(Microsoft Word - Zarys biologii molekularnej dla student\363w kierunku lekarskiego.doc)

Spis treści

Struktura jądra komórkowego i chromatyny

Mutacje i mechanizmy naprawy DNA

Wpływ leków Cytostatycznych na kwasy nukleinowe

Cytogenetyczne i bakteryjne testy monitorowania skutków
zanieczyszczeń środowiska.

Rola komórek macierzystych i inżynierii tkankowej w regeneracji.

Metody stosowane w biologii molekularnej

Regulacja ekspresji genów u eucaryota

Epigenetyka

Molekularnej podstawy starzenia się

Kontrola genetyczna determinacji płci

Podstawy cytogenetyki człowieka

Podstawy mechanizmów zmienności i dziedziczenia

Mechanizmy patogenetyczne powstawania wad wrodzonych

Wektory i terapia genowa

Struktura jądra komórkowego i chromatyny

Jądro komórkowe: najczęściej jest kształtu kulistego i występuje jako

pojedyncze organellum. Składa się z trzech części: macierzy jądrowej,
chromatyny i jąderka.

Macierz  jądrowa:  jest  roztworem  białek,  cukrów,  jonów  i  nukleotydów.
Zawieszone  w  niej  są  chromatyna  i  jąderko.  Zanurzony  w  niej  jest  także
białkowy szkielet usztywniający i utrzymujący kształt jądra. Jest on zbudowany
z  różnych  białek,  spośród  których  największym  wrzodem  na  dupie  każdego
studenta  są  laminy.  Odkryto  je  w  1974r.  poprzez  stopniową  ekstrakcję
elementów  jądra  przy  udziale  detergentów  (metoda  Berezneya  i  Coffeya).
Częśćchromatyny pozostaje w ścisłym związku z białkami otoczki. Nielaminowe
białka,  wchodzące  w  skład  wewnątrzjądrowej  sieci  włóknistej  nazywa  się
matrynami.  Matryny  mają  strukturę  włóknisto-ziarnistą.  Oznacza  się  je
symbolami literowymi lub cyfrowymi (np. 1,2,3…). Mają one różne właściwości
w zależności od typu komórki e.g. matryna F/G wiąże się z DNA przy pomocy
palców cynkowych (p. regulacja ekspresji genów). Analiza składu peptydowego
macierzy jądrowej może być pomocna w diagnostyce nowotworowej.
DNA  macierzy  jądrowej:  w  jądrze  wyróżnia  się  dwie  klasy  DNA:  główną
(75%)  i  stowarzyszoną  z  macierzą  białkową  (sami  zgadnijcie  ile%).  DNA
stowarzyszony  z  macierzą  można  rozdzielić  na  rozpuszczalny  oraz
resztkowy,  stanowiący  ok.  1%  całości  DNA,  związany  ze  strukturą  macierzy
jądrowej,  tworzący  z  nią  sieć  włókien.  Prawdopodobnie  umożliwia  on
prawidłowe rozmieszczenie długiej nici DNA w jądrze.
RNA  macierzy  jądrowej:  w  jądrach  występuje  hnRNA  (niejednorodny
jądrowy),  sarna  (mały  jądrowy)  i  śladowe  ilości  rRNA.  W  macierzy  wykryto
duże ilości prekursorowego rRNA i mRNA.

Chromatyna: zbudowana jest z nici DNA związanej z białkami pistonowymi i
niehistonowymi. Dzieli się ją na:

•

Euchromatynę: występuje pod postacią bardzo cienkich nici, składa się
z

rozwiniętych

odcinków

chromosomów,

niewidocznych

pod

mikroskopem  świetlnym.  Jest  czynna  transkrypcyjnie  i  zajmuje  7-10%
całej  chromatyny  jądrowej.  Występujące  w  niej  sekwencje  unikatowe
kodują  geny  strukturalne.  Ilość  DNA  zależy  od  zaawansowania
ewolucyjnego  organizmu,  aczkolwiek  jest  bardzo  zmienna  ze  względu  na
występowanie

sekwencji

powtarzalnych,

które

dzielimy

tandemowe i rozproszone. Sekwencje tandemowe ulegające
transkrypcji to odcinki kodujące rRNA, 5S RNA i tRNA. Pozostałe
sekwencje

tandemowe

DNA

satelitarny,

nietranskrybowany.

Euchromatyna  w  stanie  nieaktywnym  występuje  między  innymi  w
plemnikach, jądrach ptasich erytrocytów lub jako ciałko Barra w żeńskich
komórkach  ssaków.  W  przeciwieństwie  do  heterochromatyny,  która
zawsze  pozostaje  nieaktywna,  euchromatyna  skondensowana  może
odzyskać zdolność  tranksrypcyjną.

•

Heterochromatynę: zbudowaną z krótkich sekwencji ułożonych
tandemowo i powtórzonych w każdym genomie milion i więcej razy. Nie
zawiera

sekwencji

kodujących,

poza

nielicznymi

wyjątkami

(transpozony). W chromosomach znajduje się ona w ściśle określonych
miejscach, np. w okolicach centromerów lub telomerów.

Nukleosomowa  budowa  chromatyny:  chromatyna  jest  zbudowana  z
dwóch  splecionych  nici  DNA,  tworzących  helisę  o  średnicy  2  nm,
nawiniętych na oktamery histonowe. Podstawową jednostką strukturalną
chromatyny  jest  nukleonom  złożony  z  rdzenia  pistonowego  o  średnicy
10nm  i  owiniętej  wokół  niego  cząsteczki  DNA  o  długości  166-200  pz.
Pomiędzy  nukleosomami  znajduje  się  DNA  łącznikowy  o  długości  10-95pz.
W rejonach łącznikowych występują histony H1, stabilizujące nić. Kolejnym
poziomem  organizacji  jest  układanie  się  nukleosomów  w  splot  o  skoku  6
nukleosomów  i  grubości  11nm.  Następnie  włókno  to  wytwarza  pętle
(domeny), które skracają je i pogrubiają do 300nm. Zespoły domen tworzą
następnie  grona  I  i  II  rzędu  i  długości  10

-3*10

pz. Tak uorganizowane

włókno ulega dodatkowej kondensacji i skróceniu, tworząc chromosomy.

Otoczka  jądrowa:  odgradza  jądro  od  cytoplazmy.  Zbudowana  jest  z  dwóch
błon  i  wyściółki  podosłonkowej  (laminy).  Osłonka  jądrowa  perforowana  jest
licznymi  porami  jądrowymi,  w  których  znajdują  się  złożone  kompleksy
białkowe  poru.  Zewnętrzna  błona  osłonki  jest  podobna  do  siateczki
śródplazmatycznej,  z  kolei  wewnętrzna  cechuje  się  odmiennym  składem
białkowym.  Na  szczególną  uwagę  zasługują  białka  receptorowe  dla  białek
laminy  B:  emeryny  i  murimy  i  wiele  innych.  Błonę  zewnętrzną  oddziela  od
wewnętrznej  przestrzeń  zwana  cysterną  perynuklearną  o  szerokości  20-
40nm. Wewnętrzna wyściółka białkowa osłonki zbudowana jest z trzech typów
białek: Laminy A, B1 i B2. wyściółka stanowi szkielet oraz miejsce kotwiczenia
chromosomów.  Jej  białka  ulegają  w  późnej  profazie  fosforylacji,  stając  się
rozpuszczalne (p. regulacja cyklu kom.).
Pory  osłonki  jądrowej:  są  hydrofilową  drogą  transportu  substancji  między
cytoplazmą i jądrem. Ilość porów w osłonce jest różna i zależy od gatunku, typu
komórki  i  jej  stanu  fizjologicznego.  Jądra  plemników  nie  mają  porów.  W
miejscu tworzenia się poru łączy się błona zewnętrzna i wewnętrzna, formując
otwór,  w  którym  tkwi  kompleks  białkowy  poru  o  średnicy  zewnętrznej  120-
140nm,  przebity  kanałem  o  średnicy  9nm.  Białka  tworzące  kompleks  nazywa
się  nukleoporynami.  Kompleks  składa  się  z  trzech  pierścieni  białkowych
połączonych pionowo i poziomi ośmioma włóknami. Środek pierścienia zajmuje
kompleks  transportujący,  w  którym  przebiega  kanał  porowy  wypełniony
bezpostaciową substancją. Jądrowa część kompleksu ma formę zwężającego się
ku  końcowi  kosza  złożonego  z  ośmiu  filamentów.  Kompleksy  te  ulegają
rozpadowi w czasie mitozy i odbudowie w późnej telofazie.
Transport  jądrowo  cytoplazmatyczny:  można  go  podzielić  na  dwie
kategorie:
1. Makrocząsteczki wchodzące w interakcje z białkami kompleksu porowego

2. makrocząsteczki wchodzące w interakcje z białkami kompleksu porowego za
pośrednictwem innych białek.
Pierwotnie  podejrzewano,  że  szybkość  transportu  zalezy  od  masy  cząsteczki,  a
jej  wartość  rzędu  50  kDa  jest  graniczna  i  wszystkie  cięższe  transportowane  są
bardzo  długo,  aż  24godziny.  Okazuje  się  jednak  że  istotną  rolę  w  szybkośc
transportu  odgrywa  rola  białka  transportowanego  w  procesach  jądrowych.
Transport  białek  z  cytoplazmy  do  jądra  (import)  odbywa  się  z  udziałem
sekwencji lokalizującej NLS, z kolei cząsteczki eksportowane (głównie RNA)są
wyposażone w sekwencje NES. Obie sekwencje rozpoznawane są przez białka z
grupy  importyn.  Transport  jądrowy  uzależniony  jest  także  od  cyklicznej
przemiany GTP w GDP z udziałem białka Ran-GTP.
Etapy transportu jądrowo-cytoplazmatycznego
1.

Importyny alfa i beta rozpoznają sekwencję NLS, przyłączoną do białka
importowanego.

Importowany kompleks przesuwa się w kierunku kanału porowego.

kompleks jest transportowany do jądra z udziałem Ran-GTP. W
nukleoplazmie czynniki transportujące oddysocjowują.

Importyna beta zostaje przejściowo połączona z kompleksem porowym, by
wrócić do cytoplazmy

Importyna alfa wraca do cytoplazmy.

Transport  przy  udziale  importyn  jest  aktywny  ze  względu  na  ich  znaczne
rozmiary.  na  przebycie  tej  drogi  zużyta  zostaje  energia  z  ok.  10cz.  GTP,
aczkolwiek  są  to  jedynie  domysły,  gdyż  niektórzy  naukowcy  dowodzą,  że
transport  ten  tak  naprawdę  wcale  nie  wymaga  energii,  i  zużywana  jest  ona
jedynie do odnowienia nośników białkowych.

Jądra  dodatkowe:  poza  opisanymi  powyżej  strukturami  w  jądrach
komórkowych  spotyka  się  czasami  także  kilka  innych.  Zalicza  się  tu  włókna
okołochromatynowe,  ziarnistości  okołochromatynowe,  ziarnistości
międzychromatynowe i ciała jądrowe. Te ostatnie dzielimy na dwie klasy;
proste  i  zwinięte.  Na  szczególną  uwagę  zasługują  ciała  jądrowe  zwinięte,
posiadające  białko  p80-koilinę,  a  także  czynniki  odpowiedzialne  za  składanie
mRNA,  czynniki  regulujące  dojrzewanie  rRNA  i  formowanie  końca  3’mRNA
histonów. Mają one postać włóknistą, kolisto zwiniętą, o średnicy o.1-10 µm.
Wyższą  klasą  od  ciał  jądrowych  są  jądra  dodatkowe.  Są  one  zamknięte  w
osłonce  jądrowej  i  posiadają  pory.  Wewnątrz  znajdują  się  zbudowane  z
ziarnistego  materiału  zawierającego  RNA  i  białka  kuliste  pseudojąderka.
Jądra  dodatkowe  powstają  przez  pączkowanie  z  jądra  komórkowego  wraz  z
osłonką.  Po  uformowaniu  jądra  dodatkowe  umiejscawiają  się  w  pobliżu  błony
cytoplazmatycznej. Na  dzień  dzisiejszy  na  temat  ich  funkcji  w  komórce gówno
wiemy.

Jąderko: występuje u większości komórek eukariotycznych za wyjątkiem
plemników i ptasich erytrocytów. Ich wielkość zależy od intensywności syntezy
białek w komórce. Ich zadaniem jest synteza prekursorowego rRNA na matrycy
rDNA, a następnie formowanie jednostek tworzących rybosomy. Powstają one z
odcinków chromosomów zwanych organizatorami jąderkowymi, a ich

liczba nigdy nie przekracza liczby organizatorów. U człowieka może występować
do dziesięciu jąderek, albowiem posiada on 5 par chromosomów jąderkowych.
Większa ilość jąderek jest wynikiem amplifikacji genów kodujących rRNA.
Jąderko składa się w 80-90% z białek, do których należą:

•

Polimeraza RNA I

•

Nukleolina (aktywizuje proces transkrypcji rDNA i bierze udział w
formowaniu podjednostek rybosomowych)

•

Fibrylaryna (uczestniczy w dojrzewaniu pre-rRNA)

•

Rybocharyna (bierze udział w dojrzewaniu dużych podjednostek
rybosomów)

•

Jąderko składa się z trzech rejonów: włóknistego, gęstego
włóknistego i ziarnistego. Wszystkie trzy zawieszone są w macierzy
jąderkowej zbudowanej ze zrębu białkowego

Regulacja cyklu komórkowego

Cykl rozwojowy u Eucaryota podlega niezwykle skomplikowanej regulacji. Jego

prawidłowy przebieg możliwy jest tylko dzięwki obecności dwóch punktów
restrykcyjnych.

Punkt 1: granica G1 i S. tutaj odbywa się kontrola integralności

materiału genetycznego. Wykrycie uszkodzenia DNA powoduje uruchomienie
mechanizmów naprawczych oraz zatrzymanie cyklu do czasu zakończenia
naprawy.

Punkt 2: granica faz G2 i M. w tym miejscu odbywa się kontrola

prawidłowości kondensacji i segregacji materiału genetycznego oraz
tworzenie wrzeciona podziałowego.

Regulacja cyklu odbywa się poprzez uruchamianie kaskadowych reakcji

fosforylacji i defosforylacji białek, przeprowadzanych przez odpowiednie kinazy i
fosfatazy. Najczęściej fosforyzowanymi aminokwasami są Thr i Ser. Aktywacja
kinaz zachodzi w obu punktach restrykcyjnych.

Czynnika dojrzewania MPF

MPF (maturation promoting factor) powoduje, że komórki jajowe, w których

mejoza  uległą  zatrzymaniu  w  profazie  I,  wchodzą  w  mejozę  II  i  dojrzewają  do
zapłodnienia. Wykazano, że jaja Xenopus mimo usunięcia jądra i innych organelli
ulegają  cyklicznym  zmianom,  co  dowodzi  istnienia  biochemicznego  oscylatora
regulującego cykl komórkowy. MPF jest heterodimerem białkowym, ulegającym w
czasie  cyklu  komórkowego  licznym  zmianom,  pod  wpływem  różnych  czynników.
Jednym ze składników MPF jest produkt genu cdc2, białko o masie cząsteczkowej
34 000,  nazywane  p34.  białko  p34

cdc2

(obecnie kinaza cdk1). Jest kinazą

przenoszącą grupy fosforanowe z ATP na różne białka. Jego obecność wykryto we
wszystkich  organizmach,  a  jego  geny  wykazują  znaczną  zachowawczość  w
przebiegu  ewolucji  (63%  między  ludzką  a  drożdżową  cdc2).  U  człowieka  gen  ten
zlokalizowany  jest  na  długim  ramieniu  chromosomu  10.  jej  poziom  w  różnych
etapach  cyklu  nie  ulega  zmianie,  co  wyklucza  jej  działanie  jako  oscylatora.  Na
szczęście  drugi  składnik  MPF,  kochana  przez  studentów  medycyny  cyklina
potrafi ulegać rytmicznej syntezie w interfazie i degradacji w fazie M. obecnie, żeby
studentom  się  nie  nudziło,  wyróżnia  się  5  rodzin  cyklin,  obejmujących  10  białek.
Najlepiej  poznany  jest  wpływ  kompleksu  cyklina  B-  cdk1  na  rozpad  otoczki
jądrowej.  Po  ufosforylowaniu  włóknistych  białek  otoczki  (lamin)  stają  się  one
rozpuszczalne, a po defosforylacji odtwarzają otoczkę.

Rola kinazy p34

cdc2

(cdk1) i kinaz rodziny cdk w regulacji cyklu

komórkowego.

Kinaza cdk odgrywa kluczową rolę w regulacji cyklu komórkowego.

Fosforyzowane  w  niej  są:  Tyr,  Thr  i  Ser.  U  organizmów  wyższych  fosforylacja
zachodzi  w  różnych  kinazach  cdk,  w  zależności  od  fazy  cyklu.  W  fazie  S  i  G1
fosforylowane sąTyr15 i Thr14. Ser277 w fazie G1, a Thr161 w fazie G2. w fazie M
wszystkie poza Thr161 są defosforylowane. W kinazach cdk Tyr15 i Thr14 znajdują
się  w  domenie  wiążącej  ATP,  z  kolei  Thr161  w  domenie  wiążącej  cykliny,  co

stabilizuje ich kompleksy. W początkowej fazie G1 białko p34

cdc2

nie jest związane

z  cykliną,  przez  co  pozostaje  nieaktywne.  W  miarę  akumulacji  cyklin  D  i  E  i
połączeniu  ich  z  kinazą  następuje  jej  aktywacja,  co  doprowadza  do  startu  cyklu
(indukcji replikacji, faza S) i organizacji centrum mikrotubul (MTOC). Po przejściu
punktu restrykcyjnego komórki zaczynają produkować różne cykliny (jednakowoż
głównie  B),  które  tworzą  kompleksy  z  kinazą  p34

cdc2

. kompleksy te (pre-MPF)

pozostają  nieaktywne  z  powodu  fosforylacji  Ty15  i  Thr14.  defosforylacja  Tyr15  w
późnej G2 pozwala na aktywację MPF, co skutkuje przejściem do mitozy. Przejście
pre-MPF  w  MPF  kontrolowane  jest  przez  produkt  genu  wee1,  mik1  i  cdc25,
kodujących  enzymy  o  przeciwnym  działaniu.  Kinazy  wee1  i  mik1  powodują
fosforylację Tyr15 i są inhibitorami mitozy, z kolei fosfataza tyrozynowa cdc25 jest
jej aktywatorem. U człowieka występuje wiele kinaz cdk, pokrewnych do p34cdc2.
obecnie znamy ich ponad 10.

3.

Rola cyklin w regulacji cyklu komórkowego

Regulacja aktywności kinaz cdk odbywa się nie tylko drogą fosforylacji, ale

także  poprzez  łączenie  ich  w  kompleksy  z  cyklinami.  Są  one  białkami
zbudowanymi  z  ok.  400  aminokwasów.  Ich  domena  funkcjonalna  (kaseta
cyklinowa)  wykazuje  duży  stopień  konserwatywności  sekwencji.  Każda  cyklina
zawiera także sekwencję biorącą udział w jej degradacji przy udziale proteasomów
sprzężonych  z  ubikwityną.  Bierze  ona  udział  w  wiązaniu  cyklin  z  cdk.  Cykliny
można podzielić na:

•

Cykliny mitotyczne (A i B)

•

Cykliny fazy G1 (D i E)

Cykliny mitotyczne

Cykliny mitotyczne zgrupowane są w dwie klasy (A i B) w zależności od funkcji.

Dodatkowo cykliny B dzieli się na B1 i B2. Obie klasy cyklin mitotycznych różnią
się funkcją i czasem degradacji. Proteoliza Cykliny B na granicy metafaza/anafaza
powoduje  inaktywację  MPF,  co  prowadzi  do  zakończenia  mitozy  i  przejścia  do
interfazy  z  dekondensacją  chromosomów,  reorganizacją  otoczki  jądrowej  i
cytokinezą.  Obecność  zmutowanej  cykliny  B  powoduje  zablokowanie  cyklu  w
mitozie. Cyklina B jest produkowana podczaf fazy G2 i stopniowo ulega akumulacji
w  komórce,  związana  przez  struktury  błoniaste  i  w  postaci  ziarnistości.  Razem  z
białkiem  p34

cdc2

tworzy kompleks pre-MPF. Na początku profazy ulega

translokacji do jądra komórkowego. W odróżnieniu od cykliny B, cyklina A bierze
udział  już  w  przebiegu  fazy  S,  gdzie  jest  niezbędna  do  inicjacji  replikacji  DNA.
Gromadzi  się  ona  głównie  w  jądrze,  a  częściowo  także  rozpuszczona  w
cytoplazmie.  Jej  aktywność  wzrasta  stopniowo  w  miarę  akumulacji.  Z  kolei
aktywność  cykliny  B  pozostaje  niska  pomimo  jego  wysokiego  poziomu  aż  do
zadziałania  produktu  genu  cdc25.  szczyt  aktywności  kompleksu  kinaza-cyklina  A
występuje,  gdy  aktywność  kompleksu  kinaza-cyklina  B  dopiero  zaczyna  rosnąć.
Także degradacja cykliny A następuje wcześniej niż B, bo już w momencie rozpadu
otoczki jądrowej.

Cykliny fazy G1

Są one aktywne we wczesnych fazach cyklu komórkowego. Do grupy tej zalicza

się trzy cykliny klasy D (D1, D2, D3) oraz cyklinę E, a także bardzo słabo poznaną
cyklinę C. każda z cyklin fazy G1 tworzy kompleksy z odpowiednią kinazą:

•

Cykliny D z cdk4 i cdk6

•

Cykliny E z cdk2

•

O cyklinie C gówno wiemy

Kinazy cdk4 i cdk6 w kompleksach z cyklinami klasy D działają w początkowym

etapie  fazy  G1,  aktywność  kompleksu  cdk2-cyklina  E  pojawia  się  później,  a
maksimum osiąga na granicy faz G1/S. w komórkach fazy G1 występują też liczne
inhibitory  cyklin  oraz  antygen  proliferujących  komórek  PCNA.  Nadekspresja
genów cyklin klasy D umożliwia komórkom włączenie się do cyklu podziałowego,
skracając  fazę  G1.  z  kolei  spadek  poziomu  cykliny  D1  powoduje  zahamowanie
komórek w fazie G1 cyklu. Także Nadekspresja genu cykliny E, a czasami również
cykliny D2, skraca fazę G1 i przyspiesza rozpoczęcie fazy S. wysoki poziom cykliny
D1  może  spowodować  blok  w  fazie  G1,  dając  czas  na  naprawę  DNA  z  udziałem
PCNA.  W  hamowaniu  cyklu  komórkowego  przez  cyklinę  D1  bierze  udział  białko
p53  i  indukowane  przez  nie  białko  p21  oraz  inhibitor  cdk.  W  warunkach
fizjologicznych  aktywność  p53  podlega  regulacji  ze  strony  mdm2  na  zasadzie
ujemnego sprzężenia zwrotnego.

Białko p53 nasila ekspresję genu mdm2, którego produkt tworzy z kompleksy

p53-mdm2, pozbawiony aktywności indukcji genów. Białko mdm2 wykazuje w
tym dimerze aktywność ligazy ubikwitynowej, co prowadzi do degradacji p53.
aktywność mdm2 kontrolowana jest z kolei przez białko p19. kompleks mdm2-p19
nie wykazuje aktywności ligazy, co prowadzi do stabilizacji poziomu p53.

Cyklina D1 może brać udział zarówno w indukcji jak i inhibicji cyklu

komórkowego, mniej wiadomo o cyklinach D2 i D3, aczkolwiek prawdopodobnie
także biorą one udział w regulacji cyklu, zwłaszcza przy różnicowaniu mioblastów i
komórek układu krwiotwórczego.

Cyklina E ma związek z aktywnością kinazy histonu H1, która jest najwyższa w

późnej G1 i wczesnej S. cyklina E może tworzyć kompleks z cdk1, jednakże nie
wykazuje on aktywności kinazowej.

Cyklina C jest najsłabiej poznana. Wiemy jedynie, że jej mRNA osiąga

najwyższy poziom we wczesnej G1 i że najbardziej różni się od cyklin
mitotycznych.

Degradacja cyklin przy udziale systemu ubikwitynowego

Szybka degradacja cyklin mitotycznych przebiega przy udziale białkowych

kompleksów  zwanych  proteasomami  (konkretnie  proteazy  26S  proteasomu).
Degradacji  ulegają  jednak  jedynie  cząsteczki  odpowiednio  oznaczone.  Rolę
znacznika  pełni  tu  małe  białko;  ubikwityna,  która  zostaje  przy  udziale  ATP
przyłączona  do  cząsteczki  cykliny,  tworząc  kompleks  zwany  cyklosomem.
Bezpośrednio przed degradacją dochodzi do modyfikacji cykliny, zwiększającej jej
powinowactwo  do  enzymów  przenoszących  ubikwitynę.  W  degradację  cyklin  są

zaangażowane co najmniej dwie kinazy: p34

cdc2

oraz kinaza białkowa p39

mos

Bezpośrednio przed mitozą stwierdza się wzrost stężenia jonów Ca

kalmoduliny, od których zależy aktywność kinazy II. Obecność zmutowanej, stale
aktywnej kinazy II powoduje blok w fazie G2, pomimo wzrostu aktywności MPF.
Degradację cyklin pod koniec mitozy wywołuje rozpad kompleksu kinazy p34

cdc2

cyklina, w którym Thr161 jest nadal ufosforylowana. Dopiero degradacja cyklin
powoduje defosforylację tego aminokwasu, powodującą całkowity zanik
aktywności kinazowej, gwarantujący prawidłowy przebieg cyklu komórkowego.

Inhibitory kinaz zależnych od cyklin (CKI)

W komórkach somatycznych odok cdk i cyklin występują dodatkowe czynniki

białkowe, wywierające hamujący wpływ na aktywność tych kompleksów takie jak:

•

Białko  p21  WAF1:  produkt  genu  CIP1.  hamuje  aktywność
enzymatyczną  cdk  w  kompleksach  z  cyklinami.  Najsilniej  działa  na
kompleksy cdk2-Cyklina A, a najsłabiej na cdk2-Cyklina B. poziom jego
mRNA  jest  w  komórkach  starzejących  się  i  zahamowanych  w  G0
podwyższony 10-29krotnie. W komórkach G0 przechodzących do cyklu
następuje  częściowy  wzrost  poziomu  mRNA  dla  genu  pic1.  regulacja
białka p21 odbywa się na drodze zależnej i niezależnej od p53.

•

Białko p16 INK4A: kodowane przez gen CDKN2A. wiąże się głównie z
cdk4, gdy inaktywacji ulega Rb i pokrewne mu białka. W komórkach o
zmutowanym białku pRb wzrasta ekspresja genu dla białka p16 i
następuje inaktywacja cdk4, co jednak nie wpływa na postęp cyklu, gdyż
zmutowane pRb znajduje się w stanie ciąglej hiperfosforylacji.

•

Białko p27 KIP1:  produkt  genu  KIP1.  jest  uniwersalnym  inhibitorem
cdk.  Pośredniczy  ono  w  transdukcji  sygnału  pochodzącego  z  TGF-β,
blokującego  komórki  w  późnej  G1.  białko  p27  wiąże  się  z  kompleksem
cdk2-cyklina  E,  zwiększając  poziom  cykliny  E  potrzebny  do  aktywacji
cdk2.  z  kolei  wiązanie  p27  z  kompleksem  cdk4-cyklina  D2  umożliwia
aktywację  kompleksu  cdk2-cyklina  E.  W  komórkach  nie  znajdujących
się pod wpływem TGF-β białko p27 jest obecne, ale pozostaje związane
w kompleksy z innymi białkami, przez co staje się nieaktywne.

Mechanizmy kontrolujące cykl komórkowy

Regulacja transkrypcyjna: większość genów aktywna jest podczas całego

cyklu komórkowego, jednak część ulega jedynie okresowej aktywacji w
określonych fazach. Są to na przykład:

•

Geny DHFT, TK, TS, c-myb- w fazie G1/S.

•

Geny histonów: H1,H2A, H2B, H3, H4- w fazie S.

•

Geny Cyklin A, cdc 25, HSP70 (białko szoku cieplnego)- w

późnej S/G2.

•

Geny GKSHs1 i GKSHs2: dla białek wiążących kinazę p34

cdc2

fazie G2/M.

Kontrola przez ujemne sprzężenie zwrotne (zobaczyć w Drewie, zero
konkretów w tym temacie, więc się nie rozpisuję).

Kontrola  przez  czynniki  spoza  cyklu:  komorki  mogą  być  aktywowane  do
cyklu  przez  czynniki  pozakomórkowe,  takie  jak  hormony  i  czynniki  wzrostu  i
różnicowania,  wpływ  układu  nerwowego  i  inne  podobne,  które  dzielimy  na
mitogenne i hamujące proliferację.

•

Czynniki  wzrostu  i  różnicowania  (CWR):  składa  się  na  nie  ok.  40
polipeptydów  i  leukotrienów,  których  działanie  ma  miejsce  przy  stężeniu
zaledwie  10

-10

mol/litr. Oddziałują one na komórkę za pomocą błonowych

receptorów,  pobudzając  do  wzrostu  (wejście  do  cyklu),  bądź  przerostu
(zwiększania  masy).  Należą  tutaj  między  innymi:  naskórkowy  czynnik
wzrostu,  interleukiny  1-9,  czynnik  wzrostu  nerwów  oraz  w  ch*j  i  trochę
innych.

•

Białko  p110Rb:  jest  to  fosfoproteina  posiadająca  10  miejsc  fosforylacji
reszt  Ser  i  Thr.  Jego  fosforylacja  odbywa  się  przy  udziale  kinaz  cdk  w
określonych fazach cyklu komórkowego. Inicjacja jego fosforylacji następuje
pod  wpływem  cykliny  E,  synteza  kolejnych  cyklin  utrzymuje  je  w  stanie
kiper-  lub  hipofosforylacji.  Hipofosforylowana  postać  białka(faza G1)
zapobiega proliferacji komórek, podczas gdy hiperfosforylowana (fazy S, G2,
M) powoduje jej wzmożenie, uwalniając szereg czynników transkrypcyjnych,
mogących wchodzić w kompleks z białkiem p33

cdc2

•

Białko p53: składa się z 393 aminokwasów i jest fosfoproteiną. Prawidłowa
jego  postać  występuje  w  jądrze,  podczas  gdy  zmutowaną  obserwuje  się  w
cytoplazmie.  Wykazuje  zdolność  wiązania  z  produktami  onkogennych
wirusów (np. SV40, Papilloma E6), a także produktem genu mdm2 o dużej
aktywności  transformacyjnej.  Związane  z  produktem  Papilloma  E6  podlega
degradacji  przy  udziale  systemu  ubikwitynowego.  Posiada  ono  zdolność
wiązania  się  z  dwuniciowym  DNA  i  zatrzymywać  cykl  w  późnej  G1  w
przypadku  uszkodzeń  DNA,  dając  czas  na  pracę  enzymów  naprawczych
przed  fazą  S.  zatrzymując  cykl  na  przełomie  G2/M  zapobiega  utracie
materiału  genetycznego  wskutek  złamań  chromosomów.  Prawidłowa  jego
forma ma zdolność indukowania apoptozy, podczas gdy zmutowane hamuje
ten  proces,  stając  się  onkogenem.  Jego  zmutowaną  postać  wykrywa  się  w
licznych nowotworach (jelita, płuc, przełyku).

Mutacje i mechanizmy naprawy DNA

Mutacja- Zmiana dziedziczna powstająca wskutek zmiany genu w jego nowy allel
(mutacja genowa), zmiany struktury chromosomu (mut. Chromosomowa
strukturalna),

zmiany

liczby

chromosomów

(mut.

liczbowa),

bądź

zwielokrotnienie haploidalnego zestawu chromosomów (mut. genomowa).

Mutacje genowe

•

Mutacją genową nazywamy zmianę sekwencji nukleotydów w obrębie
genu na inną od sekwencji nukleotydów genu wyjściowego.

Najprostszym przykładem mutacji genowej jest mutacja punktowa,
czyli obejmująca 1 parę zasad:

•

Tranzycja: zmiana jednej zasady purynowej na inną purynową
(pirymidynowej na pirymidynową)

•

Transwersja: zmiana zasady purynowej na pirymidynową
lub odwrotnie

•

Delecja: wypadnięcie jednej lub większej liczby par nukleotydów
z danego genu

•

Insercja: wstawienie pojedynczej lub większej liczby par
nukleotydów do danego genu.

Mutacje genowe mogą doprowadzać do różnych, mniej lub bardziej
poważnych następstw:

•

Zmiany sekwencji aminokwasów w polipeptydzie kodowanym przez
zmutowany gen. Takie zjawisko nazywamy mutacją zmiany
sensu

•

Przerwania syntezy łańcucha polipeptydowego jeśli powstanie
triplet nonsensowny (kodon STOP); mutacja nonsensowna

•

Do mutacji niemej, jeśli powstanie triplet synonimiczny

W  wyniku  delecji  lub  insercji  pewnej  liczby  nukleotydów,  innej
niż wielokrotność  trzech  następuje    zmiana  ramki  odczytu    i
powstający  produkt  ma  zmienioną  sekwencję  aminokwasów  od  miejsca
wystąpienia mutacji do C- końca.

Skutkiem  mutacji nonsensownych są takie  choroby  jak: mukowiscydoza,
fenyloketonuria, alkaptonuria, retinoblastoma.

Mutacje (aberracje) chromosomowe

Wszelkie zmiany w strukturze i liczbie chromosomów. Mogą powstawać
zarówno w komórkach somatycznych, jak i w gametach. Mogą być dziedziczne
lub powstawać de novo.

Aberracje strukturalne: mogą dotyczyć pojedynczej lub obydwu
chromatyd. Ich przyczyną jest przerwanie ciągłości chromatydy lub
chromosomu. Mogą prowadzić do:

•

Delecji (usunięcia/ deficjencji) fragmentu chromosomu. Gdy dotyczy
odcinka  końcowego  mówimy  o  delecji  terminalnej,  jeśli  z  kolei
chodzi o fragmenty ze środka chromosomu stosujemy termin  Delecja
interstycjalna.  Delecja  dotyczyć  może  nawet  bardzo  dużych
fragmentów  chromosomu.  Niektóre  chromosomy  posiadają  odcinki
wykazujące  szczególną  podatność  na  złamania  (kruche  miejsca
genomu).  Miejsca  takie  u  człowieka  występują  m.in.  na  chromosomie
2,  6,  9  12,  20  oraz  X  (jego  złamanie  skutkuje  upośledzeniem
umysłowym  u  mężczyzn,  u  kobiet bezobjawowe  nosicielstwo).  Delecje
dużych fragmentów są z reguły letalne.

•

Inwersji: odwrócenia odcinka chromosomu o 180

co powoduję

zmianę  pozycji  genów,  mogącą  mieć  wpływ  na  zmianę  ich  ekspresji.
Jeśli  inwersja  dotyczy  fragmentu  chromosomu  wraz  z  centromerem
nazywamy  ją  eucentryczną,  jeśli  zaś  inwertowany  fragment  nie
zawiera centromeru używamy terminu acentryczna.

•

Translokacji:

przeniesienia

części

chromosomu

inny.

Translokacje

polegające

wymianie

odcinków

między

chromosomami

niehomologicznymi

nazywamy

translokacją

wzajemną. W takim przypadku nie zmienia się liczba chromosomów,
lecz zmianie ulega ich budowa. Innym typem translokacji są
translokacje

robertsonowskie

(u człowieka

dot.

tylko

chromosomów  akrocentrycznych).  Polega  ona  na łączeniu  się  całych
lub  prawie  całych  ramion  długich  dwóch  różnych  chromosomów
(połączenie  centryczne).  Miejscem  połączenia  jest  rejon  centromeru.
Dochodzi do utraty funkcjonalnie nieistotnej części mat. Genetycznego
(ramion  krótkich).  W  konsekwencji  translokacji  zrównoważonych  nie
zmienia  się  ilość  mat.  Genetycznego,  ale  następuje  zmiana  jego
lokalizacji

(45

chromosomów

metafazowych).

W translokacji

niezrównoważonej następuje powiększenie ilości mat. Genetycznego o
dodatkową kopię translokowanego chromosomu (dwa homologiczne
chromosomy

teocentryczne

mogą

koniugować

jednym

metacentrycznym wskutek czego powstaje triwalent), chociaż liczba
chromosomów wynosi 46. w takim przypadku zawsze dochodzi do
ujawnienia się choroby.

•

Duplikacji:  podwojenia  fragmentu  chromosomu,  co  może  mieć
istotne  znaczenie  ewolucyjne  (duplikacja  sekwencji  hemoglobiny).
Duplikowane  kopie  genów  mogą  występować  jako  bezpośrednie
powtórzenia (tandemowe) lub jako odwrócone względem siebie

•

Utworzenia chromosomu kolistego (wskutek tworzenia się lepkich
końców

miejscach

pęknięć

chromosomów.

końcach

prawidłowych chromosomów znajdują się telomery zabezpieczające
przed ich wzajemnym łączeniem się), dwucentromerowego lub
izochromosomu

(postaje

wskutek

poprzecznego

podziału

centromeru  chromosomu  metafazowego  i  składa  się  z  połączonych
ramion krótkich lub długich; jego powstanie skutkuje ubytkiem genów
zawartych na utraconych ramionach i podwojenie liczby w ramionach,
które  go  utworzyły).  U  człowieka  chromosom  kolisty  najczęściej
powstaje z chromosomów 4, 13, 18 oraz X. powodują liczne zaburzenia
rozwojowe,  najczęściej  jednak  nie  tworzą  zdefiniowanych  zespołów
chorobowych.

Aberracje liczbowe chromosomów powstają najczęściej wskutek

nondysjunkcji par chromosomów homologicznych podczas podziałów.
Wyróżniamy dwie ich kategorie:

•

Aneuploidie:  powstają  w  wyniku  zwiększenia  lub  zmniejszenia  2n
liczby  chromosomów  o  pojedyncze  chromosomy.  Najczęściej  wskutek
nondysjunkcji. Nondysjunkcji może wystąpić zarówno w oogenezie jak
i spermatogenezie.  Skutkuje  powstaniem  gamet  disomicznych  lub
nullisomicznych.  Do  aneuploidii  zalicza  się  aberracje  liczbowe
zarówno  chromosomów  homologicznych,  jak  i  płciowych.  Może
skutkować  powstaniem  disomii  uniparentalnej;  występowaniem
w organizmie  pary  chromosomów  pochodzących  od  jednego  rodzica
(patrz zespół Angelmana i PW)

•

Euploidiy  mają  zwielokrotniony  cały  zestaw  chromosomów.
Wyróżnia  się  2  typy  poliploidii;  autopoliploidia  i  allopoliploidia.
W autopoliploidiach  garnitur  chromosomów  jest  zwielokrotniony  o
ten sam zestaw chromosomów, są one z reguły letalne. Allopoliploidy
mają z kolei 2 lub więcej niehomologicznych zespołów chromosomów,
nie występują u człowieka.

Czynniki mutagenne

Czynniki mutagenne dzielimy na

•

Fizyczne

promienie X

promienie alfa beta i gamma

protony i neutrony emitowane przy rozpadzie promieniotwórczym

promieniowanie kosmiczne

promieniowanie niejonizujące (UVA i UVB)

•

Chemiczne

kwas azotowy III

hydroksylamina

związki alkilujące (sulfonian dietylowy, iperyt azotawy)

analogi zasad azotowych (2-aminopuryna 5-bromouracyl)

barwniki akrydynowe (proflawina)

wolne rodniki tlenowe

nadtlenki

policykliczne węglowodory aromatyczne

cytostatyki (busulfan, cyklofosfamid, aminopteryna winkrystyna)

10.

niektóre

antybiotyki

właściwościach

cytostatycznych

(aktynomycyna, daunomycyna)

11.

produkty pirolizy aminokwasów

•

Biologiczne

wirusy (Herpes virus, Papilloma virus)

Mutagenne  działanie  związków  chemicznych.  Zmiana  w  budowie
chemicznej  zasad  azotowych  prowadzi  do  zmiany  par  zasad  w  łańcuchu
DNA.  Np.  dezaminacja  Adeniny  prowadzi  do  powstania  hipoksantyny
posiadającej 3 wiązania wodorowe, co prowadzi do zamiany pary AT na CG
w  dwóch  kolejnych  cyklach  replikacyjnych.  Hydroksyloamina  reaguje  z
cytozyną  zmieniając  ją w uracyl,  co  prowadzi  do  Tranzycja  C->T.  Związki
alkilujące  wprowadzają  w różnych  miejscach  zasad  azotowych  grupy
metylowe.  Alkilacja  Guaniny  w pozycji  N7  powoduje  osłabienie  wiązania  z
pentozą  co  z  kolei  skutkuje  depurynizacją  DNA.  W  pustym  miejscu  może
dojść do tranzycji lub transwersji.

Barwniki  akrydynowe  wnikają  między  pary  zasad  powodując  ich
rozsunięcie,  co  może  prowadzić  do  błędów  replikacji  wskutek  delecji  lub
insercji  pojedynczych  nukleotydów,  co  skutkować  może  zmianą  ramki
odczytu.

Wolne  rodniki  pochodzenia  tlenowego  powodują  uszkodzenia  zasad
azotowych,  reszt  cukrowych  i  rozerwanie  wiązań  fosfodiestrowych  i
utworzenie  wiązań  poprzecznych  DNA-białka  chromatyny.  Uszkodzenie
rodnikami  indukuje  powstawanie  autoprzeciwciał,  co  ma  znaczenie  w
chorobach  autoimmunologicznych.  Mogą  także  wywoływać  pęknięcia
łańcucha (patrz aberracje chromosomowe)

Produkty pirolizy aminokwasów powstają np. wskutek smażenia mięs
w temperaturze powyżej 150

C. powstają z połączenia kreatyniny cukru

i aminokwasu (najczęściej Gly Trp Phe Glu). Mają działanie kancero-
i teratogenne

Mykotoksyny (np. aflatotoksyna) produkowane przez niektóre grzyby
(aspergillus,

fusarium)

które

rozwijają

się

nieprawidłowo

przechowywanej żywności.

Mutagenne działanie czynników fizycznych

Promienie jonizujące zwiększają częstość występowania uszkodzeń DNA.
Wybija  ono  elektrony  z  atomów  i  cząsteczek,  co  prowadzi  do  powstania
jonów  i wolnych  rodników  inicjujących  różne  reakcje  chemiczne.  Efekt
promieniowania jonizującego zależy od stężenia tlenu w środowisku (wraz z
jego  wzrostem  wzrasta  częstość  mutacji).  Powoduje  ono:  zerwanie  w.
fosfodiestrowych,  modyfikacje  zasad,  uszkodzenie  pentozy,  powstanie  w.
krzyżowych  DNA  (sieciowanie).  Szczególnie  narażone  na  nie  są  komórki
szybko dzielące się.

Promieniowanie  UV  jest  mniej  przenikliwe  niż  jonizujące,  ale
intensywnie  pochłaniane  przez  DNA.  Prowadzi  do  wytwarzania  wiązań
kowalencyjnych  między  leżącymi  obok  siebie  pirymidynami,  powodując
transwersje, tranzycje, rzadko zmiany ramki odczytu.

Mechanizmy naprawy uszkodzeń DNA

Pozwalają

przywrócić

pierwotny

stan

materiału

genetycznego.

najważniejszych enzymów biorących udział w naprawie DNA należą:

•

Polimerazy DNA jądrowe (α, β, δ, ε) i mitochondrialna γ

•

Ligazy DNA

•

Glikozydazy DNA

•

Endonukleazy purynowe/pirymidynowe 5’-AP i 3’-AP

•

Białka pomocnicze

•

Fotolizy DNA

•

Metylotransferaza-O

-metyloguanina (MGMT)

Naprawa DNA w komórce może być kompletna lub niekompletna, co prowadzi
do mutacji  i  aberracji  chromosomowych.  Jeżeli  enzymy  naprawcze  nie  zdołają
naprawić uszkodzeń, to komórka może przejść na szlak apoptozy.
Procesy  naprawy  DNA  zachodzą  w  okresie  przedreplikacyjnym,  podczas
replikacji DNA lub w okresie poreplikacyjnym. Duży wpływ na nie ma struktura
chromatyny.  Nić  DNA  łącząca  chromosomy  jest  naprawiana  szybciej  niż  nić

nawinięta (DNA rdzeniowy). Szybkość naprawy euchromatyny jest większa niż
heterochromatyny.

Naprawa  DNA  przez  bezpośrednią  rewersję  uszkodzenia.  Polega
na odwróceniu  reakcji,  w  wyniku  której  doszło  do  uszkodzenia.  Biorą  w  niej
udział metylotransferaza MGMT oraz fotoliazy DNA.

Metylotransferaza

MGMT

naprawie błędną

metylację.

Katalizuje

przeniesienie grupy alkilowej z atomu O

Guaniny na cysteinę, w wyniku czego

następuje  inaktywacja  MGMT.  Ekspresję  MGMT  w  różnych  tkankach  cechuje
zróżnicowany poziom. U ludzi najwyższy w komórkach wątroby, zaś najniższy w
szpiku  (w komórkach  nowotworowych  ulega zmniejszeniu  o  20-30%).  Reakcja
ta jest kosztowna dla komórki, gdyż naprawa każdej metyzacji pociąga za sobą
utratę  jednej  cząsteczki  enzymu.  MGMT  występuje  u  wszystkich  żywych
organizmów.

Fotoliaza  to  enzym  odpowiedzialny  za  fotoreaktywację,  czyli  rozłączanie
dimerów  pirymidynowych  przy  udziale  fal  elektromagnetycznych  o  długości
300-600  nm.  Proces  ten  nazywamy  również  naprawą  na  świetle.  Każda
fotoliaza  zawiera  dwa chromofory,  odpowiedzialne  za  absorpcję  fotonów:
FADH

oraz metynylo-tetrahydrofolian (MTHF) lub 8-hydroksy-deazoflawina

(8-HDF). MTHF lub 8-HDF absorbują energię świetlną, którą przekazują
potem do FADH

. energia ta jest używana do rozdzielania dimerów.

Innym  przykładem  rewersji  uszkodzenia  jest  działanie  ligazy,  która  łączy
pęknięcia  w  łańcuchu  DNA.  Jej  aktywność  ogranicza  się  jedynie  do  pęknięć
pomiędzy grupą 5’fosforanową a 3’hydroksylową.

Usuwanie  błędnie  sparowanej  zasady  (missmatch  repair-  MMR).
Dotyczy  usuwania  błędów  replikacyjnych  nie  naprawionych  przez  Polimerazy,
wywołanych przez czynniki chemiczne oraz błędy w parowaniu zasad powstałe
przy  rekombinacji  DNA.  Istotne  jest  rozpoznanie,  która  z  dwóch  nici  DNA
została  prawidłowo  zsyntetyzowana,  a  która  zawiera  błąd.  Badania  na  E.  Coli
wykazują,  że dużą  rolę  w  tym  zakresie  odgrywa  stopień  metylacji  DNA.  W
sekwencjach  GATC  E.  Coli  etylowana  jest  adenina,  ale  metylacja  nie  zachodzi
bezpośrednio  po  replikacji,  lecz  jakiś  czas  później.  Dzięki  temu  możliwa  jest
identyfikacja  nowej  nici  (niezmetylowana  adenina).  U  Eucaryota  nić  potomna
jest  rozpoznawana  dzięki  przerwom  między  fragmentami  Okazaki  nici
opóźnionej.  Białka  uczestniczące  w rozpoznawaniu  i  naprawie  uszkodzenia
kodowane są przez zespół genów zwanych mutatorowymi.

Przebieg procesu u E. Coli

Rozpoznanie  i  przyłączenie  się  do  miejsca  pomyłki  białka  MutS
(zdolnego  rozpoznać  nie  tylko  błędnie  sparowane  zasady,  ale  także
insercje i delecje obejmujące do 4nukleotydów).

stabilizacja

kompleksu

MutS-DNA

przez

białko

MutL

(odpowiedzialnego także za połączenie z białkiem MutH)

białko MutH przyłącza się naprzeciw najbliższej metylowanej
adeniny w nici rodzicielskiej i nacina nić potomną.

Wycięcie nieprawidłowej nici i dosyntetyzowanie nowej przy
udziale:

•

UvrD (helikaza II; rozkręca nić DNA od miejsca nacięcia
przez MutH do miejsca pomyłki)

•

Egzonukleaza o odpowiedniej polarności wycinająca
błędnie sparowany fragment

•

Polimeraza DNA III dosyntetyzowująca odpowiednią
sekwencję zasad

•

Ligaza DNA łącząca nowo powstały fragment z nicią
macierzystą

U  eucaryota  ten  mechanizm  naprawy  nie  został  całkowicie  poznany,  ale
przypuszczalnie jest on bardzo podobny do tego u E. Coli.
W organizmach eukariotycznych brakuje homologów MutH i UvrD, ale jest wiele
homologów MutS i MutL.
Zaburzenie funkcji genów mutatorowych jest przyczyną powstania między innymi
raka jelita grubego.

Naprawa  przez  wycinanie  zasad  azotowych.  (Base  excision  repair-
BER )
Jest  to  mechanizm  stosowany  głównie  do  usuwania  uracylu  lub  alkilowanych
zasad. W procesie tym wyróżniamy 3 etapy:

usunięcie nieprawidłowej zasady przez specyficzną N-glikozylazę i
wytworzenie miejsca purynowego/pirymidynowego (AP)

nacięcie przez Endonukleazy AP wiązania fosfodiestrowego powyżej
AP

wypełnienie miejsca AP przez polimerazę DNA

Naprawa przez wycinanie nukleotydów: bierze udział w usuwaniu
większości uszkodzeń DNA. U każdego organizm przebiega według identycznego
schematu:

rozpoznanie uszkodzenia

przyłączenie kompleksu białkowego w miejscu uszkodzenia

podwójne nacięcie uszkodzonej nici w pewnej odległości od
uszkodzenia

usunięcie zawierającego uszkodzenie oligonukleotydu

uzupełnienie luki przez polimerazę DNA

połączenie wolnych końców przy udziale ligazy DNA

Naprawa  rekombinacyjna  bierze  udział  w  naprawie  pęknięć  dwuniciowych.
System ten jest dokładnie poznany i opisany u bakterii. U eucaryota wyróżnia się
trzy  szlaki  naprawy:  rekombinacja  homologiczna,  dopasowanie  pojedynczej  nici
oraz  rekombinacja  niehomologiczna.  U  ssaków  różne  mechanizmy  dominują  w
zależności od pozycji w cyklu komórkowym:

•

podczas fazy G1 i wczesnej S rekombinacja niehomologiczna

•

podczas późnej S i G2 rekombinacja homologiczna

W  rekombinacji  homologicznej  do  odtworzenia  struktury  chromosomu
wykorzystywany  jest  jego  nieuszkodzony  homolog.  W  pierwszym  etapie  system
naprawczy rozpoznaje powstały wskutek pęknięcia dwuniciowego fragment DNA.
Jedna  z  jego  nici  zostaje  strawiona  przez  egzonukleazy.  Pozostała  nić  z  wolnym
końcem  3’  łączona  jest  z  nieuszkodzonym  odcinkiem  homologicznym.  Na
podstawie  informacji  z  nieuszkodzonego  DNA  zostaje  odtworzony  przebieg
naprawionej  cząsteczki.  W  mechanizmie  dopasowania  nici  DNA  białka
wykorzystują sekwencje powtórzone w najbliższym sąsiedztwie pęknięcia.

W  rekombinacji  niehomologicznej  największy  udział  ma  kinaza  białkowa
zależna od DNA (DNA-pk). Dokładny przebieg procesu nie został jeszcze poznany.

Odpowiedź  SOS  dotyczy  komórek  bakteryjnych  i  uruchamiana  jest
przypadkach,  gdy  w  DNA  nastąpiły  liczne  mutacje  lub  zatrzymana  została
replikacja.  Bierze  w  niej  udział  ok.  20  różnych  genów,  spośród  których  liczne
kodują  enzymy  naprawy  DNA.  W odróżnieniu  od  innych  metod  naprawczych,
system  SOS  może  pozostawiać  liczne  błędy  (system  mutagenny).  Jest  on  próbą
uratowania  komórki  za  cenę  ewentualnej  mutacji.  Uruchamiany  jest  przy
uszkodzeniach  zbyt  rozległych,  by  mogły  je  naprawić  poprzednie  mechanizmy.
Jego  uruchomienie  powoduje  zahamowanie  podziału,  co  daje  dodatkowy  czas  na
naprawę.  Uszkodzenia  DNA  indukują  aktywność  proteazową  białka  RecA,  które
rozkłada  represorowe  białka  LexA  i  lambda,  blokujące  geny  enzymów  naprawy
DNA,  dzięki  czemu  wzrasta  transkrypcja  tych  genów.  Do  mutacji  dochodzi,
ponieważ  produkty  genów  UmuDC  umożliwiają  elongację  łańcucha  tuż  za
miejscem  uszkodzenia  lub  pomimo  błędnie  wbudowanej  zasady  (naprawa  ze
skłonnością  do błędu).  Po  dokonaniu  naprawy  poziom  białka  RecA  obniża  się,
zwiększając  syntezę  LexA  i  lambda,  które  ponownie  blokują  ekspresję  genów
mechanizmu SOS.

Naprawa DNA jest niezwykle ważnym dla komórki i organizmu procesem. Istnieją
choroby  związane  z  obniżeniem  aktywności  lub  zupełnym  brakiem  jednego
z enzymów naprawczych takie jak:

•

Xeroderma pigmentosum

•

Zespół Blooma

•

Anemia Fanconiego

•

Atalia teleangiectasia

Obniżenie zdolności naprawy zwiększa także ryzyko zachorowania na nowotwory,
oraz  przyspiesza  starzenie.  Naprawa  uszkodzeń  jest  też  niezwykle  istotna  w
układzie  nerwowym  a  jej  upośledzenie  obserwuje  się  między  innymi  w  chorobie
Alzheimera i Huntingtona.

Naprawę DNA spowalnia hipertermia, spadek poziomu ATP, palenie tytoniu, picie
alkoholu oraz teofilina.

Mutacje niestabilne (dynamiczne)- ekspansja tripletów. Ekspresja takich
mutacji  zmienia  się  w  kolejnych  pokoleniach.  W  ich  wyniku  powstają  takie
choroby jak:

•

Zespół łamliwego chromosomu X

•

Dystrofia miotoniczna

•

Choroba Huntingtona

Mutacje dynamiczne powstają w wyniku wydłużania lub skracania sekwencji DNA.
Prawdopodobieństwo  wystąpienia  takiej  mutacji  zależy  od  długości  niestabilnej
sekwencji  DNA.  W  przypadku  wymienionych  trójek,  w  zależności  od  liczby
powtórzeń  wyróżnia  się  osoby  zdrowe,  nosicieli  i  chorych.  Najczęściej  są  to
powtórzenia  zwielokrotnionych  trójek  nukleotydów.  Gdy  liczba  powtórzeń
wzrasta,  wzrasta  też  ryzyko  zachorowania.  Np.  w  pląsawicy  Huntingtona  liczba
powtórzeń fragmentu CAG w ramieniu krótkim 4 chromosomu u zdrowych waha
się między 4-35. u chorych wynosi od 36 (wystąpienie objawów w wieku średnim),
powyżej  50  (choroba  w  młodym  wieku).  W  chorobie  Huntingtona  liczba  trójek  u
potomstwa  zwiększa  się  tylko,  gdy    mutacja  zostanie  przekazana  przez  ojca.
Zjawisko  pojawiania  się  objawów  w  coraz  młodszym  wieku  u  kolejnych  pokoleń
wskutek  zwielokrotnienia  trójek  nukleotydów  nazywamy  antycypacją.  W
przypadku  zespołu  łamliwego  chromosomu  X  prawdopodobieństwo  choroby  u
rodzeństwa nosiciela jest mniejsze niż wśród jego wnuków (paradoks Shermana)

Mutacje  letalne  występujące  w  układzie  homozygotycznym  powodują  śmierć
organizmu,  natomiast  w  układzie  heterozygotycznym  mogą  być  utrzymywane
w populacji przez wiele pokoleń, wskutek czego w populacjach gromadzą się liczne
geny letalne.

Wpływ leków Cytostatycznych na kwasy nukleinowe

Pochodne zasad azotowych

•

Fluorouracyl: stosowany

jako

lek

cytostatyczny w

litych

nowotworach żołądka, trzustki, jelita grubego oraz sutka. Ulega
przemianie

postaci

aktywnej

biologicznie;

fosfodeoksyrybonukleotydu  oraz  trifosforanu  fluorourydyny  (FUTP).
W takiej postaci blokuje aktywność syntetazy tymidylowej, prowadząc
do  zahamowania  syntezy  DNA,  za  czym  idzie  śmierć  komórki.  FUTP
jest  także  wbudowywany  do  RNA,  powodując  zablokowanie  fosfatazy
uranylowej  i zaburzenie  przekształcania  uracylu,  co  prowadzi  do
powstania RNA o nieprawidłowej budowie.

•

Cytarabina: analog 2-deoksycytydyny, posiadający arabinozę w
miejscu deoksyrybozy. Stosowana w ostrych białaczkach, a także jako
lek

immunopresyjny.

Hamuje

aktywność

Polimerazy

DNA.

Wbudowuje się do DNA i RNA

•

Merkaptopuryna: pochodna zasad purynowych. Posiada grupę –SH
zamiast aminowej. Hamują syntezę DNA, powodując przy tym
niedokrwistość, limfocytopenie i zaburzenia żołądkowo jelitowe .

•

Azatopiryna: pochodna merkaptopuryny. Wykazuje działanie
cytostatyczne i immunopresyjne. Stosowana po przeszczepach
narządów oraz w chorobach autoimmunologicznych takich jak Toczeń
rumieniowy.

Pochodne nukleozydów

•

Aciklovir:  działa  przeciwko  wirusom  opryszczki  zwykłej  i półpaśca.
Biologicznie  aktywny  staje  się  po  licznych  przekształceniach.  W
zarażonej  komórce  reaguje  z  polimerazą  DNA  powodując  jej
zablokowanie.

•

Zidowudyna: stosowana w leczeniu AIDS. Jest inhibitorem
retrotranskryptazy wirusa HIV. Hamuje namnażanie wirusa. Przedłuża
czas życia chorego i poprawia jego stan.

•

Izoprinozyna:  działa  przeciwwirusowo,  hamując  rozwój  wirusów
DNA  i  RNA  oraz  wzmaga  proliferację  limfocytów  i komórek  NK.
Stosowana  w  leczeniu  półpaśca,  ospy  wietrznej,  grypy,  odry  i
wirusowego zapalenia mózgu. Wykazuje niewielkie działania uboczne,
np. zaburzenia żołądkowe.

Cisplatyna: [Pt(NH3)2]Cl2 nieorganiczny kompleksowy związek platyny
o działaniu przeciwnowotworowym, cytotoksycznym, cytostatycznym i
immunopresyjnym.

Powoduje

wytworzenie

dodatkowych

wiązań

poprzecznych między nićmi DNA. Kumuluje się w tkankach, jej okres
półtrwania wynosi 8 do 10 dni. Objawem ubocznym jest neurotoksyczność.

wpływ niektórych antybiotyków i leków bakteriobójczych na
kwasy nukleinowe.

•

Aktynomycyna D: antybiotyk przeciwnowotworowy wytwarzany
przez streptomyces antibioticus. Wiąże się silnie z DNA dwuniciowym
na drodze wklinowania pomiędzy pary

C-G., hamując replikację i transkrypcję. Jest wykorzystywana

w leczeniu guza Wilmsa, raka jądra i kosmówczaka.

•

Daunomycyna: blokuje matrycową aktywność DNA, prowadząc do
zahamowania replikacji i transkrypcji. Działa przeciwbakteryjnie i
przeciwnowotworowo.

•

Mitomycyna C: działa jak związek alkilujący. Wiąże się trwale z
helisą DNA, tworząc dodatkowe wiązania poprzeczne, przez co hamuje
replikację i transkrypcję. Stosowana u pacjentów z nowotworami
narządowymi, wysoce toksyczna.

•

Rifamycyny:  grupa  antybiotyków  makrocyklicznych  wytwarzanych
przez  Streptomyces  mediterranei.  Inhibitory  Polimerazy  RNA  w
komórkach  bakteryjnych.  Duże  znaczenie  z tej  grupy  ma  rifampicyna,
wykazująca  działanie  immunopresyjne.  Bardzo  skuteczne  w  leczeniu
zakażeń bakteriami Gram(+)

•

Chinoliny:

inhibitory

topoizomerazy

II.

Hamują

replikację

i transkrypcję bakteryjnego DNA. Do pochodnych chinolonowych,
hamujących topoizomerazę, należą kwas pipemidowy, nalidyksowy i
oksolinowy.

Kwas

nalidyksowy

hamuje

proces

uzupełniania

nukleotydów po rozcięciu nici DNA. Bardzo skuteczne do leczenia
bakteryjnych zapaleń dróg moczowych.

•

Nitrofurany:

redukowane

komórkach

bakteryjnych

wytworzeniem wolnych rodników, które z kolei rozrywają nici
bakteryjnego DNA. Stosowane w zakażeniach dróg moczowych.

niektóre antybiotyki i toksyny hamujące syntezę białka.

•

Streptomycyna: łączy się z podjednostką 30S rybosomów
bakteryjnych, co prowadzi do błędnego odczytu mRNA. Poza tym
hamuje

wiązanie

formylometionylo-tRNA

rybosomami,

uniemożliwia

inicjację

syntezy

białka.

Powstałe

białka

są

niefunkcjonalne, przez co bakterie giną. Kumuluje się w ślimaku ucha,
co prowadzi do jego uszkodzenia i głuchoty.

•

Tetracykliny: antybiotyki o szerokim zakresie działania. Wiążą się z
podjednostką 30S rybosomów bakteryjnych, hamując wiązanie się z
nią aminoacylo-tRNA, co blokuje syntezę białka.

•

Chloramfenikol:  hamuje  aktywność  peptydylotransferazy,  przez  co
dochodzi do zablokowania syntezy peptydu, który pozostaje związany z
rybosomom.  Hamuję  syntezę  białek  u  bakterii  Gram  (+)  i  (-),
riketsjach  i  niektórych  wirusach.  Jest  bardzo  toksyczny  i  obecnie
rzadko stosowany.

•

Erytromycyna: hamuje przesuwanie się aminoacylo-tRNA z miejsca
akceptorowego na peptydylowe na podjednostce 50S rybosomy
bakteryjnego, co powoduje zahamowanie syntezy białka.

•

Puromycyna:  przypomina  budową  aminoacylo-tRNA.  Wiąże  się  z
rybosomami w miejscu akceptorowym, kończąc przedwcześnie syntezę
łańcucha  polipeptydowego  w  komórkach  zarówno  pro-  jak  i
eukariotycznych.  Jest  bardzo  toksyczna,  używana  jedynie  do
doświadczeń na zwierzętach.

•

Toksyna błonicy: wytwarzana przez maczugowca błonicy. Wiąże się
z  błoną  cytoplazmatyczną  komórek  chorego.  Po  wniknięciu  do  ich
wnętrza dzieli się na 2 fragmenty i ulega przemianom prowadzącym do
powstania  dyftamidu;  zmodyfikowanego  czynnika  elongacji  eEF-2.
jego  modyfikacja  uniemożliwia  syntezę  białka.  Wystarczy  jedna
cząsteczka toksyny, by inaktywować cały dostępny w komórce eEF-2.

•

Alfa sarcyna: toksyna z grzybów. Rozbija dużą podjednostkę
rybosomów, doprowadzając do inaktywacji tego organellum.

•

Rycyna: N-glikozydaza pochodzenia roślinnego. Odrywa pojedyncze
adeniny od rRNA niszcząc rybosomy.

•

Alfa-amanityna: toksyna muchomora sromotnikowego. Tworzy
trwałe kompleksy z polimerazą RNA II i polimerazą RNA III komórek
eukariotycznych, hamując elongację mRNA. 5-6mg toksyny to dawka
smiertelna.

•

Penicylina:  łączy  się  swoiście  z  enzymem  bakteryjnym,  hamując
syntezę  peptydoglikanów.  Skutkuje  to  powstawaniem  bakterii
pozbawionych  ściany  komórkowej,  łatwo  ulegające  cytolizie.  Nie

Cytogenetyczne i bakteryjne testy monitorowania

skutków zanieczyszczeń środowiska.

Test  Amesa:  wykorzystuje  się  do  niego  szczepy  Salmonella  typhimurium
pozbawione  zdolności  syntezy  histydyny  (his-).  Wysiewa  się  je  na  pożywkę
zawierającą  bardzo  małe  ilości  histydyny  oraz  badaną  substancję  wraz  z
frakcją  S9  (ekstrakt  z  wątroby  szczura,  mający  na  celu  aktywację
metaboliczną  substancji).  Bakterie  rosną  i  namnażają  się,  dopóki  pożywka
zawiera  histydynę.  Po  jej  zużyciu  na  pożywce  zostają  jedynie  te  kolonie,  w
których

nastąpiła

mutacja,

przywracająca

zdolność

syntezy

aminokwasu(rewersja).  Po  72godzinach  od  rozpoczęcia  testu  zlicza  się
kolonie  rewertantów,  porównując  liczbę  rewertantów  w  próbie  kontrolnej.
Jeśli  wynik  znacznie  przewyższa  wyniki  z  kontroli  (minimum  dwu-,
trzykrotnie),  to  substancję  uznaje  się  za  mutagen  bezpośredni.  Jest  to  test
wysoce  skuteczny  w  wykrywaniu  substancji  rakotwórczych  oraz  testowania
związków, mających być użytymi jako leki.

Test strukturalnych aberracji chromosomowych: w teście tym
wykorzystuje

się

właściwości

klastogenne

(zdolność

łamania

chromosomów)

badanych

mutagenów

fizycznych

chemicznych.

Uszkodzenia  chromosomów  można  obserwować  w  stadium  metafazy.  Test
można przeprowadzać In vitro lub In vivo. W warunkach In vitro materiałem
mogą  być  limfocyty  krwi  obwodowej,  fibroblasty,  trofoblasty  lub  komórki
płynu  owodniowego.  Do  przeprowadzeniu  testu  na  limfocytach  pobiera  się
krew  żylną  i  zakłada  hodowle  komórkowe.  Limfocyty  dodaje  się  do
odpowiedniego medium hodowlanego zawierającego badaną substancję w co
najmniej trzech stężeniach niższych od cytotoksycznego. Jeżeli komórki nie
mają  możliwości  aktywacji  metabolicznej  związku  dodaje  się  frakcji  S9.  po
stymulacji limfocytów do podziału hodowlę utrzymuje się w 37 oC przez 48
godzin.  Na  ostatnie  2  godziny  podaje  się  inhibitor  wrzeciona  podziałowego
(kolchicyna).

Następnym

etapem

jest

przeprowadzenie

szoku

hipotonicznego  w  0.075  m  KCl  i  utrwalanie  komórek  w  mieszaninie
metanolu  i  kwasu  octowego  lodowego.  Z  uzyskanej  zawiesiny  sporządza  się
preparaty mikroskopowe, które barwi się metodą Giemzy i poddaje analizie.
Do  każdej  dawki  bada  się  co  najmniej  100  metafaz,  zapisują  liczbę
chromosomów  i  rodzaj  występujących  aberracji.  W  warunkach  In  vivo  tes
przeprowadza  się  na  dojrzałych  płciowo  myszach.  Podaje  się  dożołądkowo
lub  dootrzewnowo  badaną  substancję  w  kilku  dawkach  z  zakresu  20-60
DL

. grupa kontrolna otrzymuje rozpuszczalnik danej substancji. Związek

podaje się na 30, 18 lub 72 godziny. Na 2-3 godziny przed zakończeniem
myszy uśmierca się, z kości udowej wypreparowuje się szpik, który poddaje
się zabiegom analogicznym do próbek In vitro. Uzyskany materiał nanosi się
na szkiełka i barwi metodą Giemsy. Ocena polega na analizie mikroskopowej
dokonywanej przez dwie niezależne od siebie osoby. Za kryterium

mutagenności środka uznaje się znaczący procent aberracji w próbie
badawczej w porównaniu z kontrolną.

Test wymiany chromatyd siostrzanych (SCE): znalazł zastosowanie w
ocenie  In  vitro  oraz  In  vivo.  Podstawą  badania  jest  semikonserwatywna
replikacja  DNA.  Jeśli  do  środowiska  doda  się  analog  tyminy,  5-
bromodeoksyurydynę  (BrdU)  to  następuje  jej  wbudowanie  w  miejsce
tyminy.  Prowadzi  to  do  różnego  wybarwienia  chromatyd  po  dwóch  cyklach
komórkowych.  Chromatydy  zawierające  BrdU  barwią  się  słabiej  niż
normalne.  W  wybarwionych  w  ten  sposób  chromosomach  obserwujemy
przemieszczenia  się  odcinków  homologicznych  między  chromosomami,
reprezentowanych  przez  różnie  zabarwione  odcinki  jednej  chromatydy,  co
określa się nazwą wymiana chromatyd siostrzanych. Test wykonywać można
na

różnych

rodzajach

komórek.

Celem

określenia

własciowości

genotoksycznych  związku  wykonuje  się  test  In  vitro  na  limfocytach  krwi
obwodowej  i  In  vivo  na  myszach.  Analiza  polega  na  liczeniu  punktów
pęknięć  i  przemieszczeń  fragmentów  chromatyd  siostrzanych.  Wyniki
zestawia  się  w  tabelach.  Badany  związek  który  powoduje  istotny  wzrost
częstości SCE uznaje się za genotoksyczny.

test  mikrojądrowy:  jest  jedną  ze  standardowych  metod  wykrywania
narażenia  na  czynniki  mutagenne.  Z  jego  pomocą  wykrywa  się  skutki
działania  czynników  chemicznych  i  fizycznych,  powodujących  złamania
chromosomów  oraz  uszkodzenia  wrzeciona  podziałowego.  Na  skutek
zaburzeń  wrzeciona  chromosomy  nie przesuwają się  do biegunów  komórki,
lecz zostają w cytoplazmie tworząc mikrojądra, które powstawać mogą także
z  odłamanych  fragmentów  chromosomów  lub  chromatyd  nie  posiadających
centromerów.  Mikrojądra  obserwuje  się  w  komórkach  interfazowych.  Test
wykrywa  działanie  mutagenów  bezpośrednich  i  wymagających  systemu
aktywacyjnego  (frakcja  S9).  Można  go  przeprowadzać  In  vitro  i  in  vivo.  In
vivo  najczęściej  wykorzystuje  się  erytrocyty  polichromatyczne  szpiku
kostnego  lub  śledziony  dojrzałych  myszy.  Badaną  substancję  podaje  się  w
trzech  dawkach  dootrzewnowo  lub  dożołądkowo.  Po  określonym  czasie
wykonuje  się  rozmazy  komórkowe,  które  poddaje  się  barwieniu  metodą
Giemsy i analizie mikroskopowej. Ocena preparatu polega na określeniu:

•

liczby erytrocytów polichromatycznych z mikrojądrami na 1000
badanych.

•

Liczby

erytrocytów

polichromatycznych

200

normochromatycznych.

Otrzymane wyniki poddaje się analizie statystycznej. Jeśli substancja
wywołuje

statystycznie

powtarzalny

znamienny

wzrost

częstości

występowania  erytrocytów  polichromatycznych  z  mikrojądrami,  zostaje
uznana  za  genotoksyczną.  W  warunkach  In  vitro  test  wykonuje  się  na
limfocytach krwi obwodowej. Do hodowli dodaje się cytocholazynę B, która
zatrzymuje cytokinez, nie zakłócając podziału jądra. W efekcie otrzymuje się
komórki  dwujądrzaste,  a  także  wielojądrzaste.  Analiza  preparatu  polega  na

Rola komórek macierzystych i inżynierii tkankowej w

regeneracji.

Komórki  macierzyste  zdolne  są  do  niemal  nieograniczonej  liczby
podziałów  i  posiadają  możliwość  różnicowanie  się  we  wszystkie  inne
komórki  ustroju.  Uzyskiwać  można  je  między  innymi  z  embrionów
wyhodowanych  In  vitro,  drogą  klonowania,  z  krwi  pępowinowej,  z  tkanki
płodu.  Ich  zastosowanie  niesie  ogromne  nadzieje  w  leczeniu  chorób
degeneracyjnych  czy  produkcji  sztucznych  narządów.  Po  wyróżnicowaniu
tracą swoją pluripotencję, w związku z czym spada ryzyko nowotworzenia. W
ostatnich  latach  naukowcom  udało  się  opracować  obiecującą  metodę
pobierania  z  embrionu  w  stadium  moruli  pojedynczych  komórek,  bez  jego
uszkodzenia.  Metoda  ta  daje  obiecujące  efekty  w  fazie  doświadczeń  na
ludzkich

embrionach,

choć

nadal

istnieją

obawy,

iż

zmniejsza

prawdopodobieństwo  implantacji.  Pobrane  komórki  umieszcza  się  w
hodowli,  gdzie  rozwijają  się  w  linie  komórek  macierzystych.  Nieznane  na
razie  są  także  długoterminowe  efekty  takiego  działania  dla  zdrowia
człowieka.  Wątpliwości  budzi  także  strona  moralna  takich  zabiegów,  gdyż
pobrane  komórki  stać  się  mogą  nowym  życiem,  na  co  pozwala  im
totipotencjalny  charakter.  Inną  możliwością  jest  klonowanie  metodą
wymiany  jądra,  która  eliminuje  bariery  zgodności  tkankowej,  nawet  po
zastosowaniu  komórek  odzwierzęcych,  co  także  budzi  pewne  wątpliwości
natury moralnej.

Bardzo  ważnym  dokonaniem  w  zakresie  komórek  macierzystych  było
odkrycie ich obecności w układzie nerwowym dorosłego człowieka. Niesie to
niezwykłe  możliwości  regeneracyjne  i  jest  obiektem  intensywnych  badań.
Obecność  komórek  macierzystych  u  człowieka  dorosłego odkryto  dopiero  w
latach  60tych  XX  wieku,  a  ich  wykorzystanie  niesie  z  sobą  ogromny
potencjał.  Udowodniono,  że  komórki  hemopoetyczne  mogą  różnicować  się
we  wszystkie  3  listki  zarodkowe  i  dawać  początek  neuronom,
kardiomiocytom  i  hepatocytom,  co  stawia  je  na  poziomie  komórek
embrionalnych,  nie  stwarzając  przy  tym  pola  do  wątpliwości  moralno-
etycznych.  Źródłem  komórek  macierzystych  jest  także  krew  pępowinowa,  a
ich  izolowanie  jest  obecnie  powszechnym  zabiegiem.  Problemy  nadal
sprawia ich izolacja z krwi i namnażanie In vitro.

Typy i źródła pozyskiwania komórek macierzystych.

•

Komórki embrionalna: komórki wewnętrznej masy blastocysty

•

Płodowe: łożyskowe, płynu owodniowego, krwi pępowinowej,
tkankowo specyficzne.

•

Dorosłe: szpiku kostnego, tkanki tłuszczowej, tkankowo specyficzne

Przykłady zastosowań inżynierii tkankowej w regeneracji.

•

Inżynieria  tkankowa  w  ortopedii:  choroby  chrząstki  stawowej
(chondropatie)  są  poważnym  problemem  milionów  ludzi.  Chrząstka
stawowa  nie  posiada  zdolności  regeneracyjnych,  a  jej  uszkodzenia
prowadzą

degeneracji

stawu.

Tradycyjne

metody

leczenia(artroskopia,

nawiercanie,

przeszczepianie

autogennej

chrząstki) nie są wystarczające. Duże nadzieje wiąże się z implantacją
autologicznych chondrocytów (ACI) hodowanych In vitro. Technika ta
polega na wyizolowaniu z próbki tkanki chrzęstnej komórek i ich
hodowli

warunkach

laboratoryjnych.

Usuwanie

macierzy

pozakomórkowej  następuję  poprzez  jej  trawienie  enzymatyczne.  W
hodowli  komórkowej  chondrocyty  ulegają  odróżnicowaniu  i  wykazują
cechy  komórek  fibroblastopodobnych.  Celem  przywrócenia  im
odpowiednich  właściwości  stosuje  się  nośniki  z  biomateriałów.
Komórki  te  mają  szerokie  zastosowanie  m.in.  w  regeneracji  chrząstki
rzepki, a także osteoporozy, zapalenia kości i stawów czy reumatyzmu.
Dalsze  badania  dotyczą  technik  leczenia  uszkodzeń  chrząstki  przy
pomocy komórek macierzystych szpiku.

•

Inżynieria tkankowa w chirurgii plastycznej opiera się na
możliwościach

stworzonych

przez

zastosowanie

komórek

tłuszczowych.  Tkanka  tłuszczowa  jest  niezbędna  przy  zabiegach
rekonstrukcyjnych  i  korekcyjnych  twarzy  i  reszty  ciała.  Dużym
problemem  jest  utrata  tkanek  wskutek  defektów  wrodzonych,  urazów
lub  po  resekcji  nowotworów.  Na  tym  polu  stosowane  dotychczas
techniki przeszczepu tłuszczu, implantów silikonowych czy produktów
na bazie kwasu hialuronowego nie przyniosły zadowalających efektów.
Obiecujące  jest  połączenie  komórek  tłuszczowych  lub  macierzystych
(np.

mezenchymalnych)

biodegradowalnymi

polimerowymi

skafoldami  (rusztowaniami).  Wytworzone  tą  drogą  substytuty  tkanki
tłuszczowej są bardzo zbliżone do naturalnych. W chirurgii głowy i szyi
dużym  problemem  jest  utrata  chrząstki  i  kości.  Przyszłością  jest
stworzenie  In  vitro  autologicznej  chrząstki  lub  elementu  kostnego
metodami  inżynierii  tkankowej.  Autologiczna  chrząstka  staje  się
standardem  w  rekonstrukcji  nosa  i  uszu.  Chondrocyty  namnaża  się  z
fragmentów pobranych z chrząstki ucha, żebrowej lub przegrody nosa.
Metoda ta wymaga jednak interwencji chirurgicznej i grozi zakażeniem
ogólnoustrojowym.  Dotychczas  stworzono  tą  droga  implanty  ucha,
tchawicy, stawu szczękowego i przegrody nosa. Niezwykle pożądanym
celem  staje  się  także  odkrycie  metody  hodowli  tkanki  kostnej,  gdyż
pobieranie  dużych  ich  fragmentów  z  innych  części  ciała  wiąże  się  z
bólem i poważnymi komplikacjami.

•

Inżynieria tkankowa w transplantologii. Co roku tysiące ludzi
umiera czekając na transplantację nerek, serca, płuc czy wątroby.
Uszkodzenia tkanek i narządów najczęściej leczy się farmakologicznie,

chirurgicznie,  poprzez  transplantację  organów  lub  wszczepienie
biomateriałów.  Coraz  większą  nadzieję  wiąże  się  w  ostatnich  latach  z
inżynierią  tkankową.  Komórki  pobrane  do  rekonstrukcji  mogą  być
autologiczne  (dawca  i  biorca  to  ten  sam  organizm),  allogeniczne
(dawca i biorca należą do jednego gatunku) lub ksenogeniczne (dawca
i  biorca  z  różnych  gatunków).  W  celu  wytworzenia  nowych  tkanek
poprzez  namnażanie  komórki  łączy  się  z  matrycami  naturalnymi  lub
syntetycznymi  i  umieszcza  w  bioreaktorach.  Sztuczny  zrąb  z
komórkami  przeszczepia  się  do  uszkodzonego  miejsca,  gdzie  komórki
namnażają  się  i  grupują,  tworząc  nową  tkankę.  Polimer  ulega  w
międzyczasie  stopniowej  degradacji.  Wielkie  nadzieje  wiąże  się  z
różnicowaniem  i  namnażaniem  komórek  macierzystych.  Dotychczas
nie  wyhodowano  w  całości  funkcjonalnego  narządu,  poza  pęcherzem
moczowym.

•

Inżynieria  tkankowa  w  dermatologii.  Metodami  inżynierii
tkankowej  wyprodukowano  substytuty  skóry,  pomocne  m.in.  w
leczeniu  żylnych  owrzodzeń  stóp,  poparzeń  oraz  ran  pooperacyjnych.
Produkt powinien stanowić barierę chroniącą przed infekcjami i utratą
wody.  Dostępnych  jest  wiele  żywych  i  sztucznych  substytutów  skóry.
Do  żywych  zaliczamy  auto-  i  allogeniczne  substytutu  złożone  z
fibroblastów i keratynocytów, czy też dwuwarstwowe konstrukty skóry,
złożone  zarówno  z  epidermy,  jak  i  żeli  kolagenowych  zasiedlonych
fibroblastami.  Zaletą  żywych  substytutów  jest  ich  zdolność  do
wydzielania  cytokin,  chemokin  i  czynników  wzrostu,  niezbędnych
podczas  gojenia.  Jeżeli  duża  część  ciała  chorego  uległa  uszkodzeniu
tkanki nie da się wytworzyć z jego własnych komórek. Wówczas stosuje
się  substytuty  sztuczne,  jak  integraf,  złożona  z  kolagenu,  siarczanu
chondroityny  i  silikonu,  zapobiegającego  wysychaniu.  Produkt  ten
pokrywa ranę, przyczynia się do angiogenezy, przygotowując skórę do
przeszczepu  wyhodowanego  In  vitro  naskórka.  implanty  tworzy  się
poprzez  pobranie  fragmentu  skóry,  hodowanego  następnie  przez  2-
3tygodnie w laboratorium, aż do uzyskania wystarczającego fragmentu
do przeszczepu. Pozwala to na trwałe pokrycie rany bez ryzyka odrzutu
i  odtworzenia  skóry  właściwej.  Efekt  kosmetyczny  także  jest
zadowalający.  Inżynieria  tkankowa  ma  znaczenie  także  w  leczeniu
bielactwa  nabytego  drogą  przeszczepu  melanocytów.  Coraz  częściej
udaje  się  uzyskać  z  komórek  skóry,  a  także  mieszków  włosowych,
somatycznych komórek macierzystych.

Typy regeneracji fizjologicznej

Regeneracja fizjologiczna dotyczy naturalnej odnowy tkanek nie wynikającej z
doznanych obrażeń. Dzieli się na trzy rodzaje:

•

Regeneracja stała: włosy, paznokcie, plemniki, gruczoły łojowe,
krwinki

•

Regeneracja cykliczna: śluzówka macicy, gruczoły mleczne

•

Jednorazowa: wymiana uzębienia mlecznego na stałe

Typy regeneracji pourazowej

•

Regeneracja  przerostowa:  dotyczy  uszkodzonych  narządów
wewnętrznych  ssaków.  W  przypadku  urazu  i  utraty  części  narządu,
wszystkie  jego  komórki  zaczynają  powiększać  się  i  wykazywać
wzmożoną  aktywność  mitotyczną,  zachodzi  więc  hipertrofia
(przerost)  oraz  hiperplazja.  Nazwa  tego  typu  odnowy  wynika  z
faktu,  iż  proces  ten  jest  bardzo  podobny  do  kompensacji,  tj.
przerostu nieuszkodzonego narządu parzystego po usunięciu drugiego
narządu  z  pary.  Proces  ten  jest  podstawą  chirurgicznego  leczenia
złamań  kości  i  gojenia  ran  pooperacyjnych.  Usunięcie  pewnej  części
wątroby  szczura  powoduje  jej  wzrost,  który  ustaje  po  osiągnięciu
pierwotnych  rozmiarów,  co  dowodzi  istnienia  pewnych  czynników
kontrolujących regenerację.

•

Metaplazja:      jest  to  możliwość  przejścia  zróżnicowanej  komórki  w
inną,  należącą  do  tej  samej  tkanki.  Przykładem  jest  przemiana
nabłonka  walcowatego  w  odporniejszy  wielowarstwowy  wskutek
ucisku  kamieni  żółciowych  na  ściany  woreczka.  Zjawiska  tego  nie
obserwuje się w obrębie tkanki mięśniowej.

•

Epimorfoza: polega na odtworzeniu brakujących części ciała w
wyniku mnożenia się komórek i wzrostu nowej tkanki.

•

Morfalaksja: polega na rekonstrukcji części ciała poprzez zmianę
specyfikacji pozostałej tkanki, przykładem jest regeneracja kończyny u
płazów.

Regeneracja kończyny u płazów

U płazów ogoniastych występuje niespotykana wśród kręgowców zdolność
do regeneracji kończyny. Odcięta w regionie zonoszkieletu kończyna
regeneruje się w 2-3 miesiące.
Etapy regeneracji:

•

Proliferacja

komórek

entodermalnych

rejonie

amputacji,

nakrywająca ranę grubą czapeczkę ektodermalną (AEC).

•

AEC indukuje leżące pod nią komórki do utworzenia zespołu komórek
mezenchymatycznych (blastemy regeneracyjnej), która pochodzi ze
wszystkich

typów

komórek

mezodermalnych,

uległych

odróżnicowaniu.

•

Komórki blastemy odtwarzają kończynę.

Duże  znaczenie  w  regeneracji  ma  unerwienie  kończyny.  Wykazano,  że
usunięcie  nerwów  kończyny  przed  rozpoczęciem  regeneracji  uniemożliwia
regenerację,  a  ich  usunięcie  po  zainicjowaniu  procesu  prowadzi  do  jego

spowolnienia. Na uwagę zasługuje fakt, iż kończyny gadów są najbardziej
unerwione spośród wszystkich kręgowców. Regeneracja zawsze postępuje w
kierunku dystalnym, niezależnie od miejsca przecięcia.

Molekularne podstawy specyfikacji regionalnej

W  blastemie  specyfikacja  regionalna  może  obejmować  działanie  kwasu
retinowego  i  ekspresję  genu  HoxA.  Naskórek  rany  jest  bogatym  źródłem
kwasu  retinowego,  który  może  tworzyć  gradient  w  blastemie  krótko  po  jej
powstaniu.  Dowodem  na  działanie  kwasu  retinowego  jest  fakt,  że  po
wprowadzeniu  dużych  jego  ilości  do  regenerującej  na  poziomie  nadgarstka
kończyny, prócz nadgarstka powstanie cała kończyna.

Organizm  płaza  nie  tylko  potrafi  odtwarzać  utracone  części  dystalne,  ale
także  utracone  elementy  pośrednie  kończyn,  co  nazywamy  regeneracją
interkalarną.

Komórki  płazów  wyposażone  są  w  informacje  pozycyjne  w  formie
współrzędnych  biegunowych  na  trójwymiarowej  mapie.  Pozwala  to  na
zachowanie  orientacji  proksymalno-  dystalnej  przy  odtwarzaniu  elementów
kończyn.

Metody stosowane w biologii molekularnej

Izolacja  DNA:    polega  na  oddzieleniu  DNA  od  innych  struktur
komórkowych,  a  także  cząsteczek  RNA  i  białek  związanych  z  DNA.  W
zależności  od rodzaju materiału, z którego izoluje się materiał genetyczny, i
jego  przeznaczenia  stosuje  się  różne  metody  izolacji.  Materiałem
biologicznym może być

•

krew obwodowa

•

plemniki (nasienie)

•

wymazy komórkowe

•

mocz

•

mleko

•

plwocina

•

wycinki tkanek

•

płyn mózgowo rdzeniowy

•

hodowle bakteryjne i tkankowe

metody izolacji DNA dzielimy na dwie główne grupy

•

izolacja klasyczna z użyciem fenolu i chloroformu

•

stosowanie gotowych zestawów do szybkiej i uproszczonej izolacji DNA

Każda  procedura  izolacji  DNA  powinna  się  zakończyć  ocenją  jego  ilości  i
jakości  przy  pomocy  pomiaru  spektrofotometrycznego  przy  długości  fali
260-280nm.  Zawartość  wyizolowanego  DNA  w roztworze  podaje  się  w
µg/ml. Wyliczana jest ona ze wzoru

Z=A

260

x 50 x R

Gdzie:
50- stały współczynnik
R- rozcieńczenie
Czystość izolowanego DNA podawana jest w % wyliczanego ze stosunku
absorbancji 260/280nm (1,8 = 100% czystości DNA).
Izolowany DNA przechowuje się do miesiąca w temp. 4-8

C lub zamrożony

w -20

C do usranej śmierci.

metoda PCR: polega na powieleniu In vitro fragmentu genomowego DNA
wielkości od kilkudziesięciu do kilkudziesięciu tysięcy par zasad. Początkowo
w  procesie  wykorzystywano  termolabilną  polimerazę  od  E.  Coli,  ale
wymagało to dodawania kolejnej jej porcji po każdej denaturacji. Przełomem
w  tej  technice  było  wprowadzenie  termostabilnej  Polimerazy  Taq
pochodzącej  od  bakterii  termofilnych.  Reakcję  przeprowadza  się  w
sterowanym elektronicznie bloku grzejnym (termocykler), a produkty ocenia
za pomocą elektroforezy. Reakcja następuje w trzech etapach:

•

denaturacja dwuniciowego DNA przeprowadzana przez ogrzanie
do 90-95

C na 0.5- 2 min.

•

przyłączanie starterów; oligonukleotydów hybrydyzujących z
3’końcem każdej nici w temp 50-60

C w ciągu 30-60 s.

•

polimeryzacja DNA przeprowadzana w 72

pod  koniec  pierwszego  cyklu  otrzymujemy  dwie  kopie  DNA  z regionem,
który  chcieliśmy  zwielokrotnić. Nastepnie  proces  się  powtarza. Liczba  kopii
DNA rośnie wykładniczo. Zwykle przeprowadza się 20 do 40 cykli. Metoda ta
pozwala na uzyskanie dużej ilości DNA nawet z bardzo małej próbki (1 µg) co
ma  istotne  znaczenie  na  przykład  w  kryminalistyce  (starczy  jeden  włos
z cebulką).  Technikę  PCR  stosuje  się  do  wykrywania  nosicielstwa
zmutowanego  genu  w  rodzinach  obciążonych  ryzykiem  np. mukowiscydoza
czy  fenyloketonuria,  badań  na  embrionie  w zapłodnieniu  In  vitro,
antropologii i diagnostyce chorób zakaźnych.
Innym  rodzajem  metody  jest  PCR  „multipleks”,  w  której  stosuje  się  kilka
starterow  dla  różnych  genów.  Natomiast  w  reakcji  odwrotnej  trankryptazy-
PCR (RT-PCR) proces poprzedzony jest przepisaniem informacji z mRNA na
komplementarny  cDNA  w  obecności  startera,  najczęściej  uniwersalnego
oligo  dT.  Produkty  PCR  są  najczęściej  badane  pod  kątem  mutacji  drogą
sekwencjonowania  lub metodami pośrednimi (SSCP)

SSCP: metoda, wykorzystująca unikalną właściwość kwasów nukleinowych,
polegającą na tworzeniu przez pojedyncze nici DNA konformerów, których
kształt zależy od sekwencji DNA. zmiany struktury DNA takie jak mutacjie
punktowe powodują zmianę konformacji pojedynczej nici DNA, co wykrywa
się przy pomocy elektroforezy.

RFLP jest to polimorfizm fragmentów DNA powstających wskutek działania
endonukleaz  restrykcyjnych  na  nić  DNA.  Może  on  być  następstwem
tranzycji,  transwersji,  insercji  lub  delecji,  prowadzących  do  zaniku  miejsca
rozpoznawanego  przez  enzymy  restrykcyjne.  Metoda  ta  pozwala  ma
mapowanie  genów.  Dzięki  analizie  polimorfizmu  odkryto  między  innymi
lokalizację  na  chromosomei  X  genu  odpowiedzialnego  za  dystrofię  mięśni
Duchenne’a.

Fingerprint:

polega

badaniu

polimorfizmu

sekwencji

mikrosatelitarnych  (STRP)  i  minisatelitarnych  (VNTR).  Zmienność
sekwencji VNTR polega na różnej liczbie powtórzeń motywu w danym locus.
Analiza  kilku  loci  danego  osobnika  daje  charakterystyczny  dla  niego  wzór
fragmentów  DNA  (profil),  tzw.  Genetyczny  odcisk  palca.  Obraz  ten  jest
unikatowy niczym linie papilarne. Im bliżej dwie osoby są spokrewnione tym
bardziej  podobny  jest  ich  profil  DNA.  Badania  profili  DNA  obejmują
najczęściej  analizę  markerów  minisatelitarnych,  nie  tylko  pod  kątem  liczby
kopii,  ale  także  nieznaczne  różnice  sekwencji  nukleotydów.  Sekwencje  są
wykrywane  najczęściej  metodą  Southerna  po  uprzednim  namnożeniu
materiału  metodą  PCR.  Metodę  tą  szeroko  stosuje  się  w  kryminalistyce,  a
także w badanu pokrewieństwa i ustalaniu ojcostwa.

Metoda  Southerna:  opisana  po  raz  pierwszy  w  1975r.  .  pozwala
identyfikować  fragmenty  restrykcyjne  przy  użyciu  elektroforezy  żelowej  i
sond molekularnych. Mieszaninę fragmentów restrykcyjnych rozdziela się na
żelu agarozowym, denaturuje celem podzielenia na fragmenty jednoniciowe i
przenosi  na  filtr  nitrocelulozowy.  Jednoniciowy  DNA  poddaje  się
hybrydyzacji ze specyficzną sondą DNA lub RNA, znakowaną radioizotopem
(

P). metodą autoradiograficzną można wykryć fragmenty DNA

komplementarne  do  znakowanej  sondy.  Podobnie  identyfikować  można
cząsteczki  RNA  lub  białka  poprzez  badanie  wiązanai  znakowanych
przeciwciał  przeciw poszukiwanym grupom antygenów.

Sekwencjonowanie  DNA:  metoda  polegająca  na  ustaleniu  rodzaju  i
kolejności  nukleotydów  w  DNA,  która  przeprowadza  się  przy  użyciu
specjalnych  aparatów.  stosuje  się  następujące    metody  sekwencjonowania:
Maxama,  Gilberta  i  enzymatyczną  Sangera.  Metody  Maxima  i  Gilberta
polegają  na  przeprowadzeniu  4  reakcji  chemicznych  w  odrębnych
mieszaninach, w wynikó których cząsteczka DNA przecinana jest w miejscu
występowania  jednej  z  4  zasad,  zależnie  od  użytego  odczynnika.  produkty
tych  reakcji,  różniące  się  długością,  są  następnie  rozdzielane  przez
elektroforezę  na  żelu.  Obecnie  częściej  stosuje  się  metodę  Sangera.  Polega
ona  na  enzymatycznym  wydłużaniu  nowych  łańcuchów  na  matrycy
badanego  DNA.  Począwszy  od  wyznakowanego  radioizotopowo  startera.
Reakcję przeprowadza się w czterech odrębnych mieszaninach zawierających
niezbędne  substraty.  Reakcję  zatrzymuje  się  po  pewnym  czasie  przez
dodanie  pochodnej  odpowiedniego  dideoksyrybonukleotydu  w  małym
stężeniu.  Dideoksy-NTP  terminuje  wydłużanie  łańcucha  w  miejscu
włączenia,  gdyż  brak  grupy  OH  przy  3’węglu  uniemożliwie  utworzenie
kolejnego wiązania. Powstaje mieszanina fragmentów DNA różnej długości,
które  można  analizować  drogą  elektroforezy  i  autoradiograficznie.
Elektroforeza porządkuje elementy według wielkości. Rezultatem metod jest
seria  prążków  w  żelu,  z  których  można  bezpośrednio  odczytać  sekwencje
DNA.

Metoda  ASO:    wykorzystuje  się  w  niej  dwa  różne  oligonukleotydu,  jeden
komplementarny  do  sekwencji  prawidłowego  genu,  drugi  komplementarny
do zmutowanego. W odpowiednich warunkach sondy ASO hybrydyzują tylko
z  komplementarną  sekwencją  DNA.  Wykorzystuje  się  ją  do  badań
przesiewowych  anemii  sierpowatej.  W  badaniach  wykorzystuje  się  krwinki
białe;  poddaje  się  je  ogrzaniu  aż  do  denaturacji  DNA,  następnie  namnaża
region  β-globiny  przy  pomocy  PCR.  Namnożony  DNA  nanosi  się  na  filtry
połączone  z  odpowiednimi  oligonukleotydami.  Po  uwidocznieniu  prązków
genotyp  odczytać  można  bezpośrednio  z  filtrów,  gdyż  tam,  gdzie  nastąpi
hybrydyzacja oligonukleotydu pojawi się zaciemnienie filtra.

Regulacja ekspresji genów u eucaryota

W komórce eukariotycznej aktywnych jest jedynie 15% genów, reszta pozostaje

dezaktywowana. Wybór genów podlegających ekspresji jest wieloetapowy.
Regulacja odbywa się już na poziomie modyfikacji upakowania chromatyny, a
kończy na regulacji posttranslacyjnej.

Regulacja na poziomie matrycy DNA
DNA może istnieć w trzech formach

••••

Forma I; superzwinięta. Naprężenia nici wywołane dodatkowymi
obrotami powodują, że przybiera ona kształt warkocza

••••

Forma II; odpowiada rozluźnionej postaci DNA, który przybiera kształt
kolisty.

••••

Forma III;

liniowa postać DNA.

Podstawową formą przestrzenną DNA jest forma I, umożliwiająca najlepszy

dostęp do helisy różnym białkom. Interakcja DNA-białko jest podstawą
regulacji ekspresji. Zmiana stopnia skręcenia zmienia możliwości dostępu
białek do DNA, stanowiąc tym samym czynnik regulujący ekspresję.

Mutacje w genach topoizomeraz (enzymy usuwające lub tworzące

superzwoje) zmniejszające ich aktywność, prowadzą do zmniejszenia
transkrypcji wielu genów.

Obszar DNA otaczający gen lub grupę genów ulegających ekspresji nazwano

domeną funkcjonalną. Domenę taką można znaleźć poprzez trawienie
fragmentów chromatyny DNA-zą I, która wyszukuje „wyeksponowanych”
odcinków DNA, do których ma uprzywilejowany dostęp.

Miejsca wrażliwe na DNA-zę I: odpowiadają one genom aktywnym, także

tym, które były aktywne w przeszłości (np. kodujące białka płodowe). Dowodzi
to, że geny te znajdują się w konformacji ułatwiającej DNA-zie I dostęp.
Dostępność ta odnosić się będzie prawdopodobnie także do innych białek takich
jak polimeraza RNA. Specyficzna struktura przestrzenna jest najwyższym
poziomem egulacji ekspresji, na którym odbywa się selekcja genów, które mają
być transkrybowane.

Miejsca nadwrażliwe na DNA-zę I: niektóre miejsca genomu są jeszcze

bardziej wrażliwe na enzym. W miejscach tych nie ma nukleosomów, tak więc
białka  wiążące  mają  tu  najłatwiejszy  dostęp  do  DNA.  Geny  te  w  kontakcie  z
DNA-zą  nie  są  niszczone.  Wykonuje  ona  tylko  kilka  precyzyjnych  cięć,  które
mogą  zostać  ponownie  połączone.  Pełni  więc  ona  rolę  restryktazy.  Miejsca
nadwrażliwe najczęściej zlokalizowane są w promotorach genów aktywnych.

Regulacja ekspresji na drodze metylacji

Metylacja DNA polega na enzymatycznym przyłączeniu grup metylowych do

nukleotydów. U eucaryota dotyczy ona wyłącznie cytozyn wchodzących w skład
nukleotydu CpG. Metylacja wiąże się ze spadkiem aktywności transkrypcyjnej
genów. Jest ona procesem odwracalnym. Obecnie wiadomo że proces ten
odgrywa zajebiście dużą rolę w różnicowaniu się komórek.

Regulacja na poziomie transkrypcji

Białka regulatorowe; zwane inaczej czynnikami transkrypcyjnymi. Są to

białka  oddziałujące  z  polimerazą  RNA  (np.  TF  II  D,  TF  II  B).  są  one  zdolne
przyłączać  się  do  specyficznych  sekwencji  DNA,  mogąc  regulować  poziom
transkrypcji. Niektóre występują tylko w określonych typach komórek, Inne we
wszystkich.  Są  one  kodowane  przez  geny  regulatorowe,  stanowiące  5-10%
genomu  człowieka.  Mają  one  budowę  modularną  i  składają  się  z  pełniących
określone  funkcje  domen  białkowych.  Powszechnie  występują  3  typy  domen:
(1)domeny wiążące DNA (2)domeny odpowiedzialne za dimeryzację (3)domeny
transaktywujące.  Domeny  wiążące  DNA  i  odpowiedzialne  za  dimeryzację
zawierają

charakterystyczne

struktury

białkowe,

zwane

motywami.

Scharakteryzowano trzy typy domen wiążących:

Helisa-zwrot-helisa (HTH): białko HTH posiada dwa krótkie fragmenty

tworzące helisę,  rozdzielone  odcinkiem  tworzącym zwrot.  Jedna  z  dwóch  helis
(rozpoznawcza)  lokalizuje  w  cz.  DNA  specyficzne  zasady  i  łączy  się  z  nimi
słabymi  wiązaniami.  Połączenie  helisa  rozpoznawcza-DNA  zależy  od
pozostałych  części  białka.  W  momencie  związania  obie  cząsteczki  ulegają
zmianom konformacji.

Palce cynkowe: motyw ten zawiera atom cynku otoczony 4 aminokwasami.

Istnieją dwie formy „palców”: Cys

His

oraz Cys

. motyw ten jest wielokrotnie

powtórzony  w  domenie  wiążącej  DNA.  Oddziaływanie  zachodzi  między
aminokwasy  zasadowe  a  dużym  rowkiem  helisy  DNA.  Przykładem
występowania  tego  motywu  jest  czynnik  transkrypcyjny  Sp1  powszechnie
występujący  u  eucaryota.  Palce  cynkowe  występują  w  czynnikach,  będących
receptorami  hormonów  steroidowych.  Białka  GATA,  istotne  w  rozwoju  linii
erytrocytalnej (GATA-1) i innych w układzie krwiotwórczym.

Domena zasadowa zawiera motywy: helisa-pętla-helisa oraz suwak

leu-cynowy.

Suwak leucynowy: jego charakterystyczną cechą jest występowanie leucyny

w co siódmej pozycji w obrębie 35 reszt aminokwasowych. Białka suwaka
tworzą dimer złożony z dwóch skręconych łańcuchów. Leucyny, które znajdują
się wewnątrz superhelisy, stabilizują ich strukturę. W pobliżu N- końca
dimerów znajduje się 30- aminokwasowa domena wiązania DNA.

Helisa-pętla-helisa: składa się z dwóch hydrofobowych helis, oddzielonych

pętlą. W skład pętli wchodzi 12-28 aminokwasów. Przypuszczalnie helisy biorą
udział w tworzeniu heterodimerów białkowych, a pętla oddziałuje z DNA.

Regulacja ekspresji w pozycji cis i trans: wydajność transkrypcji może

być kontrolowana przez sekwencje DNA, zwane wzmacniającymi (enchancer),
które mogą się znajdować w odległości tysięcy pz od wzmacnianego genu. Mają

one z reguły długość 100-200 pz i są w stanie wiązać czynniki transkrypcyjne.
Niektóre miejsca wiążą czynniki zmniejszające wydajność transkrypcji
(silencer). Sekwencje wzmacniające posiadają szereg wspólnych właściwości

••••

Wzmacniają znacznie poziom transkrypcji danego genu.

••••

Ich inwersja nie zmienia właściwości, a jedynie lekko je osłabia (tj.
można sobie je obracać na wszystkie strony świata a Itak działają)

••••

Utrzymują swe właściwości nawet przemieszczone o kilka tys. Pz,
ale do pewnego punktu, kiedy je tracą.

••••

Mogą modyfikować strukturę przestrzenną DNA i stopień
spiralizacji.

Regulacja postranskrypcyjna

Wycinanie intronów- system alternatywny. Wycinanie poszczególnych

intronów  jest  od  siebie  niezależne.  Może  także  dochodzić  do  usuwania
niektórych eksonów, przez co powstają białka zupełnie odmienne. Przykładem
na to jest synteza kalcytoniny w tarczycy. Produkt tego samego, co kalcytonina
genu,  wytwarzany  w  mózgu  i  dojrzewający  w  sposób  odmienny  staje  się
neurotransmitterem.

Redagowanie RNA. Dotyczy między innymi syntezy apolipoproteiny Apo-

B100 w wątrobie i Apo-B48 w jelicie cienkim (co to takiego ta apolipoproteina
dowiecie  się  na  biochemii  i  pewnie  pożałujecie  swojej  ciekawości).  Obie
apolipoproteiny  różnią  się  masą.  Sekwencja  ich  RNA  jest  identyczna,  gdyż  są
kodowane  przez  jeden  gen,  ale  w  Apo-B48  w  przepisanym  mRNA  następuje
zastąpienie  cytozyny  uracylem  w  pozycji  2153,  co  powoduje  pojawienie  się
kodonu STOP i wcześniejszy koniec translacji.

Regulacja przez zmianę stabilności mRNA. Stabilność mRNA określa

się  używając  terminu  „czas  półtrwania”.  U  bakterii  wynosi  on  2  minuty,  a  w
kom. zwierzęcych 4-24h. przykładem takiej regulacji są onkogeny c-myci c-fos,
kodujące  białka,  które  wzmacniają  ekspresję  niektórych  genów  regulujących
przebieg  cyklu  komórkowego.  Stabilizacja  mRNA  tych  onkogenów  powoduje
wzrost  stężenia  kodowanych  przez  nie  białek,  co  prowadzi  do  wzmożonej
proliferacji. Za niestabilność prawidłowego mRNA c-mych odpowiedzialny jest
region  51  nukleotydów,  głównie  AT,  znajdujący  się  w  części  3’  mRNA.  Delecja
tego  regionu  powoduje  znaczne  wydłużenie  czasu  półtrwania,  czyniąc  go
jebanym onkogenem.

Regulacja przez magazynowanie mRNA. Ma ono bardzo istotny wpływ

na  kontrolowanie  ekspresji.  mRNA  wielu  genów  zostaje  zaraz  po  przepisaniu
zmagazynowany  w  jądrze  lub  cytozolu  i  nigdy  nie  pojawia  się  jakikolwiek
produkt ich translacji. W trakcie działania sygnałów takich jak hormony zmiana
stężeń białek i mRNA jest bardzo szybka, podczas gdy transkrypcja ulega tylko
nieznacznemu  przyspieszeniu.  W  takich  właśnie  przypadkach  uwolnione
zostają  te  zmagazynowane  rezerwy  mRNA.  Dobrym  przykładem  tego  zjawiska
jest składowanie mRNA w komórce jajowej, które nie ulega translacji. Dopiero
po  pewnej  liczbie  podziałów  zostaje  użyte  do  produkcji  białek  indukujących
różnicowanie komórek. Rozmieszczenie tego mRNA w komórce jajowej nie jest
jednolite, co sprawia, że różne komórki potomne dziedziczą różną jego ilość.

Regulacja na poziomie translacji

Jest to etap o którym na dzień dzisiejszy gówno wiemy. Prawdopodobnie

mechanizmy  kierujące  tą  regulacją  odgrywają  rolę  w  magazynowaniu  mRNA
opisanym  powyżej.  Przykładem  na  to  jest  regulacja  ekspresji  genów  globiny
przez  hem.  Jeżeli  nie  dotrze  on  do  środowiska,  bądź  zostanie  wyczerpany,  to
translacja  genów  globin  bardzo  szybko  się  zatrzymuje.  Hem  działa  za
pośrednictwem  białka  posiadającego  aktywność  kinazową  wobec  czynnika
inicjacji  eIF-2.  elementem  regulacyjnym  może  być  także  obróbka  nowo
powstałych białek, do której należą: glikozylacja, fosforylacja, acetylacja.

Regulacja pod wpływem temperatury- białka HSP

Komórki eukariotyczne reagują na nieznacznie podwyższoną temperaturę

wzmożoną  syntezą  polipeptydów  zwanych  białkami  szoku  cieplnego.  Do  ich
syntezy  może  dochodzić  także  w  przypadku  infekcji  wirusowej,  etanolu  lub
innych  stresorów.  Wiele  z  HSP  pełni  funkcje  białek  opiekuńczych  inne  są
protezami.  Występujący  w  komórkach  zwierząt  czynnik  HSF,  który  wiązać  się
może  z    sekwencją  DNA  zwaną  HSE,  zlokalizowanej  80-200  pz  od  początku
transkrypcji mRNA indukując odpowiedź szoku termicznego. Aktywacja genów
szoku  cieplnego  jest  jedną  z  form  odpowiedzi  na  stres.  Aktywność  jądra
komórkowego  należy  do  najbardziej  wrażliwych  na  stres.  Synteza  DNA  ulega
spowolnieniu,  kumulują  się  prekursory  rRNA  i  zahamowane  zostaje  usuwanie
intronów. Nawet krótki szok cieplny wywołuje zmiany w funkcjonowaniu jądra.

Białka Chaperonowe

Są one powoli działającymi ATP-azami. Uczestniczą w ATP- zależnym procesie

zwijania  polipeptydów  oraz  tworzeniu  kompleksów  białkowych.  Biorą  one
udział w formowaniu oktamerów pistonowych, przenoszenia białek przez błony
mitochondrialna  i  nadawania  im  właściwej  konformacji  wewnątrz  organelli.
Blokują  one  niepożądane  reakcje  między  cząsteczkami  i  utrzymują  w  całości
rosnący  łańcuch.  Kompleks  ADP-chaperon  ma  duże  powinowactwo  do
niesfałdowanych,  nie  wykazując  go  wcale  wobec  białek  natywnych.  Związanie
chaperonu  z  polipeptydem  powoduje  odłączenie  od  niego  ADP  i  przyłączenie
ATP.  Powstały  kompleks  formuje  kawałek  polipeptydu,  zużywając  energię  z
ATP i znowu jako ADP-chaperon przyłącza się do kolejnego niepofałdowanego
segmentu.

Regulacja przez hormony steroidowe

Hormony steroidowe odgrywają zajebiście dużą rolę w regulacji ekspresji,

wpływając między innymi na wzrost i różnicowanie się komórek. Sygnał
hormonalny (ligand) jest przekazywany do genu docelowego przez receptory
wewnątrzkomórkowe.

Wiązanie

liganda

uruchamia

interakcję

charakterystyczną  regulatorową  sekwencją  DNA  w  genie  docelowym  (HRE-
element  odpowiedzi  hormonalnej).  Receptor  związany  z  ligandem  ułatwia
tworzenie  się  kompleksu  z  innymi  czynnikami  transkrypcyjnymi  i  stymuluje
transkrypcję.  Wszystkie  receptory  hormonów  steroidowych  posiadają
identyczną strukturę ogólną składającą się z:

••••

końca NH

- terminalnego specyficznego dla receptora

••••

regionu ok. 65 aminokwasów (domena C), który jest bardzo
konserwatywny. W domenie C występują dwa motywy palców
cynkowych.

••••

Regionu niekonserwatywnego o zmiennej długości.

••••

Zakończenia domeną o różnej długości, wiążącą hormon.

Ze względu na strukturę i funkcję receptory hormonów można podzielić na

dwie grupy; (1)zawierająca receptory glikokortykoidów, progesteronu,
androgenów i mineralokortykoidów (2)zawierającą receptory estrogenów,
hormonu tarczycy, kwasu retinowego i witaminy D

Element odpowiedzi hormonalnej (HRE). Są to specyficzne sekwencje

DNA,  do  których  wiążą  się  aktywowane  receptory  hormonów  steroidowych.
Regulują  one  ekspresję  sąsiadujących  genów.  Badania  nad  HRE  pozwoliły
odkryć  palindromowi  sekwencje  15  par  zasad,  mogących  znajdować  się  w
odległości 100- kilka tys. Pz od miejsca startu transkrypcji. HRE dzieli się na 4
klasy:

•

GRE- element odpowiedzi glikokortykoidów

•

ERE- element odpowiedzi estradiolu

•

TRE- element odpowiedzi hormonu tarczycy

•

DRE- wiąże receptory sieroce (takie, których funkcji ani ligandów nie
znamy)

Ligandy aktywują geny poprzez wywoływanie niewielkich zmian w kinetyce

receptorów  i  jego  powinowactwie  do  HRE,  co  ułatwia  dostęp  czynnikom
transkrypcyjnym  i  polimerazie.  Podczas  nieobecności  liganda  większość
receptorów  zlokalizowanych  jest  w  cytoplazmie,  a  kompleks  receptor-hormon
migruje  do  jądra  komórkowego  aby  modulować  ekspresję  genów.  Niektóre
receptory występują w jądrze niezależnie od obecności liganda.

Białko G jest heterotrimerem ulokowanym w błonach komórkowych, który

tłumaczy i wzmacnia sygnały przekazywane do wnętrze komórki, powodując
zmianę aktywności enzymów komórkowych. Posiada ono strukturę IV rzędową
i trzy podjednostki, które wiążą i hydrolizują GTP. Białka G stają się aktywne w
interakcji z kompleksem receptor-hormon w obecności Mg

i GTP. W

momencie aktywacji białka G jego podjednostki dysocjują, a podjednostka alfa
aktywuję cyklazę adenylową. Powoduje to pośrednio syntezę cAMP, biorącego
udział w wielu szlakach metabolicznych.

Epigenetyka

Epigenetyka to zmiany funkcji lub ekspresji genów bez zmian w kodzie
genetycznym, ale z modyfikacjami struktury chromatyny.

Rodzaje epigenetycznej modyfikacji genów:

•

Metylacja

•

Imprinting

•

Modyfikacja histonów zasadowych

•

Inaktywacja chromosomu X

•

Interferencja DNA

•

Białka Polycomb i Trithorax

Metylacja  to  proces  przyłączania  grup  metylowych  do  zasad  azotowych.
Aktywna  chromatyna  jest  z  reguły  słabo  zmetylowana  i  ma  acetylowane
histony,  nieaktywna  odwrotnie;  ma  metylowaną  cytozynę  i  nieacetylowane
histony.  U  kręgowców  dinukleotydy  cytozyny  w  sekwencji  5’CpG3’  mogą  być
enzymatycznie  metylowane,  dając  w  efekcie  5-metylocytozynę.  Metylacja  z
reguły  idzie  w  parze  z  dezacetylacją  histonów,  która  skutkuje  zwiększeniem
zagęszczenia  chromatyny.  Geny  heterochromatyny  zwykle  są  nieaktywne,
prawdopodobnie zagęszczona struktura chroni je przed dostępem Polimerazy
RNA.  Metylowana  cytozyna  tworzy  silniejsze  niż  zwykła  wiązania  wodorowe,
co stabilizuje helisę. W procesie replikacji DNA zauważamy, że metylowana
jest  tylko  nić  rodzicielska,  co  ma  ogromne  znaczenie  dla  mechanizmów
naprawy.  W  nici  potomnej  pierwszy  cel  dla  metylazy  zachowawczej stanowią
połowicznie  metylowane  palindromy

CpG.CpG. Metylacja cytozyny

na  nici  potomnej  (w  fazie  S)  jest  komplementarna  do  metylacji  nici
rodzicielskiej.  W  komórkach  ssaków  występuje  kilka  metylaz,  spośród  nich
DMNT1  występuje  najobficiej  i  wykazuje  największe  powinowactwo  do
połowicznie metylowanego DNA (metylaza zachowawcza). Z kolei DNMT3A i
DNMT3B  są  głównymi  metylazami  de  novo.  Białka  wiążące  się  z
sekwencjami metylo-CpG (MECPs) współdziałają z etylowanym DNA. MECP2
bezpośrednio  blokuje  czynnik  transkrypcyjny  IIB,  może  odłączyć  histon  H1  i
współdziałać  z  innymi  białkami,  wiążąc  się  z  metylo-CpG  i  deacetylazami
histonowymi,  by  skondensować  strukturę  chromatyny.  Skondensowana  i
nieaktywna  chromatyna  zawiera  także  metylowane  histony.  W  kondensacji
udział  bierze  rodzina  białek  MBD,  która  rozpoznaje  i  wiąże  rejony  DNA
metylowane.  U  bezkręgowców  metylacja  występuje  w  znacznie  węższym
zakresie,  niż  u  kręgowców.  Znakowanie  ich  chromatyny  prawdopodobnie
przebiega poprzez połączenie z nią białek lub RNA, oraz modyfikację histonów
w  nukleosomach.  W  utrzymywanie  różnicowania  tkanek  u  Drosophila
zaangażowany jest produkt genu Polycomb.

Wyspy CpG: są to skupienia dinukleotydów CpG występujące w pobliżu
wielu genów u ssaków. Spotyka się je przy końcach 5’(mRNA) w rejonie
promotora. Restrykcyjna nukleaza HPaII tnie fragment CCGG, jeśli środkowa

zasad C nie jest metylowana.  Tnie ona wyspy CpG na małe fragmenty DNA
w komórkach, gdzie dany gen jest aktywny. Badania wykazują, że, że DNA nie
jest  cięty  w  komórkach,  w  których  dany  gen  nie  ulega  ekspresji  (nieaktywny
DNA  jest  zmetylowany).  Pierwszy  ekson  ma  z  reguły  większe  zagęszczenie
wysp niż pozostałe. Wyspy CpG usuwane są w genomu wskutek dezaminacji
metylowanej  cytozyny,  która  prowadzi  do  powstania  Tyminy.  Enzymy
naprawcze  lokalizują  błędnie  sparowane  nukleotydy  (TpG)  i  powodują
zamianę G na A, prowadząc do usunięcia wyspy. W ten sposób ok. 80% wysp
CpG zostaje usuniętych z DNA. Pozostają tylko te, które utrzymały się wskutek
selekcji  mutacji  w  niezbędnych  kodonach  lub  w  regionach  kontrolnych
sąsiadujących  z  sekwencjami  kodującymi.  W  komórkach  szlaku  płciowego,
gdzie nie występuje metylacja, nie zachodzi też usuwanie wysp CpG.

Metylacja zachodzi w fazie S, w przypadku komórek szlaku płciowego ma to

miejsce dopiero w zygocie, po zapłodnieniu. Podczas nowotworzenia
obserwujemy hipo- lub hipermetylację.

Hipometylacja skojarzona jest z elementami regionów paromotorowych

onkogenów, powoduje ona nadekspresję genów. Może być przyczyną raka jelita
grubego.

Hiperfosforylacja ma charakter punktowy. Np. hiperfosforylowany gen p16

powoduje guzy piersi, mózgu i pęcherza moczowego.

Choroby związane z zaburzeniami metylacji:

•

Zespół Retta: zaburzenia zaliczane do autystycznych.

•

Zespół ICF: niedobór odporności, anormalna budowa twarzy.

•

Zespół Rubinsteina Taybiego: boczne ustawienie paliczków, wady
serca.

Metylacja DNA może być modyfikowana przez:

•

Witaminę B12

•

Kwas Foliowy

•

Cholinę

•

Metioninę

Modyfikacje histonów

•

Powodują remodelowanie chromatyny

•

Kowalencyjne zmiany histonów i proces metylacji są współzależne.

Typy modyfikacji:

•

Acetylacja Lys

•

Fosforylacja Ser

•

Metylacja Lys i Arg

•

Przyłączenie ubikwityny

Modyfikacje histonów mogą powodować choroby takie jak ostra białaczka
(promielocytowa i limfoblastyczna)

3.

Imprinting (rodzicielskie piętnowanie genów) jest to forma aktywacji bądź
inaktywacji  genu  w  zależności  od  tego,  na  którym  chromosomie
rodzicielskim się znajduje. Ekspresji ulega zawsze tylko jeden allel; matczyny
lub ojcowski. Drugi z nich zwykle jest zmetylowany. Zjawisko to określa się
mianem  ekspresji  monoallelicznej.  We  wczesnych  stadiach  rozwoju  allele
jednego  z  rodziców  są  wybiórczo  inaktywowane,  lecz  przebieg  procesu
selekcji  nie  został  dotychczas  wyjaśniony.  U  ludzi  występują  dwa  duże
regiony  podlegające  imprintingowi.  Jeden  z  nich  znajduje  się  na
chromosomie  11p15.5,  drugi  na  15q12.  w  przypadku  15q12  brak
ojcowskiego chromosomu powoduję chorobę Pradera- Willego, z kolei brak
matczynego zespół Angelmana. Te same mutacje wywołują różne symptomy
w zależności, czy zachodzą na chromosomie matczynym czy ojcowskim.

Inaktywacja chromosomu X: w komórkach ssaków zawsze aktywny jest
tylko jeden chromosom X, drugi X (w przypadku polisomików i poliploidów
także  każdy  kolejny)  u  samic  pozostaje  inaktywowany.  Wykorzystywany  do
tego  jest  mechanizm  polegający  na  przyłączeniu  dojrzałego  RNA
transkrybowanego z chromosomu, który ma być inaktywowany (chromosom
cis).  U  ssaków  kontrolę  nad  procesem  pełni  centrum  inaktywacji  X  (Xic)
złożone z kilku elementów:

•

Xist: koduje łańcuch, z którego transkrybowany jest niekodujący
RNA okrywający nieaktywny X podczas heterochromatynizacji.

•

TsiX: jest odwrotnością Xist, przez co jest do niego
komplementarny. Ma początek w okolicy genu DXPas34. Delecja
tegoż genu powoduje trwałą inaktywację chromosomu X, więc
przypuszczalnie oba fragmenty neutralizują działanie Xist.7

•

Xce: odgrywa rolę w wyborze, który X ma być inaktywowany.
Pewne jego allele zwiększają szanse na to, że „ich” X pozostanie
aktywny.

Molekularnej podstawy starzenia się

Definicje i teorie starzenia się
Pomimo obiecującego nagłówka muszę was rozczarować… nie ma definicji
starzenia się, aczkolwiek wyróżniamy kilka przemian zachodzących w
organizmie, których opis może od biedy służyć za takową. Są to:

•

Postępujący z wiekiem spadek żywotności organizmu.

•

Zachodzące z upływem czasu nieodwracalne zmiany w organizmie.

•

Suma ubytków biologicznych gromadzących się po okresie dojrzewania

•

Wzrastająca wrażliwość na czynniki szkodliwe powodujące coraz
większe wahania homeostazy

•

Zespół procesów zanikowych w narządach ciała, które pojawiają się z
końcem procesów wzrostowych.

Teorie dot. podstaw starzenia się

Teorie  zużycia.  Im  szybsza  przemiana  materii,  tym  krótsze  życie.  Np.
ryjówka, której serce  uderza  750  razy  na  minutę  żyje  1,5  roku, podczas  gdy
słoń, który  ma 30  razy  niższy  metabolizm,  żyje  80  lat.  Organizmy  o bardzo
wolnym  metabolizmie,  jak  żółwie,  czy  krokodyle  żyją  bardzo  długo.  W
świetle  ostatnich  badań  teoria  ta  łączona  jest  ponadto  z  teorią
wolnorodnikową (Harmana) i teorią mutacji.

Teorie  zatrucia.  W  komórkach  nieulegających  podziałom  z  wiekiem
gromadzi  się  substancja  zwana  lipofuscyną.  Tempo  jej  akumulacji  jest
bardzo różne u różnych organizmów. Nie jest ona czynnikiem powodującym
starzenie,  ale  raczej  wskaźnikiem  szybkości  przebiegu  tego  procesu.
Lipofuscyna  jest  mocno  usieciowanym  lipoproteidem,  gromadzącym  się  w
lizosomach,  a  jej  odkładanie  świadczy  o  dużej  ilości  wolnych  rodników
tlenowych,  za  czym  przemawia  fakt,  że  podawanie  przeciwutleniaczy
powoduje  spowolnienie  jej  akumulacji,  a  jak  się  ma  szczęście  to  nawet  jej
zaniku.

Inną  teorią  zatrucia  jest  teoria  Miecznikowa,  mówiąca  o  zatruwaniu
organizmu  przez  jady  bakteryjne  powstające  w  jelicie  grubym  oraz  teoria
odkładania  się  soli  wapnia  lub  cholesterolu.  Jeszcze  głupsza  jest  teoria
odkładania się w organizmie z wiekiem ciężkiej wody.

Teoria

sieciowania.

miarę

upływu

czasu

wszystkich

makromolekułach o długim okresie półtrwania dochodzi do wytworzenia się
wiązań  poprzecznych,  co  nazywamy  sieciowaniem.  Jak  zwykle
wszystkiemu  winne  są  wolne  rodniki  powstające  w  mitochondriach.
Sieciowaniu  ulega  między  innymi  kolagen,  białka  soczewki  oka  (zaćma!),  a
także  kwasy  nukleinowe.  Proces  ten  powoduje  utratę  bądź  zaburzenie  ich
funkcjonalności.

Teoria  Hayflicka.  Inaczej  zwana  teorią  ograniczonej  liczby  podziałów.
Opiera  się  na  fakcie,  iż  większość  komórek  takich  jak:  fibroblasty,
chondrocyty,  astrocyty  czy  keratynocyty  ma  ograniczoną  liczbę  podziałów.
Jedynie  komórki  linii  zarodkowej,  hemopoetyczne  szpiku  i  nowotworowe
wydają się być nieśmiertelne. Fibroblasty różnych organizmów są zdolne do
różnej liczby podziałów. Fibroblasty ludzi cierpiących na progerię cechują się
mniejszą  liczbą  możliwych  podziałów.  Najnowsze  badania  dowodzą,  że
wpływ  na  to  ma  obecność  telomerów  na  końcach  chromosomów,  które
ulegają skróceniu po każdym podziale.

Teoria  Orgela.  Zwana  teorią  katastrofy  błędów.  Opiera  się  na  dwóch
postulatach.  (1)  przenoszenie  informacji  na  drodze  DNA-RNA-białko  nie
zachodzi  ze  100%  dokładnością.  (2)  w  przenoszenie  informacji  genetycznej
zaangażowane  są  enzymy  i  regulatory.  Nawet  niewielkie  błędy  w  ich
strukturze  powodują  wadliwe  funkcjonowanie.  Powoduje  to  wystąpienie
kolejnych błędów, z którymi mechanizmy naprawy w pewnym momencie nie
mogą sobie poradzić. Prowadzi to do zaburzenia funkcjonalności komórki, a
po  przekroczeniu  punktu  krytycznego-  śmierci.  Szczególnie  groźne  są
mutacje  w  genach  kodujących  enzymy  naprawcze  DNA.  Nienaprawiane
mutacje są przyczyną nie tylko przyspieszonego procesu starzenia, ale także
wielu chorób dziedzicznych czy nowotworów. Liczne doświadczenia dowodzą
prawdziwości tej teorii. Czynniki mutagenne jak promieniowanie jonizujące,
czy różne związki chemiczne przyspieszają starzenie, powodując uszkodzenia
DNA  (patrz  mechanizmy  naprawy  i  wpływ  leków  cytostatycznych).
Dowiedziono też, że Polimeraza DNA starych komórek robi znacznie więcej
błędów, niż nówka.

Teoria  skracania  telomerów.  Telomery,  jak  już  wspominałem,  są  to
końcowe  odcinki  chromosomów,  chroniące  je  przed  zniszczeniem.  Nie  są
one  replikowane  z  resztą  genomu,  ale  dobudowywane  enzymatycznie  po
każdym podziale. U ludzi z progerią są one znacznie krótsze niż u zdrowych.
W  nowotworach  nie  ulegają  one  skróceniu,  gdyż  występuje  w  nich  enzym
zwany telomerazą, który zawsze odbudowuje je do pełnej długości.

Teoria  mutacji  somatycznych.  W  starzejących  się  komórkach  wzrasta
liczba  aberracji  chromosomowych.  Zmienia  się  także  stopień  acetylacji,
metylacji  i  fosforylacji  białek  chromatyny.  Szczególnie  intensywnie  proces
uszkadzania  DNA  zachodzi  w  mitochondriach,  gdzie  występuje  zawsze
w pizdu  wolnych  rodników.  Mechanizmy  naprawy  w  starych  komórkach
funkcjonują gorzej niż w młodych, co prowadzi do coraz częstszych mutacji.

Teoria mutacji mtDNA. mtDNA zbudowany jest z ok. 17 kb i zawiera ok.
37 genów. Od jądrowego różnią go następujące cechy; (1)nie jest połączony z
histonami. (2)nie ma enzymów naprawy. (3)dziedziczony głównie po matce.
(4)bardzo  narażony  ma  powstające  In  situ  wolne  rodniki.  (5)jest
przepisywany  i  transkrybowany  w  całości.  (6)geny  ułożone  są  w  nim  w
sposób  ciągły.  (7)często  zachodzą  w  nim  duże  delecje.  Mitochondria

uszkodzone  przez  wolne  rodniki  i  inne  złe  rzeczy  tracą  swą  wydolność
energetyczną,  przez  co  komórce  zaczyna  brakować  energii.  Uszkodzone
mitochondria  tworzą  usieciowane  kompleksy,  odkładane  w  lizosomach.
Dowodem  potwierdzającym  wpływ  stanu  mitochondriów  na  długość  życia
jest  ścisła  korelacja  długości  życia  potomstwa  z  długością  życia  matki,  od
której pochodzą prawie wszystkie mitochondria.

Teoria Harmana. Zwana teorią wolnorodnikową. Co to jest wolny rodnik
wie  każdy,  jak  powstaje  chyba  też.  mogą  one  nieodwracalnie  uszkadzać
komórki,  reagując  z  białkami  i  kwasami  nukleinowymi,  a  także  utleniając
fosfolipidy  błony  komórkowej.  Organizm  jest  przed  nimi  chroniony  przez
dysmutazę  ponadtlenkową,  katalazę  i  peroksydazę  glutationową.  Oprócz
enzymów  ważną  rolę  grają  tu  antyoksydanty,  takie  jak:  witamina  C,
witamina E, beta-karoteny i kwas moczowy. Doświadczanie stwierdzono, że
dodawanie  do  pożywienia  przeciwutleniaczy  może  mieć  istotny  wpływ  na
długość życia. Teoria ta jest w zasadzie jednoznaczna z wyżej wymienionymi.

10.

Teoria immunologiczna. Zakłada, że przyczyną starzenia się jest

postępujące  z  wiekiem  osłabienie  systemu  immunologicznego.  Układ
immunologiczny  jest  regulowany  przez  geny  układu  MHC,  układ  dokrewny
oraz  nerwowy.  W  starzejącym  się  organizmie  powstają  białka  o  zmienionej
strukturze,  które  są  traktowane  przez  układ  odpornościowy  jak  obce
antygeny.  Mutacje  genów  w  limfocytach  B  i  T  upośledzają  ich  funkcje,  co  z
biegiem  lat  powoduje,  że  organizm  jest  bardziej  podatny  na  zakażenia  oraz
występowanie  komórek  nowotworowych,  które  w  normalnych  warunkach
powinny były zostać usunięte.

Starzenie  się  przebiega  u  różnych  osobników  jednego  gatunku  z  różną
szybkością, co oznacza, że wiek biologiczny może się różnić od metrykalnego.
Przykładem ilustrującym to zjawisko są osoby cierpiące na progerię, które w
wieku  10  lat  mają  fenotyp  osoby  starej  i  umierają  na  zawał  serca,  podczas
gdy  niektórzy  ludzie  w  wieku  90  lat  zachowują  nadal  wysoką  sprawność.
Sposobem  na  przedłużenie  życia  jest  ograniczona  dieta,  gdyż  niska
kaloryczność  wpływa  na  mniejsze  zużycie  tlenu,  co  niesie  ze  sobą
wytwarzanie mniejszej ilości wolnych rodników w mitochondriach.

Kontrola genetyczna determinacji płci

Chromosomy X i Y

Chromosomy płci (X i Y) powstałe na drodze ewolucji z pary autosomalnej.

Chromosom  X  pod  względem  wielkości  i  położenia  centromeru  podobny  jest  do
chromosomów z grupy C. na chromosomie tym zlokalizowanych jest wiele (1094)
genów, w większości nie mających związku z determinacją płci. Na końcu ramion
krótkich chromosomów płciowych X i Y znajdują się fragmenty homologiczne.
Są  to  regiony  pseudoautosomalne  (PAR),  dzięki  którym  podczas  mejozy  w
spermatogenezie  może  dochodzić  do  koniugacji  tych  chromosomów  i  crossing-
over.  W  sąsiedztwie  regionu  pseudoautosomalnego  w  chromosomie  X
zlokalizowane są 2 geny. Ramiona długie chromosomu X zawierają również ważne
geny dla determinacji i różnicowania płci. Są to geny kodujące białkowe receptory
cytoplazmatyczne  i  jądrowe,  odpowiedzialne  za  reakcję  komórek  na  działanie
testosteronu  i  dihydrotestosteronu.  Chromosom  Y  jest  małym  chromosomem
akrocentrycznym podobnym do chromosomów grupy G; stanowi on ok. 1% DNA.
W  ludzkim  kariotypie  cechuje  się  on  szczególnym  polimorfizmem.  Badania
wykazują,  że  jego  rozmiary  różnić  się  mogą  w  szerokim  zakresie,  mogąc  osiągać
rozmiary  chromosomów  grupy  G(mniejsze),  jak  i  grupy  E  (większe).  Szczególną
jego  cechą  jest  brak  nitek  satelitonośnych  w  odróżnieniu  od  akrocentryków
autosomalnych. Największą część chromosomu Y stanowią powtarzalne sekwencje
satelitarne. Satelitarne DNA Bq składa się z dwóch powtarzalnych klonów DYZ1 i
DYZ2,  które  stanowią  50-57%  całkowitego  DNA  chromosomu  Y.  region
euchromatynowy  obejmuje  całe  ramię  krótkie,  okolicę  przycentromerową  i
proksymalną  część  ramienia  długiego.  W  ramieniu  krótkim  zlokalizowany  jest
region  PAR,  obejmujący  koniec  ramion  krótkich  chromosomu  Y.  bardzo  blisko
regionu PAR znajduje się gen SRY, determinujący powstanie jąder. Jest to jedyny
gen  swoisty  wyłącznie  dla  chromosomu  Y.  następnie  leżą  geny  homologiczne  dla
obydwu chromosomów płciowych. W regionie przycentromerowym zlokalizowano
grupę  genów  odpowiedzialnych  za  spermatogenezę  (AZF).  W  porównaniu  z
chromosomem  X;  liczba  genów  na  Y  jest  niewielka  (dotychczas  zlokalizowano  57
cech zlokalizowanych na Y).

Chromatyna płciowa

Termin „chromatyna płciowa” odnosi się do odpowiednio wybarwionych struktur

chromatyny

widocznych

jądrze

interfazowym,

odpowiadających

skondensowanym chromosomom X i Y, które wykryć można w komórkach niemal
wszystkich tkanek.

Chromatyna X (ciałko Barra). Odkryte w 1949. W jądrach interfazowych

komórek  żeńskich  wybarwia  się  ciemniejsza  grudka  zasadochłonnej  chromatyny,
dyskowato  przylegająca do błony jądrowej. U człowieka najczęściej bada się je w
rozmazach  nabłonka  jamy  ustnej  i  komórkach  płynu  owodniowego.  W
granulocytach  obojętnochłonnych  uwidacznia  się  ono  w  postaci  wyrzuconej  poza
obręb  jądra,  ale  pozostającej  z  nim  w  kontakcie  grudki  zwanej  pałeczką
dobosza.  Ciałko  Barra  to  ta  część  chromatyny  jądrowej,  która  w  pierwszych
dniach  rozwoju  zygoty  uległa  inaktywacji  (kondensacji)  określanej  obecnie  jako

lionizacja.  Z  tej  lionizowanej  chromatyny  w  czasie  podziału  komórki  powstanie
jeden  z  dwóch  obecnych  chromosomów  X.  inaktywacja  tego  chromosomu  jest
mechanizmem  wyrównującym  ilość  informacji  genetycznej  zawartej  w  dwóch
chromosomach  X  u  kobiety  w  stosunku  do  jednego  u  mężczyzny.  Inaktywacja
obejmuje  większość,  ale  nie  wszystkie  geny.  Inaktywacji  nie  podlegają  geny
zlokalizowane na końcach ramion krótkich, leżących w rejonie PAR oraz niektóre
geny  zajmujące  bardziej  proksymalną  część  ramienia  krótkiego  i  proksymalną
część  ramienia  długiego.  W  prawidłowej  komórce  żeńskiej  o  kariotypie  46  XX
obecne jest jedno ciałko Barra. Liczba ciałek zawsze jest o jeden mniejsza od liczby
chromosomów  X.  w  rozmazie  komórek  nabłonka  jamy  ustnej  obecność  ciałek
Barra waha się między 20-60%. W tkankach niedzielących się notuje się względnie
stały odsetek ciałek Barra (w neurocytach 90%). W przypadku delecji chromosomu
X niekiedy obserwuje się mała grudkę chromatyny, natomiast w przypadku dużego
chromosomu  X  (izochromosom  ramion  długich)  obserwuje  się  grudkę  dużą.  W
zespołach

chorobowych

przebiegających

aberracjami

strukturalnymi

chromosomów X unieczynnia się z reguły chromosom nieprawidłowy. Badanie
chromatyny X jest najprostszą pośrednią metodą wykrywania aberracji liczbowych
chromosomu X. badanie chromatyny X ma zastosowanie także w medycynie
sądowej.

Teoria Lyon

W komórkach zarodka żeńskiego około 16 dnia życia zarodkowego dochodzi do

inaktywacji  jednego  z  chromosomów  X.  czas  trwania  tego  procesu  jest  różny  w
zależności  od  rodzaju  tkanki  embrionalnej.  Ponieważ  komórki  potomne  żeńskie
mają  jeden  chromosom  X  ojcowski  i  jeden  X  matczyny,  w  poszczególnych
tkankach  inaktywowana  zostaje  losowo  jeden  z  nich.  Tak  więc  organizm  kobiety
pod  względem  chromosomów  X  jest  mozaiką  złożoną  z  komórek  zawierających
nieaktywny  X  ojcowski  lub  matczyny.  Losowa  inaktywacja  zachodzi  w  różnych
proporcjach.  W  pewnych  przypadkach  może  dochodzić  do  preferencyjnej
inaktywacji  matczynego  lub  ojcowskiego  X.  przyczyny  takiej  sytuacji  mogą  być
różne,  np.  mutacje  genu  XIST  lub  innych  zlokalizowanych  na  X.  molekularne
podłoże  inaktywacji  X  nie  jest  dokładnie  poznane.  Wiadomo,  że  jednym  z  ogniw
procesu  jest  modyfikacja  metylacji.  Proces  inaktywacji  inicjowany  jest  w  miejscu
XIC,  w  którego  obrębie  leży  gen  XIST.  XIST  produkuje  RNA,  które
rozprzestrzeniając  się  wokół  chromosomu  powoduje  jego  inaktywację.  Spośród
zlokalizowanych  na  X  genów  niektóre  pozostają  aktywne.  Są  to  geny  mające
odpowiedniki na chromosomie Y. nieaktywny X jest bardzo odporny na działanie
mutagenów.  Uszkodzić  może  go  jedynie  niewiele  czynników,  np.  5-azacytydyna
powodujaca  demetylację  DNA.  Unieczynniony  X  charakteryzuje  się  opóźnioną
replikacją, zachodzącą w późnej fazie S.

Ciałko Y

W interfazowym jądrze komórek męskich wybarwionych barwnikami

fluorescencyjnymi  uwidacznia  się  chromatyna  Y,  którą  stanowi  dystalne
skondensowana  część  długich  ramion  Y  uwidocznionej  w  postaci  fluoryzującej
grudki.  W  przypadku  małego  chromosomu  Y  lub  delecji    jego  regionu
heterochromatynowego  ciałko  Y  jest  niedostrzegalne.  Obecnie  metoda  ta  nie  ma

znaczenia diagnostycznego, tak więc spodziewajcie się, że będzie bardzo dokładnie
omawiana i powtarzana na kolosie.

Rola chromosomów płciowych w determinacji gonad

Proces różnicowania jąder z gonady pierwotnej zachodzi jedynie w obecności

chromosomu  Y.  zakłada  się  że  zlokalizowany  na  nim  jest  hipotetyczny  czynnik
TDF  ukierunkowujący  proces.  Po  długich  poszukiwaniach  odkryto,  że  rolę  TDF
pełni  gen  SRY  zlokalizowany  w  obrębie  ramion  krótkich  Y.  SRY  koduje  białkowy
czynnik transkrypcyjny zawierający motyw wiążący z DNA (HMG-box). Kompleks
taki  może  swoiście  aktywować  lub  hamować  funkcje  innych  genów,  pośrednio
prowadząc do różnicowania jąder. SRY należy do dużej grupy białek zwanej SOX.
Wzmożona ekspresja SRY jest prawdopodobnie sygnałem do różnicowania się w 7
tygodniu  rozwoju  komórek  Sertoliego  z  komórek  nabłonkowych  grzebienia
płciowego.  W  tym  samym  czasie  zwiększa  się  ekspresja  genu  SOX9,  biorącego
udział  w  aktywacji  genu  SRY.  Z  kolei  SOX9  jest  aktywowany  przez  gen    SF1,
natomiast  zlokalizowany  na  chromosomie  X  gen  SOX  3  jest  jego  inhibitorem.  W
warunkach  prawidłowych  ekspresji  SOX  3  zapobiega  gen  SRY.  Zaburzenia
ekspresji SOX9  powodują  zaburzenia różnicowania  jądra.  W  interakcjach  między
tymi  genmi  dużą  rolę  odgrywa  zlokalizowany  na  X  gen  DAX1.  jego  ekspresję

stwierdza  się  w  komórkach  grzebienia  moczopłciowego,  podwzgórza  i  przysadki.
Jego  ekspresja  następuje  równolegle  z  SRY.  Zakłada  się  że  SRY  blokuje  DAX1,  a
ten  wówczas  nie  może  hamować  ekspresji  SF1,  co  umożliwia  ekspresję  SOX9.
duplikacja  DAX1  powoduje  zahamowanie  rozwoju  jąder  u  płodów  XY,  gdyż
prowadzi  do  nadekspresji.  Podobne  komplikacje  mają  miejsce  w  przypadku
zlokalizowanego  na  1.  chromosomie  geny  WNT4,  normalnie  blokowanego  przez
SRY. Gen ten u płodów XX powoduje rozwój żeńskich narządów płciowych.

Na temat genetycznego podłoża różnicowania jajników wiemy bardzo niewiele.

Dogmatem  jest  stwierdzenie,  że  ich  powstanie  zachodzi  w  przypadku  braku
czynników  stymulujących  powstanie  jądra  (nasuwa  się  więc  od  razu,  że  w
zabranym Adamowi żebrze doszło do inaktywacji SRY). Struktury gonady żeńskiej
pojawiają  się  ok.  12  tygodnia,  czyli  później  niż  męskie.  Prawidłowemu  rozwojowi

Schemat współzależności poszczególnych genów w warunkowaniu
płci

Podstawy cytogenetyki człowieka

Wstęp

Cytogenetyka człowieka jest nauką młodszą od cytogenetyki innych organizmów,

gdyż o jej istnieniu mówić można dopiero od roku 1956, kiedy to po długich i
ciężkich badaniach komuś mądremu udało się wreszcie stwierdzić, że człowiek ma
nie 48, a 46(!) chromosomów, co jak wiemy wymagało zastosowania obliczeń o
wprost niewiarygodnym stopniu złożoności.

Z początku badania cytogenetyczne przeprowadzane były stosunkowo rzadko,

gdyż  głównym  źródłem  komórek    były  punkcyjne  nakłucia  szpiku  czy  jąder,  a
takowe  nakłucia  niosą  ze  sobą  dość  duże  ryzyko  dla  pacjenta,  a  poza  tym  mało
który mężczyzna da sobie nakłuć… kość udową celem pobrania szpiku. Przełomem
na tym polu było opracowanie prowadzenia hodowli limfocytów krwi obwodowej,
co  jest  możliwe  przy  dodaniu  do  hodowli  tzw.  Fitohemaglutyniny,  która  to
powoduje  odróżnicowanie  limfocytów  do  form  młodocianych,  które  zaczynają  się
intensywnie  dzielić.  Hodowlę  taką  przeprowadza  się  na  odpowiedniej  pożywce  z
zastosowaniem krwi heparynowanej, następnie dodaje się kolchicyny i odwirowuje
frakcję  limfocytów  z  hodowli.  Następnie  komórki  poddaje  się  obróbce,
prowadzącej  do  rozluźnienia  odróżnicowanych  limfocytów,  co  poprawia
widoczność  chromosomów.  Następnie  barwi  się  preparaty  met.  Giemsy  lub
innymi.  Analizy  dokonujemy  na  największym  powiększeniu  mikroskopu,
wykonując  mikrofotografie,  z  których  następnie  wycina  się  kawałki  zdjęcia  z
poszczególnymi  chromosomami  i  odpowiednio  układa.  Celem  poprawienia
dokładności stosuję się metody radiograficzne, znakując nukleotydy pierwiastkami
promieniotwórczymi.

Morfologia chromosomów metafazowych

Chromosom metafazowy jest najbardziej skondensowaną formą chromatyny

jądrowej.  Heterochromatyna  i  euchromatyna,  wchodzące  w  skład  chromosomu
różnią  się  między  sobą  rodzajem  DNA  (w  heterochromatynie  występują  krótkie
sekwencje tandemowe). Euchromatyna jest replikowana we wczesnej i średniej S.
Dekondensacja heterochromatyny zachodzi wyłącznie w późnej fazie S. w wyniku
kondensacji  długość  chromosomu  wynosi  zaledwie  10

-4

części długości

rozwiniętego  DNA.  Chromosom  składa  się  z  dwóch  chromatyd  połączonych  w
miejscu  przewężenia  pierwotnego,  zwanego  centromerem,  który  jest  także
miejscem  przyczepu  włókien  wrzeciona  podziałowego.  W  centromerze  występują
różne  sekwencje  powtarzalne,  w  większości  satelitarny  DNA,  ale  także  sekwencje
SINES i LINES. W chromosomach człowieka wyróżnia się 4 główne rodziny takich
sekwencji  (p.  nowy  Drewa  str.  433).  Wymienione  sekwencje  łączą  się  ze
swoistymi  białkami,  tworząc  wielowarstwową  strukturę  zwaną  kinetochorem.
Współdziała  on  z  mikrotubulami  wrzeciona  podziałowego,  ułatwiając  podział
chromatyd  siostrzanych  lub  chromosomów  w  anafazie  mitozy  czy  też  mejozy.  W
większości komórek kinetochor ma postać trójblaszkowej płytki złożonej z:

•

Zewnętrznej (gęstej)

•

Środkowej (mało wyraźnej)

•

Wewnętrznej

Centromer dzieli chromosom na ramiona długie (q) i krótkie (p). na podstawie

położenia centromeru chromosomy dzielimy na trzy grupy:

•

Chromosomy metacentryczne; centromer w środku chromosomu (p=q)

•

Chromosomy submetacentrzyczne; (p<q)

•

Chromosomy akrocentryczne; (p<<q)

•

Chromosomy telocentryczne; centromer na samym końcu chromosomu,
brak ramion długich (u człowieka takich nie ma)

Na  końcach  chromosomów  znajdują  się  sekwencje  telomerowe.  Telomerowy
DNA  nie  jest  upakowany  w  postaci  nukleosomów;  zamiast  histonów  występują
białka  telomerowe.  Połączenie  DNA  telomerowego  z  tymi  białkami  nazywamy
telosomem.  telomery  mają  zwykle  strukturę  typu  „spinka  do  włosów”  o  dużej
zawartości guaniny. Każdy chromosom ma 2 telomery, tak więc w komórce jest ich
92. telomer chroni koniec chromosomu przed uszkodzeniem, umożliwia replikację
całego  chromosomu,  nadzoruje  ekspresję  genów  oraz  wspomaga  organizację
chromosomów  podczas  podziału.  Ponadto  jest  swego  rodzaju  zegarem
biologicznym,  skracając  się  z  każdym  podziałem  nieuchronnie  prowadzi  do
zaprzestania w pewnym momencie podziałów komórki, co ma ogromny wpływ na
procesy  starzenia.  Ma  to  oczywiście  pozytywne  strony,  w  pewnym  stopniu
chroniąc  komórki  przed  transformacją  nowotworową.  W  pewnych  rodzajach
komórek występuje enzym telomeraza, zapobiegający temu skracaniu, co czyni je
niemal nieśmiertelnymi (np. komórki szpikowe). Enzym telomeraza posiada krótki
odcinek RNA, służący do odtwarzania brakującego kawałka telomeru.

Na końcach ramion p chromosomów akrocentrycznych mogą występować

satelity,  które  są  fragmentami  chromatyny  oddzielonymi  od  ramion  krótkich
chromosomu  przez  tzw.  przewężenie  wtórne  (nitka  satelitonośna).  U  człowieka
przewężęnie wtórne jest odcinkiem jąderkotwórczym chromosomów 13, 14, 15, 21,
22  (akrocentrycznych),  zwany  jest  on  inaczej  organizatorem  jąderkowym.
Jest to odcinek zawierający tandemowo ułożone geny rDNA dla kodowania rRNA.
W  telofazie  odcinki  te  biorą  udział  w  formowaniu  się  jąderka.  U  człowieka
występuje 10 organizatorów.

Kryteria klasyfikacji chromosomów

Chromosomy człowieka sklasyfikowano zgodnie z zasadami opracowanymi

na konferencjach w Denver, Londynie, Paryżu, Sztokholmie i Zabrzu (20??, ale
kiedyś na pewno do tego dojdzie). Celem tych konferencji było ujednolicenie
zasady klasyfikacji chromosomów. Dziś podstawą jest system nazewnictwa ISCN z
2005 i 2009r. za kryteria przyjęto:

•

Wielkość chromosomów

•

Położenie centromeru

•

Rozmieszczenie prążków w chromosomach

Na podstawie tych kryteriów wyodrębniono poszczególne pary chromosomów

somatycznych; oznaczone numerami 1 do 22 oraz chromosomów płci

wydzielonych  jako  odrębną  parę.  Autosomy  podzielono  na  7  grup-  od  A  do  G.
chromosom X zalicza się do grupy C, a chromosom Y do grupy G. Oceny kariotypu
dokonuje  się  pod  mikroskopem  świetlnym.  Dla  dokładniejszej  analizy  materiału
wykonuje  się  tzw.  kariogram.  Jest  to  zestaw  chromosomów  przedstawionych
graficznie  według  ścisłych  zasad,  który  sporządza  się,  wykonując  mikrofotografię
płytek metafazowych wybarwionych prążkowo. Z odbitek wycina się chromosomy i
układa  w  poszczególne  pary  homologiczne  według  wielkości,  położenia
centromeru  i  wzorów  prążkowych.  Kariogram  człowieka  przedstawia  się  w
następujący sposób:

•

Do grupy A zaliczono pary 1-3; 1 i 3 to duże chromosomy
metacentryczne; 2 jest submetacentryczny.

•

Do grupy B parę 4 i 5; duże chromosomy submetacentryczne.

•

Do grupy C pary 6-12 oraz X; wszystkie submetacentryczne średniej
wielkości

•

Do grupy D pary 13-15; mogą zawierać nitki satelitonośne i satelity

•

Do grupy E pary 16-18 16 to małe i prawie metacentryczne, natomiast 17
i 18 to małe submetacentryki.

•

Grupa F obejmuje pary 19 i 20; najmniejsze chromosomy
metacentryczne.

•

Grupa G obejmuje pary 21 i 22 oraz zbliżony do nich rozmiarami
chromosom Y. pary 21 i 22 to małe chromosomy, mogące zawierać nitki
satelitonośne i satelity. Chromosom Y satelit nie posiada nigdy.

Zestaw

chromosomów

występujących

komórce

somatycznej,

charakterystycznej liczbie i morfologii zwiemy kariotypem.

Wskazania do analizy kariotypu

Badanie cytogenetyczne przeprowadza się tylko wtedy, gdy istnieje podejrzenie,

że obraz kliniczny choroby może być spowodowany obecnością aberracji
chromosomowej.

Wskazania do postnatalnego oznaczania kariotypu

występowanie cech genotypowych charakterystycznych dla określonego
zespołu chromosomowego

występowanie wad rozwojowych i/lub cech dysmorfii z wystąpieniem
opóźnienia psychoruchowego

niepowodzenie rozrodu0 2 lub więcej poronienia samoistne w I trymestrze
lub urodzenie dzieci z wadami o nieznanej etiologii

brak cech dojrzewania płciowego

pierwotny lub wtórny brak miesiączki

znaczny niedobór wzrostu o nieznanej etiologii u kobiet

nieprawidłowa budowa zewn. Narządów płciowych, obojnactwo

występowanie aberracji strukturalnych w rodzinie

Metody badania chromosomów

Najczęstszą metodą uzyskiwania chromosomów do badań cytogenetycznych jest

hodowla  limfocytów  krwi  obwodowej  zgodnie  z  metodą  podaną  we  wstępie.
Obecnie  w  badaniach  cytogenetycznych  stosuje  się  metody  wybarwiania
pozwalające  stwierdzić  na  chromosomach  prążki  G,  Q,  R  oraz  C.  praktyce
najczęściej  bada  się  chromosomy  metafazowe  wybarwione  na  prążki  G,  których
liczba  związana  jest  ze  stopniem  kondensacji  chromatyny.  W  haploidalnej  liczbie
chromosomów o średnim stopniu kondensacji wyróżnić można 300-400 prążków,
w  chromosomach  prometafazowych  550-580,  a  w  profazowych  nawet  do  850.
metoda  uzyskiwania  chromosomów  o  zwiększonej  rozdzielczości  obrazu
prążkowego  (prometafazowe  i  profazowe)  nazywana  jest  HRT.  Zmniejszenie
stopnia  kondensacji  osiąga  się  przy  pomocy  odpowiednich  środkó9.,  jak  na
przykład  BrdU.  W  badaniach  rutynowych  stosowany  poziom  rozdzielczości  nie
przekracza  550-580  prążków.  Wartości  liczbowe  prążków  przyporządkowane
ramionom krótkim i długim maleją w kierunku od cz. dystalnych do centromerów.
Odcinek najbliższy centromeru określa się cyfrą 1, następnie 2,3…

Prążki G; wybarwia się je najczęściej traktując preparaty enzymami

proteolitycznymi  takimi  jak  trypsyna,  czy  pronaza,  a  następnie  barwi  metodoą
Giemsy.  W  wyniku  otrzymuje  się  chromosomy  barwione  na  prążki  ciemne,
poprzedzielane jasnymi. Ciemne prążki G odpowiadają obszarom bogatym w pary
AT  z  późno  replikującym  DNA.  Regiony  te  zawierają  skondensowaną
heterochromatynę  z  nielicznymi  aktywnymi  genami.  Od  prążków  jasnych  różnią
się  składem  białek.  Badania  wykazały  że  ta  chromatyna  jest  bogata  w  białka
zawierające  mostki  siarkowe,  co  cechuje  występujące  w  chromosomach  białka
niehistonowe.  Prążki  jasne  to  obszary  bogate  w  GC,  wcześnie  replikujące,
zawierające  euchromatynę.  Wzór  prążków  G  jest  unikatowy  dla  każdej  pary
chromosomów; odzwierciedlają one odmienną kondensację chromatyny.

Prążki Q; do ich wybarwienia używa się dwóch rodzajów fluorochromów:

•

zdolnych do jonowego wiązania się z DNA oraz interkalacji między
płaszczyzny zasad (e.g. oranż akrydynowy)

•

fluorochromy interkalujące do podwójnego łańcucha DNA, wykazujące
powinowactwo do pewnych zasad azotowych (e.g. atebryna [Q])

badania  wykazują,  że  silnie  fluoryzujące  odcinki  DNA  są  bogate  w  pary  AT,
natomiast  pary  GC  wygaszają  fluorescencję.  Niektóre  odcinki  chromosomów
człowieka  wykazują  bardzo  silną  fluorescencję.  ,  np.  okolice  centromeru  3.
chromosomu  (gr.  A),  satelity  akrocentryków  i  dystalne  odcinki  ramion  q
chromosomu Y.

Prążki C; wykrywa się dzięki nim regiony chromosomów zawierające

chromatynę  konstytutywną.  Barwią  się  barwnikiem  Giemsy  w  obszarze
chromatyny centromerowej i przycentromerowej po uprzedniej inkubacji  w r-rze
wodorotlenku Baru. Wybarwiają się rejony zbudowane z powtarzalnych sekwencji
satelitarnego  DNA;  silnie  związane  ze  swoistymi  białkami  niehistonowymi,  które

chronią DNA. Barwienie tą metodą u człowieka ukazuje na ciemno rejony
centromerów oraz okolice przycentromerowe. U człowieka wielkość chromatyny
przycentromerowej chromosomów pary 1, 9, 16 jest cechą polimorficzną.

Prążki R; są odwrotnością prążków G. ciemne prążki G reprezentują obszary

bogate w GC, natomiast jasne w AT. Barwienie to uzupełnia analizę kariotypu,
ukazują aberracje niedostrzegalne w wybarwieniu prążków G i Q.

Hybrydyzacja fluorescencyjna In situ (FISH); jest to metoda, pozwalająca

na  lokalizowanie  swoistych  sekwencji  DNA  bezpośrednio  w  materiale
biologicznym.  Stosuje  się  w  niej  sondy  molekularne  znakowane  radioaktywnie
(metoda  ISH),  które  obecnie  są  wypierane  przez  sondy  fluorescencyjne  (FISH).
Stosuje się sondy sprzężone z innymi cząsteczkami, wykazującymi powinowactwo
do  DNA  (np.  biotyna).  Metoda  ta  pozwala  wykryć  amplifikacje,  Delecje  lub
duplikacje oraz zmiany w liczbie i strukturze chromosomów, wykrywalne zarówno
w metafazie, jak i interfazie(!). do badań cytogenetycznych wykorzystuje się sondy
wiążące  regiony  centromerowi  (sondy  centromerowi)  poszczególnych  par
chromosomów  w  płytkach  metafazowych,  ale  także  w  interfazowych  jądrach
komórek.

Zastosowanie kliniczne FISH

•

diagnostyka zespołów mikrodelecyjnych

•

diagnostyka przyczyn niepełnosprawności intelektualnej

•

szybkie wykrywanie aneuploidii

•

diagnostyka nowotworów

podobna do FISH jest metoda hybrydyzacji porównawczej CGH. Specyficzną cechą
techniki  jest  to,  że  materiał  pobrany  od  pacjenta  jest  hybrydyzowany  do
prawidłowych  chromosomów  metafazowych  w  preparacie  cytogenetycznym.  Do
mieszaniny  hybrydyzacyjnej  dodaje  się  referencyjny  DNA  komórki  prawidłowej
oraz  DNA  badany  w  równych  ilościach.  Wyznakowuje  się  je  odpowiednimi
fluorochromami  (czerwonymi  i  zielonymi).  Następnie  wyznakowane  DNA
przyłącza się w procesie hybrydyzacji do chromosomów na preparacie kontrolnym.
Analiza wyników polega na pomiarze i porównaniu natężeń obydwu fluorescencji
(zieleń:czerwień)  wzdłuż  wszystkich  chromosomów  i  odniesienia  uzyskanych
profili  do  wzorców  (ideogramów  chromosomów).  Profil  fluorescencyjny  w
przedziale 0.75-1.25  uznaje się za prawidłowy.  Wartości poniżej  lub  powyżej  tego
zakresu  w  określonym  rejonie  chromosomu  wskazują  na  nieprawidłowe  liczby
kopii sekwencji DNA. Wadą metody jest stosunkowo mała rozdzielczość oraz brak
możliwości wykrywania mozaikowatości chromosomowej. Metodę tą stosuje się do
diagnostyki aberracji niezrównoważonych w komórkach nowotworowych oraz jako
uzupełnienie cytogenetyki klasycznej.

Zapisywanie wyników badań cytogenetycznych

do doczytania w podręczniku.

Podstawy mechanizmów zmienności i dziedziczenia

Podstawowe pojęcia genetyczne:

•

Gen: podstawowa jednostka dziedziczności

•

Allel: jedna z wersji genu w określonym miejscu (locus) na danym
chromosomie homologicznym.

•

Geny letalne: geny, których ekspresja powoduje śmierć organizmu

•

Genotyp: zespół genów danego osobnika warunkujących jego
właściwości dziedziczne.

•

Fenotyp: zespół cech organizmu, włączając w to nie tylko morfologię,
lecz również np. właściwości fizjologiczne.

•

Homozygota: organizm posiadający identyczne allele danego genu
(np. aa lub AA) w chromosomach.

•

Heterozygota: organizm posiadający różne allele tego samego genu

•

Cecha dominująca: allel ujawniający się w fenotypie organizmu
diploidalnego zarówno w przypadku genotypu homozygotycznego
(gdy obydwa chromosomy homologiczne zawierają dany allel) jak i w
przypadku heterozygoty.

•

Cecha recesywna: allel, którego działanie ujawnia się fenotypowo
jedynie w przypadku homozygoty recesywnej.

•

Dominacja zupełna i niezupełna: w dominacji zupełnej jeden allel
całkowicie maskuje drugi, z kolei w niezupełnej maskuje go jedynie
częściowo.

•

Krzyżówka  testowa-  za  jej  pomocą  sprawdza  się  genotyp  osobnika
badanego,  o  którym  nie  wiadomo  czy  jest  homo-  czy  heterozygotą.
Polega na skrzyżowaniu badanego osobnika z homozygotą aa. Jeśli w
pokoleniu  F1  pojawią  się  same  osobniki  o  cechach  dominujących
mieliśmy  do  czynienia  z  homozygotą  dominującą,  jeśli  z  kolei
otrzymamy

rozszczepienie

pod

względem

danej

cechy,

z heterozygotą.

•

Krzyżówka wsteczna- polega na kojarzeniu heterozygot pokolenia F1
z którymkolwiek z typów rodzicielskich zarówno z cechą dominującą
jak i recesywną.

I i II prawo Mendla, chromosomowa teoria dziedziczenia

•

I prawo Mendla (p. czystości gamet): podczas podziału mejotycznego
komórki następuje rozdział odpowiadającej sobie pary genów (alleli).
Do każdej gamety przechodzi tylko jeden allel danej pary. Mendel
sformułował to prawo w oparciu o swoje doświadczenia wyniesione z
hodowli i krzyżowania między sobą różnych odmian grochu.

•

II  prawo  Mendla:  Cecha  uwarunkowana  jedną  parą  genów
dziedziczona  jest  niezależnie  od  cechy  uwarunkowanej  drugą  parą
genów,  w  związku  z  czym  w  pokoleniu  F2  obserwuje  się
rozszczepienie  fenotypów  w  stosunku  9:3:3:1.  dwie  cechy
dziedziczone są niezależnie wówczas, gdy geny warunkujące te cechy
znajdują  się  na  różnych  parach  chromosomów  homologicznych
(geny  niesprzężone).  Jeśli  dwa  geny  leżą  na  jednym  chromosomie,
wówczas dziedziczone są one zależnie.

•

Chromosomowa  teoria  dziedziczenia:  Na  przykładzie  Drosophila
melanogaster T. Morgan wykazał związek pomiędzy przekazywaniem
cech  dziedzicznych  a  chromosomami.  Garnitur  chromosomowy
muszki  składa  się  z  2n=  8  chromosomów;  6  autosomów  i  2
chromosomów płci. Samica ma dwa chromosomy X, a samiec jeden X
i  jeden  Y.  Morgan  krzyżował  muszki  szczepu  dzikiego  o  czerwonych
oczach z muszkami zmutowanymi i oczach innego koloru. Krzyżował
homozygotyczną samicę czerwonooką z samcem o oczach białych. W
pokoleniu F1 wszystkie muszki miały oczy czerwone. W pokoleniu F2
wszystkie  samice  były  czerwonookie,  a  wśród  samców  połowa  miała
czerwone,  a  połowa  białe  oczy.  Stosunek  fenotypów  bez
uwzględniania płci wynosił w F2 3:1. wykonanie krzyżówki odwrotnej
jednoznacznie dowodzi, że gen warunkujący barwę oczu znajduje się
na  chromosomie  X.  Morgan  zauważył,  że  segregacja  genów  podczas
rozdziału  chromosomów  następuje  zgodnie  z  I  prawem  Mendla,  z
kolei  drugie  prawo  Mendla  spełnione  jest  dla  cech  znajdujących  się
na  różnych  chromosomach.  Morgan  wykazał  także,  że  geny
znajdujące  się  na  jednym  chromosomie  tylko  w  niektórych
warunkach  są  zupełnie  sprzężone.  Jest  to  związane  z  procesem
wymiany odcinków chromosomów (crossing-over). U muszki c-over
zachodzi  tylko  u  samic,  gdyż  chromosomy  samców  nie  tworzą
chiazm.  Na  podstawie  opisanych  odkryć  sformułowano  kilka
podstawowych tez chromosomowej teorii dziedziczenia:
-geny  zlokalizowane  są  na  chromosomach  liniowo  w  określonej
kolejności

-geny  alleliczne  znajdują  się  w  tych  samych  loci  chromosomów
homologicznych

-poszczególne chromosomy zawierają różną liczbę genów; zestaw ich
jest charakterystyczny dla danego chromosomu

-geny  leżące  bisko  siebie  w  chromosomie  są  ze  sobą  sprzężone  i
dziedziczone łącznie

-częstość występowania c-over zależy od odległości między genami

-częstość  c-over  między  genami  w  obrębie  tej  samej  pary
chromosomów jest stałą dla danego gatunku

-organizmy  powstałe  z  rekombinacji  po  c-over  noszą  nazwę
rekombinantów

•

Epistaza:  jest  to  oddziaływanie  jednego  genu  na  ujawnienie  się
innego  genu,  niebędącego  jego  allelem.  Gen  hamujący  nazywamy
epistatycznym,  a  maskowany  hipostatycznym.  W  zależności  od
właściwości  genu  tłumiącego  mówimy  o  epistazie  dominującej  lub
recesywnej.

•

Penetracja  i  ekspresja:  penetracja  genu,  jest  częstością,  z  jaką
dany  gen  (allel)  dominujący  lub  allele  recesywne  w  układzie
homozygotycznym  ujawniają  się  w  fenotypie  jego  nosicieli.  Jeżeli
wszyscy  nosiciele  mają  fenotyp  charakterystyczny  dla  danego  genu,
penetracja  jest  pełna,  jeśli  nie  wszyscy,  to  niepełna.  Penetracja,
podobnie jak ekspresja zależy zarówno od genotypu jak i środowiska.
Penetracja  może  być  ograniczona  do  jednej  płci.  Przykładem
penetracji  niepełnej  jest  choroba  Huntingtona.  Przy  penetracji
niepełnej  choroba  może  się  nie  ujawnić,  gdyż  penetracja
patologicznego  genu  zależy  od  wieku.  Całkowitą  penetrację
obserwujemy  w  chorobie  Reclinghausena.  Ekspresja  to  stopień
ujawnienia  się  produktu  danego  genu,  odpowiedzialnego  za  jakąś
cechę.  Określa  się  ją  na  poziomie  mRNA  lub  białka.  Niektóre  geny
dominujące

wykazują

zmienną

ekspresję.

Przykładem

jest

polidaktylia, objawiająca się wystąpieniem dodatkowych palców na
kończynach. Zmienność tej cechy łatwo prześledzić można w obrębie
członków jednej rodziny.

•

Poligeny:  inaczej  geny  kumulatywne.  Należą  do  róznych  par  alleli,
zajmują  różne  loci  na  chromosomach,  ale  wpływają  na  wytworzenie
tej  samej  cechy.  Efekty  ich  działania  się  sumują,  stąd  nazwa(!).  u
człowieka warunkują barwę skóry, a także iloraz inteligencji.

•

Plejotropia:  polega  na  warunkowaniu  przez  jeden  gen  kilku
pozornie  niezwiązanych  ze  sobą  cech  genotypowych.  Przykładem
może  być  zespół  Marfana.  Dochodzi  w  nim  do  uszkodzenia  włókien

sprężystych i zaburzenia tworzenia kolagenu wskutek patologicznego
genu

dominującego.

Charakterystyczną

cechą

zespołu

jest

pająkowatość palców.

•

Komplementacja: polega na dopełniającym działaniu produktów
różnych genów. Produkt jednego genu wpływa na produkt drugiego.
U człowieka działanie komplementarne wykazują genu decydujące o
zabarwieniu włosów i skóry.

•

Cechy  dziedziczone  ilościowo:  zmieniają  się  w  sposób  ciągły  i
można  je  wyrazić  liczbowo.  Należą  do  nich  liczne,  zarówno
prawidłowe  jak  i  patologiczne  cechy  fenotypu;  między  innymi:
pigmentacja  skóry,  masa  ciała,  podatność  na  choroby  zakaźne,
ciśnienie krwi, liczba krwinek, inteligencja. Do patologicznych należy
otyłość i nadciśnienie tętnicze.

Mechanizmy powstawania zmienności wśród organizmów

•

Zmiennością

nazywamy

występowanie

dziedzicznych

lub

niedziedzicznych  różnic  pomiędzy  komórkami  danego  organizmu
(wewnątrzosobnicza),  między  osobnikami  należącymi  do  tej  samej
populacji  (osobnicza)  lub  pomiędzy  populacjami  (grupowa).  W
przypadku człowieka istotna jest zmienność osobnicza, której znaczną
część  stanowią  różnice  w  sekwencji  DNA  polegające  na  zamianie
pojedynczego  nukleotydu  u  osób  niespokrewnionych.  Badania
dowodzą,  że  różnice  między  dwiema  niespokrewnionymi  osobami
wynoszą  1:1000  nukleotydów.  Zmienność  fenotypowa  może  mieć
charakter  ciągły (fluktuacyjna),  jak  np.  wzrost,  masa,  IQ,  pigmentacja
włosów.  Przykładem  zmienności  alternatywnej  u  człowieka  jest
układ  grupowy  Rh.  Analizując  zmienność  osobniczą  należy  pamiętać,
że ten sam zespół genów w różnych warunkach może dać różne efekty
fenotypowe.

•

Rekombinacje: pod tym terminem kryje się każdy proces, w którym
dochodzi do pęknięcia nici DNA i wymiany jego fragmentów między
chromosomami

homologicznymi.

Wyróżnia

się

rekombinację

homologiczną,

zlokalizowaną

transpozycyjną.

Rekombinacja

homologiczna następuje, gdy rekombinujące cząsteczki mają mają
identyczną

lub

bardzo

podobną

sekwencję

nukleotydową.

Rekombinacja  niehomologiczna  obejmuje  fragmenty  o  niewielkiej
homologii. U prokaryota rekombinacja zajść może w wyniku losowego
doboru  konigatów.    U  eucaryota  następuje  wskutek  losowego  doboru
osobników rodzicielskich, losowej segregacji chromosomów w mejozie
oraz  losowego  łączenia  się  gamet  i  c-over.  Rekombinacja
transpozycyjna  dotyczy  ruchomych  odcinków  DNA  (transpozonów),
będących cechą charakterystyczną eucaryota.

(temat  o  rekombinacjach  bakterii  pozwalam  sobie  pominąć,
zakładając  z  p=1,  że  nie  należy  do  istotnych  w  świetle  tematyki  z
rozpiski  na  katedrze.  Jeśli  ktoś  chce  nauczyć  się  50  dodatkowych
bialek odsyłam do Drewy, str. Ok. 380)

Mutacje:  są  to  zmiany  zachodzące  w  DNA  na  różnych  poziomach,
które,  jeśli  nie zostaną  naprawione,  to  zostaną  przekazane  komórkom
potomnym  lub  potomstwu.  (rodzaje  mutacji  opisywałem  już  w
temacie o naprawie DNA i tam też odsyłam)

Dziedziczenie u człowieka

•

Układ  ABO;  antygeny  układu  AB0  wykrywane  są  na  powierzchni
krwinek czerwonych, gdzie są związane z glikoproteinami i glikolipidami
błony erytrocytów. Antygeny  te  występują  także  na  powierzchni  innych
komórek  krwi  oraz  wielu  narządów,  obecne  są  także  w  płynach
ustrojowych  i  wydzielinach  ludzi.  jedynie  tkanka  nerwowa  nie  posiada
antygenów AB0. pojawiają się w 5-6 tygodniu rozwoju płodowego, a do
ich  pełnej  ekspresji  dochodzi  w  6-18  miesiacu  po  urodzeniu.  W  locus
AB0  na  ramieniu  długim  chromosomu  9  występują  3  allele:  A,  b  i  0.
każdy  człowiek  ma  w  parze  chromosomów  zawsze  2  allele.  A  i  B  są
dominujące wobec 0, a względem siebie kodominujące. Alloprzeciwciała
układu  należą  głównie  do  klasy  IgM.  Ich  wytwarzanie  następuje  bez
uprzedniego  kontaktu  z  antygenem,  rozpoczyna  się  tuż  po  urodzeniu  i
rośnie,  osiągając  maksimum  w  młodym  wieku.  Alloprzeciwciała
znajdujące się w osoczu krwi aglutynują krwinki czerwone z antygenami,
których nie ma w organizmie. Dlatego osoby z grupą A mają antygen A
na erytrocytach, a w surowicy przeciwciała anty-B. osoby z grupą B mają
odwrotnie. W osoczu ludzi z grupą 0 występują oba rodzaje przeciwciał i
żadnego  antygenu  na  krwinkach,  z  kolei  w  układzie  AB  nie  ma
przeciwciał w osoczu a na krwinkach są oba antygeny.
Geny A, B i 0 mają długość 18-20kb i składają się z siedmiu eksonów.
Geny  A  i  B  są  wysoce  homologiczne,  a  różnice  między  nimi  dotyczą  7
nukleotydów,  przez  co  produkty  genów  A  i  B  różnią  się  między  sobą
zaledwie 4 spośrób 353 aminokwasów. Decydujący wpływ na swoistość
A  i  B  mają  aminokwasy  266  i  268.  Najczęściej  występujący  allel  0,  w
porównaniu  z  allelem  A  nie  ma  jednego  nukleotydu  w  eksonie  6.
wynikiem  tego  jest  przesunięcie  ramki  odczytu,  co  prowadzi  w  pozycji
117  do  powstania  kodonu  STOP.  Powstały  polipeptyd  nie  zawiera
miejsca  aktywnego,  bo  jest  za  krótki  (choć  podobno  rozmiar  nie  gra
roli…).  Tak  więc gen  0  jest  genem  amorficznym.  Rzadsza  jest  odmiana
allelu 0, której produkt wskutek substytucji jednego aminokwasu nie ma
aktywności enzymatycznej. Allel A także posiada 2 odmiany, różniące się
długością o 21 aminokwasów (2 jest dłuższa i mniej aktywna). Tak więc
osoby  z  grupą  krwi  A2B  lub  A2  mają  słabszą  odmianę  antygenu  A.  ich
krwinki  aglutynują  słabiej  niż  przy  występowaniu  odmiany  A1.  osocze
osób  A2  i  A2B  może  zawierać  przeciwciała  Anty-A1,  aglutynujące
erytrocyty  z  antygenem  A1.  Antygeny  grupowe  AB0  są  niejednorodne,
tak  więc  poza  normalnymi  grupami  krwi  wyróżnia  się  wiele  podgrup,
różniących się głównie liczbą antygenów na krwinkach. Różnorodność ta
wynika  z  mutacji  w  genach  kodujących  odpowiednie  transferazy,  które
zmieniają  aktywność  enzymu  i  przekładają  się  na  ilościową  zmianę

ekspresji  antygenu.  Na  tej  podstawie  zidentyfikowano  wiele  odmian
głównych  grup  krwi.  W  obrębie  grupy  A  wyróżnia  się  A1,  A2,  A3,  Ax  i
Ael, które wykazują kolejno coraz słabszą ekspresję antygenu A. Antygen
B ma odmiany B1, Bx, Bel, wśród których także obserwuje się malejącą
aktywność.  Zidentyfikowano  także  polimorficzne  allele  0,  wykazujące
znikomą  aktywność  transferazy  A.  dziedziczenie  grup  krwi  odbywa  się
zgodnie z prawami Mendla.
Układ Rh został odkryty u małpy. Jest to układ antygenowy złożony z
49 serologicznie zdefiniowanych antygenów. Wśród nich wyróżnia się 5
istotnych klinicznie antygenów: D, C, c, E, e, (pozostałych 44 można się
spodziewać  na  kolokwium).  Ich  biosynteza  zaczyna  się  w  6  tygodniu
życia  płodowego.  Geny  Rh  znajdują  się  na  ramieniu  krótkim
chromosomu  1.  W  locus  tym  zidentyfikowano  geny  RHD  i  RHCE,
powstałe w wyniku duplikacji i wyróżniają się 96% homologią. Obydwa
składają się z 10 eksonów, kodują polipeptydy RHD i RHCE o długości
416  aminokwasów,  zawierające  determinanty  antygenowe  układu  Rh.
Geny  RHD  i  RHCE  zorientowane  są  wobec  siebie  przeciwstawnie.
Między nimi znajduje się gen SMP1, którego funkcji dotąd nie poznano.
Gen RHD koduje antygen D, natomiast RHCE antygeny C, c, E, i e. u ok.
85% rasy kaukaskiej (białej) na krwinkach obecny jest antygen D (Rh+),
a  u  około  15%  brak  antygenu  D  (Rh-).  Brak  ten  jest  w  większości
związany  z  delecją  genu  RHD,  wskutek  nierównomiernego  crossing-
over. Antygeny Rh zlokalizowane są na powierzchni błony erytrocytu. W
odróżnieniu od innych układów grupowych polipeptydy te nie zawierają
reszt  cukrowych,  ale  charakterystyczna  jest  obecność  reszt  kwasu
palmitynowego. Ekspresja RHD i RHCE następuje jedynie w obecności
glikoproteiny  RhAG  o  strukturze  podobnej  do  tych  białek.  Wszystkie  3
tworzą  kompleks  z  innymi  białkami  i  glikoproteinami.  Brak  lub
zredukowana  ilość  białek  tego  kompleksu  prowadzą  do  pojawienia  się
rzedkiego fenotypu Rh

null

i Rh

mod-

. Funkcja kompleksu białek układu Rh

jest  nieznana,  ale  pewne  jest,  że  pełni  on  istotną  rolę  w  utrzymaniu
struktury  krwinek  czerwonych.  Brak  polipeptydów  Rh  prowadzi  do
skrócenia ich życia, co objawia się niedokrwistością hemolityczną. Geny
warunkujące  występowanie  antygenów  Rh  są  dziedziczone  w  postaci
dwóch  haplotypów,  po  jednym  od  każdego  rodzica.  Najczęstszymi
haplotypami u rasy białej jest CDe (ok. 40%) i cDE (ok. 15%), pozostałe
występują  z  częstością  poniżej  4%.  Antygeny  układu  Rh  występują  w
wielu  wariantach,  czemu  winne  są  punktowe  mutacje  w  obrębie  tych
genów. Najsilniejsze  właściwości  immunogenne ma  antygen  D.  osoby  z
genotypem  DD  lub  Dd  mają  na  erytrocytach  antygen  D,  tak  więc  ich
fenotyp  to  Rh+.  Osoby  z genotypem  dd  określamy  jako  Rh-.  Zaznaczyć
należy  jedynie,  że  allel  d  nie  istnieje,  jest  to  jedynie  oznaczenie
utraconego wskutek delecji allelu RhD. Przeciwciała układu Rh (anty-D,
anty-C,  anty-c,  anty-E  i  anty-e)  są  w  większości  przeciwciałami
odpornościowymi  klasy  IgG  i  mogą  przechodzić  przez  łożysko.  W
przeciwieństwie  do  przeciwciał  AB0  wytwarzanie  przeciwciał  anty-Rh
jest  stymulowane  przez  sam  antygen  Rh.  Przeciwciała  te  są  więc

wyrazem odpowiedzi immunologicznej na zetknięcie z obcym Rh. Osoby
Rh- nie mają przeciwciał anty-D w osoczu. Powstają one w wyniku
przetoczenia krwi Rh+ lub immunizacji matki-Rh- antygenami Rh+
płodu.

Dziedziczenie mitochondrialne odbywa się po linii matczynej. Uważa
się, że wszystkie mitochondria dziedziczone są po matce z komórki jajowej.
Wskutek tego mutacje matczynego modna są przekazywane całemu
potomstwu.

Należy

zauważyć,

że

ryzyko

wystąpienia

choroby

mitochondiralnej  zależy  od  segregacji  mitochondriów  do  komórek
potomnych.  Komórki  jajowe  kobiety  także  różnią  się  zawartością
zmutowanego  modna  (heteroplazmia).  Tak  więc  nasilenie  objawów
klinicznych  i  ich  rodzaj  będą  odmienne  w  zależności  od  liczby  i
rozmieszczenia  nieprawidłowych  mitochondriów  w  tkankach.  Przykładem
choroby związanej z punktową mutacją modna jest dziedziczna neuropatia
nerwu  wzrokowego  Lebera,  powodująca  utratę  wzroku  w  centrum  pola
widzenia. Chorują najczęściej młodzi mężczyźni, u kobiet objawy pojawiają
się  później  i  są  łagodniejsze.  W  przebiegu  choroby  na  dnie  oka  obserwuje
się zmiany naczyniowe (teleangiekazje). Utrata wzroku następuje w wieku
10-20lat w ciągu kilku tygodni od wystapienia pierwszych objawów.

Niektóre zespoły aberracji chromosomowych

Aberracje liczbowe chromosomów somatycznych

•

Zespół  Downa:  trisomia  chromosomu  21.  występuje  raz  na  700
urodzeń, kobiety powyżej 35 lat ryzyko wzrasta do 1: 360 i do 1: 100
w  wieku  40  lat.  Do  głównych  cech  genotypowych  należą:  olbrzymia
okrężnica  (choroba  Hirschsprunga),  obniżone  napięcie  mięśniowe,
opuszczone kąciki ust, krótka szyja, wystający język, wrodzone wady
serca, spowolniony  rozwój  ruchowy  i umysłowy,  zaburzenia  rozwoju
mowy,  czasami  ADHD  lub  autyzm  dziecięcy.  Większość  chorych  ma
IQ  w  granicach  35-49,  co  świadczy  o  upośledzeniu  w  stopniu
umiarkowanym.

•

Zespół Patau: trisomia chromosomu 13. występuje w od 1:8000 do
1:12  000  urodzeń. Istnieje  zależność między  ryzykiem  wystąpienia  a
wiekiem  matki.  Występują  liczne  cechy  dysmorficzne  i  wrodzone
wady  rozwojowe  takie  jak  małogłowie,  ubytki  skóry  na  głowie,
małoocze,  częściowy  ubytek  siatkówki  i  naczyniówki  oka,  płaski
grzbiet  nosa,  rozszczep  podniebienia,  poli-  i  syndaktylia.  Tetralogia
Wallota,  wodonercze,  wnętrostwo  u  chłopców.  Tylko  5-10%  dzieci
przeżywa do 1r.ż., większość umiera w okresie noworodkowym.

•

Trisomia chromosomu 8: niewielki lub średni stopień
zahamowania wzrostu, zaburzenia w budowie twarzoczaszki,

Mechanizmy patogenetyczne powstawania wad

wrodzonych

•

Deformacje-  wady  powstające  w  ostatnim  trymestrze  ciąży  pod  wpływem
czynników  mechanicznych  działających  na  rosnący  płód.  Przyczyną  mogą
być  nieprawidłowości  budowy  macicy  lub  miednicy,  a  także  w  przypadku
ciąż  mnogich.  Do  czynników  płodowych  należą:  nieprawidłowe  ułożenie
płodu,  falowodzie,  pierwotne  choroby  mięśni  ograniczające  ruchy  płodu.
Deformacje  dotyczące  kości  stawów  mogą  stanowić  poważny  problem
zdrowotny.  Zniekształcenia  tkanek  miękkich  z  reguły  ustępują  po  zaniku
czynnika deformującego.

•

Przerwania-  dotyczą  struktur  początkowo  prawidłowo  rozwijających  się.
Mogą  być  spowodowane  niedotlenieniem,  wylewem  krwi  lub  zrostem
tkanek.  W  miejscu  przerwania  uszkodzone  zostają  wszystkie  struktury,  bez
względu  na  pochodzenie.  Występują  one  sporadycznie,  a  ich  następstwa
zależą od czasu, w którym nastąpiły.

•

Malformacje-  są  to  zaburzenia  rozwoju  pierwotne,  powstałe  w  okresie
zarodkowym.  Dotyczą  zaburzeń  migracji,  proliferacji,  apoptozy  i
różnicowania.  Mogą  być  efektem  nieprawidłowej  morfogenezy.  Są  zwykle
złożone  i  mają  poważne  konsekwencje  kliniczne.  Przykładem  jest
holoprosencefalia.

•

Dysplazje- są skutkiem nieprawidłowego różnicowania się komórek tkanki,
co  prowadzi  do  zmian  budowy  organizmu.  Większość  dysplazji  to  choroby
monogenowe;  należą  tu  również  naczyniaki  i  znamiona  naczyniowe.  Cechy
morfologiczne  składające  się  na  dysplazję  mogą  być  widoczne  zaraz  po
urodzeniu albo u starszych pacjentów.

Duże wady wrodzone

Do  wad  dużych  należą  zaburzenia  rozwojowe  istotnie  upośledzające  czynność
organizmu, niejednokrotnie skracając życie. Około 2/3 wad z tej grupy to wady
pojedyncze.  Należą  do  nich  głównie  zmiany  w  obrębie  OUN,  takie  jak:
małogłowie,  przepuklina  mózgowa,  przepuklina  oponowo-rdzeniowa.  Także
wady  układu  pokarmowego  (rozszczep  wargi  i  podniebienia,  niedrożność
dwunastnicy,  zrośnięcie  odbytu),  serca  (ubytek  przegrody  międzykomorowej,
hipoplazja  lewego  serca,  przerwany  arcus  aorta)  oraz  układu  moczowego
(nerka  podkowiasta,  agnezja  nerek,  zastawka  cewki  tylnej)  należą  do  wad
dużych. Niektóre z nich prowadzą do wczesnego zgonu (anacefalgia). Niektóre
wymagają interwencji chirurgicznej (niedrożność odbytu). W klasyfikacji ICD10
wady  wrodzone  i  choroby  genetyczne  zaliczamy  do  kategorii  Q00-Q99,  ale
niektóre z wad, jak na przykład naczyniaki (D18) i znamiona barwnikowe(D22)
objęte są innymi kategoriami.

Wady OUN

Wodogłowie izolowane

Występuje  0.4/1000  ur.  Może  być  efektem  infekcji  lub
krwawienia  w  rozwoju  płodowym  lub  dziedziczone
recesywnie (autosomalnie lub na X) rozpoznawanie w II
trymestrze badaniem USG.

Holoprosencefalia

Zaburzenie rozwoju przodomózgowia. Często towarzyszy
małogłowie,  hipoteloryzm  oczny,  obustronny  rozszczep
wargi,  w  skrajnych  przypadkach  cyklopia.  Z  reguły
letalna; zgon do 3 mies.  życia. Można diagnozować USG.

Lisencefalia (gładkomózgowie)

Wada  powstała  wskutek  nieprawidłowej  migracji
neuronów  między  9  a  13  tygodniem  życia  płodowego.
Upośledzone  procesy  dojrzewania  mózgowia  (wtórnie
małogłowie).  Może  prowadzić  do  agyrii  lub  pachygyrii
(całkowity lub częściowy brak zakrętów ).

Wielkogłowie

Wymiary

głowy

przekraczające

odchylenia

standardowe w stos. do średniej przy prawidłowych
rozmiarach komór mózgu.

Małogłowie

Wymiary  głowy  poniżej  3  odchyleń  standardowych  w
stos.  do  średniej.  Występuje  raz  na  1000  urodzeń.
Wyróżniamy  postać  pierwotną  (błedy  neurogenezy)
orazt wtórne (po 32 tyg. Życia płodowego). Obwód głowy
po  urodzeniu  prawidłowy,  odchylenia  pojawiają  się  z
wiekiem.

Wady cewy nerwowej

Bezmózgowie

Stanowi  40%  wszystkich  przypadków    wad  cewy
nerwowej.  Występuje  0.75  razy  na  1 000  urodzeń.
Obserwuje  Si  e  brak  skóry,  sklepienia  czaszki  i  tkanki
nerwowej  (wada  otwarta)  lub  rzadziej  brak  struktur
OUN przy zachowanych powłokach (wada zamknięta).

Przepuklina mózgowa

Stanowi  5%  wszystkich  wad  cewy  nerwowej.  W  95%
wada  zamknięta.  Stopień  uszkodzenia  układu  zależy  od
tego,  jakie  struktury  stanowią  jej  zawartość.  Może  być
elementem  zespołu  Meckela,  wtedy  obserwujemy
hipoplazję  płatów  węchowych,  wady  gałek  ocznych  i
rozszczep wargi.

Rozszczep kręgosłupa

Ok. 55% wad cewy nerwowej. Wyróżnia się kilka postaci:

•

Rozszczep ukryty- rzadko powoduje kalectwo.

•

Rozszczep torbielowaty- w jego obrębie dwie
formy;

przepuklina

oponowa

(worek

przepuklinowy  zbudowany  z  opony  rdzeniowej,  a
zawartość  to  płyn  M-R)  lub  przepuklina
oponowo-rdzeniowa  (najczęstszy;  worek  zawiera
płyn M-R oraz rdzeń lub jego korzenie)

Skutki  wady  zależą  od  położenia  rozszczepu  i  stopnia
uszkodzenia  rdzenia.  80%  przypadków  dotyczy  ok.
lędźwiowej  i  lędźwiowo-krzyżowej.  Powoduje  wtedy
zaburzenia    funkcji  narządów  miednicy  mniejszej  i
kończyn dolnych.

Wady kończyn

Wady ubytkowe

Amelia-

brak

kończyny;

fokomelia-

brak

cz.

proksymalnej  kończyny.  klasycznym  przykładem  tych
wad jest teratogenne działanie Talidomidu, stosowanego
jako środek przeciwwymiotny w I trymestrze.
Ubytki  poprzeczne-  występują  raz  na  5 000  urodzeń
często  z  powodu  amputacji  In  utero  spowodowanej
pasmami owodni.
Występuje też aplazja kości promieniowej; np. w zespole
Holt-Orama

Palce dodatkowe

Mogą występować osiowo (od str. Promieniowej) lub
pozaosiowo (od łokciowej). Izolowana polidaktylia
występuje jako cecha dominująca z niepełną penetracją,
ale obserwujemy ją też w trisomii chromosomu 13.

Palcozrosty

Może  mieć  różne  postacie.  Od  skórnej  syndaktylii  aż  po
rozległe  palcozrosty  obejmujące  także  tkanki  miękkie  i
kości.  Częstość  wady  wynosi  1  :  1000  urodzeń.  Wadę
obserwuje się w zespole Polanda.

Rozszczepy dłoni i stóp

Występuje z częstością 1: 90 000 urodzeń. Etiologia jest
zróżnicowana.  W  postaci  izolowanej  obustronnej  wada
może  być  dziedziczona  ze  zmienną  ekspresją  jako  cecha
autosomalna  dominująca.  Obserwowana  też  w  zespole
EEC

Wady układu krążenia

Ubytek przegrody

międzykomorowej

Stanowi 25-24% wszystkich wad krążenia. Występuje 1-3
razy

1 000

urodzeń.

Wada

etiologii

wieloczynnikowej, może też towarzyszyć aberracjom
chromosomowym, w tym trisomiom 13, 21, 18 i 22 pary.
Spotykana także w dziedziczonych autosomalnie
odminująco zespołach Holt-Orama i Aperta.

Ubytek przegrody

międzyprzedsionkowej

3.4-14%  ogółu  wad.  Polega  na  braku  jednej  lub  dwóch
części  przegrody  przedsionków.  80%  wad  dotyczy
ubytków  otworu  owalnego.  Najczęściej  spotykany  jako
wada  izolowana,  a  także  w  przypadku  trisomii
chromosomu 21 i 22, z zespołem Holt_Orama, Noonan i
Treacher-Collinsa

dziedziczonymi

autosomalnie

dominująco.

Kanał przedsionkowo-komorowy

Stanowi 5-7.5% wad. Może istnieć jako wada izolowana,
często jednak występuje w trisomii chromosomu 21.

Przetrwały przewód tętniczy

Ok. 10% wszystkich wad. Częstość znacznie większa u
wcześniaków, trzykrotnie częściej u dziewczynek.
Występuje w polisemii 49 XXXXY, trisomii 13,18,21 pary
i delecjach 4p i 5p.

Zespół hipoplazji lewego serca

1.4-5.7% wad wrodzonych. Rzadko występuje rodzinnie.
Obserwowany

wśród

pacjentów

trisomią

chromosomu

Nadastawkowe zwężenie aorty

1-2%  przypadków  wad  serca.  Sporadycznie  występuje
jako  cecha  występująca  dominująco.  Jest  najczęstszą
wadą  układu  krążenia  obserwowaną  u  chorych  z
zespołem  Williama.  Zwężenie  narasta  z  wiekiem
pacjenta.

Koarktacja aorty

5-8% wszystkich wad serca. Częściej występuje u
chłopców.

Stosunkowo

często

spotykana

przy

monosomii chromosomu X, obserwowana także w
zespole Aperta.

Wady stożka i pnia naczyniowego

Do  tej  grupy  należy  m.in.  tetralogia  Fallota,  atrezja
zastawki  tętnicy  płucnej  z  ubytkiem  przegrody
międzykomorowej,  odejście  obydwu  tętnic  z  prawej
komory i wspólny pień tętniczy. Wady tej grupy cechują
zespół DiGeorge’a.

Zastawkowe zwężenie tętnicy

płucnej.

10% ogółu wad. Jako wada izolowana wystepuje z
częstością 2-4% u rodzeństwa. Obserwowana w trisomii
chromosomu 18 i zespole Noonan

Wady układu pokarmowego

Wady przedniej ściany brzucha

Skutkują  nieprawidłowym  położeniem  jelit,  często  także
wątroby  i  śledziony.  Występują  raz  na  6000  ciąż.
Możliwe do wykrycia w okresie prenatalnym, możliwe do
korekcji  chirurgicznej.  Jedną  z  nich  jest  przepuklina
sznura  pępowinowego,  polegająca  na  obecności  worka
przepuklinowego  zawierającego  wątrobę  i/lub  jelito,  do
którego

wierzchołka

przytwierdzony

jest

sznur

pępowinowy.

Przepuklina przeponowa

Wystepuje  1:  2 000-3  000  urodzeń.  Niemal  96%
przypadków dotyczy tylno bocznej  przepony, najczęściej
lewostronnie.  Mogą  być  przyczyną  wtórnej  hipoplazji
płuc. Nawet niewielkie ubytki przepony mogą być groźne
dla  życia.  W  około  Połowie  przypadków  współistnieje  z
innymi wadami.

Rozszczep wargi/podniebienia

Występuje raz na 1000 urodzeń jako wada izolowana o
dziedziczeniu wieloczynnikowym, a także towarzysyz
wielu zespołom wad.

Niedrożność przełyku

1: 3 000 urodzeń żywych. U większości współistnieje z
przetoką tchawiczo-przełykową. Wada ta jest groźna dla
życia noworodka, szczególnie w przypadku przetoki.

Wrodzone zwężenie odźwiernika

1: 200 chłopców i 1: 1000 dziewcząt. Do objawów należą
nasilone wymioty i przerost odźwiernika wyczuwany
badaniem

palpacyjnym.

Konieczna

jest

korekcja

chirurgiczna.

Wrodzona niedrożność jelit

Występuje  u  1  na  330  noworodków.  Może  obejmować
każdy  odcinek  jelita.  Zrośnięcie  dwunastnicy  jest  w  60-
70%  wadą  izolowaną.  Rozpoznanie  prenatalne  może
nastąpić  przy  badaniu  USG  i  wskazuje  na  wykluczenie
trisomii chromosomu 21.

Choroba Hirschprunga

1:  5 000  noworodków  z  przewagą  płci  męskiej  (3:1).  Do
objawów  należą  zaparcia  i  wzdęcia  spowodowane
brakiem  zwojów  podśluzówkowych  i  mięśniowych
końcowego  odcinka  jelita  grubego.  Choroba  ma
heterogenną etiologię

Wrodzone wady nerek i układu moczowego

Agnezja nerek

Jednostronny brak nerki nie daje objawów klinicznych i
rozpoznawany jest przypadkowo. Agnezja obustronna
jest wadą o powaznym rokowaniu prowadzącą do zgonu
w okresie noworodkowym. Występuje raz na 3000
urodzeń, częściej u płci męskiej. Brak nerek prowadzi do
małowodzia, które skutkuje sekwencja Potter.

Torbielowatość nerek w postaci

dorosłej

000

urodzeń.

Dziedziczona

autosomalnej

dominujaco.  Torbiele  mogą  się  umiejscawiać  na
nerkach,  wątrobie,  śledzionie  i  trzustce;  początkowo  nie
dając żadnych objawów. W czwartej dekadzie życia wada
ujawnia  się  w  postaci  postępującego  zaburzenia  funkcji
nerek oraz nadciśnienia tętniczego.

Torbielowatość nerek dziecięca

Dziedziczna autosomalnie recesywnie. objawia się obec-
nością  licznych  torbieli  wątroby  i  nerek.  Torbiele  nerek
są  efektem  rozdęcia  kanalików  zbiorczych.  W  wątrobie
obserwujemy  włóknienie  i  nieprawidłowy  rozwój  dróg
żółciowych.  Pierwsze  objawy  w  dzieciństwie.  Obserwu-
jemy też przebieg ciężki z początkiem objawów w okresie
noworodkowym.

Dysplazja wielotorbielowata nerek Nazywana również uropatią obturacyjną. Występuje

sporadycznie, zwykle jako skutek przeszkody w odpływie
moczu. Najczęstszą przyczyną jest obecność zastawek
cewki moczowej. Występuje znacznie częściej u płodów
płci męskiej. W skrajnej sytuacji prowadzi do zniszczenia
struktur nerki

Choroby jednogenowe

Autosomalne dominujące:

•

Achondroplazja: najczęściej występująca niskorosłość, wystepująca raz na
15  000-40 000  urodzeń.  Przyczyną  jest  mutacja  w  receptorze  FGFR3,
powodująca  upośledzenie  wzrostu.  Do  objawów  należy  skrócenie  odcinków
proksymalnych  kończyn,  pogrubienie  kości  długich,  wydatne  czoło,
powiększona  głowa  przy  tułowiu  normalnych  rozmiarów.  Obniżony  wzrost
(ok.  120-13o  cm),  małe  sześcienne  trzony  kręgów.  Heterozygoty  żyją  10-15
lat krócej niż średnia zdrowych ludzi. Homozygoty umierają tuż po porodzie
wskutek niewydolności mm. oddechowych.

•

Zespół  Marfana:  dziedziczne  zaburzenie  biosyntezy  składników  tkanki
łącznej.  Występuje  1-2  razy  na  10 000  urodzeń,  25%  to  mutacje  de  novo.
Zaburzenie  polega  na  zakłóceniu  syntezy  glikoproteiny;  fibrylny  1,  co
powoduje  defekty  substancji  międzykomórkowej.  Objawy  związane  są  z
uszkodzeniem

włókien

sprężystych

występowaniem

nadmiernie

rozciągliwej tkanki łącznej. Dochodzi do nadmiernego wzrostu kości długich
i zaburzenia proporcji ciała oraz wydłużenia palców (arachnodaktylia) oraz
lejkowatego kształtu klatki piersiowej. Główną przyczyną zgonów są wady
aorty.

•

Choroba  Huntingtona:  występuje  4-7  razy  na  100 000  urodzeń.
Odpowiedzialność za nią ponosi gen IT-15 zlokalizowany w 4p16.3, kodujący
białko  Huntyngtynę,  które  jest  obecne  w  cytoplazmie  wielu  komórek  i  jest
związane  z  cytoszkieletem  i  pęcherzykami  synaptycznymi  neuronów  oraz
transportem  akrosomalnym.  Choroba  jest  wynikiem  niestabilnej  liczby
powtórzeń  sekwencji  (CAG)n,  kodującej  Glu.  U  zdrowych  występuje  10-29
powtórzeń,  30-35  w  stanie  permutacji  a  większa  niż  36  liczba  warunkuje
rozwój  choroby.  Zmutowane  białko  tworzy  nierozpuszczalne  wtręty  w
neuronach  oraz  zakłóca  transkrypcję.  Objawami  choroby  są:  zmiany
neuropatologiczne,  spadek  masy  ciała,  zaburzenia  psychiczne,  w  tym
osobowości,  wahania  nastroju,  trudności  w  uczeniu  się,  hiperkinezy
objawiające  się  ruchami  pląsawicznymi,  narastające  otpępienie,  a  w  fazie
zaawansowanej  sztywność  mięśni.  Postępująca  degeneracja  OUN  prowadzi
do  spadku  sprawności  a  w  końcu  do  śmierci.  Najczęściej  pierwsze  objawy
występują ok. 4. dekady życia. W kolejnych pokoleniach choroba pojawia się
w coraz młodszym wieku (p. ekspansja tripletów). Śmierć następuje w 10-25
lat od pojawienia się objawów.

Autosomalne recesywne

•

Fenyloketonuria:  w  chorobie  następuje  kumulacja  fenyloalaniny  w
organizmie  wskutek  defektu  jednego  z  metabolizujących  ją  enzymów.
Występowanie  to  ok.  1:  10 000.  gromadzenie  Phe  powoduje  wtórne
zaburzenia

metaboliczny

Tyr

Trp.

Dochodzi

deficytu

neurotransmitterów. Objawy pojawiają się w pierwszych tygodniach życia.
Są to: mysi zapach moczu, zmniejszenie syntezy melanin, opóźnienie

rozwoju psychoruchowego, w pełni rozwinięta choroba prowadzi do
ciężkiego upośledzenia IQ (20-40). Występować może nadpobudliwośc i
agresja. Leczenie opiera się na diecie ubogiej w Phe.

•

Mukopolisacharydoza:

związana

nadmiernym

gromadzeniem

mukopolisacharydów  w  tkance  łącznej.  Objawia  się  pogrubieniem  skóry,
przepukliną  pępkową  i  pachwinową,  niskorosłością,  upośledzeniem
umysłowym,  hepatosplenomegalią  i  charakterystycznym  kształtem  palców.
Wystepuje od 1 na 25 000 do 1 na 500 000 urodzeń

•

Albinizm: następstwo zaburzeń syntezy melanin. Osoby dotknięte chorobą
mają białą skórę z różowym odcieniem, białe włosy i różowe lub niebieskie
tęczówki, co skutkuje zwiększoną wrażliwością na promienie słoneczne.
Występuje z częstością 1: 35 000 osób.

•

Mukowiscydoza:  1:  2 000-4000  urodzeń.  Polega  na  mutacji  genu  CFTR
kodującego regulator transportu jonów, którego funkcją jest transport jonów
chlorkowych  przez  błony.  Prowadzi  to  do  zwiększonej  absorpcji  jonów
sodowych  i  wody  w  komórkach  nabłonkowych,  co  powoduje  powstanie
gęstego  śluzu  zalegającego  w  wyścielonych  nabłonkiem  przewodach.
Konsekwencją  tego  są  częste  infekcje,  niewydolność  trzustki  ze
zwłóknieniem  torbielowatym  i  wzrost  poziomu  elektrolitów  w  pocie.  Przez
analizę  potu  można  chorobę  zdiagnozować.  Może  dochodzić  do
odwodnienia,  azoospermii  wskutek  niedrożności  nasieniowodów.  Chorobę
charakteryzuje zmienne nasilenie objawów u osób z tą samą mutacją

•

Anemia  sierpowatokrwinkowa:  występuje  często  w  Afryce,  basenie
morza  śródziemnego  i  u  Afroamerykanów.  Przyczyną  jest  mutacja  w  genie
hemoglobiny powodująca powstanie nieprawidłowej postaci białka(HbS), co
z  kolei  prowadzi  do  zmian  kształtu  krwinek  na  sierpowaty.  Erytrocyty
wadliwe  są  usuwane  przez  śledzionę,  co  prowadzi  do  anemii.  Choroba  jest
jednak  na  terenie  Afryki  „korzystna”  gdyż  nosicielstwo  tej  mutacji  chroni
przed  zarażeniem  zarodźcami.  Objawy:  stan  zapalny  i  wtórne  uszkodzenia
narządów wskutek zatorów, niedokrwistość.

Sprzężone z chromosomem X

•

Zespół  łamliwego  chromosomu  X:  1:  4000  urodzeń  u  mężczyzn  i
1: 8000  u  kobiet.  Defekt  polega  na  uszkodzeniu  genu  FMR1,  kodującego
białko  wiążące  RNA.  mutacja  polega  na  ekspansji  tripletu,  co  prowadzi  do
zmetylowana  genu,  które  powoduje  z  kolei  zanik  jego  ekspresji.  Objawy:
niska  masa  urodzeniowa,  mały  obwód  głowy,  zwiększona  objętość  jąder,
duże  małżowiny  uszne  i  hipotonia  mięśniowa.  Obserwuje  się  objawy
autyzmu,  zaburzenia  mowy  i  opóźnienie  rozwoju  psychoruchowego.  U
dorosłych deformacje twarzoczaszki, wydatne guzy czołowe, bladoniebieskie
tęczówki,  powiększenie  jąder,  zniekształcenie  kręgosłupa,  szerokie  ręce  i
krótkie palce, enceflopatie i objawy padaczki. Przy pełnej mutacji średnie iq
u mężczyzn wynosi ok. 40. jeśli metylacja FMR jest niekompletna iq jest na
normalnym poziomie. Kobiety z pełną mutacją mają iq w granicach normy,
średnio u 1/3 występują deformacje twarzoczaszki.

Wektory i terapia genowa

Fragmenty DNA pocięte restryktazą mogą był łączone z innym odcinkiem DNA

(wektorem) trawionymi tą samą restryktazą. Końce DNA badanego i wektora
mogą zostać połączone za pomocą ligazy. Wektory dzielimy na:

•

Autonomiczne: replikują się niezależnie od genomu gospodarza.

•

Integracyjne: włączają do jego DNA są bardziej stabilne, ale występują w
mniejszej liczbie kopii. Należą tu między innymi wektory retrowirusowe.

•

Ekspresyjne: mają na celu zapewnić efektywną ekspresję wszczepianego
genu.

•

Wektory  wahadłowe  (bifunkcjonalne):  mogą  występować  w  co
najmniej  dwóch  różnych  organizmach,  przy  czym  można  je  przenosić
między komórkami prokariotycznymi i eukariotycznymi.

Dobór odpowiedniego typu wektora zależy od rodzaju komórki, w jakiej

zamierzamy  klonować  dany  fragment  DNA.  Najważniejszym  funkcjonalnym
elementem wektora są sekwencje Ori, odpowiedzialne za inicjację replikacji, które
muszą  być  odpowiednie  dla  wybranego  organizmu.  Istotną  cechą  wektorów  jest
obecność  w  nich  sekwencji  markerowych,  kodujących  np.  konkretne  cechy
fenotypowe  danego  organizmu,  które  dadzą  się  łatwo  zauważyć  lub  geny
odporności na antybiotyki.

Do najważniejszych wektorów używanych w medycynie należą:

•

Plazmidy bakteryjne: pozachromosomowe cząsteczki DNA, wielkości
kilku-kilkuset tysięcy PZ, zdolne do samodzielnej replikacji u prokaryota i
niektórych eucaryota. Plazmidy są przenoszone w procesie koniugacji
między komórkami bakteryjnymi

•

Wektory  fagowe:  są  to  wirusy  infekujące  bakterie  przez  aktywne
wstrzyknięcie  swojego  DNA  do  wnętrza  komórek.  Ich  namnażanie  jest
bardzo szybkie. Najlepiej poznanym jest fagλ, który może być używany jako
wektor  do  infekowania  E.  Coli.  DNA  faga  może  zostać  zamienione
miejscami  z  jakimś  odcinkiem  bakteryjnego,  włączając  się  tym  samym  do
genomu  lub  wnikać  do  niego  na  zasadzie  insercji.  Z  kolei  fag  M13  ma
mniejszy plazmid (6tys pz) ale nie powoduje lizy komórki po namnożeniu.

•

Kosmidy: używane w klonowaniu dużych odcinków DNA (do 45 kpz).
Składają się z sekwencji plazmidu z miejscem Ori, połączonych z sekwencją
cos faga λ, koniecznej do upakowania DNA w kapsydy.

•

Wektory drożdżowe:

•

Sztuczne chromosomy drożdżowe: posiadają sekwencje centromeru,
telomeru i inicjacji replikacji, które łączy się z plazmidami. Są doskonałe do
badania ekspresji genów.

•

Sztuczne chromosomy bakteryjne: są bardziej stabilne od
drożdżowych i łatwiej się nimi transformuje E.Coli, a także łatwiej namnaża
i izoluje.

•

Wektory eukariotyczne ssaków: jednymi z pierwszych były te oparte o
wirusa SV40. zawierają one fragmenty DNA wirusa z sekwencją ori,
promotory genów kodujące wczesne białka wirusa oraz sekwencje
odpowiedzialne za inicjację transkrypcji.

•

Sztuczne chromosomy ssaków

•

Nośniki  syntetyczne:  praktyczne  zastosowanie  mają  liposomy,  czyli
cząsteczki lipidów o charakterze kationowym, zawierające egzogenny DNA
wprowadzony  za  pomocą  plazmidu.  Liposomy  mogą  wprowadzać  odcinki
DNA  o  rozmiarach  do  150  kpz.  Charakteryzują  się  one  niską
immunogennością

dużą

pojemnością.

Zmodyfikowane

przez

skompleksowanie z gangliozydem GM1 czyni je niewidzialnymi dla
makrofagów. Innymi wektorami chemicznymi są polipeptydy kationowe.

Terapia genowa

Polega na wprowadzeniu prawidłowego genu do komórki w której występuje on

w  formie  uszkodzonej  lub  nie  występuje  w  ogóle.  Terapia  musi  być  poprzedzona
testami  In  vivo  oraz  In  vitro.  Konieczne  jest  użycie  odpowiednich  wektorów.
Wskaźnikiem  sukcesu  terapii  jest  pojawienie  się  ekspresji  danego  genu.  Pacjenci
poddani  terapii  genowej  musze  pozostawać  pod  ścisłą  kontrolą  w  celu  oceny
efektów  leczenia  i  wykrycia  ewentualnych  skutków  ubocznych.  Obecnie  jedyną
dopuszczalną  metodą  jest  wprowadzanie  wektorów  do  komórek  somatycznych.
Modyfikacja komórek linii płciowych jest ze względów etycznych zabroniona.

Strategie terapii genowej:

•

Ex vivo: polega na pobraniu od chorego komórek do celowych i
wprowadzeniu genu In vitro. Kolejnym etapem jest ponowne
wprowadzenie komórek do organizmu.

•

In vivo: polega na wprowadzeniu terapeutycznego genu bezpośrednio do
tkanek.

Rodzaje terapii genowej

•

Dodawanie genów: gen uszkodzony pozstaje w swoim locus, a gen
terapeutyczny jest wprowadzony w inne miejsce chromosomu.

•

Zamiana genów: polega na wymianie genu zmutowanego na gen
prawidłowy w procesie somatycznej rekombinacji homologicznej.

•

„doskonalenie  genomu”:  dodanie  genu,  który  nie  zastępuje  żadnego
innego,  ale  koduje  substancje,  które  fizjologicznie  nie  są  produkowane
przez komórkę. Mogą to być geny kodujące rybozymy, białka wirusowe i
interleukinę  2.  produkty  genu  wprowadzonego  wpływają  na  ekspresję
innych.

Próby terapii genowej u ludzi
Do roku 2010 odbyły się 1644 próby kliniczne terapii genowe u ludzi, z czego

ponad 900 przeprowadzono po roku 2000. najwięcej z nich dotyczyło chorób
nowotworowych, na drugim miejscu znalazły się choroby sercowo-naczyniowe.

Terapia genowa w niektórych chorobach

•

Mukowiscydoza:  próby  dotyczą  głównie  skorygowania  defektu
genetycznego  komórek  oskrzeli,  gdyż  objawy  płucne  są  w  chorobie
najgroźniejsze.  Najczęstszymi  wektorami  są  w  tym  przypadku
adenowirusy, ostatnio też lentiwirusy. Transgen (CFTR) w odpowiednim
wektorze  wprowadza  się  drogą  wziewną.  Głównym  problemem  jest
wprowadzenie  wektora  do  komórek,  gdyż  spotyka  się  on  z  odpowiedzią
odpornościową. Z powodu wymiany komórek nabłonka terapia musi być
regularnie powtarzana. Do przywrócenia prawidłowego stanu organizmu
wystarczy 10% ekspresja CFTR.

•

Choroby  układu  naczyniowego:  próby  koncentrują  się  na  chorobie
niedokrwiennej  serca  i  kończyn.  Z  dużym  sukcesem  prowadzi  się  próby
wprowadzania  genów  kodujących  substancję  wzmagające  angiogenezę,
np.  VEGF  czy  jeszcze  skuteczniejszy  FGF-4.  prace  dotyczą  też
ograniczenia  restenozy  (ponownego  zwężenia)  po  angioplastyce.  Stosuje
się tu geny kodujące rybozymy ograniczające proliferację mięśni gładkich,
która w nadmiarze powoduje zwężenie naczyń. Wyniki badań w kierunku
walki  z  miażdżycą  są  mniej  obiecujące,  co  wynika  z  trudności  w
otrzymaniu  odpowiedniej  ekspresji  czynnika  angiogennego  i  jego
utrzymania  aż  do  zajścia  procesu.  Innym  podejściem  jest  wszczepianie
naczyń  żylnych  modyfikowanych  ex  vivo  chorym  na  chorobę  zarostowo-
zakrzepową.

•

Hipocholesterolemia  rodzinna:  terapia  przebiega  ex  vivo  na
pobranym  fragmencie  wątroby  przy  namnożeniu  hepatocytów  In  vitro  i
wprowadzeniu  do  nich  za  pomocą  retrowirusów  genu  kodującego
receptor dla LDL, a następnie ponownym wszczepieniu tych komórek do
wątroby  chorego  poprzez  żyłę  krezkową.  Zabieg  taki  powtarza  się
trzykrotnie, ale skuteczność nie jest wysoka.

•

Choroba Parkinsona: we wszystkich próbach wykorzystuje się wektory
AAV.  Pierwsze  próby  polegały  na  wprowadzeniu  do  jądra  podwzgórza
genu dekarboksylazy kwasu glutaminowego, którego produkt pośredniczy
w  syntezie  GABA.  Inną  metodą  jest  wprowadzenie  genu  dla  neuturyny,
który która pobudza różnicowanie neuronów dopaminergicznych. Trzecią
opcją  jest  terapia  ciała  prążkowanego  genem  dekarboksylazy  L-
aminokwasów aromatycznych.

•

AIDS:  pracę  postępują    w  trzech  kierunkach.  Jednym  z  nich  jest
wprowadzenie do komórek hematopoetycznych transgenu powodującego
niewrażliwość  na  infekcję  wirusową  HIV.  Inną  metodą  jest  dostarczanie
transgenu  do  limfocytów  t  CD  4i  8.  trzecią  metodą  ma  być  immunizacja
antygenami wirusa HIV, która wywoła odporność na wirusa.

•

Choroba  Huntingtona:  prace  polegają  na  uzyskaniu  nadekspresji
rzęskowego czynnika neurotroficznego CNTF, redukującego obumieranie
prążkowia.  Do  komory  bocznej  mózgu  wstrzykuje  się  półprzepuszczalną
kapsułkę  ze  zmodyfikowanymi  komórkami  nerki  chomika.  Kapsułkę
wymienia  się  co  6  miesięcy.  W  pierwszych  badaniach  klinicznych  tej

metody otrzymano zadowalające efekty. W badaniach prowadzonych u
naczelnych osiągnięto całkowitą korekcję fenotypu.

•

Choroba  Alzheimera:  pierwsza  próba,  przeprowadzona  w  2001  roku
polegała  na  wprowadzeniu  do  przodomózgowia  komórek  wykazujących
ekspresję  czynnika  wzrostu  nerwów  NGF  stymulującego  neurony
cholinergiczne. Komórki implantowane to autologiczne fibroblasty.

Terapia genowa nowotworów

•

Immunoterapia:  polega  na  uczynieniu  Komorek  nowotworowych
„widocznymi”  dla  układu  immunologicznego,  przez  zmodyfikowanie  ich
genami kodującymi cytokin  takie jak TNFα. Prowadzi to do zwiększenia
prezentacji antygenów przez komórki nowotworowe i w efekcie rekrutacji
specyficznych limfocytów T i B.

•

Wirusy  onkolityczne:  wektory  tego  typu  wybiórczo  niszczą  komórki
nowotworowe,  pozostając  nieszkodliwe  dla  prawidłowych.  Wirusy
namnażają  się  w  komórkach  nowotworowych  i  po  jej  rozpadzie  atakują
kolejne.  W  pierwszej  próbie  wykorzystano  zmodyfikowane  wirusy,
namnażające  się  w  komórkach  pozbawionych  białka  p53.  innym
wykorzystywanym  wirusem  jest  zmodyfikowany  Hermes  simplex
stosowany w raku piersi i trzustki.

•

Kompensacja mutacji: polega na inhibicji funkcji onkogenu i
przywróceniu funkcji genu supresorowego dzięki:

Zatrzymaniu transkrypcji onkogenu przy pomocy antysensownych
oligonukleotydów tworzących strukturę podwójnej helisy

Zatrzymania translacji mRNA określonego onkogenu przez
zastosowanie jak wyżej antysensownych sekwencji

Zablokowanie funkcji onkoprotein

Zastąpienie

zmutowanych

form

genów

p53,

czy

RB1

niezmutowanymi.

•

Terapia stosująca geny samobójcze: jest to przykład molekularnej
chemioterapii. Próby kliniczne obejmują:

Transfer genu kinazy tymidyniowej zwiększającej podatność na
aciklovir

Transfer genu deaminazy cytozynowej, powodujący podatność na 5-
fluorocytozynę

Transfer genu cytochromu P450 2B wzmacniający podatność na
cyklofosfamid.

Ogółem  geny  samobójcze  kodują  produkty,  które  przekształcają  podany  do
organizmu  substancję  (prolek)  w  trujące  metabolity  indukujące  apoptozę.
Produkty  toksyczne  mogą  też  być  niebezpieczne  dla  zdrowych  komórek
sąsiednich.  Dzięki  tej  metodzie  dokonano  przełomu  w  walce  z  glejakiem
mózgu.