Mutacje genowe (punktowe) i polimorfizmy DNA (część I)

Mutacje są to utrwalone zmiany w sekwencji DNA genu, które mogą powstać spontanicznie najczęściej z powodów błędów podczas replikacji DNA lub w wyniku działania różnych czynników mutagennych. Ze względu na obecność w komórce mechanizmów korygujących replikację, częstość mutacji samorzutnych jest niewielka, rzędu jedna na 10⁵ do 10⁷ komórek. Częstość mutacji może być podwyższona o kilka rzędów wielkości przy zadziałaniu czynników uszkadzających DNA, takich jak: promieniowanie jonizujące, UV, czy niektóre związki chemiczne. Główną przyczyną mutacji są różnego rodzaju czynniki mutagenne, które zwykle działają losowo tzn. nie jesteśmy w stanie przewidzieć, który nukleotyd i w którym genie zostanie przykładowo wymieniony na inny, w wyniku czego powstanie mutacja.

Nie wszystkie mutacje są dziedziczne. Mutacje w komórkach somatycznych nie są przekazywane z pokolenia na pokolenie, dotyczą osobnika u którego powstały. Tylko te mutacje są dziedziczne, które powstały w komórkach rozrodczych i w wyniku zapłodnienia mogą być przekazane potomstwu, które staje się jej nosicielem i może znowu przenieść tę mutację na następne pokolenie. Mutacje obok procesów rekombinacji DNA warunkują zmienność fenotypową organizmów. To właśnie zmienność mutacyjna jest podstawą procesów ewolucyjnym. Niektóre mutacje mogą być przyczyną chorób genetycznych, ponieważ zmieniają informację genetyczną prowadząc do zaburzeń ekspresji genów, procesów transkrypcji oraz translacji.

W genomie ludzkim obserwuje się różne typy mutacji począwszy od mutacji genowych (punktowych) poprzez rearanżacje genowe do dużych mutacji chromosomowych strukturalnych i liczbowych.

Mutacje punktowe wynikają ze zmiany pojedynczych nukleotydów w regionie kodującym genu, co powoduje zmianę sensu informacji genetycznej i prowadzi do powstania nowych form alleli. Zazwyczaj konsekwencją mutacji genowej jest utrata prawidłowej funkcji białka (częściej) lub powstanie białka o zmienionej funkcji biologicznej (rzadziej). Natomiast mutacje w sekwencjach regulatorowych genu mają wpływ na ekspresje genu i mogą powodować podwyższenie lub obniżenie ilości powstającego białka

Rodzaje mutacji punktowych:

1. substytucja - (podstawienia pojedynczego nukleotydu) w regionie kodującym

- tranzycja - zamiana puryny na inną purynę lub pirymidyny na inną purynę

- transwersja - zamiana puryny na pirymidynę lub odwrotnie

Efektem substytucji jest albo zmiana sensu (mutacja „missense” ) albo zmiana nonsensowna (mutacja „nonsens”). W przypadku zmiany sensu powstaje nowy kodon a w rezultacie wbudowanie innego aminokwasu w łańcuch białkowy. Np.: w genie globiny zamiana w kodonie 6 adeniny (A) na tyminę (T) powoduje zmianę kodonu GAG dla kwasu glutaminowego na GTG kodującego walinę. Konsekwencją tej mutacji jest anemia sierpowatokrwinkowa.

Gdy występuje zmiana nonsensowna może powstać przedwczesny kodon „stop” i w efekcie krótszy łańcuch białkowy, zwykle mniej stabilny, który szybciej ulega degradacji. Np. jedną z mutacji wywołującej ciężkie objawy hemofilii jest substytucja cytozyny (C) na tyminę (T) w pozycji 2307 genu kodującego czynnik VIII krzepnięcia krwi. Mutacja ta tworzy kodon „stop” TGA powodując skrócenie białka o 26 końcowych aminokwasów.

Zdarza się że, z powodu zdegenerowania kodu genetycznego, substytucja nie zmienia sekwencji aminokwasowej w kodowanym białku i nie powoduje żadnych konsekwencji. Mutacje takie nazywane są mutacjami niemymi (cichymi)

2. delecja - (ubytek) jednego lub kilku nukleotydów w regionie kodującym

3. insercja - (wstawienie) jednego lub kilku nukleotydów w regionie kodującym

Zarówno delecja jak i insercja prowadzić może do zmiany tripletów kodu we wszystkich kodonach występujących po tej zmianie, a efektem jest całkowita zmiana sekwencji aminokwasów w kodowanym białku. Mutacje te określane są jako „frameshift” - zmiany ramki odczytu. Często poniżej miejsca insercji lub delecji pojawiają się kodony „stop”. Przesunięcie ramki odczytu powoduje na ogół utratę aktywności kodowanego białka.

4. inwersja - zmiany pozycji kilku sekwencji DNA w obrębie genu lub poza nim. Przykładem

może być mutacja odwrócona, w której fragment sekwencji DNA jest wycinany, a następnie

wbudowany to samo miejsce lecz w przeciwnej orientacji. Efektem jest zmiana w kodowanym

białku.

5. mutacje w obrębie promotora genu - mogą zmieniać regulację transkrypcji lub translacji zmniejszając powinowactwo polimerazy RNA do miejsca promotorowego obniżając tym samym wytwarzanie mRNA i w efekcie zmniejszając syntezę białka.

6. mutacje dynamiczne - zmiana ta polega na zwielokrotnieniu liczby trójnukleotydowego motywu w sekwencji genu. Mutację taką po raz pierwszy opisano w genie FMR1, która odpowiedzialna jest za wystąpienie zespołu łamliwego chromosomu X /zespół FraX/ związanego z upośledzeniem umysłowym. U osób zdrowych liczba kopii trójki CGG nie przekracza 54, u bezobjawowych nosicieli zespołu FraX liczba dochodzi do 200, u osób chorych może przekroczyć nawet 1000 powtórzeń. Liczba powtórzeń CGG powyżej 200 zaburza migrację podjednostki rybosomalnej 40S, a skutkiem jest zahamowanie translacji - brak syntezy kodowanego białka.

7. mutacje miejsc cięcia na granicy intron-ekson genu - zaburzają prawidłowe wycinanie intronów w czasie formowania dojrzałego mRNA . Zmiany mogą wystąpić w sekwencji GT określającej zawsze miejsce donorowe łączenia (połączenie ekson/intron od końca 5') lub w sekwencji AG określającej miejsce akceptorowe (połączenie intron/ekson od końca 3'). Mutacje, które zmieniają połączenia AG lub GT prowadzą do całkowitego braku prawidłowego składania mRNA, czego wynikiem jest powstanie niestabilnego , niefunkcjonalnego białka Mutacje te zwane są również mutacjami RNA.

8. insercja transpozonów (elementów ruchomych genomu) - może powodować mutacje typu zmiany ramki odczytu tworzące nowe sekwencje tripletów. W niektórych przypadkach może wystąpić uaktywnienie funkcjonalnego genu np. onkogenu, jeśli wbudowanie nastąpi w okolicy jego promotora. Wykazano, że taka insercja wywołuje u człowieka pojedyncze przypadki neurofibromatozy typu I, rodzinnych nowotworów gruczołu piersiowego czy rodzinnej polipowatości jelit.

Polimorfizmy DNA

Polimorfizm to zróżnicowanie genetyczne warunkujące zmienność wewnątrz gatunku które można obserwować na poziomie całego osobnika (różnice fenotypowe), na poziomie biochemicznym (np. różne formy antygenów powierzchniowych komórki, grup krwi, enzymów ), na poziomie chromosomowym (różnice cech morfologicznych chromosomów np. rozmiar heterochromatyny przycentromerowej) oraz na poziomie DNA . Termin polimorfizm DNA odnosi się do szerokiego zakresu zmienności pojedynczych zmian nukleotydowych lub zmienności powtórzeń nukleotydowych co warunkuje występowanie w populacji dwóch lub więcej alleli w danym locus w parze chromosomów homologicznych (formy alleliczne). Allele mogą więc różnić się pojedynczym podstawieniem nukleotydu w sekwencji DNA lub też liczbą powtórzeń określonego motywu w sekwencjach DNA. Polimorfizm DNA występuje powszechnie z częstością większą niż ogólna częstość mutacji i to jest kryterium odróżniające zmianę polimorficzną od mutacji. Przyjmuje się, że jeżeli w populacji zmiana sekwencji nukleotydów występuje częściej niż 1 % to jest to polimorfizm. Większość polimorfizmów nie wpływa na cechy kliniczne fenotypu i nie prowadzi /poza wyjątkami/ do objawów chorobowych.

Sekwencje polimorficzne mogą występować w sekwencjach kodujących ale głównie obecne są w nie kodujących regionach DNA. Mogą być wykorzystane jako markery genetyczne, które dziedziczone są w sposób mendlowski, jako proste cechy kodominujace ze zmianą fenotypową np.określoną cechą czy objawami choroby. Mogą być użyte do śledzenia sposobu dziedziczenia się choroby w rodzinie, która sprzężona jest z określonym markerem genetycznym. Wykorzystuje się je więc do mapowania genów. W sądownictwie i kryminalistyce - do identyfikacji osobniczej oraz ustalania pokrewieństwa, (metody wykrywania polimorfizmu mikro- i minisatelitarnego ; DNA-fingerprints), jak również do określania genetycznej zgodności krwi, nasienia czy tkanki.

Rodzaje polimorfizmów DNA

1. Polimorfizm pojedynczych nukleotydów (SNP ang. single nucleotide polymorphism) - ten typ zmienności allelicznej polega na występowaniu zmiany pojedynczych nukleotydów w DNA. Wykrywany jest, powszechnie stosowaną metodą, analizy restrykcyjnej fragmentów RFLP /ang. restriction fragment lenght polymorphism / w izolowanym DNA badanego pacjenta przy użyciu enzymów restrykcyjnych. Są to endonukleazy bakteryjne (nie syntetyzowane u człowieka), które tną DNA w ściśle określonym dla każdego enzymu miejscu. Opisano kilka tysięcy różnych enzymów rozpoznających określone sekwencje DNA. Efektem trawienia ludzkiego DNA enzymem restrykcyjnym jest powstanie około miliona fragmentów DNA o różnej długości, które można elektroforetycznie uporządkować według wielkości fragmentów. Każda zmiana nukleotydu/ów w DNA powoduje zmianę miejsca cięcia enzymu restrykcyjnego, a widocznym efektem powstanie dwóch różnej długości fragmentów restrykcyjnych (określanych jako polimorficzne fragmenty DNA) dla danej pary alleli. Polimorfizm pojedynczych nukleotydów ujawniany jest więc na podstawie nieobecności lub obecności miejsca restrykcyjnego, ponieważ zmiana sekwencji może eliminować lub wprowadzać nowe miejsce cięcia.. Metoda RFLP nie wykrywa rodzaju mutacji punktowej , lecz wskazuje na obecność zmiany w badanym regionie DNA. W genomie człowieka wykryto tysiące miejsc polimorficznych SNP.

2. Polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych - STRP /ang. short tandem repeat polymorphism/. Mikrosatelity to sekwencje tandemowe, w których motyw 1, 2, 3 i 4 nukleotydowy powtarza się w pojedynczym locus od kilku do kilkuset razy. Np.: powszechnie występujący motyw CA może zawierać w tandemie 10 - 60 jednostek CA. Wiadomo również, że w genomie człowieka istnieje ok. 50 tys-100 tys. bloków powtórzeń CA w różnych miejscach. Mikrosatelity rozłożone są mniej więcej równomiernie co 6 - 10 tysięcy par zasad /kpz/ w miejscach niekodujących, jak również w obrębie genów (najczęściej w sekwencjach flankujących i intronach, chociaż spotykane są również w sekwencjach kodujących). Ilość powtórzeń mikrosatelitarnych różni się znacząco u poszczególnych osób. Polimorfizmy powtórzeń mikrosatelitarnych nie są wykrywane metodą RFLP, ponieważ miejsca cięcia enzymów restrykcyjnych nie ograniczają rejonu powtórzeń. Identyfikowane są natomiast techniką polimerazowej reakcji łańcuchowej PCR, która to metoda pozwala na szybką produkcję milionów kopii krótkich sekwencji DNA.

3. Polimorfizm sekwencji minisatelitarnych - Szacuje się, że w genomie człowieka znajduje się kilka tysięcy loci z sekwencjami minisatelitarnymi. Minisatelity to tandemy DNA zawierające od 10 do 100 nukleotydów (podstawowa motyw jest dłuższy i bardziej złożony niż w mikrosatelitach), które powtarzają się w pojedynczym locus od 2 do kilkuset razy. Mogą występować wyłącznie w jednym locus i są określane jako minisatelity pojedynczego locus, albo też w kilku różnych miejscach - są to minisatelity multilocus.

Zmienność genetyczna wyrażona jest ilością powtórzeń minisatelitów w danym regionie i określana jest jako VNTR /ang.variable number tandem repeats polymorphism/. VNTR-y wykrywa się konwencjonalną metodą RFLP z użyciem sondy molekularnej komplementarnej do badanego minisatelity.

1

1

---