi. Homozygoty umierają tuż po porodzie
wskutek niewydolności mm. oddechowych.

•

Zespół Marfana: dziedziczne zaburzenie biosyntezy składników tkanki
łącznej. Występuje 1-2 razy na 10 000 urodzeń, 25% to mutacje de novo.
Zaburzenie polega na zakłóceniu syntezy glikoproteiny; fibrylny 1, co
powoduje defekty substancji międzykomórkowej. Objawy związane są z
uszkodzeniem

włókien

sprężystych

i

występowaniem

nadmiernie

rozciągliwej tkanki łącznej. Dochodzi do nadmiernego wzrostu kości długich
i zaburzenia proporcji ciała oraz wydłużenia palców (arachnodaktylia) oraz
lejkowatego kształtu klatki piersiowej. Główną przyczyną zgonów są wady
aorty.

•

Choroba Huntingtona: występuje 4-7 razy na 100 000 urodzeń.
Odpowiedzialność za nią ponosi gen IT-15 zlokalizowany w 4p16.3, kodujący
białko Huntyngtynę, które jest obecne w cytoplazmie wielu komórek i jest
związane z cytoszkieletem i pęcherzykami synaptycznymi neuronów oraz
transportem akrosomalnym. Choroba jest wynikiem niestabilnej liczby
powtórzeń sekwencji (CAG)n, kodującej Glu. U zdrowych występuje 10-29
powtórzeń, 30-35 w stanie permutacji a większa niż 36 liczba warunkuje
rozwój choroby. Zmutowane białko tworzy nierozpuszczalne wtręty w
neuronach oraz zakłóca transkrypcję. Objawami choroby są: zmiany
neuropatologiczne, spadek masy ciała, zaburzenia psychiczne, w tym
osobowości, wahania nastroju, trudności w uczeniu się, hiperkinezy
objawiające się ruchami pląsawicznymi, narastające otpępienie, a w fazie
zaawansowanej sztywność mięśni. Postępująca degeneracja OUN prowadzi
do spadku sprawności a w końcu do śmierci. Najczęściej pierwsze objawy
występują ok. 4. dekady życia. W kolejnych pokoleniach choroba pojawia się
w coraz młodszym wieku (p. ekspansja tripletów). Śmierć następuje w 10-25
lat od pojawienia się objawów.

Autosomalne recesywne

•

Fenyloketonuria: w chorobie następuje kumulacja fenyloalaniny w
organizmie wskutek defektu jednego z metabolizujących ją enzymów.
Występowanie to ok. 1: 10 000. gromadzenie Phe powoduje wtórne
zaburzenia

metaboliczny

Tyr

i

Trp.

Dochodzi

do

deficytu

neurotransmitterów. Objawy pojawiają się w pierwszych tygodniach życia.
Są to: mysi zapach moczu, zmniejszenie syntezy melanin, opóźnienie

74

rozwoju psychoruchowego, w pełni rozwinięta choroba prowadzi do
ciężkiego upośledzenia IQ (20-40). Występować może nadpobudliwośc i
agresja. Leczenie opiera się na diecie ubogiej w Phe.

•

Mukopolisacharydoza:

związana

z

nadmiernym

gromadzeniem

mukopolisacharydów w tkance łącznej. Objawia się pogrubieniem skóry,
przepukliną pępkową i pachwinową, niskorosłością, upośledzeniem
umysłowym, hepatosplenomegalią i charakterystycznym kształtem palców.
Wystepuje od 1 na 25 000 do 1 na 500 000 urodzeń

•

Albinizm: następstwo zaburzeń syntezy melanin. Osoby dotknięte chorobą
mają białą skórę z różowym odcieniem, białe włosy i różowe lub niebieskie
tęczówki, co skutkuje zwiększoną wrażliwością na promienie słoneczne.
Występuje z częstością 1: 35 000 osób.

•

Mukowiscydoza: 1: 2 000-4000 urodzeń. Polega na mutacji genu CFTR
kodującego regulator transportu jonów, którego funkcją jest transport jonów
chlorkowych przez błony. Prowadzi to do zwiększonej absorpcji jonów
sodowych i wody w komórkach nabłonkowych, co powoduje powstanie
gęstego śluzu zalegającego w wyścielonych nabłonkiem przewodach.
Konsekwencją tego są częste infekcje, niewydolność trzustki ze
zwłóknieniem torbielowatym i wzrost poziomu elektrolitów w pocie. Przez
analizę potu można chorobę zdiagnozować. Może dochodzić do
odwodnienia, azoospermii wskutek niedrożności nasieniowodów. Chorobę
charakteryzuje zmienne nasilenie objawów u osób z tą samą mutacją

•

Anemia sierpowatokrwinkowa: występuje często w Afryce, basenie
morza śródziemnego i u Afroamerykanów. Przyczyną jest mutacja w genie
hemoglobiny powodująca powstanie nieprawidłowej postaci białka(HbS), co
z kolei prowadzi do zmian kształtu krwinek na sierpowaty. Erytrocyty
wadliwe są usuwane przez śledzionę, co prowadzi do anemii. Choroba jest
jednak na terenie Afryki „korzystna” gdyż nosicielstwo tej mutacji chroni
przed zarażeniem zarodźcami. Objawy: stan zapalny i wtórne uszkodzenia
narządów wskutek zatorów, niedokrwistość.

Sprzężone z chromosomem X

•

Zespół łamliwego chromosomu X: 1: 4000 urodzeń u mężczyzn i
1: 8000 u kobiet. Defekt polega na uszkodzeniu genu FMR1, kodującego
białko wiążące RNA. mutacja polega na ekspansji tripletu, co prowadzi do
zmetylowana genu, które powoduje z kolei zanik jego ekspresji. Objawy:
niska masa urodzeniowa, mały obwód głowy, zwiększona objętość jąder,
duże małżowiny uszne i hipotonia mięśniowa. Obserwuje się objawy
autyzmu, zaburzenia mowy i opóźnienie rozwoju psychoruchowego. U
dorosłych deformacje twarzoczaszki, wydatne guzy czołowe, bladoniebieskie
tęczówki, powiększenie jąder, zniekształcenie kręgosłupa, szerokie ręce i
krótkie palce, enceflopatie i objawy padaczki. Przy pełnej mutacji średnie iq
u mężczyzn wynosi ok. 40. jeśli metylacja FMR jest niekompletna iq jest na
normalnym poziomie. Kobiety z pełną mutacją mają iq w granicach normy,
średnio u 1/3 występują deformacje twarzoczaszki.

75

•

Hemofilia A i B: zaburzenia krzepliwości spowodowane brakiem jednego z
czynników krzepnięcia (więcej samemu doczytać bo to wręcz licealne).
Obniżona krzepliwość prowadzi do ciężkich krwotoków oraz wylewów krwi
do jam dużych stawów.

76

Wektory i terapia genowa

Fragmenty DNA pocięte restryktazą mogą był łączone z innym odcinkiem DNA

(wektorem) trawionymi tą samą restryktazą. Końce DNA badanego i wektora
mogą zostać połączone za pomocą ligazy. Wektory dzielimy na:

•

Autonomiczne: replikują się niezależnie od genomu gospodarza.

•

Integracyjne: włączają do jego DNA są bardziej stabilne, ale występują w
mniejszej liczbie kopii. Należą tu między innymi wektory retrowirusowe.

•

Ekspresyjne: mają na celu zapewnić efektywną ekspresję wszczepianego
genu.

•

Wektory wahadłowe (bifunkcjonalne): mogą występować w co
najmniej dwóch różnych organizmach, przy czym można je przenosić
między komórkami prokariotycznymi i eukariotycznymi.

Dobór odpowiedniego typu wektora zależy od rodzaju komórki, w jakiej

zamierzamy klonować dany fragment DNA. Najważniejszym funkcjonalnym
elementem wektora są sekwencje Ori, odpowiedzialne za inicjację replikacji, które
muszą być odpowiednie dla wybranego organizmu. Istotną cechą wektorów jest
obecność w nich sekwencji markerowych, kodujących np. konkretne cechy
fenotypowe danego organizmu, które dadzą się łatwo zauważyć lub geny
odporności na antybiotyki.

Do najważniejszych wektorów używanych w medycynie należą:

•

Plazmidy bakteryjne: pozachromosomowe cząsteczki DNA, wielkości
kilku-kilkuset tysięcy PZ, zdolne do samodzielnej replikacji u prokaryota i
niektórych eucaryota. Plazmidy są przenoszone w procesie koniugacji
między komórkami bakteryjnymi

•

Wektory fagowe: są to wirusy infekujące bakterie przez aktywne
wstrzyknięcie swojego DNA do wnętrza komórek. Ich namnażanie jest
bardzo szybkie. Najlepiej poznanym jest fagλ, który może być używany jako
wektor do infekowania E. Coli. DNA faga może zostać zamienione
miejscami z jakimś odcinkiem bakteryjnego, włączając się tym samym do
genomu lub wnikać do niego na zasadzie insercji. Z kolei fag M13 ma
mniejszy plazmid (6tys pz) ale nie powoduje lizy komórki po namnożeniu.

•

Kosmidy: używane w klonowaniu dużych odcinków DNA (do 45 kpz).
Składają się z sekwencji plazmidu z miejscem Ori, połączonych z sekwencją
cos faga λ, koniecznej do upakowania DNA w kapsydy.

•

Wektory drożdżowe:

•

Sztuczne chromosomy drożdżowe: posiadają sekwencje centromeru,
telomeru i inicjacji replikacji, które łączy się z plazmidami. Są doskonałe do
badania ekspresji genów.

•

Sztuczne chromosomy bakteryjne: są bardziej stabilne od
drożdżowych i łatwiej się nimi transformuje E.Coli, a także łatwiej namnaża
i izoluje.

77

•

Wektory eukariotyczne ssaków: jednymi z pierwszych były te oparte o
wirusa SV40. zawierają one fragmenty DNA wirusa z sekwencją ori,
promotory genów kodujące wczesne białka wirusa oraz sekwencje
odpowiedzialne za inicjację transkrypcji.

•

Sztuczne chromosomy ssaków

•

Nośniki syntetyczne: praktyczne zastosowanie mają liposomy, czyli
cząsteczki lipidów o charakterze kationowym, zawierające egzogenny DNA
wprowadzony za pomocą plazmidu. Liposomy mogą wprowadzać odcinki
DNA o rozmiarach do 150 kpz. Charakteryzują się one niską
immunogennością

i

dużą

pojemnością.

Zmodyfikowane

przez

skompleksowanie z gangliozydem GM1 czyni je niewidzialnymi dla
makrofagów. Innymi wektorami chemicznymi są polipeptydy kationowe.

Terapia genowa

Polega na wprowadzeniu prawidłowego genu do komórki w której występuje on

w formie uszkodzonej lub nie występuje w ogóle. Terapia musi być poprzedzona
testami In vivo oraz In vitro. Konieczne jest użycie odpowiednich wektorów.
Wskaźnikiem sukcesu terapii jest pojawienie się ekspresji danego genu. Pacjenci
poddani terapii genowej musze pozostawać pod ścisłą kontrolą w celu oceny
efektów leczenia i wykrycia ewentualnych skutków ubocznych. Obecnie jedyną
dopuszczalną metodą jest wprowadzanie wektorów do komórek somatycznych.
Modyfikacja komórek linii płciowych jest ze względów etycznych zabroniona.

Strategie terapii genowej:

•

Ex vivo: polega na pobraniu od chorego komórek do celowych i
wprowadzeniu genu In vitro. Kolejnym etapem jest ponowne
wprowadzenie komórek do organizmu.

•

In vivo: polega na wprowadzeniu terapeutycznego genu bezpośrednio do
tkanek.

Rodzaje terapii genowej

•

Dodawanie genów: gen uszkodzony pozstaje w swoim locus, a gen
terapeutyczny jest wprowadzony w inne miejsce chromosomu.

•

Zamiana genów: polega na wymianie genu zmutowanego na gen
prawidłowy w procesie somatycznej rekombinacji homologicznej.

•

„doskonalenie genomu”: dodanie genu, który nie zastępuje żadnego
innego, ale koduje substancje, które fizjologicznie nie są produkowane
przez komórkę. Mogą to być geny kodujące rybozymy, białka wirusowe i
interleukinę 2. produkty genu wprowadzonego wpływają na ekspresję
innych.

Próby terapii genowej u ludzi
Do roku 2010 odbyły się 1644 próby kliniczne terapii genowe u ludzi, z czego

ponad 900 przeprowadzono po roku 2000. najwięcej z nich dotyczyło chorób
nowotworowych, na drugim miejscu znalazły się choroby sercowo-naczyniowe.

78

Terapia genowa w niektórych chorobach

•

Mukowiscydoza: próby dotyczą głównie skorygowania defektu
genetycznego komórek oskrzeli, gdyż objawy płucne są w chorobie
najgroźniejsze. Najczęstszymi wektorami są w tym przypadku
adenowirusy, ostatnio też lentiwirusy. Transgen (CFTR) w odpowiednim
wektorze wprowadza się drogą wziewną. Głównym problemem jest
wprowadzenie wektora do komórek, gdyż spotyka się on z odpowiedzią
odpornościową. Z powodu wymiany komórek nabłonka terapia musi być
regularnie powtarzana. Do przywrócenia prawidłowego stanu organizmu
wystarczy 10% ekspresja CFTR.

•

Choroby układu naczyniowego: próby koncentrują się na chorobie
niedokrwiennej serca i kończyn. Z dużym sukcesem prowadzi się próby
wprowadzania genów kodujących substancję wzmagające angiogenezę,
np. VEGF czy jeszcze skuteczniejszy FGF-4. prace dotyczą też
ograniczenia restenozy (ponownego zwężenia) po angioplastyce. Stosuje
się tu geny kodujące rybozymy ograniczające proliferację mięśni gładkich,
która w nadmiarze powoduje zwężenie naczyń. Wyniki badań w kierunku
walki z miażdżycą są mniej obiecujące, co wynika z trudności w
otrzymaniu odpowiedniej ekspresji czynnika angiogennego i jego
utrzymania aż do zajścia procesu. Innym podejściem jest wszczepianie
naczyń żylnych modyfikowanych ex vivo chorym na chorobę zarostowo-
zakrzepową.

•

Hipocholesterolemia rodzinna: terapia przebiega ex vivo na
pobranym fragmencie wątroby przy namnożeniu hepatocytów In vitro i
wprowadzeniu do nich za pomocą retrowirusów genu kodującego
receptor dla LDL, a następnie ponownym wszczepieniu tych komórek do
wątroby chorego poprzez żyłę krezkową. Zabieg taki powtarza się
trzykrotnie, ale skuteczność nie jest wysoka.

•

Choroba Parkinsona: we wszystkich próbach wykorzystuje się wektory
AAV. Pierwsze próby polegały na wprowadzeniu do jądra podwzgórza
genu dekarboksylazy kwasu glutaminowego, którego produkt pośredniczy
w syntezie GABA. Inną metodą jest wprowadzenie genu dla neuturyny,
który która pobudza różnicowanie neuronów dopaminergicznych. Trzecią
opcją jest terapia ciała prążkowanego genem dekarboksylazy L-
aminokwasów aromatycznych.

•

AIDS: pracę postępują w trzech kierunkach. Jednym z nich jest
wprowadzenie do komórek hematopoetycznych transgenu powodującego
niewrażliwość na infekcję wirusową HIV. Inną metodą jest dostarczanie
transgenu do limfocytów t CD 4i 8. trzecią metodą ma być immunizacja
antygenami wirusa HIV, która wywoła odporność na wirusa.

•

Choroba Huntingtona: prace polegają na uzyskaniu nadekspresji
rzęskowego czynnika neurotroficznego CNTF, redukującego obumieranie
prążkowia. Do komory bocznej mózgu wstrzykuje się półprzepuszczalną
kapsułkę ze zmodyfikowanymi komórkami nerki chomika. Kapsułkę
wymienia się co 6 miesięcy. W pierwszych badaniach klinicznych tej

79

metody otrzymano zadowalające efekty. W badaniach prowadzonych u
naczelnych osiągnięto całkowitą korekcję fenotypu.

•

Choroba Alzheimera: pierwsza próba, przeprowadzona w 2001 roku
polegała na wprowadzeniu do przodomózgowia komórek wykazujących
ekspresję czynnika wzrostu nerwów NGF stymulującego neurony
cholinergiczne. Komórki implantowane to autologiczne fibroblasty.

Terapia genowa nowotworów

•

Immunoterapia: polega na uczynieniu Komorek nowotworowych
„widocznymi” dla układu immunologicznego, przez zmodyfikowanie ich
genami kodującymi cytokin takie jak TNFα. Prowadzi to do zwiększenia
prezentacji antygenów przez komórki nowotworowe i w efekcie rekrutacji
specyficznych limfocytów T i B.

•

Wirusy onkolityczne: wektory tego typu wybiórczo niszczą komórki
nowotworowe, pozostając nieszkodliwe dla prawidłowych. Wirusy
namnażają się w komórkach nowotworowych i po jej rozpadzie atakują
kolejne. W pierwszej próbie wykorzystano zmodyfikowane wirusy,
namnażające się w komórkach pozbawionych białka p53. innym
wykorzystywanym wirusem jest zmodyfikowany Hermes simplex
stosowany w raku piersi i trzustki.

•

Kompensacja mutacji: polega na inhibicji funkcji onkogenu i
przywróceniu funkcji genu supresorowego dzięki:

o

Zatrzymaniu transkrypcji onkogenu przy pomocy antysensownych
oligonukleotydów tworzących strukturę podwójnej helisy

o

Zatrzymania translacji mRNA określonego onkogenu przez
zastosowanie jak wyżej antysensownych sekwencji

o

Zablokowanie funkcji onkoprotein

o

Zastąpienie

zmutowanych

form

genów

p53,

czy

RB1

niezmutowanymi.

•

Terapia stosująca geny samobójcze: jest to przykład molekularnej
chemioterapii. Próby kliniczne obejmują:

o

Transfer genu kinazy tymidyniowej zwiększającej podatność na
aciklovir

o

Transfer genu deaminazy cytozynowej, powodujący podatność na 5-
fluorocytozynę

o

Transfer genu cytochromu P450 2B wzmacniający podatność na
cyklofosfamid.

Ogółem geny samobójcze kodują produkty, które przekształcają podany do
organizmu substancję (prolek) w trujące metabolity indukujące apoptozę.
Produkty toksyczne mogą też być niebezpieczne dla zdrowych komórek
sąsiednich. Dzięki tej metodzie dokonano przełomu w walce z glejakiem
mózgu.