IZOLACJA DNA Z ŻELU AGAROZOWEGO
Znanych jest wiele metod odzyskiwania DNA z żeli, żadna z nich jednak nie jest pozbawiona wad. Do głównych problemów podczas izolowania DNA z żeli należą:
obecność inhibitorów reakcji enzymatycznych. Większość handlowych preparatów agarozy, zwłaszcza w przeszłości, zanieczyszczona była polisacharydami działającymi hamująco na aktywność enzymów używanych w trakcie dalszej obróbki klonowanego DNA. Mimo znacznego postępu w jakości produkowanej agarozy nadal zdarza się izolowanie DNA w formie nieaktywnej.
mało skuteczne odzyskiwanie dużych fragmentów DNA. Wydajność izolowania fragmentów DNA z żelu jest funkcją ich ciężaru cząsteczkowego. Jak dotąd, brak jest naprawdę skutecznych metod dla fragmentów DNA dłuższych od 5 kb, które trudno wiążą się do DEAE-Sephacelu czy DEAE-celulozy i równie trudno się z nich eluują.
nieskuteczne odzyskiwanie małych ilości DNA. Im mniejsza ilość DNA na żelu, tym mniejsza wydajność jego odzyskiwania. Dlatego metod tych nie poleca się, gdy ilość DNA jest mniejsza od 500 ng.
brak możliwości odzyskania jednocześnie kilku fragmentów o różnej długości.
W pracach genetyki molekularnej często zachodzi konieczność odzyskania z żelu elektroforetycznego określonych frakcji DNA lub RNA. Czynność ta, zwana elucją, wykorzystywana jest między innymi w następujących pracach:
DNA uzyskany w wyniku klonowania zazwyczaj poddawany jest subklonowaniu, tzn. insert lub jego fragment zostaje przeniesiony z jednego wektora do innego. Przeniesienie insertu do nowego wektora jest konieczne, gdyż wektory stosowane do klonowania DNA nie dają takich możliwości badawczych, jakie można uzyskać z wykorzystaniem innych wektorów, np. wektorów ekspresyjnych lub wektorów do transformacji organizmów eukariotycznych.
Subklonowanie konieczne jest również wówczas, gdy w wyniku klonowania uzyskano duży fragment DNA, np. Klon genomowy obejmujący kilka genów, a celem pracy jest sklonowanie pojedynczego genu lub jego fragmentu.
Elucja z żelu elektroforetycznego wykonywana jest również wtedy, gdy sklonowany fragment DNA, chcemy oddzielić od wektora a aby poddać go reakcji znakowania, np. radioaktywnym izotopem. W niektórych przypadkach DNA po znakowaniu, ponownie poddawany jest elektroforezie, tym razem w celu oddzielenia wyznakowanej cząsteczki od radioaktywnych nukleotydów, które nie zostały do niej wbudowane.
Fragmenty DNA mogą być izolowane zarówno z żeli agarozowych jak i poliakryloamidowych. Do elucji DNA z żeli agarozowych mogą być wykorzystywane agarozy o normalnej temperaturze topnienia lub agarozy niskotopliwe. Agarozy niskotopliwe, dzięki wstawieniu grup hydroksyetylowych w łańcuchu polisacharydowym agarozy, polimeryzują w temp. ok. +29°C i depolimeryzują w temp. +65°C, czyli poniżej temperatury topnienia DNA. Dzięki temu wycięty fragment agarozy, zawierający daną frakcję DNA, można stopić termicznie, a następnie oddzielić od niego DNA, np. na drodze ekstrakcji fenolowej. W celu oddzielenia DNA od roztopionej agarozy można również stosować zamrażanie w -80°C. Po rozmrożeniu preparatu, wytrącona agaroza zostaje odwirowana do osadu a uwolniony DNA pozostaje w supernatancie. Niektóre typy agaroz niskotopliwych, o wysokiej czystości, umożliwiają przeprowadzanie reakcji enzymatycznej bezpośrednio w roztopionym żelu. Wadą żeli wykonanych z niskotopliwej agarozy jest ich niższa rozdzielczość w porównaniu do rozdziałów elektroforetycznych przeprowadzonych w normalnych agarozach. Używane do elucji agarozy o normalnej temperaturze topnienia nie mogą zostać stopione termicznie gdyż temperatura, którą należałoby zastosować, czyli ponad +60°C, spowodowałaby denaturację DNA. Dlatego do stopienia wyciętego fragmentu agarozy wykorzystuje się niektóre związki chemiczne, np. NaJ. Po chemicznym rozpuszczeniu agarozy, do odzyskania DNA z roztworu często wykorzystuje się zdolność mikrokuleczek krzemowych do adsorpcji kwasów nukleinowych na swojej powierzchni. Kuleczki z przyłączonym DNA tworzą zawiesinę, którą może łatwo oddzielić od roztworu na drodze wirowania. Dodanie do uzyskanego osadu wody lub buforu TE powoduje oddysocjowanie DNA z kuleczek. Metoda ta, ze względu na krótki czas trwania i wysoką wydajność jest obecnie bardzo często wykorzystywana.
METODY ODZYSKIWANIA DNA Z ŻELI
Elucja przy zastosowaniu DEAE-celulozy (dietyloaminoetyl)
Nie wymaga topienia agarozy. Przeniesienie DNA na DEAE celulozę odbywa się w trakcie
rozdziału elektroforetycznego, podczas którego fragment bibułki DEAE celulozy należy umieścić w żelu na drodze migracji DNA. W metodzie tej wykorzystuje się właściwości jonowymienne DEAE celulozy. W warunkach elektroforetycznych, czyli przy stosunkowo niskim stężeniu soli i neutralnym pH, grupy funkcyjne DEAE-celulozy, obdarzone ładunkiem dodatnim (+), wiążą cząsteczki DNA. Przeniesienie DEAE celulozy do buforu o wysokim st. soli, np. NaCl, powoduje elucję DNA do roztworu. DNA można również eluować z agarozy stosując wirowanie w probówce z filtrem. Wycięty fragment agarozy po nałożeniu na filtr i odwirowaniu uwolni DNA, który wraz z buforem obecnym w żelu przedostanie się do probówki pod filtrem. Z membran nie eluuje się jednak jednoniciowe DNA (ssDNA) oraz fragmenty powyżej 15 kb. W przypadku elucji dużych fragmentów DNA, tzn. powyżej 5 tpz, gdy inne metody okazują się mało wydajne, zaleca się stosowanie elektroelucji w woreczkach dializacyjnych.
Elektroelucja w woreczkach dializacyjnych
W metodzie tej wycięty fragment żelu z frakcją DNA przenosi się do woreczka dializacyjnego a następnie całość umieszcza się w aparacie elektroforetycznym. Pod wpływem pola elektrycznego, DNA migruje z żelu i zatrzymuje się przy wewnętrznych ściankach woreczka. Po usunięciu agarozy, DNA łatwo może zostać wypłukany z woreczka do nowej probówki. Elektroelucja do woreczków dializacyjnych jest najmniej wygodną ze stosowanych technik, ale okazała się najefektywniejsza w izolowaniu dużych fragmentów DNA (powyżej 5 kb), mało wydajnie izolowanych innymi metodami.
3) Elucja DNA z żeli poliakrylamidowych
DNA z żeli poliakryloamidowych często eluowany jest po reakcji znakowania. W tym przypadku, przed przystąpieniem do elucji należy zidentyfikować pozycję DNA z wykorzystaniem autoradiografii. Następnie fragment żelu z DNA lub RNA zostaje wycięty, zmacerowany i zawieszony w buforze elucyjnym (1 mM EDTA, pH 8,0; 0,5 M octan amonu; 10mM octan magnezu; 0,1% SDS). Całość poddawana jest następnie kilkunastogodzinnej inkubacji, podczas której kwasy nukleinowe dyfundują z rozdrobnionego żelu do buforu. Po zakończeniu inkubacji zawiesinę żelu należy odwirować od buforu zawierającego uwolniony DNA. Na zakończenie, DNA z roztworu należy wytrącić etanolem.