IZOLACJA BIAŁEK REKOMBINOWANYCH

1). Wybór gospodarza do nadprodukcji białek

Do otrzymywania rekombinowanych białek najczęściej stosowane są systemy bakteryjne, w szczególności oparte na hodowli Escherichia coli. Najczęściej stosuje się szczepy K12 lub B (np. BL21) oraz pochodzące od nich mutanty. Zalety E.coli to:

• Zdolność do szybkiego wzrostu na tanich podłożach

• Wysoki stopień scharakteryzowania genomu

• Dostępność wielu wektorów i szczepów

• Brak patogenności

Wady E.coli to:

• Brak niektórych mechanizmów modyfikacji posttranslacyjnych syntezowanych białek

• Nadprodukcja niektórych białek w E.coli prowadzi do ich akumulacji w postaci nierozpuszczalnych ciał inkluzyjnych

• Brak efektywnych mechanizmów sekrecji białek do podłoża

• Białka o dużej masie cząsteczkowej mogą być nieprawidłowo fałdowane

• Preparaty izolowane z E.coli mające zastosowanie terapeutyczne trzeba oczyszczać z lipopolisacharydu (LPS-u)

Alternatywą dla E.coli są gramdodatnie szczepy z rodzaju Bacillus, które nie wytwarzają błony zewnętrznej i zdolne są do wydzielania dużych ilości białek do podłoża, co znacznie ułatwia ich oczyszczanie. Inne stosowane do nadprodukcji białek bakterie to: Lactobacillus lactis, Corynebacterium glutamicum, bakterie z rodzaju Streptomyces. W sytuacji gdy niezbędne jest wprowadzenie pewnych modyfikacji posttranslacyjnych do produkowanego białka stosuje się systemy inne niż bakteryjne. Mogą to być grzyby: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Aspergillus niger lub Trichoderma reesei. Zalety systemów grzybowych to:

• Zdolnośc do szybkiego wzrostu i niski koszt hodowli,

• Zdolność do wprowadzania modyfikacji posttranslacyjnych,

• Stosunkowo łatwe wydzielanie białek do podłoża.

Do nadprodukcji białek wykorzystuje się także komórki owadzie (system bakulowirusowy), linie komórkowe ssaków oraz rośliny. Te ostatnie znalazły zastosowanie przy wytwarzaniu biofarmaceutyków na dużą skalę. Do zalet systemów roślinnych należy zaliczyć:

• Niski koszt hodowli w porównaniu produkcją białek w innych systemach na dużą skalę,

• Możliwość skierowania białka do odpowiednich przedziałów wewnątrzkomórkowych,

• Etap oczyszczania białka może zostać pominięty, jeśli rekombinowane białka będą podawane doustnie.

Wady to:

• Niski poziom produkcyjny w porównaniu z systemami bakteryjnymi czy grzybowymi (około 14 % całej puli białek rozpuszczalnych)

• Długi czas potrzebny do uzyskania linii roślin transgenicznych wykazujących stałą ekspresję pożądanego genu,

• Mała wiedza dotycząca procesu oczyszczania białek z roślin.

Tabela 1. Porównanie systemów ekspresyjnych stosowanych do uzyskiwania białek rekombinowanych

Porównywana cecha	Escherichia coli	Drożdże	Komórki owadzie	Komórki ssacze
Czas generacji	20 minut	2 godz.	24 godz.	24-48 godz.
Wymagania	Proste pożywki	Proste pożywki	Złożone pożywki	Złożone pożywki
Modyfikacje potranslacyjne	brak	obecne	obecne	obecne
Poziom nadprodukcji białka	do 80%	do 80%	do 50%	niski
Utrudnienia	Redukujące środowisko w cytoplazmie	Trudna do dezintegracji ściana komórkowa	Ekspresja ograniczona do późnych etapów infekcji

2). Kluczowe etapy produkcji białek w bakteriach:

• EKSPRESJA - w uzyskaniu odpowiedniego poziomu ekspresji białka istotne są:

• Odpowiedni wektor lub integracja do chromosomu

• Szczep gospodarza

• Warunki hodowli - wpływają na ilość wytworzonej biomasy, efektywność indukcji transkrypcji, wydajność translacji, zwijanie białka i jego stabilność.

Strategie klonowania

Tabela 2. Porównanie strategii klonowania.

Strategia	Metoda REaL	Rekombinacja specyficzna do miejsca
Charakterystyka	Gen lub jego fragment jest najpierw klonowany do standardowego wektora nieekspresyjnego, a następnie sekwencjonowany. Po sprawdzeniu sekwencji nukleotydowej gen może być przeklonowany do wybranego wektora ekspresyjnego. Większość konstruktów do nadekspresji jest tworzona za pomocą enzymów restrykcyjnych i ligazy.	Stosowane w tej metodzie enzymy przeprowadzają cięcie i ligację fragmentu DNA podczas jednego etapu. Wysoka specyficzność reakcji jest spowodowana tym, że miejsca zajścia rekombinacji są dużo dłuższe niż miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne. Komercyjnie dostępne metody są oparte na systemach fagowych.
Zalety	- Jeśli produkt klonowanego genu jest toksyczny dla komórki, jego wklonowanie prosto do wektora ekspresyjnego może okazać się trudne lub nawet niemożliwe. Wektory ekspresyjne są często niskokopijne, co utrudnia klonowanie i sekwencjonowanie badanego genu. - Jest to najmniej kosztowna metoda	- Szybka i wydajna
Wady	- Pracochłonna	- Wysokie koszty

Jak wybrać odpowiedni wektor?

1. Promotor

• Promotor do konstrukcji wektora ekspresyjnego powinien być silny (daje to możliwość produkcji białka rekombinowanego na poziomie 10-30% wszystkich białek w komórce),

• Powinien być indukowany za pomocą prostych i tanich substratów (aby jego ekspresja podstawowa była jak najmniejsza i nie obciążała metabolizmu komórki),

• Musi ulegać skutecznej represji (w innym przypadku może powodować niestabilność plazmidu, obniżenie tempa wzrostu i mutacje)

Tabela 3. Porównanie promotorów

	Promotor lacZp	Promotor bakteriofaga T7	Promotor PBAD
Charakterystyka	Silniejszy wariant lacZp stanowi lacUV5p (skuteczniej kontroluje ekspresję podstawową). Promotory tacp i trcp to dwa sysntetyczne warianty promotora lacZp. Jest to słaby promotor.	Promotor faga T7 nie jest rozpoznawany przez bakteryjną polimerazę RNA. Transkrypcja rozpoczyna się w momencie pojawienia się w komórce polimerazy RNA faga T7.Gospodarz bakteryjny posiada wprowadzony do chromosomu gen kodujący polimerazę RNA faga T7 pod kontrolą promotora lacUV5, rozpoznawanego przez bakteryjną polimerazę RNA. Transkrypcja z promotora lacUV5 jest indukowana przez IPTG. Zastosowanie tego promotora pozwala na zmniejszenie ilości białek komórkowych poprzez zahamowanie polimerazy RNA bakteryjnej dzięki dodaniu wraz z induktorem rifampicyny (polimeraza RNA fagowa nie jest na nią wrażliwa).	Zaletami systemu z tym promotorem jest niski koszt indukcji, wysoki poziom ekspresji genu, skuteczna regulacja i możliwość stopniowania poziomu ekspresji. Wydajność jest jednak niższa w porównaniu z systemem opartym na promotorze fagowym.
Indukcja	Allolaktoza lub IPTG	IPTG lub autoindukcja	Arabinoza
Represja	Za pomocą LacI. Przy braku lub niskich stężeniach induktora represor wiąże się do sekwencji nukleotydowej operatoratora zachodzącej na promotor i hamuje transkrypcję.	Pomiędzy promotorem, a genem kodującym polimerazę RNA T7 znajduje się sekwencja operatorowa, wiążąca białko represorowe blokujące inicjację transkrypcji. Dopiero po związaniu represora z IPTG, co prowadzi do utraty powinowactwa białka do miejsca operatorowego, może rozpocząć się transkrypcja genu polimerazy fagowej.	Za pomocą aktywatora/represora AraC.
Zastoso-wanie	Do produkcji białek błonowych lub toksycznych dla komórki	Do produkcji białek rekombinowanych, w tym także toksycznych dla komórki.	Do produkcji białek rekombinowanych.

2. Znaczniki

Znacznikiem może być krótki peptyd, domena lub całe białko. Przyłączenie ich do produkowanego białka może ułatwić detekcję, oczyszczanie lub zwiększyć rozpuszczalność białka. Znaczniki można przyłączać do końca N- lub C- białka. Cechy znacznika:

• wysokie powinowactwo do złoża na którym będzie oczyszczane białko,

• możliwość elucji substancjami niskocząsteczkowymi,

• niewielki wpływ na aktywność i strukturę trzeciorzędową białka,

• musi być prosty do wykrycia,

• musi być łatwy do usunięcia.

W celu zwiększenia rozpuszczalności białka dodaje się znaczniki: MBP (białko wiążące maltozę) lub NusA. Aby ułatwić oczyszczanie białka na złożu przyłącza się m.in. znacznik polihistydynowy - His-Tag lub GST-Tag. Przyłączenie do białka znacznika nadającego sygnał wizualny tzw. rainbow tags umożliwia śledzenie losów białka podczas oczyszczania. Tego typu znaczniki muszą być stosowane razem z innymi znacznikami ułatwiającymi oczyszczanie białka.

Znaczniki można usuwać z końca N za pomocą mniej specyficznych proteaz np. czynnika Xa lub enterokinazy. Bardziej specyficzne proteazy zostawiają zwykle 1-2 aminokwasy. Zastosowanie białka SUMO razem ze znacznikiem polihistydynowym umożliwia precyzyjne odcięcie znacznika za pomocą proteazy SUMO. Dodatkowo taki kombinowany znacznik zwiększa rozpuszczalność białka rekombinowanego i ułatwia jego oczyszczanie.

3. Markery selekcyjne

Markerami selekcyjnymi są najczęściej geny kodujące oporność na antybiotyki: ampicylinę, chloramfenikol, kanamycynę i tetracyklinę. Ampicylina jest najmniej praktycznym antybiotykiem: łatwo ulega hydrolizie w kwaśnym środowisku, pH hodowli obniża się z czasem wzrostu hodowli. W przypadku, gdy produkowane białko jest dla komórki gospodarza toksyczne, a wektor niesie gen oporności na ampicylinę plazmid może nie utrzymywać się w populacji. Rozwiązaniem jest wtedy zastosowanie karbenicyliny.

4. Stabilność mRNA

Czas półtrwania mRNA w komórce E.coli jest czynnikiem silnie wpływającym na poziom ekspresji genów. Średni czas półtrwania w temperaturze 37°C wynosi od kilku sekund do 20 minut. Wydajne wiązanie rybosomów zwiększa stabilność mRNA, a zmniejsza występowanie struktur drugorzędowych i końca poli-A. W komórkach E. coli za poliadenylację odpowiadają dwie poliadenylujace polimerazy RNA: PAPI

i PAPII, a za degradację, przede wszystkim dwie egzonukleazy: RNaza II i PNPaza i endorybonukleaza RNaza E. Poliadenylacja ułatwia degradację mRNA z udziałem RNazy II i PNPazy. Koniec 5' mRNA nie powinien zawierać sekwencji tworzących struktury spinki do włosów, co może utrudnić wiązanie rybosomy i przyspieszyć jego degradację.

Pomocne w nadekspresji białek mogą być rybonukleazy np. endorybonukleaza MazF tnie mRNA a miejscu ACA. Po indukcji ekspresji genu mazF prawie cały mRNA komórkowy ulega fragmentacji. Gdy sekwencja nukleotydowa genu kodującego rekombinowane białko zostanie odpowiednio zmieniona i motywy ACA zostaną z niej usunięte syntezowane jest prawie wyłącznie rekombinowane białko. Nadekspresja jest prowadzona w niskiej temperaturze (15°C); wzrost bakterii zostaje w tych warunkach zahamowany, natomiast pozostają one aktywne metabolicznie.

5. Reguła N-końca

Na stabilność rekombinowanych białek znaczny wpływ ma reszta aminokwasowa występująca bezpośrednio po metioninie (w komórkach E. coli — fMet). Od niej zależy wydajność usuwania formylometioniny. W komórkach E. coli, takie cięcie jest katalizowane przez aminopeptydazę metioninową. Jeżeli zaraz po f-Met występuje reszta His, Gln, Glu, Phe, Met, Lys, Tyr, Trp lub Arg, cięcie następuje z wydajnością rzędu 16%. W pozostałych przypadkach formylometionina jest odcinana z wydajnością 97%. Jeżeli po odcięciu f-Met pierwszą resztą jest: Arg, Lys, Phe, Leu, Trp albo Tyr, okres półtrwania białka w komórce E. coli wynosi zaledwie 2 minuty, podczas gdy w pozostałych przypadkach dochodzi do 10 godzin. Najgorsza sytuacja ma miejsce kiedy za metioniną występuje reszta leucyny, wtedy istnieje wysokie prawdopodobieństwo odcięcia formylometioniny (powyżej), a powstały polipeptyd posiadający na aminowym końcu leucynę, ulega szybkiej proteolizie. By uniknąć takiej sytuacji, należy wziąć pod uwagę możliwość zmiany sekwencji aminokwasowej końca N lub umieszczenie dodatkowej domeny przed Met-Leu.

• PRAWIDŁOWE ZWIJANIE I LOKALIZACJA KOMÓRKOWA:

Białka nadprodukowane w E.coli mogą być kierowane do cytoplazmy, peryplazmy, wbudowywane w błonę komórkową lub wydzielane do podłoża.

Tabela 4. Porównanie miejsc do których kierowane mogą być białka rekombinowane

Lokalizacja	Cytoplazma	Peryplazma	Podłoże
Wady lokalizacji	Jest środowiskiem redukującym, gdzie nie dochodzi do powstawania mostków dwusiarczkowych. Nie są tutaj także właściwie zwijane białka, które w natywnej konformacji zawierają liczne, niesparowane reszty cysteiny. Często dochodzi do agregacji białek (ciał inkluzyjnych)	Niektóre białka tworzą także w peryplazmie ciałka inkluzyjne (przydatna jest w tym przypadku koekspresja izomeraz disulfidowych). Systemy transportu do peryplazmy czasami nie są wydajne i dochodzi do „zapychania błon”	Laboratoryjne szczepy E.coli nie mają efektywnych mechanizmów transportu przez błonę zewnętrzną
Zalety lokalizacji	Wysoka wydajność ekspresji białka Powstawanie ciałek inkluzyjnych może być także zaletą gdy białko rekombinowane jest toksyczne dla komórki. W agregatach białko chronione jest także przed proteolizą. Prawdopodobieństwo powstawania ciał inkluzyjnych zmniejsza dołączenie do białka hydrofilowego znacznika, ko ekspresja białek opiekuńczych lub zmiana warunków hodowli.	Niższy stopień zanieczyszczenia innymi białkami Mniejsze ryzyko degradacji proteolitycznej Możliwe jest wprowadzenie mostków dwusiarczkowych	Niewielki stopień zanieczyszczenia innymi białkami
Kierowanie białek
				Aby skierować białko do przestrzeni pery- plazmatycznej na końcu N dołącza się peptyd sygnałowy rozpoznawany przez translokazę Sec lub Tat. Podczas translokacji jest on odcinany przez proteazę związaną z wewnętrzną błoną, której centrum aktywne znajduje się po stronie periplazmatycznej. Najczęściej stosowane peptydy sygnałowe pochodzą z genów ompT, ompA, pelB (pET22b), phoA, malE, lamB i z β-laktamazy.	Aby uzyskać rekombinowane białko w podłożu należy stymulować pasywny transport przez błonę zewnętrzną poprzez destabilizację elementów strukturalnych osłon lub wprowadzając do szczepów laboratoryjnych genów kodujących aparaty sekrecyjne pochodzących z szczepów patogennych. Można także zastosować tzw. formy L (szczepy pozbawione mureiny i błony zewnętrznej)

• DALSZA OBRÓBKA:

• Oczyszczanie białka

• Usuwanie domeny fuzyjnej

• Zwijanie białka in vivo

Oczyszczanie białek rekombinowanych

1. DEZINTEGRACJA KOMÓREK

Aby wyizolować białka otrzymane np. w systemach nadekspresji w komórkach drobnoustrojów potrzebne są odpowiednie metody, które pozwalają na uwolnienie danego białka z komórki z dużą wydajnością przy jednoczesnym zachowaniu jego własności (aktywności enzymatycznej, struktury itp.).. Szczególnie pleśnie i drożdże ale również komórki roślinne posiadają oporną na lizę ścianę komórkową, która utrudnia izolacje białek i innych składników komórkowych.

Typowa procedura izolacji białek z komórki składa sie z następujących etapów:

• przemycia masy komórkowej (z pozostałości pożywki lub innych komórek w przypadku tkanek np. krwi),

• liza komórek (w celu uwolnienia frakcji cytozolowej komórek)

• oddzielenie frakcji komórkowych od siebie (rozdział frakcji błon komórkowych, rozpuszczalnych białek i frakcji nierozpuszczalnej). Do rozdziału tych frakcji używa się metod sedymentacyjnych w wirówkach. Ekstrakt komórkowy otrzymany po lizie komórek nazywamy homogenatem. Po oddzieleniu np. składników nierozpuszczalnych przez wirowanie (zwykle od 10 min. przy 15.000 g do 1 godziny przy 100.000 g) otrzymuje sie nadsącz (surowy ekstrakt) i osad zawierający frakcje błon komórkowych. Nadsącz może być dalej oczyszczany i zawarte w nim białka rozdzielane np. na kolumnach chromatograficznych w zależności od specyficznych własności interesującego nas białka (ciężar cząsteczkowy, punkt izoelektryczny, wiązanie sie z innymi substancjami itp.) Najważniejszym z punktu widzenia wydajności procesu izolacji białek jest etap dezintegracji komórek. Metody dezintegracji komórek zestawiono w tabeli 5.

Tabela 5. Metody dezintegracji komórek.

Metoda	Zasada działania	Rodzaj komórek (tkanek)	Ograniczenia
Homogeniza-cja	Używa sie róźnych typów homogenizatorów: Potter-Elvehjema (tkanki watroby, serca, mózgu, mieśni gładkich), Dounce'a (tkanka mózgu, komórki z hodowli tkankowych), homogenizatora-miksera. W czasie homogenizacji utrzymuje się obnioną temperaturę (0-4^oC) i dodatek inhibitorów proteaz komórkowych. Postęp procesu mona monitorować przez obserwacje mikroskopowe lub przez pomiar uwolnionego białka komórkowego w nadsączu	Tkanki zwierzęce
Sonifikacja	W metodzie tej wykorzystuje sie wibracje tzw. fale kawitacji wywoływane w roztworze przez ultradźwięki, które mechanicznie uszkadzają ścianę komórkowa Wielkość wibracji musi być utrzymywana na takim poziomie aby nie powodować tworzenia sie piany ponieważ wywołuje to natlenienie roztworu co z kolei moe prowadzić do denaturacji białek.W czasie sonifikacji konieczne jest równie chłodzenie zawiesiny komórek.	Dodezintegracji bakterii np. Escherichia. coli, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae i komórek zwierzecych np. mózgu.	Ilość komórek nie może przekroczyć 1g na cykl.
Prasa French'a (French Pressure Cell)	Metoda polega na poddaniu zawiesiny komórek wysokiemu ciśnieniu i gwałtownym uwolnieniu do ciśnienia atmosferycznego w specjalnym typie prasy. Zmiana ciśnienia powoduje rozpad komórek.	Komórki bakteryjne i drożdżowe	Metoda pozwala na dezintegracje z wysoką wydajnością zawiesin komórek o objętości ok. 10-30 ml ale staje sie technicznie trudna dla mniejszych objętości i zbyt czasochłonna dla objętości większych.
Wytrząsanie z kulkami szklanymi.	Mechaniczne uszkadzanie ściany komórkowej powodują małe kulki szklane wytrząsane w zawiesinie komórek.	Komórki drożdży i bakterii	W małej skali (ok. 1 g masy komórek) prowadzi sie ja w naczyniach laboratoryjnych np. probówkach, przy dużych objętościach zawiesiny komórek wymaga użycia specjalnej aparatury
Trawienie enzymatyczne.	Polega na degradacji składników ściany komórkowej i otrzymaniu komórek pozbawionych ściany komórkowej tzw. protoplastów, które łatwo poddać lizie przez np. szok osmotyczny. W przypadku bakterii używa się lizozymu trawiącego bakteryjne peptydoglikany, u drożdży używana jest zymoliaza (glukanaza), enzym trawiący glukan będący głównym składnikiem ściany komórkowej drożdży	Drożdże i bakterie
Liza detergentami	Jest bardzo zachowawcza jesli chodzi o własności izolowanych białek jeśli tylko stężenie detergentu potrzebnego do lizy komórek jest niewysokie. Najcześciej używane detergenty to: Triton X-100, NP-40, dodecylan sodowy, siarczan sarkozylu, deoksycholan sodowy i inne.	Hodowle tkankowe
Szok osmotyczny	Komórki są wrażliwe na szok osmotyczny gdy przetrzymywane są w roztworach hypotonicznych (o ciśnieniu osmotycznym mniejszym niż w cytoplazmie).	Komórki pozbawione ściany komórkowej np. protoplasty bakterii i drożdży, erytrocyty
Zamrażanie/rozmrażanie	Wzrost objętości zamarzającej w cytoplazmie wody oraz powstające kryształy lodu powodują uszkadzanie ściany i błony komórkowej oraz organelli komórkowych. Metodę stosuje sie podczas izolacji odpornych na denaturacje białek ponieważ zamarzanie powoduje częściową utratę wody hydratacyjnej białek co prowadzi do zmian ich własności (denaturacja).	Komórki eukariotyczne i prokariotyczne	Ograniczeniem jest równie konieczność ochrony białek przed działaniem uwolnionych, głównie z lizosomów, enzymów proteolitycznych.

2. OTRZYMYWANIE LIZATU BAKTERYJNEGO. PROBLEM ROZPUSZCZALNOŚCI BIAŁKA

Lizaty bakteryjne otrzymuje się zawieszając komórki bakteryjne w buforze lizującym. Zawiesinę następnie worteksuje się z proszkiem szklanym lub poddaje sonifikacji. Inna stosowana łagodna (natywna) metoda otrzymywania białek z komórek bakteryjnych wykorzystuje trawienie otoczki bakteryjnej lizozymem i dalej lizę komórek przy pomocy szoku osmotycznego (w buforze hipotonicznym).

Teoretycznie, wysokowydajne systemy bakteryjne pozwalają uzyskać ekspresję rekombinowanego białka na poziomie nawet 50% wszystkich białek komórkowych. W praktyce jednak, poziom syntezy zależy od cech biologicznych i fizykochemicznych białka, np. niektóre białka mogą być toksyczne dla bakterii, hamując wzrost hodowli. W przypadku ekspresji w systemach heterologicznych problemem może być także różna częstość wykorzystywania poszczególnych kodonów w komórkach różnych organizmów.

Osobnym problemem jest rozpuszczalność białka. W wielu przypadkach produkowane białko ulega akumulacji w formie nierozpuszczalnej, w postaci agregatów nazywanych ciałami inkluzyjnymi. Takie "wytrącone" białko, po otwarciu bakterii w łagodnych (natywnych) warunkach pozostanie we frakcji nierozpuszczalnej. Zarówno poziom ekspresji jak i rozpuszczalność produkowanego białka można modyfikować zmieniając wektor, szczep bakteryjny lub warunki hodowli. Wektor może zwiększać rozpuszczalność białka przez umożliwienie dołączenia polipeptydu, który jest sam łatwo rozpuszczalny lub sekwencji kierującej białko do przestrzeni peryplazmatycznej, gdzie panują bardziej sprzyjające warunki do fałdowania białek. Rozpuszczalność białek można także czasami zwiększyć stosując szczepy bakteryjne pozbawione aktywności reduktazy tioredoksynowej i/lub reduktazy glutationowej (posiadające mutacje w genach, odpowiednio, trxB i/lub gor), co ułatwia powstawanie w ich cytoplazmie wiązań dwusiarczkowych w produkowanych białkach, które wymagają takich wiązań do prawidłowego fałdowania. Nawet jeśli są formowane ciała inkluzyjne, to zwykle część białka pozostaje w formie rozpuszczalnej. Dobierając odpowiednio warunki hodowli można próbować zmieniać proporcje frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej białka. Ogólna zasada jest taka, że wraz ze spadkiem szybkości syntezy rekombinowanego białka zwiększa się udział jego formy rozpuszczalnej w ogólnej puli.

Szybkość syntezy można zmniejszyć poprzez:

• obniżenie stężenia IPTG,

• obniżenie temperatury hodowli i/lub

• hodowlę na podłożu minimalnym w przeciwieństwie do standardowo używanego podłoża pełnego.

Zwiększenie napowietrzania hodowli bakteryjnej w czasie indukcji ekspresji może także zapobiegać tworzeniu ciał inkluzyjnych. W celu zoptymalizowania poziomu ekspresji i rozpuszczalności białka można także zmieniać czas indukcji oraz fazę hodowli bakteryjnej, w której dodawany jest induktor ekspresji. W sytuacji kiedy produkowane białko, po otwarciu komórek w warunkach natywnych, nadal pozostaje we frakcji nierozpuszczalnej, to można zastosować procedurę jego izolacji w warunkach denaturujących. Najczęściej stosuje się w tym celu roztwory do lizy, zawierające 2 - 8 M mocznik lub 3 - 6 M chlorowodorek guanidyny. Jednak, z założenia, przy zastosowaniu czynników denaturujących, otrzymuje się białko pozbawione swej natywnej struktury przestrzennej. Aby przywrócić aktywność biologiczną można próbować renaturować białko in vitro, ale wydajność renaturacji zależy od indywidualnych cech białka i może być bardzo niska. Z tego powodu ekstrakcję w warunkach denaturujących stosuje się zwykle do pozyskiwania białek do takich celów, które nie wymagają zachowania struktury przestrzennej, np. przy izolacji antygenów używanych następnie do otrzymania przeciwciał, zaś unika się jej w przypadku, np. białek enzymatycznych. Z drugiej strony, formowanie ciał inkluzyjnych może nawet ułatwiać izolację, ponieważ zagregowane białko:

• występuje w wysokim stężeniu i łatwo można je oczyścić,

• jest chronione przed ewentualną proteolizą oraz

• występując w formie nieaktywnej, nawet jeśli jest potencjalnie toksyczne, nie hamuje wzrostu bakterii.

Obecność białka we frakcji nierozpuszczalnej nie zawsze oznacza, że tworzone są ciała inkluzyjne. Hydrofobowe białka mogą wiązać się silnie z błonami bakteryjnymi, a białka obdarzone silnym ładunkiem elektrycznym - z kwasami nukleinowymi. Zwiększenie rozpuszczalności można wówczas osiągnąć przez dodanie do buforu lizującego detergentów niejonowych, np. Triton X-100 (w pierwszym przypadku) lub przez trawienie kwasów nukleinowych nukleazami, np. DNazą I i RNazą A (w drugim przypadku).

3. OCZYSZCZANIE BIAŁEK

Na typową procedurę oczyszczania zwykle składają się 3 lub 4 etapy: ekstrakcja i oczyszczanie właściwe (ang. capture) oraz doczyszczanie (ang. polishing), czasem wymagany jest etap pośredniego oczyszczania (ang.intermediate purification). Metody rozdziału białek można podzielić na:

1. Mniej specyficzne: wirowanie, precypitacja, ekstrakcja, filtracja, mikrofiltracja membranowa, ultrafiltracja.

2. Specyficzne: chromatografia powinowactwa, chromatografia jonowymienna, sączenie molekularne, chromatografia oddziaływań hydrofobowych oraz chromatografia w odwróconym układzie faz. W tabeli 6 porównano techniki chromatograficzne, które znajdują zastosowanie w oczyszczaniu białek.

Typowy rozdział chromatograficzny obejmuje następujące etapy:

• zrównoważenie kolumny odpowiednim buforem o określonych pH oraz sile jonowej,

• wprowadzenie do kolumny rozdzielanej mieszaniny związków,

• oddziaływanie (np. adsorpcja) rozdzielanych cząsteczek białka z odpowiednim złożem chromatograficznym,

• wymywanie niezwiązanych ze złożem składników (w przypadku chromatografii adsorpcyjnej),

• elucja związanych ze złożem chromatograficznym cząsteczek z użyciem odpowiedniego buforu (zwykle o składzie innym niż bufor wykorzystany do równoważenia kolumny),

• wymycie wszystkich substancji z kolumny, regeneracja złoża i ponowne zrównoważenie kolumny.

Przystępując do oczyszczania białka, należy pamiętać o kilku istotnych rzeczach.

• W trakcie preparatyki istotne jest zachowanie właściwości izolowanej makrocząsteczki. By nie doprowadzać do utraty aktywności biologicznej białka, zwykle pracuje się w obniżonej temperaturze, co wiąże się z ograniczeniem rozwoju mikroorganizmów i ze spowolnieniem procesów degradacji izolowanych makrocząsteczek w wyniku działania enzymów litycznych (np. proteaz). Procesy izolacji i oczyszczania należy prowadzić w odpowiednim zakresie pH (zwykle 5-9), w którym wybrane białko wykazuje wysoką aktywność, ale z drugiej strony również odpowiednią stabilność.

• Ważne są także siła jonowa roztworu (zwykle 0,05-0,1 M) i rodzaj soli użytych do sporządzania

buforów.

• Aby zahamować działalność enzymów litycznych, w trakcie preparatyki stosuje się inhibitory, takie

jak np. PMSF czy chlorowodorek benzamidyny.

• Niektóre białka, ze względu na wyeksponowane na zewnątrz wolne grupy tiolowe, które mogą ulec utlenieniu w trakcie oczyszczania, wymagają obecności w roztworze czynników redukujących, takich jak ditiotreitol czy ß-merkaptoetanol.

• Pewne białka do zachowania swoich właściwości biologicznych potrzebują jonów metali, np. Ca²⁺ czy Mg²⁺; czasem jednak ich obecność prowadzi do niekorzystnych procesów, i wtedy do roztworu dodaje się związki kompleksujące (np. EDTA).

• W trakcie pracy z białkami należy również unikać denaturacji powierzchniowej (pienienia roztworu).

4. ELEKTROFOREZA

Stopień oczyszczenia i ewentualna degradacja białka są kontrolowane poprzez analizę próbek z poszczególnych etapów izolacji, poddanych elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis - SDS-PAGE) według modyfikacji Laemmli'ego.

Elektroforeza to ruch cząstek obdarzonych ładunkiem (jonów) w roztworze (tutaj wodnym) pod wpływem przyłożonego prądu, w tym przypadku, stałego. Białka w roztworze wodnym, w pH różnym od ich punktu izoelektrycznego (pI), są cząsteczkami wykazującymi ładunek wypadkowy różny od zera, czyli są jonami o przewadze któregoś z ładunków (w pH powyżej pI są anionami, w pH poniżej pI są kationami). Na kierunek migracji ma wpływ znak jonu, zaś na tempo migracji, wielkość ładunku oraz wielkość i kształt cząstki.

Do rozdziału białek najczęściej stosuje się żel poliakryloamidowy otrzymywany w reakcji polimeryzacji monomerów akryloamidu i N,N'-metylenobisakryloamidu. Katalizatorem w tej reakcji jest N,N,N',N'- tetrametyloetylenodiamina (TEMED), inicjatorem nadsiarczan amonu - (NH4)2S2O8, który ulega rozbiciu na dwa stabilne wolne rodniki, atakujące podwójne wiązanie w cząsteczce akryloamidu; reakcja jest hamowana tlenem z powietrza, którego dostęp do polimeryzującego żelu, odcina się warstwą wody. Żel przygotowuje się między dwiema szybkami szklanymi i standardowo składa się on z dwóch części, przygotowanych kolejno po sobie. Wpierw przeprowadza się polimeryzację głównej części - żelu "rozdzielającego", o stężeniu 8 - 20% (do rozdziału większych białek stosuje się niskoprocentowe żele, do rozdziału mniejszych białek, wysokoprocentowe żele; stężenie procentowe liczone jest w stosunku do monomeru akryloamidu). Po jego polimeryzacji, nad nim przeprowadza się polimeryzację mniejszej części - żelu "zagęszczającego", o stężeniu 4%, w którym znajdować się będą kieszonki na próbki. W przeciwieństwie do typowej elektroforezy DNA i niektórych typów elektroforezy białek, w których stosuje się bufor o tym samym składzie przy elektrodach i w żelu (tzw. ciągły system), w elektroforezie białek według modyfikacji Laemmli'ego, stosowany jest tzw. nieciągły system, polegający na użyciu buforów różniących się rodzajem jonów, siłą jonową i pH . Celem użycia nieciągłego systemu jest zwiększenie pojemności żelu (objętości próbki rozcieńczonego białka, którą można nanieść do kieszonki) i jego rozdzielczości, w stosunku do żelu w ciągłym systemie.

Białka, które mają być poddane rozdziałowi elektroforetycznemu, przed naniesieniem na żel są ogrzewane przez 3 - 5 minut w 100°C, w obecności czynnika redukującego - β-merkaptoetanolu lub ditiotreitolu (DTT) (obydwa w stężeniu 0.1 mM) oraz SDS (2%). W takich warunkach białka na ogół ulegają całkowitej denaturacji - zredukowane zostają międzyłańcuchowe i wewnątrzłańcuchowe wiązania dwusiarczkowe, a uwolnione łańcuchy ulegają kompletnemu rozwinięciu. SDS będący mocnym anionowym detergentem, dysocjuje w wodzie na kation sodowy i amfipatyczny anion dodecylosiarczanowy, który swoją alifatyczną, hydrofobową częścią łączy się z łańcuchami polipeptydowymi, w proporcji 1 anion dodecylosiarczanowy na dwie reszty aminokwasowe (1.4 g SDS na 1 g białka), nadając wszystkim białkom mocny ładunek ujemny (swoją częścią siarczanową), niezależnie od ich własnego pierwotnego ładunku wypadkowego. W tej postaci wszystkie białka mają ten sam kształt (są liniowymi cząsteczkami) i migrują do dodatniej anody, przy czym białka najmniejsze migrują najszybciej, zaś białka największe najwolniej (tylko wielkość białka ma znaczenie - różnice w kształcie i ładunku białek zostały zniwelowane). SDS obecny we wszystkich buforach ma za zadanie utrzymać białka podczas całej elektroforezy w stanie zdenaturowanym, jako aniony. Oprócz wymienionych składników, bufor do nanoszenia próbek, zawiera jeszcze 10% glicerol, służący do obciążenia próbki tak, aby opadła na dno kieszonki przy nanoszeniu na żel oraz barwnik - błękit bromofenolowy (0.01%), będącym małym anionem, migrującym szybciej niż najmniejsze białka i umożliwiającym śledzenie postępów elektroforezy (dopóki barwnik jest w żelu, wszystkie białka znajdują się w żelu między barwnikiem a kieszonką, do której zostały one naniesione przed rozpoczęciem elektroforezy).

Oczywiście, denaturacja białek enzymatycznych oznacza utratę ich aktywności (w większości przypadków nieodwracalną, choć zdarzają się wyjątki, np. RNaza może po renaturacji odzyskać swoją aktywność). Natomiast, denaturacja białek nie zawsze oznacza, że przestają być one rozpoznawane przez przeciwciała. Jeśli przeciwciała rozpoznają epitop liniowy, będący ciągłą sekwencją kilku lub kilkunastu reszt aminokwasowych, to w zdenaturowanym białku, jest on obecny, w przeciwieństwie do epitopu przestrzennego, zbudowanego z nieciągłej sekwencji aminokwasów, ułożonych w przestrzeni w sposób określony przez natywną konformację białka. Dysponując zatem odpowiednimi przeciwciałami można identyfikować białka rozdzielone elektroforetycznie w warunkach denaturujących. W celu otrzymania jak najlepszego rozdziału białek, oprócz dobrania odpowiedniego usieciowania czyli stężenia akryloamidu, należy doprowadzić do sytuacji, w której wszystkie białka w momencie rozpoczęcia rozdziału będą zagęszczone w jednym miejscu - na początku żelu (wszystkie białka rozproszone w całej naniesionej objętości do kieszonki, rozpoczną właściwą migrację w tym samym czasie z tego samego punktu).

W przypadku żeli w systemie ciągłym (z jednym buforem), po nałożeniu próbki do kieszonki i podłączeniu prądu, białka migrują bardzo szybko przez roztwór w kieszonce i zwalniają na granicy z żelem. W efekcie, ulegają tam koncentracji. Ten sposób zagęszczenia nie sprawdza się jednak najlepiej przy rozdziale populacji białek o zróżnicowanej wielkości - dla małych białek różnica w tempie migracji w wolnym roztworze i w żelu nie jest tak znaczna jak dla białek dużych, co powoduje, że nie są one tak efektywnie zagęszczone jak te duże. W celu rozwiązania tego problemu wprowadzono elektroforezę w systemie nieciągłym (z różnymi buforami). W systemie nieciągłym wg Laemmli'ego, białka ulegają koncentracji w żelu o bardzo rzadkim usieciowaniu (dużych porach), nazywanym żelem zagęszczającym. Jest to osiągane dzięki obecności w buforach glicyny i anionu chlorkowego, które różnią się tempem migracji. Ruchliwość elektroforetyczna glicyny zależy od pH zastosowanego buforu. Glicyna posiada pI 6.7 i w pH 6.8 w przeważającej części jest ona uprotonowana na grupie aminowej (+NH3CH2COO−), przez co staje się neutralna elektrycznie i tempo jej migracji jest wolne. W pH 8.3 i tym bardziej w pH 8.8 występuje ona w postaci szybko migrującego anionu glicynianowego (NH2CH2COO−). Takim zmianom w tym przedziale pH nie podlega drugi z anionów - chlorkowy, który jest najszybciej migrującym anionem w trakcie elektroforezy. Tempo migracji białek (wszystkie dzięki SDS są anionami) jest pośrednie. W żelu zagęszczajacym o pH 6.8, najszybciej migrujący anion chlorkowy pozostawia za sobą strefę o niskiej przewodności, wysokim gradiencie napięcia i wysokim pH. W tej strefie wzrasta jonizacja

glicyny i w efekcie szybkość jej migracji (sama glicyna przy tym pH żelu migrowałyby znacznie wolniej). Kiedy przesuwające się pasmo, prowadzącego anionu chlorkowego i ciągniętej za nim glicyny, napotka anion białka, jest on wyprzedzany przez prowadzący anion chlorkowy, ale pozostaje przed glicyną. W efekcie, białka są zagęszczane w postaci cieniutkich warstw (w kolejności od ich największej do najmniejszej ruchliwości) między jonami chlorkowymi a glicyną. Białka pozostają w tych cienkich warstwach (nie rozdzielone), ponieważ żel jest nisko (rzadko) usieciowany. Właściwy cel elektroforezy czyli rozdzielanie białek, może się rozpocząć, kiedy nastąpi odwrócenie tempa migracji glicyny i białek, co możliwe jest poprzez: (a) wzrost pH, tak że glicyna występować będzie w postaci anionu glicynianowego, migrującego szybciej niż aniony białka lub (b) wzrost usieciowania żelu, powodujący zwolnienie migracji anionów białkowych, tak że migrują one wolniej od glicyny. W efekcie, białka przestają być "upychane" przez glicynę i mogą zacząć się rozdzielać. W systemie nieciągłym wg Laemmli'ego, stosowane są oba te czynniki razem, w postaci żelu rozdzielającego o pH 8.8 i wysokim stopniu usieciowania. Po rozdziale, białka uwięzione w żelu, wizualizowane (uwidocznione) będą poprzez tworzenie przez nie dość trwałego ciemnoniebieskiego kompleksu ze swobodnie penetrującym żel barwnikiem, błękitem brylantowym Coomassie R-250 (CBB R-250), a następnie, odpłukanie z żelu nadmiaru (nie związanego z białkami) barwnika.

• Kwas octowy obecny w roztworach do barwienia ma za zadanie utrwalić położenie białka w żelu (przeciwdziałać rozdyfundowaniu białka w trakcie barwienia, poprzez jego wytrącenie) oraz zapewnić kwaśne środowisko potrzebne do wytworzenia kompleksów barwnika z białkiem,

• Metanol lub czasami stosowany izopropanol, oprócz wytrącania białka, potrzebny jest do rozpuszczenia barwnika.

• Mieszanie oraz podgrzewanie roztworów ma na celu skrócenie czasu całej procedury, poprzez przyspieszenie dyfuzji cząsteczek barwnika.

Przy prawidłowym wykonaniu procedury barwienia i odbarwiania, barwnikiem CBB R-250 można wykryć już mniej niż 50 ng białka w postaci prążka. Znacznie czulszymi metodami barwienia białek są:

• Metody stosujące barwniki fluorescencyjne (fluorochromy), np. SYPRO orange . Barwienie białek tą metodą przypomina barwienie DNA w żelach za pomocą bromku etydyny. Żel po elektroforezie mieszany jest w roztworze kwasu octowego zawierającym SYPRO orange przez kilkadziesiąt minut, a następnie, kompleksy białka z barwnikiem wizualizowane są przy pomocy transiluminatora UV, o długości fali świetlnej 302 nm. W celu otrzymania maksymalnej czułości, pomarańczowe kompleksy białka z SYPRO orange powinny być fotografowane (oko ludzkie pod tym względem jest mniej czułe niż błona fotograficzna lub kamera CCD).

• Metoda barwienia srebrowego jest najczulszą metodą barwienia białek i kwasów nukleinowych w żelach poliakryloamidowych. Polega na nasączeniu żelu jonami srebra Ag⁺ a następnie użyciu substancji redukującej jony srebrowe do metalicznego srebra, które jest nierozpuszczalne i widoczne. Makrocząsteczki obecne w żelu ułatwiają redukcję Ag⁺ do Ag⁰, a początkowe zredukowane atomy srebra rozpoczynają dalszy autokatalityczny proces redukcji dający w efekcie znaczną ilość zredukowanego srebra, co decyduje o wysokiej czułości metody. Barwienie srebrowe składa się z kilku etapów: utrwalania, uczulania, nasączania jonami srebra, wywołania i zatrzymania wywoływania. W etapie utrwalania żel jest traktowany kwasem (octowym, trójchlorooctowym), co zapobiega dyfuzji białek z żelu w czasie dalszej preparatyki. Roztwory użyte w czasie uczulania zawierają tiosiarczan sodu NaS₂O_3, który ma podwójne działanie - stanowi źródło anionu siarczkowego S2-, który reagując ze srebrem przyspiesza wywołanie ale także jon tiosiarczanowy tworzy kompleks z Ag+ zapobiegając redukcji do metalicznego srebra i tym samym obniżając nieswoiste tło reakcji. W tym etapie są też używane substancje modyfikujące chemicznie białka i czyniące je bardziej podatnymi na reakcję ze jonami srebrowymi (np glutaraldehyd dostaczający grup aldehydowych). W przypadku barwienia srebrowego dostosowanego do analizy białek metodą spektrometrii mas nie używa się substancji modyfikujących białka. Nasączanie jonami srebra polega na inkubacji żelu w roztworze AgNO3. Wywołanie wymaga dodania czynnika redukującego (formaldehyd) i zmiany środowiska na silnie zasadowe (Na2CO3 podnosi pH do około 12), co ułatwia autokatalityczną redukcję. Zatrzymanie wywołania polega na zakwaszeniu roztworu. Barwienie srebrowe jest metodą czułą ale nie ilościową, ponieważ różne białka wiążą jony srebra z różną wydajnością. W systemie Laemmli'ego, droga migracji białka (pojedynczego łańcucha polipeptydowego) w żelu rozdzielającym jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu dziesiętnego z jego masy cząsteczkowej (małe białka migrują najdalej). W żelu o prawidłowo dobranym usieciowaniu ta zależność jest prostoliniowa. Używając mieszaniny białek o znanych masach cząsteczkowych, tzw. wzorców masy cząsteczkowej, można, w oparciu o ich drogi migracji w żelu, wykreślić krzywą wzorcową (krzywą kalibracyjną dla danego żelu) i na jej podstawie, wyznaczyć masę badanego białka (pojedynczego łańcucha polipeptydowego), o migracji mieszczącej się w jej prostoliniowym odcinku. W przypadku, między innymi, niektórych białek z dołączoną resztą fosforanową (fosfoprotein), białek z dołączonymi resztami cukrowymi (glikoprotein) lub białek o wyjątkowo stabilnej strukturze przestrzennej (trudnej do denaturacji, np. kolageny lub histony), masa cząsteczkowa wyliczona na podstawie ich migracji w żelu, może być niepoprawna, np. pepsyna z żołądka świni, będąca fosfoproteiną, używana niekiedy jako wzorzec masy, mimo posiadania teoretycznej masy cząsteczkowej 34.7 kDa, wyliczonej na podstawie jej sekwencji aminokwasowej, w trakcie SDS-PAGE wg Laemmli'ego migruje jak białko o masie ok. 45 kDa (w innych układach buforów pepsyna może jednak migrować zgodnie ze swoją masą).

Tabela 6. Zestawienie technik chromatograficznych wykorzystywanych do oczyszczania białek rekombinowanych

Technika	Zasada rozdziału	Rodzaj złoża	Elucja	Zalety i wady
Chromatografia powinowactwa (AC)	Rozdział biocząsteczek następuje w wyniku ich odwracalnych oddziaływań ze specyficznym ligandem kowalencyjnie połączonym z odpowiednim nośnikiem.	Złoża na bazie nośników: agarozy, dekstranu lub rzadziej poliakrylamidu	Do elucji wykorzystuje się ligand kompetycyjny lub zmianę pH bądź siły jonowej.	Zalety: - bardzo wysoka specyficzność, - wysoka rozdzielczość, - możliwość uzyskania w jednoetapowym procesie bardzo czystego składnika, - możliwość nanoszenia na kolumnę próbek o dużej objętości i dużym rozcieńczeniu, - możliwość uzyskania interesującego składnika w dużym stężeniu. Wady: - w niektórych przypadkach konieczność pozyskania ligandów i przygotowania złoża we własnym zakresie, - niekiedy niska stabilność otrzymywanych złóż.
Chromatografia chelatującą (metalopowinowactwa, IMAC)	Wykorzystuje zdolność odwracalnego wiązania jonów metali takich jak: Zn, Cu, Ni czy Co przez niektóre reszty aminokwasowe występujące na powierzchni białek. Oddziaływanie polega na powstawaniu wiązań koordynacyjnych pomiędzy związanymi z nośnikiem jonami metalu a elektrodonorowymi grupami białka.	Nośnikiem złóż jest najczęściej agaroza. Najczęściej stosowanymi grupami chelatującymi są: kwas iminodioctowy (IDA), kwas nitrylotrioctowy (NTA), tris(karboksymetylo)etyleno-diamina (TED)	Do elucji wykorzystuje się ligandy kompetycyjne (imidazol, glicynę, histaminę), silne chelatory (EDTA, EGTA) lub zmianę pH bądź siły jonowej.
Chromatografia kowalencyjna	W technice wykorzystuje się zdolność tworzenia mostków dwusiarczkowych (-S-S-) pomiędzy grupami tiolowymi (-SH) występującymi na powierzchni lub w centrum aktywnym białka a grupami sulfhydrylowymi ligandu związanego z nośnikiem.	Nośnikiem złóż jest najczęściej agaroza. Ligandami są reszty glutationu lub tiopropylu.
Chromatografia jonowymienna (IEX)	Rozdział następuje w oparciu o różnice w ładunku występującego na powierzchni białek. Frakcjonowanie białek następuje na skutek odwracalnych oddziaływań pomiędzy obdarzoną ładunkiem cząsteczką a przeciwnie naładowaną grupą funkcyjną jonowymieniacza.	Złoża (jonowymieniacze) składają się z nośnika, do którego zostają przyłączone odpowiednie grupy funkcyjne obdarzone ładunkiem. Nośniki powstają na bazie celulozy, dekstranu (np. Sephadex), agaru (Sepharose CL-6B), ale także sieciowanej Celulozy (np. Sephacel). Jonowymieniacze dzieli się na kationity i anionity.	Elucja związanych do złoża białek następuje zwykle w wyniku wzrostu stężenia soli lub zmiany pH. Zmiany te mogą mieć charakter skokowy lub ciągły. W przypadku wzrastającego gradientu stężenia soli cząsteczki eluowane są w kolejności od najsłabiej do najsilniej oddziałujących ze złożem.	Zalety: - wysoka rozdzielczość, - duża pojemność złóż, - wysoka selektywność, - możliwość nanoszenia na kolumnę próbek silnie rozcieńczonych o dużej objętości, - możliwość zatężenia rozdzielanych składników w procesie elucji. Wady: - nanoszone na złoże roztwory muszą charakteryzować się niską siłą jonową i ściśle określonym pH, by procesy sorpcji mogły przebiegać efektywnie, - konieczność usunięcia soli, gdy dany składnik jest wymywany z kolumny przy dużej sile jonowej eluentu.
Sączenie molekularne (filtracja żelowa, SEC)	Rozdział białek dokonuje się w oparciu o różnice w kształcie i wielkości separowanych cząsteczek. Próbkę nanosi się na kolumnę chromatograficzną wypełnioną żelem uformowanym w postaci porowatych ziaren (wielkość porów żelu zależy od jego stopnia usieciowania).	Złoża zbudowane są zwykle na bazie dekstranu (np. preparat handlowy Sephadex), agarozy (np. Sepharose) czy poliakryloamidu (np. Biogel).	Cząsteczki o średnicy mniejszej niż średnica porów mogą wnikać do wnętrza porowatych ziaren złoża, natomiast te o wielkości większej od średnicy porów nie mogą przenikać do wodnych przestrzeni ziaren żelu i mogą znajdować się jedynie w roztworze wypełniającym przestrzenie pomiędzy ziarnami złoża. Przepływają one przez kolumnę szybciej i jako pierwsze opuszczają kolumnę. Następne substancje wypływają z kolumny w kolejności od tych o największej, następnie średniej, a na końcu najmniejszej wielkości.	Zalety: - możliwość nanoszenia na kolumnę próbki rozdzielanych cząsteczek i ich elucji w buforze o tym samym składzie, - możliwość separacji różnego typu makromolekuł, - niewielka zależność efektywności rozdziału od składu buforu służącego do nanoszenia i elucji separowanych cząsteczek. Wady: - ściśle określona, mała objętość nanoszonej próbki (powinna stanowić 1-3% całkowitej objętości złoża w kolumnie), - gorsza rozdzielczość niż w przypadku innych technik chromatograficznych, np. opartych na zjawisku adsorpcji.
Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC)	Wykorzystuje różnicę w sile oddziaływania rozdzielanych białek z hydrofobowymi ligandami unieruchomionymi na nośniku. Próbkę nanosi się na kolumnę w roztworze zawierającym duże stężenie soli. Sól odciąga wodę z powierzchni białka i odsłaniane są hydrofobowe łańcuchy boczne aminokwasów. W zależności od rodzaju tych ugrupowań cząsteczka białka będzie mocniej lub słabiej wiązana przez hydrofobowe złoże.	Złoża powstają na bazie usieciowanej agarozy czy syntetycznych polimerów silikonowych lub akrylamidowych, do których przyłączone zostają odpowiednie grupy, np. fenylowa, butylowa.	Elucji dokonuje się zwykle malejącym gradientem soli. Frakcja białek najsłabiej związanych ze złożem opuści kolumnę jako pierwsza, potem z kolumny wypływają te białka, które oddziaływały z większą mocą.	Zalety: - brak ograniczeń co do objętości nanoszonej na kolumnę próbki oraz stopnia rozcieńczenia rozdzielanych substancji, - duża pojemność złóż stosowanych w HIC, - możliwość wielokrotnego zatężenia eluowanej próbki, - nie wymaga dializy próbek uprzednio wysalanych siarczanem(VI) amonu, - cechuje się wysoką rozdzielczością. Wady: - po zakończonym rozdziale może być wymagane odsolenie próbki w przypadku, gdy interesujący składnik jest eluowany przy wysokim stężeniu soli.
Chromatografia podziałowa w odwróconym układzie faz (RPC)	Rozdział bazuje na oddziaływaniu hydrofobowych obszarów rozdzielanej cząsteczki z hydrofobowymi ligandami unieruchomionymi na żelu. Jednak w przypadku RPC gęstość powierzchniowa ligandów jest wielokrotnie większa (setki μmoli na ml żelu) niż w przypadku chromatografii oddziaływań hydrofobowych (10-50 μmoli na ml żelu).	Nośnikiem złoża jest często żel krzemionkowy. Stosuje się ligandy alkilowe, zawierające 4, 8 lub 18 atomów węgla	Do elucji wykorzystuje się zwykle rozpuszczalniki organiczne (acetonitryl, metanol).	Zalety: - wysoka selektywność i rozdzielczość, - stosunkowo krótki czas rozdziału, - dobry odzysk separowanych składników. Wady: - technika wymaga stosowania kosztownych urządzeń (chromatografów wysokociśnieniowych), - wykorzystywane w rozdziale rozpuszczalniki muszą być najwyższej jakości, - rozpuszczalniki organiczne stosowane w elucji biocząsteczek mogą niekiedy prowadzić do nieodwracalnych zmian w ich strukturze, a co za tym idzie - powodować utratę ich biologicznej aktywności.

Ekspresja genów w systemie Tabora-Studiera

Obecnie jednym z najwydajniejszych systemów ekspresji w bakteriach jest układ Tabora-Studiera. Geny docelowe klonowane są do wektorów serii pET (ang. plasmid for Expression by T7 RNA polymerase) pod kontrolę silnego promotora ø10 faga T7, nie rozpoznawanego przez bakteryjną polimerazę RNA. Transkrypcja, a następnie translacja genu rozpoczyna się w momencie pojawienia się w komórce polimerazy RNA faga T7, która selektywnie inicjuje transkrypcję z promotora ø10 faga T7. Gospodarz bakteryjny posiada wprowadzony do chromosomu gen kodujący polimerazę RNA faga T7 pod kontrolą promotora lacUV5, rozpoznawanego przez bakteryjną polimerazę RNA. Transkrypcja z promotora lacUV5 jest indukowana przez IPTG. Pomiędzy promotorem, a genem kodującym polimerazę RNA T7 znajduje się sekwencja operatorowa, wiążąca białko represorowe blokujące inicjację transkrypcji. Dopiero po związaniu represora z IPTG, co prowadzi do utraty powinowactwa białka do miejsca operatorowego, może rozpocząć się transkrypcja genu polimerazy fagowej. Pojedyncze cząsteczki polimerazy RNA T7, które mogą powstać przed indukcją, są inaktywowane przez lizozym faga T7, którego gen jest wprowadzony do komórek bakteryjnego gospodarza wraz z plazmidem pLysS lub pLysE. Ekspresja genu lizozymu zachodzi w komórce na stałym, niskim poziomie, więc nie ma wpływu na poziom ekspresji genu docelowego po indukcji systemu przez IPTG, bo wtedy powstaje bardzo dużo polimerazy fagowej. Lizozym T7 posiada ponadto zdolność hydrolizowania wiązań β-1,4-glikozydowych w peptydoglikanie ściany komórkowej bakterii, co ułatwia późniejszą lizę komórek i uwolnienie z nich żądanego produktu białkowego. Ponieważ cząsteczki lizozymu znajdują się wewnątrz komórek gospodarza i nie mogą przedostać się przez błonę komórkową do warstwy peptydoglikanu, liza komórek bakteryjnych zachodzi dopiero po naruszeniu struktury błony w początkowych etapach zabiegów prowadzących do izolacji białek. Komórki gospodarza bakteryjnego posiadają ponadto zmutowane geny lon i ompT kodujące proteazy. Zabezpiecza to powstające białko przed degradacją w trakcie procesu oczyszczania. System Tabora-Studiera został skonstruowany głównie do wydajnej produkcji białek toksycznych dla komórek gospodarza E. coli BL21(DE3) pLysS. Dzięki temu ekspresja klonowanych genów zachodzi w ściśle określonym przez eksperymentatora czasie, po indukcji systemu przez IPTG. W początkowej fazie następuje namnożenie komórek w hodowli do odpowiedniej gęstości, a dopiero w następnym etapie indukuje się produkcję białek, które mogą spowodować śmierć komórek gospodarza. W przypadku, gdy produkt klonowanego genu nie jest toksyczny dla komórek bakterii, zwykle jego biosynteza spowalnia wzrost komórek i w efekcie końcowa wydajność produkcji jest niższa. Używając systemu ekspresji Tabora-Studiera eliminuje się ten problem. Dodatkowo, po namnożeniu hodowli można blokować ekspresję genów gospodarza przez dodanie do pożywki rifampicyny, antybiotyku, który selektywnie inaktywuje bakteryjną polimerazę RNA, a nie działa na fagową, co dodatkowo zwiększa poziom ekspresji klonowanego genu.

Schemat działania systemu Tabora-Studiera w komórkach E. coli BL21(DE3) pLyS.

1

genom E.coli

Komórka gospodarza

pET

gen kodujący lizozym

lizozym T7

pLysS

Inaktywacja

polimeraza RNA T7

DE3

gen T7

lac O

promotor lac

represor lacI

gen kodujący represor lacI

polimeraza RNA E.coli

Indukcja IPTG

represor lacI

gen kodujący represor lacI

lac O

promotor T7

polimeraza RNA T7

Indukcja IPTG

gen docelowy

---