IZOL.DNA Z ŻELI, Biotechnologia notatki, Genetyka - biologia molekularna


Znanych jest wiele metod odzyskiwania DNA z żeli, żadna z nich jednak nie jest pozbawiona wad. Do głównych problemów podczas izolowania DNA z żeli należą:

W pracach genetyki molekularnej często zachodzi konieczność odzyskania z żelu elektroforetycznego określonych frakcji DNA lub RNA. Czynność ta, zwana elucją, wykorzystywana jest między innymi w następujących pracach:

Fragmenty DNA mogą być izolowane zarówno z żeli agarozowych jak i poliakryloamidowych. Do elucji DNA z żeli agarozowych mogą być wykorzystywane agarozy o normalnej temperaturze topnienia lub agarozy niskotopliwe. Agarozy niskotopliwe, dzięki wstawieniu grup hydroksyetylowych w łańcuchu polisacharydowym agarozy, polimeryzują w temp. ok. +29°C i depolimeryzują w temp. +65°C, czyli poniżej temperatury topnienia DNA. Dzięki temu wycięty fragment agarozy, zawierający daną frakcję DNA, można stopić termicznie, a następnie oddzielić od niego DNA, np. na drodze ekstrakcji fenolowej. W celu oddzielenia DNA od roztopionej agarozy można również stosować zamrażanie w -80°C. Po rozmrożeniu preparatu, wytrącona agaroza zostaje odwirowana do osadu a uwolniony DNA pozostaje w supernatancie. Niektóre typy agaroz niskotopliwych, o wysokiej czystości, umożliwiają przeprowadzanie reakcji enzymatycznej bezpośrednio w roztopionym żelu. Wadą żeli wykonanych z niskotopliwej agarozy jest ich niższa rozdzielczość w porównaniu do rozdziałów elektroforetycznych przeprowadzonych w normalnych agarozach. Używane do elucji agarozy o normalnej temperaturze topnienia nie mogą zostać stopione termicznie gdyż temperatura, którą należałoby zastosować, czyli ponad +60°C, spowodowałaby denaturację DNA. Dlatego do stopienia wyciętego fragmentu agarozy wykorzystuje się niektóre związki chemiczne, np. NaJ. Po chemicznym rozpuszczeniu agarozy, do odzyskania DNA z roztworu często wykorzystuje się zdolność mikrokuleczek krzemowych do adsorpcji kwasów nukleinowych na swojej powierzchni. Kuleczki z przyłączonym DNA tworzą zawiesinę, którą może łatwo oddzielić od roztworu na drodze wirowania. Dodanie do uzyskanego osadu wody lub buforu TE powoduje oddysocjowanie DNA z kuleczek. Metoda ta, ze względu na krótki czas trwania i wysoką wydajność jest obecnie bardzo często wykorzystywana.

METODY ODZYSKIWANIA DNA Z ŻELI

  1. Elucja przy zastosowaniu DEAE-celulozy (dietyloaminoetyl)

Nie wymaga topienia agarozy. Przeniesienie DNA na DEAE celulozę odbywa się w trakcie

rozdziału elektroforetycznego, podczas którego fragment bibułki DEAE celulozy należy umieścić w żelu na drodze migracji DNA. W metodzie tej wykorzystuje się właściwości jonowymienne DEAE celulozy. W warunkach elektroforetycznych, czyli przy stosunkowo niskim stężeniu soli i neutralnym pH, grupy funkcyjne DEAE-celulozy, obdarzone ładunkiem dodatnim (+), wiążą cząsteczki DNA. Przeniesienie DEAE celulozy do buforu o wysokim st. soli, np. NaCl, powoduje elucję DNA do roztworu. DNA można również eluować z agarozy stosując wirowanie w probówce z filtrem. Wycięty fragment agarozy po nałożeniu na filtr i odwirowaniu uwolni DNA, który wraz z buforem obecnym w żelu przedostanie się do probówki pod filtrem. Z membran nie eluuje się jednak jednoniciowe DNA (ssDNA) oraz fragmenty powyżej 15 kb. W przypadku elucji dużych fragmentów DNA, tzn. powyżej 5 tpz, gdy inne metody okazują się mało wydajne, zaleca się stosowanie elektroelucji w woreczkach dializacyjnych.

  1. Elektroelucja w woreczkach dializacyjnych

W metodzie tej wycięty fragment żelu z frakcją DNA przenosi się do woreczka dializacyjnego a następnie całość umieszcza się w aparacie elektroforetycznym. Pod wpływem pola elektrycznego, DNA migruje z żelu i zatrzymuje się przy wewnętrznych ściankach woreczka. Po usunięciu agarozy, DNA łatwo może zostać wypłukany z woreczka do nowej probówki. Elektroelucja do woreczków dializacyjnych jest najmniej wygodną ze stosowanych technik, ale okazała się najefektywniejsza w izolowaniu dużych fragmentów DNA (powyżej 5 kb), mało wydajnie izolowanych innymi metodami.

3) Elucja DNA z żeli poliakrylamidowych

DNA z żeli poliakryloamidowych często eluowany jest po reakcji znakowania. W tym przypadku, przed przystąpieniem do elucji należy zidentyfikować pozycję DNA z wykorzystaniem autoradiografii. Następnie fragment żelu z DNA lub RNA zostaje wycięty, zmacerowany i zawieszony w buforze elucyjnym (1 mM EDTA, pH 8,0; 0,5 M octan amonu; 10mM octan magnezu; 0,1% SDS). Całość poddawana jest następnie kilkunastogodzinnej inkubacji, podczas której kwasy nukleinowe dyfundują z rozdrobnionego żelu do buforu. Po zakończeniu inkubacji zawiesinę żelu należy odwirować od buforu zawierającego uwolniony DNA. Na zakończenie, DNA z roztworu należy wytrącić etanolem.



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
wykład - Polimeraza DNA, Biotechnologia notatki, Genetyka - biologia molekularna
IZOLACJA DNA ROŚLINNEGO METODĄ MIKRO C, Biotechnologia notatki, Genetyka - biologia molekularna
IZOLACJA BIAŁEK Z HODOWLI Escherichia coli, Biotechnologia notatki, Genetyka - biologia molekularna
izolacja białek - stud, Biotechnologia notatki, Genetyka - biologia molekularna
BIOLOGIA MOLEKULARNA Lista 3, Biotechnologia PWR, Semestr 5, Biologia Molekularna - Seminarium, List
opracowanie skanow, Biotechnologia, Semestr III, Biologia molekularna
Egzamin (2), pwr biotechnologia(I stopień), V semestr, Biologia molekularna, Egzamin
biolo molo 2, Biotechnologia, Semestr III, Biologia molekularna
Co to jest telomeraza i do czego sluzy1, Biotechnologia, Semestr III, Biologia molekularna
PYTANIA BIOLOGIA MOLEKULARNA egz[1].aga, Biotechnologia PWR, Semestr 5, Biologia Molekularna - Wykła
Pytania - 2007, Biotechnologia PWR, Semestr 5, Biologia Molekularna - Wykład, egzamin - stare pytani
Biologia molekularna - egzaminy, Biotechnologia PWR, Semestr 5, Biologia Molekularna - Wykład, egzam
Notateczki, Biotechnologia PWR, Semestr 5, Biologia Molekularna - Wykład, egzamin - stare pytania, P

więcej podobnych podstron