REPLIKACJA DNA
Replikacja DNA polega na syntezie dwóch kompletnych dwuniciowych helis z jednej wyjściowej, przy czym obydwie nowe helisy mają sekwencję nukleotydową identyczną z helisą wyjściową. Ponieważ każdy łańcuch macieżystej cząsteczki DNA służy jako matryca do syntezy jednego nowego łańcucha,każda z potomnych dwuniciowych helis DNA zawiera jeden łańcuch stary (wyjściowy) oraz jeden nowy. Z tego względu replikacja DNA jest semikonserwatywna.
RÓŻNICE pomiędzy przebiegiem u PROKARIOTA i EUKARIOTA
PROKARIOTA |
EUKARIOTA |
Replikon w genomie wirusów i bakterii jest tylko jeden. |
Występuje bardzo wiele replikonów od 50 - 100 tys. |
Replikacja zaczyna się od układu beta lub sigma. |
Forma replikacji ma postać pętli. |
Szybkość : 600 nukleotydów na 1 sek. |
Szybkość u człowieka: 100 nukleotydów n 1 sek. (dlatego, że nić DNA nawinięta na histony musi zostać odwinięta z dysku histonowego). |
Fragmenty Okazaki od 1000 do 2000 nukleotydów. |
Fragmenty Okazaki od 100 do 200 nukleotydów. |
Jest jedno miejsce inicjacji i replikacji i tworzy się jeden kompleks inicjujący. |
Tworzy się wiele widełek inicjujących, a więc wiele miejsc i kompletów inicjacyjnych. |
Fragmenty Okazaki są to oddzielne odcinki DNA syntetyzowane na nici opóźnionej, z których tworzony jest kowalencyjny łańcuch ciągły DNA pod działaniem trzech enzymów. Enzymy te szybko usuwają starter RNA i zastępują go odcinkiem DNA a następnie łączą kowalencyjnie kolejne fragmenty DNA. Startery DNA usuwa nukleaza, w miejsce usuniętego RNA naprawcza polimeraza DNA wprowadza deoksyrybonukleotydy, a enzym ligaza DNA łączy fosforan na końcu 5` jednego fragmentu DNA z 3`-hydroksylowym końcem fragmentu następnego. Prymaza może inicjować syntezę łańcuchów polinukleotydowych, ale nie może sprawdzić wyników swojej pracy. W rezultacie startery zawierają dużo pomyłek. Ponieważ jednak starterami są odcinki RNA, a nie DNA, są one automatycznie usuwane jako podejrzane kopie i zastępowane przez DNA. Krótki odcinek DNA, zastępujący starter RNA, jest wstawiany przez naprawczą polimerazę DNA wyposażoną w mechanizm redagowania, podobnie jak polimerazy replikacyjne. W ten sposób komórkowy aparat replikacyjny może rozpoczynać syntezę nowych łańcuchów DNA i równocześnie zapewnić wierne powielanie całego DNA.
CECHY REPLIKACJI
jest semikonserwatywna, czyli na każdej starej nici jest odbudowywana nowa nić, stara nić musi ulec rozkręceniu, co powodują odpowiednie enzymy tzw. helikazy
polimeraza DNA rozrywa wiązania wodorowe i tworzy widełki replikacyjne
elongacja zachodzi zawsze od końca 5` do końca 3`
na 1 nici DNA tworzy się nowa nić ciągła(wiodąca),za replikację tej nici odpowiada polimeraza DNA sigma
nić druga jest opóźniona, ponieważ odczytywanie odbywa się od końca 3` do końca 5` i tworzą się w ten sposób fragmenty Okazaki, które następnie łączą ligazy i tworzy się nowa nić
za inicjację syntezy DNA odpowiedzialna jest polimeraza DNA alfa i alfa jest odpowiedzialna za nić opóźnioną
polimeraza DNA epsilon odpowiada za naprawę i polimeraza DNA gamma odpowiada za replikację mitochondrialnego DNA
TRANSKRYPCJA
jest to 1 etap ekspresji genów i polega na syntezie mRNA na matrycy DNA przez polimerazę RNA II
synteza mRNA zachodzi w kierunku 5` do 3` w pozycji odwrotnej od ułożenia matrycy
zachodzi w 3 etapach :
a. inicjacja
b. elongacja
c. terminacja
RÓŻNICE W PRZEBIEGU U PROKARIOTA I EUKARIOTA
Prokariota |
Eukariota |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Inicjacja zaczyna się od promotora genu, z którym wiąże się polimeraza mRNA II. Promotor zwykle, ale nie zawsze zawiera elementy sekwencji DNA określane jako kaseta TATA - jest to miejsce przyłączenia polimerazy RNA.
Geny nie posiadające tej kasety mogą zawierać jakieś inne elementy inicjujące, ale mniej wydajna jest taka transkrypcja .Przed kasetą TATA w niektórych genach znajduje się sekwencja = kaseta CCAAAT i te dwie kasety tworzą starter do inicjacji transkrypcji.
TRANSKRYPCJA jest to przepisanie informacji z DNA na mRNA, zamiast tyminy pojawia się uracyl.
TERMINALIZACJA TRANSKRYPCJI następuje w jakimś miejscu, za końcem sekwencji kodującej białko - ten proces nie jest jeszcze dobrze poznany.
Na koniec transkrypcji, w miejscu 3` następuje dysocjacja jakiegoś czynnika transkrypcyjnego, powoduje to odłączenie polimerazy RNA II od matrycy. Powsatały RNA określa się mianem pre-mRNA. Pre-mRNA dojrzewa, na końcu 5` tworzy się 7-metyloguanozyna a na końcu 3` dołącza się sekwencja poliA, czyli ogon kwasu poliadenylowego o długości od 50 do 250 nukleotydów. Te końce chronią mRNA przed degradacją egzonukleaz.
Heterogenny mRNA (niedojrzały) dojrzewa- proces ten polega na wycięciu intronów. Gdy są one już wycięte, dojrzały mRNA łączy się u eukariotów z białkiem tworząc informosom i to białko przenosi do cytoplazmy.
TRANSLACJA
Prokariota |
Eukariota |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Sama transkrypcja wymaga obecności:
mRNA - przenosi informacje z jądra do cytoplazmy
rRNA - bierze udział w powstawaniu rybosomów
tRNA - działa jako przenośnik odpowiednich aminokwasów do właściwego miejsca w polipeptydzie.
Pierwszym aminokwasem powstającym w białku jest zawsze metionina. Na każdym rybosomie występują dwa miejsca wiązania tRNA (P i A). mRNA łączy się w cytoplaźmie z rybosomami tworząc polisom. W miejscu P dołącza się podczas inicjacji tRNA inicjatorowe, zaś w miejscu A przyłącza się aminoacylo tRNA. Miejsce rozpoznające tRNA znajduje się na powierzchni małej podjednostki rybosomu. Koło miejsc P i A znajduje się centrum enzymatyczne transferazy i miejsca warunkujące hudrolizę ATP i GTP. Rybosom rozpoznaje w mRNA metioninę i rozpoczyna się synteza łańcucha polipeptydowego. U prokariota jest formylowana forma tRNA a u eukariontów - aminoacylo-tRNA. Gdy zachodzi hydroliza ATP i GTP tworzy się cały rybosom i zaczyna się elongacja. tRNA dostarcza odpowiednie aminokwasy na antykodon.
TERMINACJA
mRNA musi napotkać kodon nonsensowny, kodony te nie są rozpoznawane przez tRNA
gdy łańcuch peptydowy jest gotowy następuje rozpad rybosomu na podjednostki i odłącza się mRNA
synteza rozpoczyna się od N-końca z wolną grupą aminową i przebiega do C-końca z wolną grupą karboksylową.
MODYFIKACJA POSTTRANSLACYJNA dotyczy usuwania pojedynczych aminokwasów z końca polipeptydu:
odcinanie sekwencji polipeptydu
rozcinanie na mniejsze białka
dodawanie małych grup chemicznych np. metylacji, fosforylacji, acetylacji, hydroksylacji a także dużych grup np. cukrowych
CECH KODU GENETYCZNEGO
jest trójkowy - 3 nukleotydy kodują jeden aminokwas
są 4 zasady
sekwencja mRNA jest czytana grupami po 3 nukleotydy, każda z tych grup o nazwie kodon specyfikuje określony aminokwas
3 kodony UAG, UGA i UAA nie kodują żadnego aminokwasu, dlatego napotkanie przez rybosom któregoś z tych kodonów powoduje zahamowanie syntezy białka, te 3 kodony nazywane są kodonami stop
kodon AUG koduje metioninę
wszystkie polipeptydy eukariontów zaczynają się metioniną
AUG w mRNA określa się jako kodon inicjujący (startowy
ponieważ są 4 zasady, istnieje 43 = 64 możliwości kodonów, tzn. 64 możliwych trójek nukleotydów o różnej sekwencji, z tego wynika następna cecha kodu :
jest zdegenerowany
w większości wypadków pojedynczy aminokwas jest kodowany przez kilka różnych kodonów np. lizyna AAA, AAG lub arginina AGA, AGG
konsekwencją degeneracji kodu jest mutacja
jest jednoznaczny
dany swoisty kodon jest przypisywany pojedynczemu aminokwasowi
jest nie nakładający się
odczytywanie kodu w czasie syntezy białek nie obejmuje żadnych nakładających się kodonów
jest bezprzestankowy
nie ma znaków przestankowych między kodonami i przekaz informacji jest odczytywany w ciągłej sekwencji tripletów nukleotydowych aż do osiągnięcia kodonu nonsensownego
jest uniwersalny
w związku z tym, że jest tyle kodonów jest tyle rodzajów tRNA.
STRUKTURA DNA
U prokariota DNA jest jednocząsteczkowe, masa cząsteczkowa wynosi ok. 2 mld Da, nie jest on połączony z białkami i stanowi ok. 1 % masy komórki. DNA komórki bakteryjnej jest kolisty i nie ma końca 3` ani 5`.Nie jest wrażliwy na działanie egzonukleaz, zaś może być trawiony przez endonukleazy. Poza komórką bakteryjną, u wirusów występuje DNA liniowy, a wewnątrz kolisty.
U eukariota DNA jest podzielony pomiędzy chromosomy i jest połączony z histonami - białkami zasadowymi.
Struktura II rzędowa DNA jest to struktura przestrzenna. W 1953r. Watson i Crick opracowali model struktury DNA. Na podstawie obrazów dyfrakcji promieni X uzyskanych przez Franklina i Wilkinsa wydedukowali, że DNA jest zbudowany z dwóch wzajemnie oplatających się nici, tworzących strukturę helikalną.
cząsteczka DNA składa się z dwóch łańcuchów polinukleotydowych ułożonych antyrównolegle
na jednym końcu łańcucha znajduje się wolny trifosforan w pozycji 5`, a na drugim końcu 3` znajduje się wolna grupa karboksylowa
oba łańcuchy skręcają się wokół wspólnej osi w prawo tworząc podwójną helisę, na 1 skok helisy przypada 10 nukleotydów w każdym łańcuchu
nukleotyd = zasada = deoksyryboza = fosforan
nukleozyd = zasada = deoksyryboza
na zewnątrz cząsteczki ułożone są i powiązane ze sobą deoksyryboza i kwas fosforowy, tworzy szkielet struktury
do wnętrza skierowane są cząsteczki zasad - dwupierścieniowych puryn (adenina i guanina) oraz jednopierścieniowych pirymidyn (cytozyna i tymidyna)
pary zasad połączone są wiązaniami wodorowymi, pomiędzy A a T występują dwa wiązania, a pomiędzy C i G występują 3 wiązania
stała łączenia się zasad powoduje tworzenie się tzw. Komplementarności zasad w wyniku czego w jednej cząsteczce dwuniciowego DNA stosunek zasad A:T = C:G = 1, natomiast suma puryn A + G = C + T, te sumy są stałe
jednoniciowy DNA występuje u niektórych wirusów oraz kolisty dwuniciowy DNA u prokariontów oraz w mitochondriach i plastydach
Odległość osiowa fragmentów spirali tworzy pełny obrót 3.4 nm. W skład jednego skoku wchodzi 10 par nukleotydowych. Udział jednej pary wynosi 0.34 nm. DNA niektórych bakteriofagów są jednoniciowe i nie wykazują cech charakterystycznych dla DNA dwuniciowego. Energia wiązań wodorowych wynosi ok. 1 kcal na 1 mol par zasad, wiązania te łatwo się rozrywają i odtwarzają. Ma to znaczenie w trakcie biosyntezy i replikacji DNA.
U prokariota DNA tworzy struktury superhelikalne ujemne, które są zwijane przeciwnie do ruchów wskazówek zegara. Gyraza to enzym odpowiadający za zwijanie DNA. Energia ATP jest zmagazynowana w energii sprężyny.
Eukarionty mają DNA połączone z licznymi białkami tworząc nukleoproteiny. Główne ich składniki to histony. Są one bogate w lizynę i argininę. Są to białka polikationowe. Histony są nośnikami silnych ładunków elektrostatycznych dodatnich, zaś kompleks nukleoproteinowy jest obojętny.
Histony dzielimy na 5 typów:
H1 - bogate w lizynę
H2a i H2b - mniej bogate w lizynę
H3 i H4 - bogate w argininę
Najbardziej konserwatywne są H3 i H4.Histony mają w centrum domenę globularną i polarne końce z aminokwasami zasadowymi, które są głównym choć nie jedynym miejscem wiązania z DNA. Kompleksy nukleoproteinowe zawierają też białka niehistonowe.
Kompleksy nukleoproteinowe wykazują periodyczną strukturę, której powtarzalnym elementem jest nukleosom. Składa się on z grona białkowego owiniętego nicią DNA. Każde grono ma kształt krążka o średnicy 10 nm i wysokości 6 nm, zawierającego po dwie cząsteczki każdego z histonów H2a,H2b,H3 i H4.Tworzy się oktamer histonowy. W środku jest tetramer oraz po jednym dimerze po obydwu stronach krążka. Wokół krążka owija się 146 par zasad tworząc 1.75 obrotu. Poszczególne nukleosomy powiązane są DNA łącznikowym. Powstają w ten sposób włókna chromatyny przypominające sznur korali. Celem biologicznym takiej budowy jest możliwość upakowania jej w jądrze. Istnieje też wtórne pofałdowanie chromatynowych włókien - solenoid.
Solenoid jest stabilizowany przez szereg białek niehistonowych, na każdy obrót przypada 6 nukleosomów. W genomie eukariontów poszczególne geny są podzielone sekwencjami niekodującymi (intronami).Zarówno sekwencje kodujące jak i nie kodujące podlegają transkrypcji.
KWAS RYBONUKLEINOWY
Różni się składem chemicznym I strukturą przestrzenną od DNA.W RNA zamiast deoksyrybozy jest ryboza, a zamiast tyminy - uracyl. Kwas RNA nie tworzy struktury helikalnej. Występuje w postaci łańcuchów polinukleotydowych, które mogą tworzyć układy równoległe, gdyż tworzy się wiązanie wodorowe pomiędzy komplementarnymi zasadami.
rRNA jest elementem budowy rybosomów. Tworzy kompleks z białkami rybosomowymi. Ma strukturę jednoniciową i tworzy obszary równolegle połączone. Niektóre rRNA mają właściwości enzymatycznych nukleaz.
mRNA jest kwasem jednołańcuchowym. Powstaje w jądrze komórkowym, zaś swoją rolę pełni w cytoplaźmie. Cząsteczka mRNA składa się z 3 fragmentów różniących się składem nukleotydowym oraz funkcją biologiczną. Kwas ten przenosi informacje z jądra do cytoplazmy. W trakcie biosyntezy mRNA następuje przepisanie sekwencji nukleotydowej z DNA na mRNA. Dzieje się to na zasadzie komplementarności zasad. DNA służy za matrycę. Naprzeciwko adeniny DNA układa się uracyl, itd. mRNA przechodzi do cytoplazmy i przekazuje informacje o sekwencji DNA. Sekwencja nukleotydów w mRNA decyduje o sekwencji aminokwasów w białku. Nie wszystkie nukleotydy mRNA uczestniczą w kodowaniu aminokwasów, tylko centralny fragment mRNA. Fragment poprzedzający i fragment końcowy pełnią funkcje pomocnicze. W mRNA są 3 odcinki:
sekwencja prowadząca zakończona czapeczką (cap), nie uczestniczy w kodowaniu aminokwasów
sekwencja kodująca często rozpoczyna się od AUG
sekwencja końcowa zakończona ogonem poliadenylowym.
Sekwencja prowadząca rozpoczyna się od 7-metyloguanozyny.Do rybozy przyłączają się kolejno 3 reszty fosforanowe. Trzecia z nich łączy się z 2 nukleotydem - AMP. Jeżeli jedynym miejscem metylacji jest guanina, to początek sekwencji cap nazywa się kapem 0.
Sekwencja kodująca decyduje o kolejności aminokwasów w białku. Każdy aminokwas posiada swój kodon, niektóre aminokwasy mają kilka kodonów.
Ogon wokół rybosomów umożliwia zakotwiczenie mRNA w rybosomach.
tRNA ma niewielką masę cząsteczkową, zawiera 65 - 110 nukleotydów. Obfituje w nietypowe zasady, przyjmuje specyficzną strukturę przestrzenną - tzw. liść koniczyny. Na końcu 3` jest fragment trójnukleotydowy CCA z wolną grupą OH przy 3`.Na końcu 5` jest zawsze nukleotyd zawierający guaninę i koniec ten jest zawsze ufosforylowany. Są w niej fragmenty równoległe, które zawierają komplementarne zasady. Pętle zawierają nietypowe zasady nie podlegające regule komplementarności np. dimetyloadenina. tRNA transportuje aminokwasy na matrycę mRNA i odnajduje miejsce dla każdego aminokwasu, a dzieje się tak dlatego, że każdy tRNA w swoich pętlach ma trójkę komplementarną wobec kodonu mRNA - jest to antykodon. Wyróżnia się pętle:
pętla DHU = dihydrourydylowa
pętla antykodonowa
pętla zmienna = dodatkowa, nie zawsze występuje, różna ilość nukleotydów w różnych cząsteczkach tRNA
pętla pseudouracylowa = rybotymidynowa.