1.Co to jest telomeraza i do czego służy?

Replikacja liniowej cząsteczki DNA eukariotycznego chromosomu stwarza problem, który nie występuje przy replikacji kolistej cząsteczki bakteryjnego DNA. Normalny mechanizm syntezy DNA oznacza, że koniec 3' nici opóźnionej nie ulega replikacji. Stwarza to lukę na końcu chromosomu, a tym samym skraca dwuniciową część zreplikowanego DNA. W rezultacie chromosomowy DNA po każdej rundzie stawałby się krótszy. Wytworzył się jednak mechanizm, który temu zapobiega - rozwiązaniem jest zastosowanie enzymu telomerazy do syntezy telomerowych końców. Telomery są końcowymi sekwencjami niekodującymi zbudowanymi z wielu kopii powtarzającej się sekwencji bogatej w G. Telomeraza składa się ze składnika białkowego i cząsteczki RNA o długości 159 pz komplementarnej w swojej części środkowej do powtarzającej się sekwencji telomerowej bogatej w G. Cząsteczka RNA telomerazy tworzy wiązania wodorowe z końcem 3' telomeru, następnie wykorzystując swój RNA jako matrycę syntetyzuje DNA, potem dołącza sześć nukleotydów do 3' końca telomeru (3 koncowe nukleotydy są takie same jak rozpoznawane przez telomerazę- „genetyka molekularna, s.109-rysunek) Następnie telomeraza dysocjuje od DNA i ponownie łączy się z końcem telomeru i cykl się powtarza setki razy. Po odłączeniu telomerazy nić krótsza jest dosyntetyzowana semikonserwaywnie z tym ze jest zawsze krótsza ze względu na niemożność uzupełnienia luki pozostałej po usunięciu ostatniego startera. Wolny koniec teolemeru, w celu pozbycia się reaktywnych lepkich końców tworzy strukturę szpilki do włosów tworząc nietypowe wiązania wodorowe G-G. Są to czteroniciowe formy DNA zwane „G-DNA” lub „G-kwartet”- jako niedostępne dla nukleaz zabezpieczają końce chromosomów przed degradacją. (rysunek „genetyka molekularna-s.108)

2.Co to są telomery - budowa?

Sekwencje DNA znajdujące się na końcach chromosomów eukariotycznych. Telomerowy Dna zbudowany jest z powtarzających się wiele razy sekwencji o sekwencji dającej się ując następującym wzorem:5'C(1-8)T(0-1)A(0-4)3' - u człowieka jest to motyw 5'TTAGGG3'. Tysiąc lub więcej kopii tej sekwencji wystepuje w tandemowo ułożonych prostych powtórzeniach na każdym końcu chromosomu.

Długość telomerów znajduje się pod ścisłą kontrolą genetyczną zabezpieczając organizm przed ich nadmiernym skracaniem lub wydłużaniem. Telomery pełnią następujące funkcje: 1)utrzymanie niezmiennej długości „właściwego” genomu,

2)stabilizacja i ochrona chromosomalnego DNA przed działaniem nukleaz i łączeniem się z innymi chromosomami

3.Polimerazy DNA u Pro i Eu?

Podstawową reakcja katalizowaną przez polimerazy jest synteza łańcucha Dna w kierunku 5' - 3'. Niektóre polimerazy mogą także zawierać aktywność egzonukleazy np. aktywność egzonukleazy 3' - 5' taką aktywność ma wiele polimeraz i bakteryjnych i eukariotycznych jest to aktywność korekcyjna naprawia błędy popełnione przypadkowo przy replikacji. Aktywność egzonukleazy 5'—3' występuje mniej powszechnie, mają ją te polimerazy których funkcja spełniana podczas replikacji wymaga zdolność usuwania co najmniej część fragmentów polinukleotydowych wcześniej dołączonych do matrycy właśnie przez nią kopiowanej. U prokariota - polimeraza DNA I, II, III. Polimeraza DNA III główny enzym replikacyjny, zespół 10 białek, jednostka alfa wykazuje aktywność polimeryzacyjną, podjednostka beta działa jak klamra mocno przytrzymująca na matrycy rdzeń polimerazy III, polimeraza DNA I -replikacja i naprawa DNA, usuwanie sekwencji starterowych RNA dzięki aktywności 5`-3`; Polimeraza DNAII- naprawa DNA.

U eukariota polimerazy alfa, beta, gamma, delta i epsilon, Wszystkie bez zdolności egzo 5'-3'. Delta-główny enzym replikacyjny, alfa- odpowiedzialna za syntezę starterów, beta- naprawę Dna, gamma-replikację mitochondrialnego DNA, epsilon- replikację DNA).

Ponadto Taq i Tfu - w PCR, odporne na wysoką temperaturę, izolowane z bakterii termofilnych.

Polimerazy bakteryjne:

Polimeraza DNA I-metaloproteid (atom cynku w miejscu aktywnym), aktywność polimeryzacyjna, egzounukleazy 5'-3' i egzonukleazy 3'-5'; 2 fragmenty- większy- „Klenowa”- aktywność polmerazy i egzonukleazy 3'-5' (przestrzennie oddzielone), fragment mniejszy-aktywnosc egzonukleazy 5'-3'. Rola: wycinanie starterów z fragmentów Okazaki oraz uszkodzonych odcinków DNA w procesie naprawy. Nie jest replikazą. Wykorzystywana w biotechnologii (np. nick translation)

Polimeraza DNA II- aktywność egzounukleolityczna 3'-5', funkcja nieznana (może bierze udział w naprawie DNA)

Polimeraza DNA III- właściwa replikaza; holoenzym w postaci dimeru; dimer nie jest identyczny w obu częściach i różni się składem podjednostek. Jedna część holoenzymu zawieraa podjednostki τ zapewniające enzymowi wysoką procesywnosc (synteza nici prowadzącej). Druga częśc zawiera podjednostki β mające powinowactwo do jednoniciowych DNA- w ten sposób w miarę postępu replikacji częsć ta traci powinowactwo i przeskakuje do przeciwległej- jeszcze jednolicowej nici umożliwiając syntezę nici opóźnionej.

Polimerazy eukariotyczne:

sigma- jądro, aktywność egzonukleazy 3'-5', procesywnosc zalezna od PCNA- specyficznego czynnika podziałów komórkowych

epsilon- duzo podjednostek, aktywność egzonukleazy 3'-5', wysoka procesywność

beta-zdolna wraz z DNazą V do nick translation

4.Modele replikacji

Model dyspersyjny - Delbrucka - zakłada że każda z syntetyzowanych nici składa się częściowo z łańcucha DNA rodzicielskiego a w części z nowo syntetyzowanego.

Model semikonserwatywny - Watsona i Cricka - zakłada że każda z nici podwójnej helisy może po rozwinięciu stać się matrycą do syntezy nowej nici

Model konserwatywny - cząsteczkipochodne zbudowane są w ten sposób że jedna ma tylko nici rodzicielskie a druga tylko nowo zsyntetyzowane

W modelu semikonserwatywnym wyróżnić możemy następujące modele replikacji:

-typu theta- replikacja zaczyna się wewnątrz dwuniciowej struktury chromosomów liniowych lub kolistych, wiedełki replikacyjne tworz acharahterystyczną strukturę przypominającą grecką litere theta.

-wg modelu obracającego się koła (replikacja typu sigma)- synteza rozpoczyna się od przecięcia jednej z nici w celu wytworzenia wolnej grupy 3' OH

-wg modelu przemieszczającej się pętli (D loop, R loop) - bezpośrednia inicjacja przez transkrypcję, model powszechny w mit DNA. Transkrypcja odsuwa jedną z nici tworząc pętlę.Specyficzne przecięcie nici RNA z wytworzeniem wolnej gr. 3' OH umozliwia dołączanie polimerazy i wydłużanie/ Jest to synteza asymetryczna-najpierw synteza zaczyna się na jednej matrycy a dopiero potem rozpoczyna się na drugiej. (Rys. s 66.)

5.Kontrola replikacji

Replikacja jest skoordynowana z cyklem komórkowym, aby w momencie podziału dostępne były zawsze dwie kopie genomu. Może być też regulowana przez warunki niekorzystne dla życia kom np. gdy DNA jest uszkodzony i wymaga naprawy zanim jego kopiowanie dobiegnie końca. Cykl komórkowy można podzielić na 4 etapy: G1,S, G2 i M. Okresy bezpośrednio poprzedzające fazę M i S są głównymi punktami kontrolnymi replikacji (G1 - decyzja czy w faza spoczynku G0 czy w fazę S, G2 - sygnał że replikacja zakończona powodzeniem). Głównym mechanizmem kontrolującym następowanie po sobie faz w cyklu komórkowym jest fosforylacja białek. Kontrolę nad tym sprawują kinazy białkowe, składające się z podjednostki regulatorowej - cykliny i katalitycznej kinazy zależnej od cyklin. Sama kinaza nie połączona z cyklina nie wykazuje aktywności katalitycznej. Są 3 różna kompleksy CDK - cykliny które związane są z określoną fazą cyklu. G1 przygotowują komórkę do fazy S poprzez aktywację czynników transkrypcyjnych, które kierują ekspresją enzymów koniecznych do syntezy DNA i ekspresją białek kompleksów cyklina - CDK S. CDK S stymulują rozpoczęcie fazy S. Kompleksy mitotyczne Cdk indukują kondensację chromosomów i prawidłowy rozdział do kom potomnych. Aktywność kompleksów CDK jest regulowana przez kontrolę transkrypcji podjednostek kompleksów, za pomocą inhibitorów, poprzez zorganizowana proteolizę gdy kompleksy są już nie potrzebne

Regulacja procesu replikacji u prokariotów odbywa się na dwa sposoby: 1)sygnałem startu jest nagromadzenie białka inicjatorowego- u E.coli białka DnaA. 2)miejsce ori jest w obydwu niciach specyficznie zmetylowane przez metylaze Dam- „starsze” DNA jest po obydwu stronach zmetylowane, „młodsze” ma jedną nic niezmetylowaną- inicjacja wymaga obustronnie zmetylowanego DNA w obrębie ori.

Jak widac regulacja odbywa się na poziomie inicjacji.

Ad. Eukariotów: fosforyzacje i defosofrylacje czynników transkrypcyjnych, sekwencje promotorowe genów aktywujących replikację.

6.Budowa transpozonu i do czego służą?

Transpozon lub tez ruchomy element genetyczny jest to krótka sekwencja Dna mogąca przemieszczać się praktycznie w każdą pozycję genomu komórki. Najprostszymi transpozonami są elementy IS u E. Coli. Składają się z genu transpozazy oskrzydlonego krótkimi identycznymi sekwencjami, ale o przeciwnej orientacji. Szereg transpozonów oprócz genu transpozazy zawiera inne geny np. geny niosące oporność na antybiotyki. Zdolność transpozonów do aktywnego wbudowywania się w genom gospodarza wykorzystuje współczesna biologia molekularna i biotechnologia. Geny zawarte w transpozonie można zastąpić innymi, wykorzystując Transpozon jako wydajny wektor. Transpozon może też zostać użyty do lokalizowania jako sonda molekularna poszukiwanych sekwencji DNA.

7.Rodzaje rekombinacji i do czego służą?

Rekombinacja homologiczna lub uprawniona dotyczy wymiany większych regionów homologicznych między dwoma cząsteczkami DNA. Zachodzi podczas mejozy (crossing - over , niezależna segregacja genów) czy też wbudowywania się obcego DNA do genomu bakteryjnego po koniugacji, transdukcji i transformacji. U procariotów w rekombinacji zależnej od recA uczestniczy czteroniciowy intermedia Hollidaya, który może się rozdzielić na dwa sposoby. Dzięki rekombinacji homologicznej może być zachowana w czasie replikacji integralność DNA zawierającego uszkodzenia.

Rekombinacja zlokalizowana lub umiejscowiona (niezależna od białka recA) zakłada wymianę fragmentów DNA między krótkimi obszarami o wspólnej sekwencji, nie wymaga długich odcinków homologicznych. Spełnia ona znaczącą rolę w cyklu infekcyjnym bakteriofaga lambda (uczestniczy w wbudowywaniu DNA faga lambda w genom E.coli). u zwierząt r.z. umożliwia tworzenie przeciwciał o dużej różnorodności.

Transpozycja nie jest rodzajem rekombinacji jednak wykorzystuje rekombinację do przeniesienia fragmentu DNA z jednego miejsca w drugie w obszarze genomu.

Rekombinacje zwiększają różnorodność genetyczną i dają duży potencjał ewolucyjny. Rekombinacja może być w skrajnych przypadkach forma naprawy uszkodzonego DNA. Każdy Transpozon koduje transpozazy, która katalizuje proces inercji. Retrotranspozony replikują poprzez intermedia RNA i są spokrewnione z retrowirusami

8.Plazmidy i ich zastosowania?

Plazmidy są to elementy genetyczne zdolne do autonomicznego powielania się i istnienia pozachromosomalnego. Większość plazmidów ma koliste, superzwinięte dsDNA, a niektóre liniowe dsDNA. Wiele plazmidów może być przenoszonych w procesie koniugacji z jednej do drugiej komórki. Niektóre plazmidy mają zdolność do wintegrowywania się w chromosom bakteryjny i wtedy ich replikacja podlega kontroli bakterii. Plazmidy są w biologii molekularnej bardzo istotnym narzędziem służącym do badania różnorodnych procesów genetycznych czy ekologii i życia bakterii. Ponadto stosowane są w biotechnologii do uzyskiwania organizmów, które pod wpływem obecności plazmidu będę wydajnie produkowały określone substancje i będą przydatne wokreślonych procesach.. Obecność plazmidów w komórce może mieć znaczny wpływ na jej fenotyp np. u Rhizobium to plazmidy umożliwiają współdziałanie z roślinami. Ze względu na zróżnicowanie wielkości plazmidów oraz posiadanych przez nie genów na:

• produkcję toksyn

• uodpornienie komórki gospodarza na antybiotyki i inne substancje

• katabolizm nietypowych substratów np. pestycydów

• kontrolę procesu koniugacji

Plazmidy koniugacyjne Plazmidy te mają zdolność do przenoszenia się z komórki donora do akceptora w procesie koniugacji. Za ten proces odpowiedzialne są geny w regionie tra znajdujące się w plazmidach. Geny te związane są między innymi z syntezą pili np. F i I Pili typu F biorą udział w transferze plazmidu F oraz niektórych plazmidów z odpornością na antybiotyki. Pili typu I są zaangażowane w przenoszenie plazmidów z opornością na antybiotyki i innymi właściwościami. Plazmidy opornościowe (R - resistance) Plazmidy te nadają komórce oporność na antybiotyki i inne inhibitory wzrostu. Plazmidy R mogą posiadać różnorodne geny oporności na antybiotyki. Geny te kodują zazwyczaj białka które inaktywują antybiotyk albo wpływają na pobranie antybiotyku przez komórkę. Poza tym znane są plazmidy z opornością na kanamycynę, penicylinę czy neomycynę. Ponadto plazmidy typu R posiadają geny, które hamują wprowadzanie plazmidu tego samego typu do komórki, plazmid dodatkowy zostaje zgubiony w procesie replikacji, co nie przeszkadza współistnieć w jednej komórce plazmidom z dwóch różnych grup. Możliwa jest rekombinacja genetyczna pomiędzy dwoma R co może prowadzić do powstania organizmów opornych na wiele leków. Plazmidy R są odpowiedzialne za uzyskiwanie przez bakterie chorobotwórcze oporności na leki (antybiotyki).

9.Atenuacja mechanizm

Mechanizm wykorzystywany do kontroli ekspresji operonu trp. Na końcu 5' policistronowego mRNA, powyżej części kodującej genu trpE znajduje się sekwencja liderowa. Sekwencja ta koduje peptyd liderowy zawierający dwie reszty tryptofanowe. Funkcją sekwencji liderowej jest precyzyjne dostosowanie ekspresji tego operonu do aktualnego poziomu tryptofanu w komórce. Sekwencja ta zawiera 4 regiony(1-4) które mogą tworzyć struktury typu spinki do włosów. U bakterii rybosomy przyłączają się do mRNA jeszcze przed zakończeniem transkrypcji. Gdy w komórce jest nadmiar tryptofanu to rybosomy natychmiast zaczynają translacje sekwencji liderowej. Oba kodony tryptofanowe leżą w obrębie sekwencji 1, a kodon stop pomiędzy 1 a 2. w trakcie translacji rybosom posuwa się tuż za polimerazą RNA. Translacja kończy się pomiędzy sekwencjami 1 i 2. W takiej sytuacji rybosom uniemożliwia tworzenie spinki do włosów między 2 a 3, zamiast tego powstaje struktura między 3 i 4 co jest terminatorem transkrypcji. Dlatego jak jest typtofan to niemozliwa jest ekspresja genów. Jeśli jest mało tryptofanu to to rybosom zatrzyma się przy dwóch kodonach tryptofanowych w sekwencji 1. Utworzy się więc struktura2:3 - zwana antyterminatorem ( a 3:4 nie będzie mogła powstać). Atenuator koduje część sekwencji liderowej odp za tworzenie terminatora.

10.Budowa i funkcje promotora u Procatyota?

Rejon promotorowy jest niewielki 40-60 pz. W jego obrębie następuje wiązanie polimerazy RNA. W obrębie promotora występują dwie 6 nukleotydowe sekwencje, szczególnie ważne dla prawidłowego funkcjonowania promotora i dlatego są podobne w różnych genach. Te dwa stałe elementy leżą w pozycji - 10 i - 35 powyżej miejsca startu transkrypcji. -10 - sekwencja zgodna to TATAAT i odpowiada za oddziaływanie z podjednostką sigma polimerazy. -35 - sekwencja zgodna TTGACA, jest ważne przy rozplataniu się DNA podczas transkrypcji. Ważna jest długość sekwencji rozdzielającej te dwa elementy nie jej sekwencja. Promotor rozpoznawany przez sigma&0 w pozycji -55 do +20

11.Redagowanie co to jest i czemu służy?

Jest to forma dojrzewania RNA polegająca na modyfikacji chemicznej (deaminacji, metylacji) w wyniku czego zmieniany jest transkrypt pierwotny i zmianie ulegają właściwości kodujące tego transkryptu. Czyli możliwe jest przekształcenie jednego pre-mRNA w 2 różne mRNA kodujące 2 różne białka. Zwiększa to możliwości kodujące genomu. Przykładem jest zmiana w ludzkim mRNA apoliproteiny B

Redagowanie rRNA i tRNA są sekwencjami niekodującymi, tak więc chemiczne modyfikacje ich nukleotydów wpływają jedynie na właściwości strukturalne cząsteczek

12.Splicing alternatywny

Zdarza się że pre-mRNa pochodzący z jednego genu przechodząc do różnych tkanek ulega w nich splicingowi (wycinaniu intronów z pierwotnego RNA) na różne sposoby. Dzieje się tak, jeżeli a) używane są różne promotory, b)używane są różne miejsca poli(A), c0 pozostawiane są pewne introny d) pozostawiane są lub usuwane pewne eksony

13.Budowa splajseosomu

Splajseosom (spliceosom) jest to kompleks snRNP + pre-mRNA umożliwiający przestrzenne zbliżenie egzonów i wypętlenie intronu.. SnRNa sa bogate w uracyl, dlatego nazwane są U1, U2, U4, U5, U6. snRNA oddziałujące ze swoistymi białkami tworząc snRNP.

Główne nukleoplazmatyczne snRNP składają się z pojedynczego snRNA, wspólnej grupy ośmiu białek, które są małe i zasadowe, oraz z różnej liczby białek swoistych dla poszczególnych snRNP. Grupa białek wspólnych ,Sm, tworzą rdzeń kompleksu i rozpoznaje w snRNA pewną sekwencję obecną w rejonie jednoniciowym cząsteczki RNA.

14.Funkcje intronów?

Są źródłem nie kodujących RNA, zawierają sekwencje regulujące transkrypcje, uczestniczą w splajsingu alternatywnym i trans splajsingu, wywołują degradację mRNA, mogą stanowić sygnał transportu mRNA z jądra do cytoplazmy.

15.Wymienić i scharakteryzować niekodujące RNA?

Jest bardziej zróżnicowany niż RNA kodujący i obejmuje transkrypty o różnorakich funkcjach, pełnionych przez same cząsteczki RNA. Głównie jest to rRNA (80%) najliczniejsza klasa RNA w komórce, jest składnikiem rybosomów (dużej i małej podjednostki). tRNA to małe cząsteczki które biorą udział w syntezie białka dostarczając zaktywowane aminokwasy do rybosomu i zapewniając im odpowiednie łączenie się w kolejności zapisanej na mRNA. Wyróżniamy także snRNA, snoRNa i i sc RNA u eukariota - dwie pierwsze pełnią funkcję przy dojrzewaniu mRNa. U bakterii dodatkowo tmRNA (transportująco -inf.), wygląda jak tRNA przyłączony do mRNA i dodaje krótkie etykietki peptydowe do białek, które zostały nieprawidłowo zsyntetyzowane-wyznacza je do degradacji

16.Jak przebiega dojrzewanie tRNA i rRNA?

U E.coli jest 7 jednostek transkrypcyjnych, 1 jednostka zawiera po kopii genu 23S,16S i 5S rRNA oraz od jednego do 4 genów różnych tRNA, Geny te są transkrybowane przez 1 polimerazę RNA tworząc pojedyńczy transkrypt 30S pre-rRNA który jest trawiony endonukleazami Rnazą III i F,P, i E. Następnie cząsteczki prekursorowe rRNA zostają przycięta na końcach przez egzonukleazy M5,M16i M23 a tRNa przez egzonukleazę Rnazę D. TRNa muszą kończyć się trójką nukleotydów 5'cca3' które dodaje nukleotydylo transferaza u eukariontów. Czasem tRNa zawiera introny które ulegają wycięciu enzymatycznemu. W rRNA najczęściej metylowane są grupy 2OH cukru i urydyna zamieniana jest na pseudourydynę. U eukariota transkrypcje tRNA prowadzi pol III, promotor jest ułożony wewnątrz genu i wyróżniamy w nim blok A i blok B z którymi wiążą się czynniki trankrypcyjne TFIIIC i B.

17.Co to jest interferencja Rna i jaka jest rola si RNA?

Interferencja RNA (RNAi, z ang. RNA interference) - zjawisko wyciszania albo wyłączenia ekspresji genu przez dwuniciowy RNA (dsRNA, z ang. double stranded RNA) o budowie i sekwencji zbliżonej do sekwencji DNA wyłączanego genu. Wyłączenie może się odbywać na trzech poziomach: a) degradacja mRNA; b) blokowanie translacji mRNA; c) prawdopodobnie również przez indukcję epigenetycznego wyciszenia genu.

Bezpośrednimi mediatorami interferencji RNA są małe, 21-23 par zasad, dwuniciowe RNA, będące produktem obróbki większych fragmentów RNA przez specjalne nukleazy.

• Za degradację (zniszczenie) mRNA odpowiedzialne są oligonukleotydy tzw. małe interferujące RNA (siRNA, z ang. small interfering RNA), charakteryzują się 100%-ową homologią sekwencji do ich celu. Wchodzą w skład specjalnej rybonukleazy i nadają jej specyficzność do sekwencji. Mechanizm siRNA powstał najprawdopodobniej jako mechanizm obronny przed dwuniciowymi wirusami RNA (dsRNA). W konsekwencji degradacji mRNA odpowiedni gen jest wyciszany, bo nie powstaje kodowane przez niego białko.

• W przypadku mechanizmu interferencji z translacją mRNA, mediatorami są tzw. mikro-RNA (miRNA). miRNA kodowane są przez genom komórki, jak normalne geny. Prekursorem są niewielkie RNA, o strukturze szpilki do włosów, które ulegają obróbce podobnie do siRNA. Kompleks wchodzą w skład kompleksów rybonukleoproteinowych blokujących specyficznie translację mRNA i nadają im specyficzność. W odróżnieniu od siRNA, miRNA nie posiadają 100%-owej homologii sekwencji do docelowego mRNA. miRNA są zaangażowane w negatywną regulację ekspresji genów podczas rozwoju.

18.Jak wprowadzamy transgen?

Najprostszym sposobem wprowadzenia genu do komórki w warunkach in vivo jest jego bezpośredni transfer za pomocą metod fizykochemicznych (np. tzw. pistoletem genowym) albo pod postacią plazmidowego, tzw. nagiego DNA (naked DNA) zawierającego dany gen. Jednak nagie cząsteczki DNA można wprowadzać tylko do określonych, powierzchniowo położonych tkanek. Najczęściej gen jest wprowadzany do komórek za pomocą specjalnego nośnika (wektora).

W terapii genowej stosuje się dwa typy nośników DNA. Pierwszy to nośniki wirusowe. Dzięki inżynierii genetycznej możliwe jest usuwanie z genomu wirusów genów związanych z cyklem rozwojowym i wstawianie w ich miejsce genu terapeutycznego. Zmodyfikowany wirus nie ulega namnażaniu w komórce, ale pozostawia w niej wprowadzony leczniczy DNA.

Drugi typ nośnika DNA to nośniki niewirusowe. Są to związki chemiczne będące polimerami kationowymi lub syntetyczne konstrukty, np. liposomy czy dendrymery. Nośniki niewirusowe dostarczają do komórek cząsteczki DNA z genem terapeutycznym na drodze endocytozy.

Taką naprawę genetyczną jest jednak bardzo trudno uzyskać w praktyce, głównie ze względu na udział wielu genów w procesie nowotworzenia. Obecnie taka korekta procesów życiowych komórek nowotworowych jest nieosiągalna - między innymi dlatego, że manipulacje genetyczne prowadzą do zmian różnych odpowiedzi wewnątrzkomórkowych, a nie lokalnych czy układowych (jak w przypadku chemioterapii molekularnej czy mobilizacji układu odpornościowego), więc tylko modyfikacja procesów przebiegających we wszystkich komórkach nowotworowych mogłaby przynieść efekt terapeutyczny. W tej chwili brak jest odpowiednich wektorów, które zapewniłyby aż tak wysoką skuteczność przenoszenia terapeutycznego DNA bez wywoływania skutków ubocznych, takich jak niepożądana odpowiedź immunologiczna, ryzyko aktywacji onkogenów i toksyczność samego nośnika.

Dlatego w próbach leczenia nowotworów dąży się raczej do swoistego zniszczenia i wyeliminowania komórek nowotworowych z organizmu. Przykładem może być wprowadzenie do tych komórek genów samobójczych, immunomodulacyjnych (zmieniających aktywność układu odpornościowego), antyangiogennych (hamujących wzrost naczyń krwionośnych) lub proapoptotycznych (pobudzających śmierć komórki na drodze apoptozy).

W przypadku genów samobójczych enzym kodowany przez terapeutyczny gen umożliwia przekształcenie nieaktywnego związku chemicznego (tzw. proleku) w substancję, której działanie prowadzi do śmierci komórki lub do uczulenia komórki na chemioterapię albo radioterapię. Najbardziej znane geny samobójcze to: gen kinazy tymidynowej wirusa opryszczki (enzym kodowany przez ten gen zmienia prolek - gancyklowir - w substancję hamującą syntezę kwasów nukleinowych) oraz gen dezaminazy cytozyny E.coli (ten enzym przekształca inny prolek - 5-fluorocytozynę - w pochodną chemiczną, która też hamuje produkcję kwasów nukleinowych i jest szeroko stosowana w konwencjonalnej chemioterapii. Kombinacje różnych systemów genów samobójczych i proleków jeszcze skuteczniej niszczą in vitro komórki nowotworowe, wykazując działanie synergistyczne.

Druga grupa genów stosowanych w próbach leczenia nowotworów to geny immunomodulacyjne. Białka kodowane przez te geny pośredniczą w eliminacji komórek nowotworowych. Mogą bezpośrednio zabijać komórki albo pobudzać limfocyty T, które niszczą komórki nowotworowe. Najprostszą i najlepiej zbadaną strategią tego rodzaju jest wprowadzenie do chorych komórek genów różnych cytokin. Obecnie stosuje się geny kodujące takie cytokiny, jak np. TNF-a, różne interleukiny (IL-2, IL-4, IL-12) czy GM-CSF.

Trzeci rodzaj genów stosowanych w próbach terapii nowotworów to geny hamujące powstawanie nowych naczyń krwionośnych w guzie. Rozrost nowotworu jest uzależniony od odpowiedniego rozwoju układu naczyniowego w powiększającym się guzie. Angiogenezę można regulować przez hamowanie komórkowych sygnałów pobudzających wzrost nowych naczyń albo przez nasilenie działania substancji hamujących rozwój naczyń. Terapia genowa wykorzystująca geny kodujące substancje hamujące wzrost naczyń (np. geny angiostatyny czy endostatyny) pozwoliłaby ominąć szereg ograniczeń zwykłego leczenia przeciwnowotworowego, np. oporność na leki (bo komórki naczyń krwionośnych nowotworu w przeciwieństwie do komórek rakowych nie są genetycznie niestabilne i nie mogą łatwo uodpornić się na działanie leku) czy wysokie koszty leczenia. Według niektórych danych transfer tego rodzaju genów zwiększa także skuteczność konwencjonalnej chemio- i radioterapii. Na razie postęp antyangiogennej terapii genowej ogranicza brak odpowiednich wektorów umożliwiających skuteczny transfer leczniczych genów w warunkach in vivo.

Czwarty rodzaj genów, który też może znaleźć zastosowanie w leczeniu nowotworów, to geny proapoptotyczne. W komórkach nowotworowych dochodzi do zaburzeń procesu apoptozy - zjawiska, które w warunkach fizjologicznych eliminuje uszkodzone komórki. Nagromadzenie mutacji w materiale genetycznym komórki nowotworowej prowadzi do zaburzeń ekspresji genów pobudzających (np. p53- jest wymagane do zahamowania cyklu komórkowego w odpowiedzi na uszkodzenia DNA) i hamujących apoptozę (np. bcl-2). Naukowcy usiłują przywrócić wrażliwość komórek nowotworowych na apoptozę poprzez transfer takich genów, jak bax, Bcl-Xs, Bim, E4orf4 i apoptyny.

19.Negatywna regulacja u procaryota?

Przykładem regulacji negatywnej jest operon lac i trp ponieważ związanie represora z operatorem uniemożliwia ekspresję genów struktury, przy czym lac i trp prezentują dwie drogi regulacji negatywnej. Lac wykorzystuje zazwyczaj aktywny represor, który po związaniu liganda zostaje unieczynniony a w trp wykorzystuje się zazwyczaj nieczynny represor aktywowany związaniem liganda.

20. Czynniki naprawcze u Eukariota i Prokariota

a) systemy naprawy bezpośredniej -działają bezpośrednio na uszkodzone nukleotydy, przywracając każdemu z nich oryginalną strukturę, pęknięcia przez ligazę DNA, niektóre formy uszkodzenia przez alkilację są bezpośrednio odwracalne, dzięki aktywności enzymów przenoszących grupę alkilową z nukleotydu na własny łańcuch polipeptydowy(enzym Ada E.coli, ludzki enzym MGMT- metylotransferaza O⁶-metyloguanino-DNA odłącza gr. alkilową z pozycjo O6 guaniny i łączy się z nią, co powoduje inaktywację tego enzymu)

b) naprawa z wycinaniem zasad -usunięcie uszkodzonej zasady azotowej, wycięcie krótkiego fragmentu wokół powstałego w ten sposób miejsca AP i ponowna synteza z udziałem polimerazy DNA

c)naprawa z wycinaniem nukleotydów -nie jest poprzedzona usunięciem uszkodzonej zasady i może działać na bardziej uszkodzone obszary DNA

d)naprawa niedopasowanych nukleotydów- poprawia błędy replikacji , ale również przez wycięcie fragmentu jednoniciowego DNA zawierającego niewłaściwy nukleotyd i wypełnienie powstałej luki

e) naprawa rekombinacyjna- naprawa dwuniciowych przerw w DNA

21. Znakowanie DNA (sond)

Na końcach lub na całej długości- znakowanie równomierne. W dwuniciowym DNA knakowaniu poddaje się 1 nić- specyficzne znakowanie jednej nici

• Izotopami radioaktywnymi, syntetyzuje się nukleotydy z jednym atomem fosforu zastąpionym przez P32 lub P33, z jednym z atomów tlenu w grupie fosforanowej zastąpionymS35, lub jednym lub więcej atomem wodoru H3

• Znakowanie nieradioaktywne: fluoroscencyjne biotyną, digoksygeniną,

-znakowanie na końcu 5` za pomocą kinazy polinukleotydowej faga T4, która przenosi radioaktywny fosforan z ATP na wolną gr. 5`-hydroksylową kwasu nukleinowego. Kwas nukleinowy z wolna gr. 5` można uzyskać przez jego defosforylację za pomocą alkalicznej fosfatazy

-znakowanie na końcu 3` stosując enzym terminalna transferazę, która dołącza 1 lub> nukleotydów do końca 3`

-w dwuniciowych cząsteczkach DNA z lepkimi końcami, cofnięty koniec 3` uzupełnia się stosując rożne polimerazy DNA i znakowane nukleotydy, używa się Klenowa

 Nick translation - DNaza I wprowadza do cząsteczki jednoniciowe pęknięcia (nick). Polimeraza I dzięki swojej aktywności 5`-3` egzonukleazy usuwa nukleotydy przed sobą a za sobą dobudowywuje nowe włączając między innymi również nukleotydy radioaktywne. W ten sposób przesuwa niejako miejsce pęknięcia. Wydajność inkorporacji wynosi około 50%. Metoda ta daje najlepsze wyniki przy znakowaniu całych plazmidów a nie jest raczej zalecana do fragmentów liniowych.

 Random priming - najczęstsza , oparta jest na hybrydyzacji oligonukleotydów (6 do 9 nukleotydów) o przypadkowej sekwencji do DNA , który ma być wyznakowany. Następnie polimeraza Klenowa (fragment polimerazy DNA I nie posiadający aktywności egzonukleolitycznej 5`-3`) dosyntetyzowuje komplementarną nić DNA poczynając od 3` OH końca przyłączonego startera. W mieszaninie reakcyjnej znajdują się także radioaktywne nukleotydy włączane stopniowo do nowo syntetyzowanej nici. Długość znakowanych fragmentów nie wpływa na wydajność reakcji. Można w ten sposób uzyskać sondę o wysokiej aktywności. Metoda jest doskonała zarówno do znakowania całych plazmidów jak i liniowych fragmentów.

22. co to jest denaturacja/degradacja białek? w jakich warunkach zachodzi?

Denaturacja białka - zmiany w III- i IV-rzędowej strukturze białka natywnego, które prowadzą do utraty aktywności biologicznej lub innej indywidualnej cechy charakterystycznej przy zachowaniu jego struktury pierwszorzędowej.Podczas denaturacji niszczone są wiązania wodorowe, a w obecności odczynników redukujących zerwaniu ulegają wiązania disulfidowe. Najważniejszymi metodami fizycznymi denaturacji są: ogrzewanie, silne mieszanie, wytrząsanie, naświetlanie promieniowaniem nadfioletowym, rentgenowskim i jonizującym lub działanie ultradźwiękami.Denaturacja chemiczna zachodzi pod wpływem związków, które są zdolne do rozerwania wiązań wodorowych, na przykład pod wpływem roztworu mocznika o stężeniu 6-8 mol/dm³ lub chlorku guanidyny o stężeniu 4 mol/dm³, na skutek działania kwasów lub zasad (wartość pH poniżej 3 lub powyżej 9), soli metali ciężkich, a także 1 %-owego roztworu SDS

Degradacja- celowe usuniecie białek w komórki. Znaczenie ubikwityny w procesie degradacji polega na naznaczaniu białek przeznaczonych do zniszczenia - poprzez kowalencyjne łączenie się z nimi.
Białko mające ulec zniszczeniu ma zwykle kilka przyczepionych cząsteczek ubikwityny. Następnie zostaje rozpoznane przez odpowiednie proteazy (kompleks proteazy 26S), które degradują białko, a ubywkitynę przywracają do wtórnego obiegu.

23. funkcje aminotransferazy??

Syntetazy aminoacylo-tRNA są grupą enzymów przeprowadzających aminoacylację tRNA. Cząsteczkę tRNA do której przyłączony jest aminokwas, nazywa się czasami naładowanym tRNA. Aminoacylacja jest reakcją chemiczną przebiegającą w dwóch etapach.

24. Promotor rozpoznawany przez sigma 70 u pro

-składa się z 40-60 pz

sekwencja -10: najbardziej zachowawcza jest sekwencja 6pz, występująca w promotorach wielu róznych genów. jest on usytuowany od miejsca startowego w pozycji -10. inaczej Kaseta Pribnowa-TATAAT. sekwencja ta jest miejscem inicjacji rozplatania DNA przez polimerazę

sekwencja -35: w rejonie -35, sekwencja heksametrowa zachowawcza zgodna TTGACA. najbardziej zachowawcze 3 pierwsze pozycje, region rozpoznawania, który zwiększa zdolność rozpoznawania czynniki sigma polimerazy RNA i oddziaływania z nią

-sekwencja w pobliżu miejsca startu ma wpływ na inicjację

-miesce startu transkrypcji w 90% wszystkich genów to puryna G

25. Charakterystyka genomu mitochondrialnego

-większość to cząsteczki koliste, ale genom mitach. niektórych mikroorg euk. są zawsze liniowe

-każde mitochondruim człowieka zawiera ok. 10 identycznych cząsteczek

-na jedno mitochondrium u S. cereviseae może przypadać ponad 100 genomów

wielkość zróżnicowana i niepowiązana ze stopniem zł. organizmu, więjkszosć zwierząt wioelokom. ma małe genomy mitach. o zwartej organizacji genetycznej

- geny leżą blisko siebie, odstępy miedzy nimi są niewielkie, zawierają introny (u niższych eukariontów i u roślin kwiatowych)

-geny RNA rybosomowego, gen białka rybosomowego, kompleks genów oddechowych, gen tRNA

-istnieje kilka białek kodowanych przez mit. , są one niezwykle hydrofobowe i nie mogą być transportowane przez błony

26.funkcji ogonka poliA

istnieje wiele hipotez, żadna nie ma przekonywujących dowodów

-wpływ na stabilność mRNA, jednak nie wydaje się to być prawdopodobne bo niektóre transkrypty maja krotkie ogonki

- inicjacja translacji, poparcie dowodami pokazującymi, zepolimeraza poli (A) podlega represji w czasie tych okresów cyklu komórkowego, w których poziom syntezy białka jest stosunkowo niski

No więc,
Wyobraź sobie zamplifikowany gen, który chcemy zsekwencjonować. Mamy
go duuuużo. Podklony to są fragmenty naszego genu, który
transformowaliśmy do bakterii. Fragmenty te są różnej długości
(otrzymujemy je np. przez sonikację lub mechaniczną rozwałkę wstawki)
i następnie wpychamy E.coli do gardła. E coli je je. Otrzymujemy teraz
transformanty z różnymi wstawkami (każda wstawka to jakiś tam odcinek
genu = podklon). Dzięki temu możemy zsekwencjonować wszystkie
"strzępki" (możliwym to jest gdyż są na ogół fragmenty te są krótkie,
a sekwencjonowac możemy tylko odcinki do około 600pz.). Następnie
zsekwencjonowane fragmenty wrzucamy do komputera, który znajduje jak
te strzępki na siebie nachodzą i wylicza nam jak wygląda cały gen (ten
z którego zrobiliśmy podklony). To mniej więcej jak puzzle :P

Przypominam, że koniecznym jest wrzucenie genu do E coli, gdyż tylko
wtedy znamy starter do reakcji sekwencjonowania.

---