IZOLACJA BIAŁKA NudEl (Ndel1) Z HODOWLI Escherichia coli BL21-RIL

Celem ćwiczeń jest wyizolowanie i oczyszczenie białka rekombinowanego NudEl (Ndel1). Gen kodujący białko NudEl został wklonowany w wektor ekspresyjny pDEST17. Indukcja ekspresji genu następuje w bakteriach po dodaniu IPTG do podłoża. Białko NudEl jest bardzo konserwatywne, pełni w komórkach ssaków istotną rolę w różnicowaniu i migracji neuronów. Stwierdzono, że brak tego białka powoduje letalność we wczesnych etapach embriogenezy. Obecność białka NudEl stwierdzono także w kinetochorach (oddziałuje tam z białkiem kinetochorowym CENP-F).

DZIEŃ I:

Indukcja ekspresji białek w hodowli bakteryjnej

1. Do 100 ml pożywki LB (+ ampicylina) zaszczepić 1 ml całonocnej hodowli bakterii E.coli BL21-RIL

2. Inkubacja w 37°C z wytrząsaniem 3 godziny

3. Pobrać 1 ml hodowli, zwirować (4000obr.,), peletkę zawiesić w 50µl buforu SDS-PAGE (1x), zworteksować i zamrozić.

4. Do hodowli dodać 0,5 ml 0,1M roztworu IPTG

5. Inkubacja w 37°C z wytrząsaniem 3 godziny. Pobrać 1ml hodowli, zwirować j.w., zawiesić w 50µl buforu SDS-PAGE (1x), zworteksować i zamrozić.

6. Zwirować po 8-9 ml hodowli 4500-6000obr., 10-15 min, 4°C (UWAGA: przed wirowaniem zważyć butelki)

7. Zlać supernatant, osad zważyć.

8. Zamrozić w -20°C

DZIEŃ II:

Przygotowanie lizatów bakteryjnych.

1. Peletki bakterii rozmrozić na lodzie dodając 0,5 ml 1xLEW buforu. Wymieszać pipetując góra-dół uważając aby nie spienić.

2. Dodać lizozymu w takiej ilości, aby końcowe stężenie wynosiło 1mg/ml (50µl)

3. Inkubować na lodzie 30 minut od czasu do czasu mieszając.

4. Dodać odpowiednią ilość kulek szklanych (na 1ml bakterii 1 g kulek) i worteksować 3000obr., 5-6 minut.

5. Przenieść zawiesinę z kulkami do 2 probówek eppendorfa

6. Wirować 10000xg, 30 minut, 4°C

7. Supernatant ostrożnie przenieść do nowej probówki i przechowywać na lodzie.

Oczyszczanie białka metodą chromatograficzną (za pomocą PrepEase His-Tagged Protein Purification Kit firmy USB)

1. Kalibracja kolumny ze złożem Ni-IDA:

1. Kolumnę umieścić w plastikowej probówce o poj. 15 ml

2. Nanieść 320µl 1xLEW buforu i poczekać aż spłynie

2. Nanieść supernatant zawierający białka na kolumnę i poczekać aż spłynie

3. Dwukrotnie przemyć kolumnę 320 µl 1xLEW buforu i poczekać aż spłynie. Elucje odrzucić.

4. Elucja białka: na kolumnę nanieść trzykrotnie po 240µl 1x Elution buforu i zbierać elucje do oddzielnych probówek. Białko przechowywać w -20°C.

DZIEŃ III:

Rozdział elektroforetyczny białek w żelu poliakrylamidowym pozwala na monitorowanie produkcji i poszczególnych etapów oczyszczania białek a także ocenę wydajności oczyszczania każdej z zastosowanych metod.

Rozdział elektroforetyczny białek

1. Przygotowanie żelu poliakrylamidowego

• Starannie umyć szyby detergentem, osuszyć czystym ręcznikiem papierowym

• Suchą silikonową uszczelkę umocować wokół szyby z naklejonymi paskami, tak, aby nacięcia na uszczelce znalazły się po zewnętrznej stronie szyby (po stronie bez naklejonych pasków). Nie dotykać wewnętrznych powierzchni szyb palcami!

• Na szybę z paskami z założoną uszczelką nałożyć drugą szybkę z „uszami” w taki

sposób, aby krawędzie jednej szyby nie wystawały poza pole drugiej szyby

• Złączone szybki spiąć za pomocą spinaczy i postawić pionowo

• Sporządzić roztwór żelu dolnego o odpowiednim stężeniu (według Tab.2)

• Wymieszać ostrożnie wszystkie składniki i wlać mieszaninę pomiędzy płytki szklane do takiej wysokości, żeby zostawić miejsce na około 1 cm żelu górnego
  i grzebień.

• Na żel nawarstwić ostrożnie 1-2 mm wody. Pozostawić do polimeryzacji (20-30

minut)

UWAGA !

APS powoduje rozpoczęcie polimeryzacji, dlatego APS i TEMED dodaje się na samym końcu,

chwilę przed wlaniem roztworu żelu między szyby!!!

• Przygotować żel górny zagęszczający (według Tab.1)

• Zlać wodę z nad żelu dolnego i osuszyć ręcznikiem papierowym

• Wlać roztwór żelu górnego między szyby i szybko włożyć grzebień. Grzebień powinien być włożony symetrycznie, w taki sposób, aby miedzy zębami było ujście dla powietrza wychodzącego spomiędzy szyb po wylaniu żelu. Uważać aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Zostawić żel do polimeryzacji.

• Po spolimeryzowaniu żelu górnego (około 15 min) wyjąć ostrożnie grzebień.

• Następnie należy ściągnąć złożone płytki z żelem z podstawki, wyjąć uszczelkę

silikonową.

• Szybki z żelem przymocować do aparatu (szybka z „uszami” musi być skierowana do aparatu). Zalać żel buforem glicynowym (1 x stężonym). Napełnić buforem dolne i górne naczynie elektrodowe (studzienki w żelu muszą być wypełnione buforem).

• Za pomocą pipety automatycznej ostrożnie przepłukać studzienki buforem i usunąć pęcherzyki powietrza z dolnej części płytki.

Tabela 1 Skład żelu górnego - zagęszczającego

Składniki	Objętość
Woda	1.4 ml
30% akrylamidy	0,35ml
Bufor: 1 M Tris (pH 6.8)	0,6 ml
10% SDS	24 µl
10% APS	14,5 µl
TEMED	4,8 µl

Tabela 2 Skład żelu dolnego - rozdzielającego (10%)

Składniki	Objętość
Woda	2,4 ml
30% akrylamidy	2 ml
Bufor: 1,5 M Tris (pH 8.8)	1,5 ml
10% SDS	60 µl
10% APS	30 µl
TEMED	3 µl

2. Przygotowanie i nanoszenie próbek. Rozdział elektroforetyczny.

• Przygotować próbki do elektroforezy. W tym celu próbki białek należy zmieszać z buforem próbkowym w proporcji 7,5µl buforu na 15µl próbki , a następnie inkubować w 100°C przez 5 min. Przygotowane próbki należy nanieść do kolejnych studzienek w żelu przy pomocy pipety automatycznej w kolejności wg. Tabeli 3.

• Przeprowadzić elektroforezę wstępną przy napięciu 90V. Po wniknięciu próbek w żel zwiększyć napięcie do 120-150V i kontynuować rozdział dopóki barwnik nie znajdzie się 0.5 cm od końca żelu (45-60 min.)

• Po skończonym rozdziale wyłączyć prąd, wylać bufor i wyjąć żel z aparatu. Następnie ostrożnie oddzielić szyby, wyjąć żel i umieścić w pudełku do barwienia.

Tabela 3 Kolejność próbek na żelu

Ścieżka	1	2	3	4	5	6
próbka	Marker masy	Bakterie przed indukcją	Bakterie po indukcji	Elucja1	Elucja 2	Elucja3
Ilość (µl)	15	15	15	15	15	15

3. Barwienie żelu (metoda szybka)

1. 
   
   Żel zalać wodą destylowaną

2. Inkubacja 1 min. w mikrofalówce (750W)

3. Inkubacja na kołysce 3 min.

4. Żel zalać barwnikiem Commossie Blue R-250

5. Inkubacja 30 s w mikrofalówce

6. Inkubacja 15 min. na kołysce

7. Żel przemyć wodą destylowaną

8. Inkubacja 3 min. na kołysce

9. Przechowywać w 4°C lub zasuszyć

4. Analiza żelu po elektroforezie:

Narysuj obserwowany żel. Porównaj rozdzielone próbki z markerem masy białek (firmy Novagen). Wypisz wnioski.

ODCZYNNIKI

BUFOR SDS-PAGE (bufor próbkowy)

1M Tris-HCl pH 6,8 5,25 ml

SDS 690 mg

glicerol 3 ml

0,1 % błękit bromofenolowy 300µl

dopełnić wodą do 10 ml

Przed użyciem dodać β-merkaptoetanol (na 170 µl buforu 30µl β-merkaptoetanolu)

BUFOR GLICYNOWY (na 2l , 1x stężony)

Tris 6 g

Glicyna 28,8 g

SDS 2 g

dopełnić do 2 l wodą

4

Czynności powtórzyć 3 razy

---