Metody izolacji i oczyszczania DNA

Izolacja materiału genetycznego zawartego w różnego rodzaju organizmach prokariotycznych
i eukariotycznych, w postaci chromosomowego lub plazmidowego DNA wymaga zastosowania odmiennych metod. Ogólnie, techniki ekstrakcji DNA polegają na rozbiciu komórek i oddzieleniu DNA od innych struktur komórkowych, cząsteczek RNA i białek związanych z DNA.

1. Dezintegracja komórek

Dezintegrację komórek przeprowadza się metodami fizycznymi np. przez zamrażanie
i rozmrażanie komórek, wywoływaniem szoku osmotycznego komórek lub metodami chemicznymi. Można również zastosować mechaniczną dezintegrację np. rozcieranie tlenkami glinu lub perełkami szklanymi. Metody te muszą być na tyle „delikatne” aby nie powodować poważniejszych uszkodzeń struktur wewnątrzkomórkowych. Bakteryjne komórki ulegają lizie pod wpływem niejonowych lub jonowych detergentów jak np. SDS, Sarkozyl czy Triton X-100, rozpuszczalników organicznych, roztworów alkalicznych lub podwyższonej temperatury. Stosuje się także lizozym lub inne enzymy trawiące ścianę komórkową mikroorganizmów. Liza komórek bakterii gramujemnych następuje po dodaniu soli sodowej kwasu wersenowego (EDTA) i lizozymu. Lizozym powoduje rozkład peptydoglikanu nadającego sztywność i kształt ścianie komórkowej bakterii. Powstałe sferoplasty ulegają lizie pod wpływem detergentu lub bezpośrednio ciśnienia osmotycznego w hipotonicznym roztworze.

Podczas izolacji DNA należy zapobiegać jego degradacji przez różnego rodzaju DNazy. Enzymy te ulegają aktywacji w obecności dwudodatnich jonów metali, dlatego izolację DNA przeprowadza się w obecności czynników chelatujących (np. EDTA). Aby uniknąć nawet nieznacznych ilości DNaz należy posługiwać się jałowym szkłem oraz płynami i drobnym jednorazowym sprzętem (końcówki do pipet, eppendorfy). Wszystkie czynności należy wykonywać w rękawiczkach.

2. Usunięcie frakcji komórkowych i białek

W celu usunięcia frakcji komórkowych stosuje się wirowanie. DNA oddziela się od białek stosując nasycony buforem roztwór fenolu, chloroform z alkoholem izoamylowym, a czasem mieszaninę fenolu z chloroformem i alkoholem izoamylowym w proporcji 25:24:1. Białka można również usunąć trawiąc je enzymem np. proteinazą K. Z odbiałczanych próbek DNA wytrącany jest etanolem lub izopropanolem w obecności octanu potasu, sodu lub amonu albo chlorku sodu. Lipidy usuwamy dzięki ekstrakcji chloroformem. Ekstrakcję chloroformem wykonujemy przeważnie bezpośrednio po ekstrakcji fenolem, gdyż chloroform oprócz lipidów i białek usuwa z fazy wodnej również resztki fenolu.

3. Usunięcie RNA

Usunięcie kwasu rybonukleinowego z otrzymanych preparatów DNA przeprowadza się enzymatycznie przez inkubację próbek z RNazą, selektywne wytrącanie RNA z roztworu chlorkiem litu, sączenie molekularne lub wirowanie w gradiencie gęstości.

4. Oczyszczanie otrzymanych preparatów DNA

Oczyszczanie otrzymanych preparatów DNA opiera się na różnicach wynikających
z molekularnej wielkości cząsteczek, drugorzędowej struktury, a w przypadku plazmidów także od superzwinięcia cząsteczek DNA oraz składu zasad. Cząsteczki DNA różniące się składem zasad można rozdzielić przez długotrwałe wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu (CsCl). Różne metody ultrawirowania w gradiencie gęstości alkalicznej sacharozy lub w gradiencie chlorku cezu
i bromku etydyny umożliwiają rozdzielenie liniowych i zrelaksowanych, od superzwiniętych form DNA, cząsteczek RNA i białek bez względu na masę cząsteczek DNA.

5. Przygotowanie DNA do przechowywania.

DNA przechowywany jest w postaci roztworu wodnego lub w buforach typu TE. Bufory te zawierają Tris, odpowiedzialny za utrzymanie stałego pH roztworu, a także EDTA, który wiąże jony dwuwartościowe, np. Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Jony te są kofaktorami wielu enzymów nukleolitycznych stanowiących zagrożenie dla przechowywanego DNA. DNA w buforach TE należy

przechowywać w +4 lub -20^oC.

---