Ćwiczenie 1
Temat: Cytogenetyczne hodowle komórkowe.
Chromosom – skondensowane DNA, 4 MB par zasad
Aberracje chromosomowe mogą być liczbowe lub strukturalne i są widoczne w mikroskopie świetlnym.
Pacjenci z wadami wrodzonymi:
-opóźnienie w rozwoju, pre-/postnatalne opóźnienie rozwoju somatycznego, cechy dysmorfii twarzy, zaburzenia zachowania (spektrum cech autystycznych)
-zaburzenia rozwoju cielesno-płciowego (np. zespół Turnera, zespół nadnerczowo-płciowy [ZNP] ma kariotyp żeński 46XX, a płciowe narządy męski; kariotyp 45X/46XY)
-zaburzenia płodności (zawsze badamy Ją i Jego!) : niepłodność żeńska i męska, poronienia nawykowe, rodzenie dzieci z wadami
Pacjenci bez wad wrodzonych: pacjenci z kariotypem nabytym – to pacjenci hematoonkologiczni z białaczkami
Materiał do analizy cytogenetycznej:
1. Krew obwodowa – limfocyty T (mają korzystny czas podziału kom.; łatwo pobranie materiału – krwi; znamy czynnik mitogenny – stymulujący podziały, mają nierozczłonowane jądro)
2. Fibroblasty skóry – gdy wynik kariotypu konstytucyjnego krwi obwodowej (Limf T) nie odpowiada fenotypowi pacjenta
3. Amniocyty – złuszczony naskórek płodowy z płynu owodniowego (amnipunkcja wczesna: 11-14 tyg, późna: 15-17 tyg)
4. Szpik kostny (białaczki) – kariotyp nabyty
5. Komórki guzów litych: wykonuje się rzadko, bardzo drogie badanie
Etapy hodowli:
1. Pobranie:
- jałowe pobranie krwi na heparynę (aktywność 4,35 j.; służy jako antykoagulant) o temp 37 st.C
- ok. 5 ml (krew), 2-4 ml (szpik, pobranie w warunkach szpitalnych)
- proporcje heparyna:krew -> 1:2
- krew nie musi być natychmiast wysyłana do lab. ( 12-24h można przetrzymać w lodówce, -4 st. C)
- W ciągu 6 tygodni przed nie można przyjmować antybiotyków i żadnych rentgenów!
2. Zakładanie hodowli komórkowej
- w 2 sterylnych flakonach – na wszelki wypadek!
- 4 ml podłoża RPMI (gotowe podłoże hodowlane) z 1 ml surowicy płodowej cielęcej lub ludzkiej (surowica grupy AB – brak przeciwciał)
- mitogen np. LF-7 (0,2 ml); dawniej mukoproteina z wyciągu z fasoli; do szpiku nie dodajemy bo ma większe możliwości podziału
- antybiotyk o szerokim spektrum – dodajemy tylko do jednego flakonu
- krew pełna: 5-10 kropli
3. Warunki hodowli: 72h (szpik 24h) w 37 st.C z dopływem 5% CO2 -> warunki podobne do tych w organizmie. W ciągu ostatniej godziny hodowli musimy nagromadzić komórki w stadium metafazy dodajemy więc kolchicyny, by zahamować anafazę (nie powstaną prawidłowe wrzeciona kariokinetyczne).
4. zahamowanie hodowli i opracowanie:
- szok hipotoniczny (0,075 M KCl, 37 st.C): 40 min – szpik kostny, 20 min – limfocyty; zachodzi zjawisko dyfuzji i osmozy: mechaniczne rozerwanie błon komórkowych
- odwirowanie
- supernatant odlewamy, ważny jest osad; komórki muszą pęknąć
- odwirowanie
- 3x utrwalanie w mieszaninie metanol:lodowaty kwas octowy w stosunku 3 : 1
Materiał taki kładziemy na szkiełko podstawowe (odtłuszczone, trzymane w lodowce) i szukamy metafaz.
Barwienie chromosomów:
- GTG (prążki G, trypsyn+ Giemsa) - najczęściej stos. do oceny kariotypu , prążki ciemne zawierają skondensowaną chromatynę = heterochromatynę (dostęp trypsyny do niej jest utrudniony), bogatą w pary zasad A-T, zawierającą stos. mało aktywnych genów. Jest to obszar wolnoreplikujący (replikuje się późno w fazie S) Prążki jasne zawierają euchromatynę, 80% aktywnych genów, dużo par C-G, obszary te replikują się wcześnie.
- CBG (prążki C, Ba(OH)+ Giemsa) - Ba(OH)2 wiąże się z heterochromatyną konstytucyjną, występuje ona w centromerach wszystkich chromosomów, więc metoda ta służy wybarwianiu centromerów
ciepło, Giemsa) - prążki barwią się na odwrót niż w GTG, metoda ta może być użyteczna w badaniu aberracji w regionach telomerowych.
- RHG (prążki R, hydroliza na ciepło+ Giemsa) - prążki barwią się na odwrót niż w GTG (R-reverse), metoda ta może być użyteczna w badaniu aberracji w regionach telomerowych.
- RBG (wodorotlenek baru BrdU + Giemsa)
- QFQ (prążki Q, fluorochrom, quinakryna)
- DA/DAPI (fluorochrom DAPI)
- AgNOR uwidocznienie rejonów satelitarnych i okołojąderkowych, traktowanie chromosomów solami srebra;
- FPG (fluorescencyjny barwnik + Giemsa z BrdU)
Pierwsza litera: to rodzaj prążkowy
Druga litera: czynnik trawiący (T-trypsyna)
Trzecia litera: rodzaj barwnika
Kariogram – zestaw poukładanych parami chromosomów
Ułożenie kariogramu: wybieramy 20 metafaz, które są podobne (z 15 najlepszych – dokumentacja, z 5 – kariogramy); wytyczne układania kariogramu ISCN 2005 wg położenia i wielkości centromeru (od największego)
Grupy chromosomów:
A – 1, 2, 3 – duże metacentryczne
B – 4, 5 – duże submetacentryczne
C – 6 – 12, X – średnie submetacentryczne
D – 13 – 15 – duże akrocentryczne
E – 16 – 18 – średnie metacentryczne
F – 19 – 20 – małe metacentryczne
G – 21 – 22, Y – małe akrocentryczne
+ na końcu układamy parę chromosomów płciowych
Czułość i rozdzielczość różnych metod oceny kariotypu:
Metody cytogenetyki klasycznej ~3-5 Mpz, odsetek ludzi w populacji: 2-5%
FISH ~40-250 kpz, 6%
HR-CGH > 3Mpz, 10%
CGH do mikromacierzy ~1mpz-20pz, 16-18%
MLPA sekwencjonowanie ~40-1 pz, 30%
Przyczyna MPD to w 70% nierozpoznana choroba genetyczna!
Ćwiczenie 2
Temat: Aberracje chromosomowe.
Aberracja submikroskopowa – zmiana niewidoczna w mikroskopie świetlnym, jej identyfikacja wymaga zastosowania czulszych metod, np. technik cytogenetyki molekularnej FISH.
Mozaikowatość – 2 lub kilka kompilacji komórek o różnym zestawie chromosomów w jednym organizmie
Aberracje – zaburzenia w liczbie lub strukturze chromosomów; mutacje materiału genetycznego widoczne pod mikroskopem świetlnym. Mogą dotyczyć autosomów, ch. XY; mogą powstawać de novo lub dziedziczyć się.
- liczbowe (nieprawidłowa liczba chromosomów)
* aneuploidie - 2n – 1, 2n +1 (złe rozchodzenie się chromosomów lub chromoatyd siostrzanych w anafazie = nondysjunkcja; np. monosomie, trisomie, podwójna monosomia 2n-1-1; nullisomia 2n-2)
* poliploidie – 3n, 4n; (powstają: z zapłodnienia komórki jajowej przez 2 (dispermia) lub więcej plemników, zaburzenia podziału zygoty, zaburzenia podziału dojrzałego jaja lub plemnika i powstanie gamety diploidalnej; wielokrotność haploidalnej liczy chromosomów)
- strukturalne (komórki somatyczne zawierają jeden lub więcej chromosomów nieprawidłowych; mogą dotyczyć autosomów lub chromosomów płci):
* zrównoważone – nie ma zmiany w ilości materiału genetycznego, np. translokacja wzajemna, inwersja; skutki nie zawsze są widoczne: zmiana ramki odczytu; są przyczyną powstawania w mejozie gamet z nieprawidłowym zestawem chromosomów. Może być przekazana na następne pokolenie jako zrównoważona lub niezrównoważona
* niezrównoważone – zwiększenie materiału, np. duplikacja, addycja lub ubytek – delecje; skutki fenotypowe są widoczne
Aberracje strukturalne:
- powstają w wyniku złamań chromosomów
- w miejscu złamania powstają lepkie końce, które zazwyczaj łączone są dzięki systemom naprawczym
-częstość występowania jest większa pod wpływem promieniowania jonizującego lub chorób dziedzicznych
a) Translokacje – przemieszczenie materiału genetycznego pomiędzy chromosomami (ale nie utrata!); nosiciel jest zdrowy, ale potomstwo jest obarczone ryzykiem wystąpienia niezrównoważonego kariotypu
- wzajemne – wymiana materiału między 2 chromosomami np. t(8;22)(q34;q11); powstaje w wyniku złamań chromosomów niehomologicznych lub przez przypadkową rekombinacje między chromosomami podczas mejozy
-niewzajemne
-zrównoważone (j.w.)
-niezrównoważone (j.w.)
- robertsonowskie = fuzje centryczne; dotyczy 2 chromosomów akrocentrycznych grupy D/G, w których złamanie następuje w centromerze lub blisko niego; powstaje chromosom z 2 centromerami; krótkie ramiona zawierające nieczynną genetycznie heterochromatynę są eliminowane
- insercyjne – jeden chromosom ma 2 pęknięcia, a drugi jedno (w sumie 3 złamiania), nosiciel jest zdrowy, a u potomstwa delecja lub duplikacja (nigdy obie zmiany jednocześnie)
b) Inwersje – chromosom pęka w dwóch miejscach i dochodzi do odwrócenia materiału genetycznego 180 stopni
- paracentryczne – złamanie w obrębie jednego ramienia i nie obejmuje centromeru
- pericentryczne – złamanie w obrębie obu ramion łącznie z centromerem
c) Delecje – utrata fragmentu chromosomu; powstaje w wyniku: utraty części chromosomu między dwoma punktami złamań, niezrównoważonego crossing-over, rodzicielskiej translokacji; fragment który uległ delecji jest acentryczny i jest eliminowany podczas następnego podziału
- terminalna – złamanie w części dystalnej chromosomu
- interstycjalna – podwójne złamanie i połączenie dystalnych części chromosomu
- szczególny typ: chromosom pierścieniowy (p. dalej)
- mikrodelecje – j.w.
d) Duplikacje – podwojenie fragmentu chromosomu w wyniku nierównego crossing-over, błędnych procesów zachodzących w mejozie u któregoś z rodziców; są mniej szkodliwe od delecji
e) Izochromosom – powstaje w wyniku poprzecznego podziału centromeru; duplikacja jednego ramienia i delecja drugiego; skutki fenotypowe: najczęściej ilościowe zmiany letalne, jeżeli dotyczy ch. 21 - z. Downa (jeśli powstaną 3 sztuki 21(q), bo tam jest region krytyczny z. Downa); najczęściej dotyczą ch. X(q) oraz Y;
f) Chromosom pierścieniowy (r) – powstaje przez jednoczesną delecję części dystalnej obu ramion krótkich bądź długich jednego chromosomu „lepkie” końce łączą się ze sobą; często występuje w obrębie ch. X u kobiet z zespołem Turnera
Kariotyp prawidłowy: 46, XX lub 46, XY
Kariogram – graficzny zapis kariotypu
ISCN – sposób zapisywania kariotypów
46, XX [20] <- liczba analizowanych komórek
46, XX, t(2;5) <- rodzaj aberracji i zaangażowane chromosomy
Jeżeli aberracja chromosomowa obecna jest we wszystkich komórkach somatycznych, mówimy wówczas o homogenności.
Mogą jednak istnieć różne linie komórkowe – z aberracja i bez, nazywamy to mozaikowością.
Może mieć również miejsce mozaikowatość gonadalna -> komórki somatyczne i gonady mają różny kariotyp.
Ćwiczenie 3
Temat: Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ – FISH oraz inne nowoczesne metody stosowane w genetyce i hematoonkologii (SKY, HR-CGH, aCGH)
FLUORESCENCYJNA HYBRYDYZACJA IN SITU (FISH)
FISH łączy w sobie elementy cytogenetyki klasycznej i metod molekularnych.
Zasada metody: hybrydyzacja - polega na tworzeniu dwuniciowych kompleksów między sondą molekularną a badanym jednoniciowym fragmentem DNA lub RNA (zgodnie z zasadą komplementarności).
Etapy FISH ogólnie:
-sporządzenie i wyznakowanie sondy
-przygotowanie preparatu
-denaturacja sondy i preparatu (termiczna, mocnymi kwasami i zasadami)
-hybrydyzacja
Sonda molekularna – fragment DNA, którego sekwencja nukleotydów jest specyficzna względem badanego regionu. Sondą może być:
- syntetyczny lub naturalny gen lub jego fragment
- syntetyczny oligonukleotyd (<50 p.z.)
- cDNA
- fragment chromosomu
- fragment genomowego DNA
Metody otrzymywania sond:
- klonowanie odpowiedniego fragmentu DNA
- synteza chemiczna ( dla oligonukleotydu 20 – 50 pz)
- sondy złożone otrzymuje się przez klonowanie całego chromosomu, cięcie go enzymami restrykcyjnymi, elektroforeza, denaturacja; wszystkie fragmenty znakuje się tym samym fluorochromem.
Fluorochromy:
- rodamina – barwnik czerwony,
- FITC – zielony,
- czerwień Texasu – czerwony,
- DAPI – niebieski,
- Aqua – niebieski,
- Cyjanina C3 – pomarańczowy,
- TRIC – czerwony.
DAPI bardzo szybko wnika do struktur – można oglądać już po 5 min.!
FISH inter- i metafazalny:
Przygotowanie materiału:
materiał po hodowli k.k., rozmaz krwi lub szpik kostny, musi być utwardzony
szkiełko odtłuszczone
chromosomy nie mogą być w cytoplazmie, utrudniona jest penetracja sondy
materiał nie może być zbyt gęsto i zbyt rzadko naniesiony na szkiełko
Oceniamy 1-5 metafaz; u chorych na nowotwory interfaza (kom. nie dzielą się po chemioterapii)
Etapy FISH szczegółowo:
nałożenie materiału na szkiełko (odwodnienie szkiełka w szeregu alkoholi 70%, 80%, 99,8% przez 2 minuty w każdym)
nałożenie odpowiedniej sondy molekularnej ogrzanej do temp 37 stopni
zaklejenie szkiełka klejem silikonowym
denaturacja materiału badanego i sondy (terminczna, chemiczna lub promieniowanie UV)
hybrydyzacja (w komorze wilgotnej, 37 stopni, 12h, ciemność)
odpłukanie niespecyficzne związanej sondy i sondy, która nie związała się wcale, w buforze płuczącym PBD przez 2 min
nałożenie DAPI na analizowane pole i przykrycie szkiełkiem nakrywkowym
detekcja sondy (działanie promieniowaniem, które wzbudza świecenie znacznika)
analiza mikroskopowa
Detekcja sondy:
lampa rtęciowa – źródło promieniowania, które wzbudza emisję znacznika fluoroscencyjnego
zestaw filtrów – przez który przechodzi promieniowanie o danej dł. Fali
mikroskop fluorescencyjny – obserwujemy emisję fluorochromu
aparat cyfrowy/system komputerowy – dokumentacja obserwowanego w mikroskopie obrazu
Rodzaje sond molekularnych stosowanych w FISH:
specyficzne (unikatowe) – dla danej sekwencji DNA
złożone (malujące) – specyficzne dla całego chromosomu lub jego ramienia
komplementarne – do sekwencji powtórzonych
Sondy specyficzne (unikatowe):
- do identyfikacji mikrodelecji, submikroskopowych aberracji i genów fuzyjnych
- stosowane w czasie metafazy oraz dla jąder interfazalnych
- fuzje genowe – analizuje się przy białaczkach – 95% pacjentów z CML (ostra białaczka limfatyczna) ma t(9;22)(q34;q11) z fuzją genową BCR/ABL1 (tzw. chromosom Philadelphia) i ABL1/BCR (9q+)
- identyfikacja pewnych genów istotnych w rozwoju nowotworów (np. gen p53
-Mikrodelecyjne zespoły:
Williamsa 7q11.23
Di George’a 22q11.2
Millera-Diekera 17p13.3
Cri du chat (kociego krzyku) 5p15
Retinoblastoma 13q14
Pradera-Willeeego/ Angelmana 15q12 ( w zależności od imprintingu genomowego)
Sondy złożone (malujące):
- specyficzne dla całego chromosomu z wył. centromeru
- tylko metafazy!
- do identyfikacji: chromosomów markerowych, dodatkowego materiału chromosomowego, złożonych/ukrytych translokacji, aneuploidii, zaburzeń ilości chromosomów płci
Sondy komplementarne do sekwencji powtórzonych:
metafazy + interfazy
centromerowe
telomerowe
komplementarne do regionów heterochromatyny konstytucyjnej
- stosowane w diagnostyce aneuploidii, hematoonkologii, do identyfikacji chromosomów markerowych, aberracji chromosomowych i mozaikowatości komórek (np. allele zespołu Klinefeltera czy Turnera)
- wykorzystuje się je przy przeszczepach, w celu sprawdzenia jak się przyjęły, gdy dawca i biorca różnili się płcią = chimeryzm przeszczepowy)
Chromoprobe FISH:
-dla wykrywania białaczek (ALL, AML) gotowe testy do badania,
- niepełnosprawność intelektualna – utrata fragmentów sub-/telomerowych – 30%
- na charakterystyczne aneuploidie -> badania prenatalne
- bardzo szybki wynik
CGH, HR-CGH:
- hematoonkologia, genetyka kliniczna, gdy mamy materiał niezrównoważony rzędu 2 m p.z. i więcej
- krew/szpik -> izolacja DNA ->znakowanie fluorochromem ->2 probówka z wzorcowym DNA -> na szkiełko wzorcowe z wzorcową metafazą -> współzawodnictwo o komplementarność między DNA zrównoważonym i niezrównoważonym; jeśli więcej któregoś DNA to ono przyłączy się do metafaz (więcej tego koloru fluorescencji)
Mikromacierze: jest to metoda bardzo dokładna (1 Mpz, a w niektórych sytuacjach nawet 10-100 kbp). Na bardzo małej płytce umieszczamy dużą ilość krótkich fragmentów DNA o znanych sekwencjach. Mikromacierze kliniczne – umożliwiają wykrycie wszystkich mikrodelecji jakie znamy (pacjentowi robi się screening) lub wykrycie aberracji subtelomerowych. Mikromacierze kliniczne – analiza kariotypu w przypadkach kiedy fenotyp pacjenta nie odpowiada określonemu zespołowi chromosomowemu.
Ćwiczenie 4 +7
Temat: Diagnostyka molekularna cz.1 + cz. 2.
Materiał do badań:
Krew obwodowa pobrana na EDTA (antykoagulant)
Śluzówka policzka
Komórki naskórka
Nasienie
Fibroblasty
Cebulki włosa
Inne komórki np. kosmówka, mięśnie itp.
Kości, zęby <- zwęglone zwłoki
Etapy izolacji DNA:
Wstępne przygotowanie materiału biologicznego do izolacji DNA:
W zależności od rodzaju i pochodzenia materiału wstępne przygotowanie może obejmować oczyszczenie z różnego rodzaju zanieczyszczeń zewnętrznych, pożywki i pozostałości innych komórek, a następnie rozdrobnienie, homogenizację, później zawieszenie jednolitej masy w odpowiednim buforze
Liza komórek:
Lizę komórek prowadzi się w zależności od rodzaju komórek i tkanek np. poprzez: homogenizację (miękkie tk. zwierzęce), rozcieranie (tk. roślinne, kom. bakteryjne), lizę detergentami (komórki z hodowli komórkowych, krew), lizę enzymatyczną (komórki bakteryjne, drożdżowe, krew). Destrukcji błony towarzyszy uwolnienie DNA i innych komponentów komórkowych do roztworu.
Inaktywacja nukleaz komórkowych w celu zabezpieczenia DNA (np. proteinaza K)
Oddzielenie kwasu nukleinowego od pozostałych komponentów kom.:
W tym celu stosuje się m.in. sole (SDS), które degradują białka (także białka histonowe)
Zagęszczenie preparatu DNA i usunięcie zanieczyszczeń małocząsteczkowych celem uzyskania roztworu DNA o pożądanej czystości i gęstości. Po wytrąceniu (98% etanolem) i przemyciu (70% etanolem) DNA pozostawia się do wyschnięcia i następnie zawiesza się w małej objętości buforu o niskiej sile jonowej lub w wodzie.
Standardowe metody izolacji DNA:
Izolacja metodą ekstrakcji fenolowej
Izolacja z pełnej krwi z użyciem nadchloranu sodowego zamiast fenolu
Izolacja metodą odsalania białek
Izolacja z pełnej krwi metodą z użyciem Igepalu (IGEPAL – nazwa handlowa preparatu)
Izolacja za pomocą kolumienek (najczęściej stosowana i najszybsza)
Izolacja automatyczna
Reakcja łańcuchowej polimerazy, PCR:
Została opracowana w 1983 roku przez Kary’ego Mullisa, za co otrzymał on Nagrodę Nobla w 1993 roku
Umożliwia specyficzną amplifikację (powielanie) in vitro wybranych odcinków DNA i RNA (przepisanych na cDNA) dzięki wykorzystaniu dwóch starterów komplementarnych do sekwencji docelowej
Stanowi odwzorowanie procesu replikacji DNA, ponieważ dochodzi do syntezy komplementarnej nici DNA
Skład mieszaniny reakcyjnej:
Matryca (DNA, cDNA)
Polimeraza Taq
Bufor
Woda
Jony Mg2+
Startery
Nukleotydy (dNTP)
Matryca – DNA lub RNA przepisane na cDNA nie może być zdegradowane, ani zanieczyszczone białkami, inhibitorami enz. (np. etanol, heparyna)
Termostabilna polimeraza Taq - wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus, nie wykazuje aktywności 3’-5’ egzonukleazy - jednego z mechanizmów naprawy błędów podczas syntezy DNA, a więc nie ma możliwości naprawy błędów replikacji. replikacja zachodzi z prędkością ok 1000 pz w czasie 30 s w temperaturze 72 stopni C. Główny enzym przeprowadzający PCR.
Bufor – zapewnia odpowiednie warunki do działania polimerazy (pH 8,3-8,8), jest dostarczany przez producenta do polimerazy
Woda – środowisko reakcji
Jony Mg 2+ - wiązane są przez startery, matrycę, polimerazę i dNTP; dokładność reakcji PCR jest proporcjonalna do stężenia wolnych jonów Mg 2+ - z reguły stosuje się st. jonów nieco większe niż stężenia dNTP, co zwiększa dokładność polimerazy
Startery (primery) – zapewniają specyficzność reakcji; komplementarne do określonego fragmentu nici DNA (matryca) oskrzydlającego analizowany fragment genu; są to krótkie ( 18-28 nukleotydów), jednoniciowe fragmenty DNA; wyróżniamy 2 rodzaje starterów: forward i reverse.
Nukleotydy (dNTP) – dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Czas trwania: ok. 2 godz.
Przebieg PCR: są to wielokrotnie (30-40) powtarzane 3-etapowe cykle:
DANATURACJA (94-95 st. C) – rozplatanie podwójnej nici DNA, czas ok. 30-60 s
WIĄZANIE STARTERÓW (40-65 st. C) – przyłączanie (hybrydyzacja) starterów do matrycy ustalane doświadczalnie w zależności od składu nukleotydowego starterów, czas ok. 30-60 s
SYNTEZA NICI/ELONGACJA (72 st. C) - właściwa amplifikacja pożądanego fragmentu genu przez polimerazę Taq
Zastosowanie PCR:
Ginekologia, położnictwo – m. in. niepłodność (mutacja genu CFTR), nawracające poronienia (analiza mutacji Leiden), przedwczesne wygaszanie czynności jajników (ekspansja powtórzeń (CGG)n w genie FMR1)
Gastroenterologia – celiakia, choroba Wilsona, hemochromatoza, nietolerancja laktozy typu dorosłego, fruktozemia, zespół Gilberta
Kardiologia – hipercholesterolemia (analiza mutacji genu LDLR oraz APOB), zakrzepica żył (analiza mutacji genu MTHFR), zespół hipoplazji lewego serca (analiza mutacji w genie GJA1), zespół wydłużonego QT
Neurologia – choroba Alzheimera (analiza mutacji genu PSEN1), drżenie samoistne, wada cewy nerwowej, zespół łamliwego chromosomu X, choroba Huntingtona
Onkologia – badanie mutacji genu BRCA1, BRCA2 (nowotwory piersi, jajnika), polipowatość jelita grubego, siatkówczak (retinoblastoma), rak rdzeniasty tarczycy, czerniak
Okulistyka – zwyrodnienie siatkówki
Dermatologia – AZS, czerniak
Choroby metaboliczne, endokrynologia – choroba Gauchera, fenyloketonuria, galaktozemia, niewrażliwość na hormony tarczycy, otyłość (analiza genu dla receptora melanokortyny)
Inne: mukowiscydoza, tromobocytopenie (postać rodzinna), określanie płci pacjenta (z poronienia lub gdy makroskopowo po urodzeniu lekarz nie może stwierdzić), sekwencjonowanie genów, hybrydyzacja, monitorowanie leczenia, mikrobiologia (HIV, prątki gruźlicy, H.pylori, Hepatitis virus A, B, C), ustalenie grupy krwi, medycyna sądowa, farmakogenetyka (podawanie leków na miarę genomu pacjenta – indywidualny polimorfizm)
Metoda PCR w czasie rzeczywistym (real time PCR, RT-PCR):
Umożliwia amplifikację danego fragmentu DNA z jednoczesną detekcją przyrostu ilości w czasie rzeczywistym
Pomiar ilość produktu jest możliwy dzięki zastosowaniu technik fluorescencyjnych
Może być używany do jakościowych i ilościowych analiz materiału genetycznego – wykrywanie zmian pojedynczych nukleotydów, np. pacjenci hematoonkologiczni
Różnica między RT-PCR a PCR: w mieszaninie mamy dodatkowo specyficzne sondy lub SybrGreen
Rodzaje sond do RT-PCR:
Sondy hybrydyzujące
Sondy TaqMan
Molecular Beacon
I inne…
SybrGreen:
Barwnik fluorescencyjny wiążący się z dwuniciowym DNA (dsDNA) – to nie jest SONDA!
Silnie i specyficznie wiąże się do mniejszej bruzdy DNA, dając silny sygnał wprost proporcjonalny do ilości DNA
Wzrastająca ilość nowosyntetyzowanych nici powoduje wzrost sygnału fluorescencji
Nie wiąże się do ssDNA (jednoniciowe DNA)
SybrGreen rozpoznaje sekwencje niespecyficzne
Nietoksyczny – teoretycznie :P
Wykorzystywany do oceny ekspresji produktu
Sondy hybrydyzujące:
Zbudowane z 2 cz. – każda wyznakowana barwnikiem fluorescencyjnym
Są komplementarne do sekwencji bez lub z mutacją
W obecności światła o określonej długości fali barwnik umieszczony na końcu jednej z sond ulega wzbudzeniu i uwalnia energię
Sondy TaqMan:
Jednoniciowa (20-30 pz)
1 koniec – barwnik fluorescencyjny
2 koniec – wygaszacz
Gdy barwnik od wygaszacza zostanie oddzielony następuje emisja promieni -> wiemy że jest mutacja
Sonda niehybrydyzująca – brak fluorescencji
W czasie PCR sonda przyłącza się do sekwencji między starterami
Molecular Beacon:
1-niciowa
Tworzy strukturę spinki do włosów
Końce są znakowane: jeden koniec fluorochromem, a drugi wygaszaczem
W obecności komplementarnej sekwencji sonda rozwija się i hybrydyzuje do matrycy
Oddzielenie się od siebie fluorochromu i wygaszacza powoduje fluorescencję
Bardzo duża czułość tej metody
Zasady RT-PCR:
Wykonujemy minimum 3 powtórzenia dla danej próby (ze względu na ograniczoną czułość)
Kontrola pozytywna
Kontrola negatywna (NTC – non template control)
Wewnętrzna kontrola ilości ( np. β-aktyna)
Zastosowanie RT-PCR: wykrywanie mutacji i polimorfizmów, porównanie aktywności genu, badanie lekooporności, monitorowanie choroby resztkowej, oznaczenie zawartości GMO w produktach spożywczych, diagnostyka mikrobiologiczna i wirusologia
Sekwencjonowanie DNA: technika umożliwiająca ustalenie sekwencji (kolejności zasad) w DNA, nie musimy przy tym bawić się w sondy, obecnie jest to zloty standard; najczęściej sekwencjonowanie wykonuje się techniką Sangera.
Ludzki genom: ponad 3 mld pz z czego 2% to sekwencje kodujące (>20 tys. genów kodujących białka, >8 tys. genów kodujących RNA, >12 tys. pseudogenów), a 98% to sekwencje niekodujące (introny + sekwencje niekodujące)
Metoda Sangera (metoda „dideoksy”): jest to metoda enzymatyczna; punktem wyjścia jest prąd PCR, następnie dodajemy dideoksynukleotydy (ddNTP zamiast dNTP). Do ddNTP dołączony jest barwnik fluorescencyjny w różnych kolorach – wynik badania to elektroforegram.
NGS (next generations sequencing) – w Polsce analizy całego genomu jeszcze nie przeprowadza, koszt 1,5 tys $, czas 1 tydzień, problemem jest tylko odczyt wyników za względu na ogromną ilość polimorfizmów w obrębie jednego genu; NGS jest to szybka, tania i wydajna metoda, mało precyzyjna w porównaniu z Sangerem. Zastosowanie: sekwencjonowanie całych genów, sekwencjonowanie wyłącznie eksonów.
MLPA – metoda do analizy mikrodelecji, na pograniczu cytogenetyki molekularnej; polega na hybrydyzacji DNA z sondami; zastosowanie: diagnostyka prenatalna i nowotworowa
Ćwiczenie 5
Temat: Choroby monogenowe. Poradnictwo genetyczne.
Poradnictwo genetyczne – udzielenie pomocy osobom chorym lub osobom ryzyka genetycznego w zrozumieniu istoty choroby dziedzicznej, sposobu jej dziedziczenia, a także przekazanie informacji o istniejących możliwościach diagnostyki.
Cele poradni genetycznej:
Uzyskanie pełnej informacji o rozpoznanej chorobie genetycznej, jej przebiegu oraz istniejących możliwości leczenia i rehabilitacji
Zrozumienie istoty genetycznego uwarunkowania choroby oraz ocena jej wystąpienia u określonych członków rodziny
Właściwe zinterpretowanie ryzyka ponownego wystąpienia choroby u potomstwa
Przyjęcie takiego postępowania, które będzie wynikiem decyzji podjętej przez konsultowanych w zgodzie z uzyskaną wiedzą, przekonaniem oraz uznawanymi celami życiowymi
Podjęcie takich form działania, które umożliwiają optymalne przystosowanie chorego do życia w środowisku oraz podjęcie działań zmierzających do zmniejszenia ryzyka ponownego wystąpienia choroby w rodzinie.
Etapy poradnictwa genetycznego:
Ustalenie lub weryfikacja rozpoznania
Analiza rodowodu
Ustalenie ryzyka genetycznego
Przekazanie porady
Koordynacja działań terapeutycznych oraz rehabilitacyjnych (także planów prokreacyjnych)
Ocena efektywności porady
Odległość międzyźreniczna:
- większa od oczekiwanej: hiperteloryzm
- mniejsza od oczekiwanej: hipoteloryzm
Odległość międzykątowa wewnętrzna:
- większa od oczekiwanej przy prawidłowej odległości międzyźrenicznej -> telecanthus
1 cecha dysmorficzna to jeszcze NIE rozpoznanie choroby genetycznej!
Prawa G. Mendla:
I prawo czystości gamet: Z pary alleli do komórek rozrodczych (gamet) przechodzi tylko jeden allel a prawdopodobieństwo połączenia się różnych gamet w procesie zapłodnienia jest jednakowe
II prawo niezależnej segregacji: Geny leżące na różnych chromosomach dziedziczą się niezależnie od siebie.
Choroby autosomalne dominujące (AD):
Z reguły przynajmniej jedno z rodziców osoby chorej również jest chore
Choroba dotyka osoby obu płci
Ryzyko wystąpienia choroby u dziecka osoby chorej i zdrowej wynosi z reguły 50%
Występuje więcej chorób dominujących niż recesywnych
Rodzinna hipercholesterolemia – szybciej chorują mężczyźni, u kobiet z początku łagodniejszy przebieg bo cholesterol jest potrzebny do produkcji estrogenów -> szybkie nasilenie choroby po menopauzie
Mutacja w genie BRCA1 u mężczyzn powoduje wzrost ryzyka wystąpienia raka trzustki
Często są to choroby o późnym początku – w 3., 4., 5. dekadzie życia – np. nowotwory, ch. Huntingtona, zespół Marfana. Możemy być dominującymi nosicielami – dopóki nie wystąpią objawy chorobowe.
Zmienna ekspresja fenotypowa: np. nerwiakowłókniakowatość (Recklinghausena), zespół Marfana
Zespół Noonan – AD; 4-41% przypadków rodzinnych; 3:1 częściej po matce, występowanie 1/1000; cechy dysmorficzne słabo zaznaczone: opadanie powiek, smutny wyraz twarzy, płetwiasta szyja, niska linia włosów na karku, asymetryczne powieki, lekkie upośledzenie umysłowe
Penetracja genu – odsetek osób, które mają mutcję + fenotyp do wszystkich osób z mutacją; np. penetracja 60% kobiet z mutacją BRCA1 -> 60/100 kobiet zachoruje na raka piersi -> daje nam to tzw. „luki genetyczne”; 100% penetracji – achondroplazja (objaw: karłowatość)
Choroba Huntingtona – postępująca choroba neurodegeneracyjna o późnym początku, choroba jest monogenowa, autosomalna, dominująca: 4p16.3, gent IT15 -> białko huntingtonina; objawy: demencja (otępienie podkorowe), zaniki neuronów w obrębie jądra ogoniastego i zwojów podstawy (prążkowie) -> tam odkłada się białko, ruchy mimowolne i trudność w ruchach zamierzonych, zmiany w zachowaniu. Czynnik etiologiczny: mutacja dynamiczna w obrębie genu IT15; sama zmiana nie powoduje objawów choroby, dopiero po zwielokrotnieniu wadliwej trójki nukleotydów pojawiają się objawy. W następnych pokoleniach objawy występują szybciej i są cięższe
10-26 (CAG)n – zakres prawidłowej liczby powtórzeń
> 36 (CAG)n – patogenna ekspresja
27-39 (CAG)n - problematyczna interpretacja wyników
Allele pośrednie: 27-35 powtórzeń
Allele o „niekompletnej penetracji”: 26-39 powtórzeń
Choroby autosomalne recesywne (AR):
Osoby takie mają z reguły zdrowych rodziców, będących bezobjawowymi nosicielami
Choroby dotykają obu płci
Często są charakterystyczne dla dennego terenu – jako przystosowanie ewolucyjne, „mutacje założycielskie”
Ryzyko wystąpienia choroby gdy poprzednie dziecko jest chore wynosi z reguły 25%
Objawiają się wcześnie, objawy muszę być leczone, często są to choroby metaboliczne
Mukowiscydoza – zaburzenie transportu jonów sodowych i chlorkowych, gen CFTR
Fenyloketonuria (PKU):
Nosicielstwo 1:46
420 różnych mutacji
Mutacje R408W stanowi 2/3 wszystkich zachorowań
Defekt enzymu rozkładającego fenyloalaninę (PAA, hydroksylaza fenyloalaninowa): brak tyrozyny do syntezy hormonów i przekaźników, powstają toksyczne metabolity fenyloalaniny które utrzymując się dłużej we krwi i płynach tkankowych powodują toksyczne działanie na rozwijający się układ nerwowy dziecka
Objawy: jasna karnacja, suche, szorstkie włosy, zaburzenia czynności tarczyc, efekt toksyczny, mysi zapach moczu
Skutki nierozpoznania/nieleczenia: upośledzenie umysłowe, małogłowie, drgawki, hiperaktywność niekontrolowane ruchy
Leczenie: dieta bez Phe wzbogacona w Tyr – powinna być stosowana do ukończenia mielinizacji włókien nerwowych, a u kobiet przez cały okres rozrodczy (toksyczne metabolity przechodzą przez łożysko!)
Choroby gonosmalne:
- Sprzężone z ch. X recesywne:
Chore głównie osoby płci męskiej
Chore dzieci zdrowych rodziców: matka jest zdrowym nosicielem i może mieć chorych krewnych: hemofilia, daltonizm, DMD
Kobiety mogą być chore, gdy chory jest ojciec a matka jest nosicielką lub czasem na skutek nielosowej inaktywacji chromosomy X
- Sprzężone z X dominujące:
Kobiety chorują częściej (zasady prawdopodobieństwa), dla mężczyzn często letalne
Rodzinna krzywica hipofosfatemiczna (FNR) – pseudoniedoborowa krzywica wit. D-oporna, wynik zaburzonego wchłaniania fosforanów w kanalikach nerkowych. Rozpoznawana najczęściej po 1 r.ż.: niski wzrost (<3 centyl), szpotawość, chód kaczkowaty, niskorosłość. Nieleczeni dorośli 130-165 cm, dziewczynki mają łagodniejszy przebieg. Diagnostyka: biochemiczna, radiologiczna, genetyczna
- Sprzężone z Y:
Gen SRY – ramię p – geny odpowiedzialne za rozwój jądra, za uruchomienie kaskady mullerowskiej – zaburzenia powodują odwrócenie fenotypowej płci; ramię q – geny spermatogenezy, region AZF, delecja -> zaburzenia spermatogenezy, utrudnienie płodności
Dziedziczenie mitochondrialne:
Duże odstępstwa od praw Mendla – ryzyko ciężkie do określenia
mitDNA także może podlegać mutacjom
najczęściej choroby nerwowo-mięśniowe
choroba Lebera – trwałe uszkodzenie nerwu wzrokowego (neuropatia Lebera), częstsza u chłopców
najwięcej mitochondriów jest w mięśniach, mózgu, wątrobie -> tych narządów dotyczą choroby dziedziczone z mitDNA
dziedziczenie od matki – komórka jajowa ma mitochondria bo żyje długo, a plemnik ma tylko parę mitochondriów, które giną przy odrzuceniu witki podczas zapłodnienia
RYZYKO GENETYCZNE
Jest oceniane jako prawdopodobieństwo wystąpienia zdefiniowanego zaburzenia
Powinno być ocenione ilościowo
Dotyczy zawsze określonej pary
- MAŁE < 5 % (ch. środowiskowe)
- ŚREDNIE 5 - 10 % (ch. wielogenowe, niektóre monogenowe)
- DUŻE > 10 % (zazwyczaj ch. monogenowe)
-Ryzyko teoretyczne:
- wyliczone z praw Mendla dla chorób jednogenowych, rodzinnych aberracji strukturalnych chromosomów
- Ryzyko empiryczne:
- z obserwacji populacyjnych, dla chorób wielogenowych, aberracji liczbowych chromosomów, zespołów wad
Ćwiczenie 6
Temat: Zespoły zaburzeń autosomów i heterosomów. Choroby poligenowe. Wady wrodzone. Cechy dysmorficzne.
Dziedziczenie wielogenowe, wieloczynnikowe - odnosi się do tych procesów, w których choroba lub wada jest rezultatem sumującego się efektu działania jednego lub wielu genów i czynników środowiskowych
Cechy wielogenowe: wzrost, inteligencja, kolor skóry
Choroby dziedziczone wielogenowo: cukrzyca t. 1 i 2, RZS, nadciśnienie tętnicze, schizofrenia, Alzheimer, nowotwory, wady wrodzone, miażdżyca.
Są to choroby bez cech dziedziczenia mendlowskiego z niecharakterystycznym ukł. rodowodu!
Często dana cecha u potomstwa wykazuje regresję do średniej, np. dzieci obojga rodziców muzyków wcale nie muszę być muzykami, albo jak jest 2 wysokich rodziców to dziecko nie musi być wysokie
Ryzyko choroby u krewnych I rzędu:
- AD: 50%
- AR: 25%
- wielogenowe: 0,5-0,9%
W III stopniu pokrewieństwa – ryzyko tych chorób jest właściwie równe ryzyku populacyjnemu
Choroby wielogenowe występują częściej od monogenowych.
Im większa wada tym większe prawdopodobieństw dziedziczenia tej wady!
Czasami różne prawdopodobieństwo u różnej płci:
Kobiety: RZS, dyasplazja bioder
Mężczyźni: nadciśnienie, stopy końsko-szpotawe, wytrzewienie
WADY WRODZONE:
Etiologia wad wrodzonych (wady wrodzone posiadają 2-3% noworodków):
Nieznana (50%)
Wielogenowa (20%)
Monogenowa
Chromosomalna (6%)
Infekcje wrodzone
Leki, alkohol
Gdy znajdujemy jedną wadę, to szukamy następnej, gdyż zazwyczaj występują następczo.
Wady budowy ciała:
Malformacje – wady rozwojowe narządu lub części ciała powstające w wyniku zaburzenia ich rozwoju w pierwszym trymestrze ciąży, co prowadzi do niepewnej lub nieprawidłowej morfogenezy, np. po zażyciu talidomidu
Deformacje – nieprawidłowości budowy, kształtu lub ułożenia jakiejś części ciała spowodowane jej uciskiem wewnątrz macicy
Dysrupcje – wady wynikające z zaburzenia prawidłowego dotychczas rozwoju danego układu lub narządu
Deformacje:
wady powstające zwykle w III trymestrze ciąży pod wpływem czynników mechanicznych
Przyczyny:
wady rozwojowe macicy, np. macica dwurożna
mała macica
mała miednica
guzy macicy (mięśniaki, włókniaki)
małowodzie
nieprawidłowe ułożenie płodu, duży płód
choroby ograniczające możliwości poruszania się płodu – zaburzenia neurologiczne, pierwotne choroby mięśni, wady stawów
- zdeformowaniu ulegają najczęściej kości, stawy i chrząstki
- po urodzeniu – widoczne w postaci:
- skręcenia lub skrzywienia kości
- ograniczenia ruchomości stawów
- spłaszczenia nosa i uszu
- większość deformacji podlega samoistnemu odkształceniu w ciągu kilku miesięcy lub lat
- sekwencja deformacyjna – gdy ucisk mechaniczny wywołuje wiele deformacji, np. sekwencja Potter
Dysrupcje – zespół taśm owodniowych, np. podczas infekcji lub gdy matka ma defekt tkanek kolagenowych. Płód zaplątuje się w taśmę -> może wystąpić martwica pierwotnie prawidłowo wytworzonego narządu, tzw. amputacja wewnątrzmaciczna. są wadami morfologicznymi wynikającymi z przerwania lub zakłócenia pierwotnie prawidłowego procesu rozwojowego
w przeciwieństwie do deformacji – nie są wyłącznie skutkiem działania sił mechanicznych, ale mogą być wywołane przez niedokrwienie, wylew krwi lub zrosty tkankowe
mogą być skutkiem działania czynnika teratogennego lub pojawiać się z nieznanej przyczyny
występują sporadycznie
Wady cewy nerwowej (najczęstsze): holoprosencefalia (nierozejście się płatów czołowych), przepuklina mózgowa (powstaje przez niezamknięcie się dolnego odcinka cewy nerwowej; worek przepuklinowy może przechodzić np. przez gałkę oczną, gorsze rokowania dla worka tylnego -> wada letalna), płody bezczaszkowe, bezmózgowe (100% letalność, niedobór kw. foliowego, powikłania dla matki), przepuklina oponowo-rdzeniowa (najczęstsza z wad cewy nerwowej, może być leczona wewnątrzmacicznie), przepuklina rdzeniowo-kręgowa (niezamknięcie tylnego odc. cewy nerwowej, konsekwencje b. różne, częste problemy ze zwieraczami i z chodzeniem), potworniak kości krzyżowo-guzicznej (rokuje stosunkowo dobrze, poród poprzez cesarskie cięcie, guz jest dobrze unaczyniony - > może to powodować przeciążenie serca -> niewydolność krążenia, często szybsze rozwiązanie ciąży)
Kwas foliowy jest potrzebny do 21 dnia po zapłodnieniu (zamknięcie cewy nerwowej)!!!
Wady serca
Wady przewodu pokarmowego: np. przepuklina pępkowa (stosunkowo dobre rokowania, jest jednym z markerów aneuploidii, im większa tym mniejsze ryzyko wystąpienia zespołu genetycznego, jest wskazaniem do amniopunkcji), niedrożność przewodu pokarmowego
Małogłowie (mikrocefalia) – może występować np. w zespole Edwardsa, toksoplazmozie, fenyloketonurii lub też jako izolowana cecha dziedziczona recesywnie jako cecha monogenowa (wtedy tylko cecha osobnicza)
Wady kończyn
Amelia – całkowity brak kończyny/kończyn
Rozszczep wargi/podniebienia
Wady małżowin usznych
Wodobrzusze (cytomegalia)
Macroglosia – za duży język, może towarzyszyć np. zespołowi Downa