Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego

w Warszawie

Wydział Nauk o Żywności

Julita Mądrzak

Numer albumu 131885

Metody badania wartości odżywczej białek

Methods of analyse the nutritional value of protein

Praca inżynierska

na kierunku – Technologia Żywności i Żywienie Człowieka

Praca wykonana pod kierunkiem

Dr inż. Małgorzaty Piecyk

Katedra Katedra Biotechnologii, Mikrobiologii i Oceny Żywności

Warszawa, 2011 r.

Oświadczenie promotora pracy

Oświadczam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i stwierdzam,
że spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie tytułu zawodowego

Data Podpis promotora pracy

Oświadczenie autora pracy

Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza praca dyplomowa została napisana przeze mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami

Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur związanych z uzyskaniem tytułu zawodowego wyższej uczelni.

Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją elektroniczną.

Data Podpis autora pracy

Składam serdeczne podziękowania mojemu Promotorowi

dr inż. Małgorzacie Piecyk

za życzliwość, pomoc oraz cenne wskazówki,

bez których niniejsza praca nie mogłaby powstać

Streszczenie

Metody badania wartości odżywczej białek

W pracy został scharakteryzowana rola białek, jaką pełnią w organizmie człowieka oraz przemiany jakimi podlega ten składnik żywności. Wartość odżywcza białka jest istotnym wskaźnikiem ogólnej jakości pożywienia, którą warunkują także czynniki fizyczne zachodzące podczas przygotowania i przetwarzania żywności.

W badaniach wartości odżywczej białek stosuje się metody chemiczne, biologiczne i metody krzyżowe. W metodach chemicznych badane białko poddaje się hydrolizie, następnie uzyskaną w jej wyniku mieszaninę aminokwasów rozdziela się za pomocą odpowiednich technik chromatograficznych (IEC, RP-HPLC, GC) lub elektroforetycznych. Takie postępowanie pozwala wyznaczyć wskaźniki wartości białka CS i EAAI. Do biologicznych wskaźników, które wyznaczane są dzięki przeprowadzonym doświadczeniom na zwierzętach, zalicza się: PER, NPR, BV, NPU. W wyniku połączenia powyższych metod możliwe jest wyznaczenie wskaźnika PDCAAS.

Słowa kluczowe: białka, analiza składu aminokwasowego, wartość odżywcza, wskaźniki biologiczne, strawność in vitro

Summary

Methods of analyse the nutritional value of protein

The thesis characterized the roles of proteins that remain in the human body and the changes occurring in it. The nutritional value of protein is an important indicator of the overall quality of food, which is conditioned by the physical factors that occur during the preparation and processing of food.

To analyse the nutritional value of protein are used biological, chemical and cross methods. In chemical methods the protein must by hydrolyzed, then the mixture of amino acids is separated by chromatographic techniques (IEC, RP-HPLC, GC) or electrophoresis techniques. Such kind of procedure allows to determine the CS and EAAI. The biological methods are using experimental animal to determine index such as: PER, NPR, BV, NPU. As a result of a combination of chemical and biological methods can be appoint PDCAAS index.

Key words: protein, amino acid composition analysis, nutritional value, biological index, in vitro digestibility

Spis treści

I. Wstęp 9

II. Cel i zakres pracy 10

III. Przegląd piśmiennictwa 11

1. Wartość odżywcza 11

2. Rola białek 13

3. Czynniki determinujące wartość odżywczą białek 17

4. Metody analityczne wykorzystywane przy oznaczaniu wartości odżywczej białek 20

4.1. Oznaczanie białka ogółem metodą Kjeldahla. 20

4.2. Chemiczne metody analizy składu aminokwasowego próbki 22

4.2.1. Przygotowanie próbki do oznaczenia składu aminokwasowego 22

4.2.2. Derywatyzacja 25

4.2.3. Chromatograficzne metody rozdziału mieszaniny aminokwasów 27

4.2.3.1. Chromatografia jonowymienna (IEC) 28

4.2.3.2. Wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconym układem faz (RP-HPLC) 31

4.2.3.3. Chromatografia gazowa (GC) 33

4.2.3.4. Metody sprzężone 34

4.2.4. Inne metody rozdzielcze- elektroforeza kapilarna (CE) 40

4.2.5. Wyznaczanie chemicznych wskaźników wartości odżywczej białek 41

4.2.6. Metody badania strawności białek in vitro 42

4.3. Metody biologiczne badania strawności białek in vivo 44

4.4. Metoda krzyżowa badania wartości odżywczej białek 46

IV. Podsumowanie 48

V. Spis piśmiennictwa 49

Wstęp

Istotny problem współczesnej populacji stanowi wadliwe żywienie. Może ono mieć poważne konsekwencje dla zdrowia, a nawet życia każdego człowieka. Należy zatem pamiętać, że żywność w zależności od źródła, posiada różną wartość odżywczą.

Odpowiednio zaplanowana dieta to taka, która zgodnie z naszymi zwyczajami żywieniowymi jest odpowiednio zróżnicowana i zbilansowana. Z tego względu analiza poszczególnych składników żywności, w tym białek jest jak najbardziej uzasadniona i ma olbrzymie znaczenie praktyczne. Współcześnie, niezwykle ważne wyzwanie stanowi zatem znalezienie standardowych i porównywalnych metod oznaczania jakości białka w żywności, które dostarczałyby rzetelnych i wiarygodnych informacji. Są one niezbędne do ustalenia odpowiedniej diety zapewniającej pokrycie zapotrzebowania na ten składnik żywności, a także stanowią cenne źródło danych dla przemysłu spożywczego do wytwarzania produktów o możliwie jak najkorzystniejszym składzie aminokwasowym.

Z punktu widzenia wartości odżywczej białka dzieli się na pełnowartościowe, częściowo niepełnowartościowe i niepełnowartościowe. Białka pełnowartościowe to takie, których spożycie dostarcza organizmowi wszystkich niezbędnych aminokwasów w odpowiednich proporcjach, odpowiadających zapotrzebowaniu człowieka. Należą do nich głównie białka mleka i jaj, a częściowo także białka mięsa. Białka częściowo niepełnowartościowe, mimo iż wystarczają organizmowi do życia, nie warunkują prawidłowego wzrostu i rozwoju. Mogą one zawierać wszystkie niezbędne aminokwasy, jednak niektóre z nich występują w niedostatecznych ilościach np. białka zbóż ubogie są w lizynę, białka nasion roślin strączkowych w metioninę. Z kolei białka niepełnowartościowe, w których brak jest co najmniej jednego aminokwasu egzogennego, nie wystarczają do utrzymania organizmu przy życiu.

Cel i zakres pracy

Celem pracy było scharakteryzowanie dostępnych metod oceny wartości odżywczej białka, które jest niezbędne organizmowi człowieka do prawidłowego funkcjonowania, a którego nieodpowiednie ilości i jakość mogą stanowić poważny problem zdrowotny.

Zakres pracy obejmował opis funkcji jakie pełnią białka i wchodzące w ich skład aminokwasy oraz opis przemian jakimi podlegają zarówno w żywym organizmie jak i w trakcie przechowywania, przetwarzania żywności, które jednocześnie wpływają na jego wartość odżywczą. Przedstawiono ponadto charakterystykę dostępnych metod oceny wartości odżywczej białka począwszy od metod chemicznych po metodę krzyżową (biologiczno-chemiczną).

Przegląd piśmiennictwa

Wartość odżywcza

Pojęcie białko (proteina) wywodzi się od greckiego słowa proteo, czyli pierwszy, najważniejszy. Użyte po raz pierwszy w 1839 r. przez sławnego szwedzkiego chemika JÖrsa Berzeliusa [Ettre i Gehrke, 2006].

Wartość odżywcza białek określa stopień w jakim białka zaspokajają metaboliczne potrzeby organizmu. Zależy ona od ich strawności, ilości dostarczanej energii niezbędnej do syntezy białek ustrojowych ze źródeł pozabiałkowych, a także od zawartości i wzajemnych proporcji aminokwasów egzo- i endogennych [Millward i inni, 2008]. Aminokwasy egzogenne nie mogą być syntetyzowane przez organizm człowieka, dlatego ważne jest, by uzupełniać ich niedobór odpowiednią dietą. Częściowy niedobór jednego z nich powoduje ograniczenie, a jego brak uniemożliwia wykorzystanie pozostałych. Do aminokwasów egzogennych zaliczamy: izoleucynę, leucynę, lizynę, metioninę, fenyloalaninę, treoninę, tryptofan, walinę oraz argininę [Jabłoński, 2000].

Najbardziej zbliżony skład aminokwasowy do składu białek ustrojowych znajduje się w białkach jaja kurzego- owoalbuminie i białku mleka- laktoalbuminie. Uznaje się je za białka wzorcowe, czyli takie o optymalnej proporcji między poszczególnymi aminokwasami. Stanowią one podstawę do porównania wartości odżywczej pozostałych białek [Gawęcki, 2010].

Strawność białek zależy od ich pochodzenia, a także od obecności innych składników żywności takich jak: błonnik pokarmowy, inhibitory enzymów trawiennych, stopnia granulacji produktu, rodzaju stosowanej obróbki w trakcie procesu technologicznego. Na strawność białek ma też wpływ stan organizmu konsumenta, jego wiek, stan uzębienia, sprawność układu pokarmowego [Christa i Soral-Śmietana, 2008].

Białka w żywym organizmie syntetyzowane są głównie z odpowiednich aminokwasów, które z kolei powstają w wyniku trawienia i wchłaniania białek pokarmowych [Gałkowska i Gałkowska-Pachota, 2010]. Ogólny schemat metabolizmu białek został przedstawiony na rysunku 1.

Trawienie białek

Trawienie białek zaczyna się w żołądku pod wpływem aktywnej formy pepsynogenu- pepsyny (endopeptydazy żołądka). Aktywacja enzymu zachodzi dzięki kwaśnemu środowisku, jakie panuje w żołądku. Endopeptydaza żołądka hydrolizuje wiązania peptydowe w cząsteczkach białka i w efekcie prowadzi do powstania krótszych łańcuchów polipeptydowych. Dalszy etap trawienia zachodzi w dwunastnicy pod wpływem soku trzustkowego zawierającego uaktywnione enzymy: trypsynę i chymotrypsynę. Trypsyna odpowiada za hydrolizę wiązań między aminokwasami zasadowymi- lizyną i argininą, chymotrypsyna natomiast rozkłada wiązania peptydowe między aminokwasami aromatycznymi. Powstałe w wyniku działania tych enzymów polipeptydy i oligopeptydy są dalej hydrolizowane w jelicie cienkim przy udziale aminopeptydazy i dipeptydazy do aminokwasów.

Aminokwasy wchłonięte w przewodzie pokarmowym trafiają do wątroby przez żyłę wrotną, pozostała natomiast ich część zostaje wykorzystana do regeneracji białka śluzówki w ścianie jelita. Wątroba odpowiada za główne przemiany aminokwasów prowadzące między innymi do powstania aminokwasów endogennych, które transportowane są przez krew i limfę do poszczególnych tkanek i wykorzystywane do budowy nowych komórek, enzymów, hormonów. Niewykorzystane aminokwasy trafiają z powrotem do wątroby, gdzie ulegają degradacji do ketokwasów i NH₃ lub też zostają przekształcone w inne aminokwasy, albo związki pochodne. Toksyczny amoniak wydalany jest w postaci mocznika z moczem. Pozostałe bezazotowe związki ulegają utlenieniu w cyklu kwasów trikarboksylowych i łańcuchu oddechowym do CO₂ i H₂O. W taki sposób aminokwasy stają się dla organizmu źródłem energii. W wyniku przemian rdzeni węglowych takich aminokwasów jak leucyna, izoleucyna, walina i tryptofan, powstaje acetylo-CoA, który wykorzystywany jest do syntezy lipidów. Rozkład alaniny, seryny, cysteiny, treoniny i glicyny prowadzi natomiast do powstania pirogronianiu, który może ulec przemianie do acetylo-CoA i przez to stać się także źródłem tłuszczu [Gawęcki, 2010].

Przemiany histydyny, proliny i argininy prowadzą do uzyskania ketoglutaranu, asparaginianu do szczawioctanu, z kolei rozpad fenyloalaniny i tyrozyny do fumaranu. Związki te wykorzystywane są w dalszych przemianach do syntezy sacharydów i niektórych aminokwasów [Sikorski, 2007; Gawęcki, 2010].

Rola białek

Białka stanowią główny element budowy tkanek organizmu człowieka, a także wielu biologicznie czynnych związków odpowiedzialnych za jego prawidłowe funkcjonowanie. Do tych związków zaliczane są między innymi enzymy i hormony, a także elementy układu odpornościowego- przeciwciała. Białka zapewniają utrzymanie bilansu wodnego i równowagi kwasowo-zasadowej organizmu [Gałkowska i Gałkowska-Pachota, 2010]. Istotne są także ze względu na ich bezpośrednie działanie na metabolizm pozostałych składników żywności takich jak: tłuszcz, węglowodany, witaminy i składniki mineralne [Jabłoński, 2000].

Główne białko mleka (kazeina) ma zdolność wiązania dwuwartościowych kationów metali takich jak wapń. Białka serwatkowe wiążą ponadto magnez, cynk, żelazo, sód i potas [Vegarud i inni, 2000]. Bioaktywne składniki białkowych frakcji w mleku zawierają enzymy, środki bakteriobójcze, hormony, prekursory i czynniki wzrostu [Bos i inni, 2000].

Nowe badania wskazują na wzrastającą rolę białek i aminokwasów w regulacji budowy ciała, zdrowia kości, funkcji żołądkowo-jelitowych, mikroflory bakteryjnej, homeostazy glukozowej [Millward i inni, 2008].

Rola białek organizmie człowieka w dużej mierze zależy od składu aminokwasów. Aminokwasy są ważne nie tylko ze względu na ich bezpośredni udział w syntezie białka i innych związków azotowych, ale pełnią bardzo ważne funkcje metaboliczne [Wang i inni, 2008]. Rola wybranych aminokwasów została przedstawiona w tabeli 1.

Tabela 1. Rola wybranych aminokwasów w organizmie człowieka.

Rodzaj aminokwasu	Funkcja w organizmie człowieka
arginina (Arg)	Istotna rola w produkcji biologicznie ważnych związków takich jak: tlenek azotu, poliamidy, prolina, glutamina, kreatyna. Tlenek azotu jest czynnikiem rozluźniającym mięśnie gładkie, przez co zwiększa się przepływ krwi do mózgu. Wpływa to korzystnie na procesy myślenia i zapamiętywania. Arginina bierze udział w detoksykacji organizmu z amoniaku, który wykazuje działanie toksyczne na ośrodkowy układ nerwowy. Wspomaga układ odpornościowy. Brak odpowiedniej ilości argininy w organizmie, może prowadzić do uszkodzenia nerek, marskości wątroby, nadciśnienia tętniczego, a nawet uszkodzenia komórek mózgu [Wu i inni, 2009].
histydyna (His)	Niezbędna w okresie wzrostu i rozwoju. Histydyna jest prekursorem histaminy, która stymuluje pracę żołądka [Gertig i Przysławski, 2006].
alanina (Ala)	Hamuje aktywność kinazy pirogronianowej, bierze udział w glukoneogenezie, reakcji transaminacji. Jest to składnik koenzymu A i kwasu pantotenowego (wit. B5). W połączeniu z innymi aminokwasami pełni funkcję przeciwutleniającą [Wu,2009].

cd. tabeli 1.

fenyloalanina (Phe)	Odpowiedzialna za prawidłowy rozwój i funkcjonowanie układu nerwowego (stanowi punkt wyjścia do syntezy wielu neuroprzekaźników: noradrenalina i adrenalina) [Wu, 2009]. Bierze udział w syntezie tyrozyny i hormonów tarczycy, dijodotyrozyny, trijodotyrozyny, tyroksyny). Zaburzenia genetyczne objawiające się brakiem enzymu hydroksylazy fenyloalaninowej, prowadzą do nadmiernego gromadzenia się tego aminokwasu i jego metabolitów we krwi i moczu. Choroba ta zwana fenyloketonurią powoduje upośledzenie umysłowe i zaburzenia neurologiczne [Gertig i Przysławski, 2006].
glicyna (Gly)	Bierze udział w syntezie puryny i seryny, porfiryny, tworzeniu hemoprotein (hemoglobiny, mioglobiny, cytochromu c [Wu, 2009]. Obecna w dużych ilościach w kolagenie [Gertig i Przysławski, 2006].
lizyna (Lys)	Sprzyja wchłanianiu wapnia, tworzeniu substancji międzykomórkowej kości, chrząstek i tkanki łącznej. Posiada właściwości antyoksydacyjne [Rhoads i Wu, 2009].
walina (Val)	Odpowiedzialna za prawidłowe funkcjonowanie układu ruchu. Wspomaga utrzymanie prawidłowej masy ciała [Guoyao i inni, 2009].
metionina (Met), cysteina (Cys)	Główne produkty przemian metabolicznych tych aminokwasów (glutation, homocysteina i tauryna) pełnią ważną funkcję w regulacji pracy jelita cienkiego [Wang i inni, 2008]. Cysteina bierze udział w odtruwaniu organizmu [Guoyao i inni, 2009].
kwas glutaminowy (Glu)	Uczestniczy w procesie syntezy białek, glukoneogenezie, transporcie azotu między organami. Wspomaga prawidłowe funkcjonowanie układu immunologicznego organizmu. Zmniejsza ryzyko zajścia apoptozy erytrocytów i komórek limfatycznych. Prekursor syntezy glutationu, argininy i proliny [Wang i inni, 2008].
tryptofan (Trp)	Prekursor serotoniny (przekaźnik pobudzeń do ośrodka sytości) [Bułhak-Jachymczyk, 2008]. W wyniku przemian tryptofanu powstaje kwas nikotynowy (wit. PP). Niedobory powodują niedokrwistość, hipoproteine-mię, zanik tkanek i zahamowanie wzrostu [Gertig i Przysławski, 2006].
leucyna (Leu)	Stymuluje syntezę białek mięśniowych. Aktywator dehydrogenazy glutaminowej [Wu, 2009].

Zarówno niedobór jak i nadmiar białek pokarmowych ma swoje negatywne skutki dla organizmu człowieka. Niedostateczny pobór białka powoduje niedożywienie białkowe. Wyróżnia się trzy rodzaje niedożywienia [Mańkowska i Grzymisławski, 2000]:

• niedożywienie typu marasmus: spowodowane białkowo-kalorycznymi niedoborami. Objawia się zmniejszeniem masy ciała, osłabieniem mięśni, niedokrwistością, upośledzeniem układu immunologicznego, krwionośnego i oddechowego,

• niedożywienie typu kwashiorkor: dalszy etap marasmus lub też pierwotny skutek białkowych niedoborów po stresie pooperacyjnym. Główne objawy związane są ze spadkiem stężenia w surowicy krwi albumin i prealbumin (białek o krótkim okresie półtrwania),

• niedożywienie typu mieszanego: występuje u ponad połowy chorych z niedożywieniem. Objawia się zarówno osłabieniem poszczególnych układów w organizmie człowieka jak i spadkiem białek czynnościowych (albumin).

Organizm człowieka nie posiada zdolności magazynowania białka, jego nadmiar jest natychmiast wykorzystywany w dalszych procesach metabolicznych jako materiał energetyczny. Wiąże to się z wydalaniem odpowiednio większych ilości mocznika, utworzonego z amoniaku w procesie dezaminacji białek [Bułhak-Jachymczyk, 2008] oraz powstaniem glukozy i tłuszczu. Powyższe czynniki, przy braku zapotrzebowania na energię przyczyniają się do powstania nadwagi, otyłości, a także prowadzą do trwałego upośledzenia nerek i wątroby. Wyniki badań eksperymentalnych wykazały negatywną rolę homocysteiny, powstającej przy braku witamin z grupy B i zaburzonym metabolizmie metioniny. Homocysteina skumulowana w nadmiernych ilościach we krwi przyczynia się do rozwoju miażdżycy. Nadmiar białek u dzieci może z kolei spowodować biegunki, objawy kwasicy, odwodnienie i gorączkę [Gawęcki, 2010].

Do innych zagrożeń zdrowotnych związanych głównie z białkami jaj, mleka, roślin strączkowych i zbóż zalicza się alergie pokarmowe. Dotyczą one około 10-20% populacji, szczególnie dzieci. Objawami alergii są głównie: katar, wysypka, obrzęk, biegunka i astma [Gawęcki, 2010]. Reakcje alergiczne związane są z odpowiedzią immunologiczną organizmu na białko, na które dany organizm jest wrażliwy. Produkowane wtedy przeciwciała zwane immunoglobulinami E (IgE), stymulują inne komórki do wytwarzania substancji wywołujących stan zapalny [Bannon, 2004].

Czynniki determinujące wartość odżywczą białek

Zmiany jakości żywności są wynikiem przebiegu różnorodnych procesów, zarówno o charakterze fizykochemicznym, jak i biochemicznym. Decydują one o możliwości technologicznego i żywieniowego wykorzystania żywności i jej składników takich jak białka [Hęś i Korczak, 2007].

Wpływ wysokiej temperatury

Białka są wrażliwe na temperaturę, stopień uwodnienia oraz środowisko alkaliczne. Łagodne ogrzewanie nie wpływa znacząco na wartość odżywczą białek, powoduje natomiast ich denaturację i tym samym utratę aktywności enzymatycznej i hormonalnej. Denaturacja białka jest na ogół procesem pożądanym, ze względu na wzrost dostępności dla enzymów trawiennych obecnych w organizmie człowieka.

Pozytywna rola wysokiej temperatury polega także na [Jabłoński, 2000]:

• niszczeniu czynników antyodżywczych, takich jak: inhibitory trypsyny, hemagluteniny i tioglikozydy;

• wzroście plastyczności masy białkowej;

• rozrywaniu wiązań wodorowych;

W trakcie ogrzewania produktów żywnościowych może dojść do tzw. reakcji Maillarda (rysunek 2). Końcowe produkty tych reakcji- melanoidy wykazują działanie przeciwutleniające, antymutagenne, obniżające poziom cholesterolu oraz stymulujące wzrost bakterii jelitowych. Związki te odpowiadają za zapach, smak oraz barwę produktów żywnościowych. W pierwszym etapie reakcji Maillarda na skutek połączenia się grupy aldehydowej lub ketonowej cukrów prostych (glukozy, fruktozy) z wolnymi grupami aminowymi białek lub aminokwasów, powstają tzw. związki „ Amadori” (amino-deoksy- ketoza) [Michalska i Zieliński, 2007]. Związki te ulegają dalszym przemianom takim jak enolizacja (zmiana ketonu w enol), dehydratacja, kondensacja aldolowa, dając ostatecznie związki aromatyczne i barwniki melanoidowe [Friedman, 1996].

Negatywnym skutkiem zastosowania zbyt wysokiej temperatury rzędu 115-300°C, może być rozpad aminokwasów lub ich niepożądana przemiana do izomerów optycznych o konfiguracji D. Ważną konsekwencją wysokotemperaturowego przetwarzania żywności jest także sieciowanie aminokwasów- z utworzeniem toksycznej lizynoalaniny (w środowisku zasadowym) lub histydynoalaniny- prowadzące do obniżenia strawności białka oraz zmniejszenia biodostępności żelaza, miedzi i cynku [Gałkowska i Gałkowska-Pachota, 2010].

Rysunek 2. Model reakcji Maillarda [Michalska i Zieliński, 2007]

Nadmierne ogrzewanie produktów bogatych w białko prowadzi do zmniejszenia biodostępności wielu aminokwasów, głównie w wyniku utrudnienia trawienia. Szczególnie wrażliwymi na wysoką temperaturę aminokwasami są: cysteina, lizyna, metionina, tryptofan, arginina i leucyna [Jabłoński, 2000].

Do niekorzystnych reakcji między białkami a cukrami może dochodzić także we krwi. Proces ten zwany jest glikacją. Składają się na niego te same etapy co w reakcji Maillarda, prowadzące do utworzenia zaawansowanych końcowych produktów glikacji (AGEs). Glikacja jest procesem powolnym i samoistnym. Jej szybkość zależy w głównej mierze od stężenia glukozy, fruktozy, galaktozy we krwi. Proces łączenia się cząsteczek białka z cukrami przebiega dwuetapowo. Pierwszy- odwracalny etap trwa ok 1 miesiąca do momentu osiągnięcia stanu równowagi, dlatego nie jest osiągalny dla białek o szybkim obrocie w organizmie. Drugi etap jest etapem nieodwracalnym. Ulegają jemu białka pozostające długo w organizmie np. kolagen [Vlassara i Palace, 2002]. Końcowe produkty glikacji między innymi stymulują nieprawidłową aktywność komórek, powodują zmiany kolagenu i przedwczesne starzenie się, ślepotę, wzrost ryzyka agregacji i spadek przeżycia płytek krwi [Brandt i inni, 2008].

Wpływ reakcji utleniania.

Jedną z głównych przyczyn niepożądanych zmian w żywności są reakcje utleniania. Produkty utleniania tłuszczu wpływają na wartość odżywcza pozostałych składników żywności w tym białek.

W produktach mięsnych problem stanowią powstające wiązania sieciujące w kompleksach białkowo-lipidowych oraz produkty oksydacji tłuszczu (nadtlenki, aktywne rodniki, aldehydy, ketony), które wchodzą w reakcję z grupami aminowymi, sulfhydrylowymi i hydroksylowymi aminokwasów. Powstałe usieciowane łańcuchy polipeptydowe są oporne na działanie enzymów proteolitycznych. Powoduje to pogorszenie strawności i stopnia przyswajalności aminokwasów, głównie lizyny, metioniny, cysteiny oraz tyrozyny. Rodzaj i stopień tych przemian zależy od: różnicy temperatur, pH środowiska, koncentracji tłuszczu, typu emulsji oraz ewentualnych dodatków przeciwutleniających i katalizujących reakcje. Produkty utleniania lipidów powodują ponadto uszkodzenia natywnej struktury białka enzymów trawiennych. W wyniku reakcji aldehydów z grupą aminową lizyny powstają bezbarwne zasady Schiffa, które po reakcji aldolizacji i polimeryzacji przechodzą w substancje o brunatnym zabarwieniu. Prekursorami tych reakcji są związki pirolowe powstałe w reakcjach utlenionych lipidów z białkami.

Wykazano, że barwne kompleksy białkowo-tłuszczowe są dość aktywnymi przeciwutleniaczami. Posiadają one podobne właściwości ochronne żywności przed utlenianiem co produkty powstałe w wyniku zajścia reakcji Maillarda.

Problem spadku ilości aminokwasów spowodowany reakcjami utleniania dotyczy głównie cysteiny, metioniny i tryptofanu. Prowadzi to do powstania odpowiednio- kwasu cysteinowego, sulfotlenku z cysteiny lub sulfonu metioniny- z metioniny oraz formyrokynureiny z tryptofanu [Hęś i Korczak, 2007].

Metody analityczne wykorzystywane przy oznaczaniu wartości odżywczej białek

4.1. Oznaczanie białka ogółem metodą Kjeldahla.

Metoda opracowana w 1883r. przez J.G. Kjeldahla, ale nadal powszechnie stosowana ze względu na swoją prostotę i dokładność. Opiera się na założeniu, że cały azot pochodzi z białka i stanowi ok. 16%, stąd w obliczeniach najczęściej stosuje się głównie przelicznik 6,25 [Wierciński, 2004]. Mnożniki białkowe dla różnych białek zostały przedstawione w tabeli 2.

Tabela 2. Mnożniki białkowe dla wybranych białek [Wierciński, 2004]

Rodzaj białka	Wartość mnożnika
Białko jaja kurzego	6,25
Białko mleka (kazeina)	6,38
Białko jęczmienia, kukurydzy, rzepaku, fasoli	6,00
Białko żyta, pszenicy, owsa, grochu, bobu, wyki	5,70
Białko orzeszków ziemnych, łubinu	5,50

.

Metodę Kjeldahla można podzielić na 3 etapy [Klepacka, 2005]:

1. Mineralizacja próbki

Proces realizowany na jednorodnej próbce poprzez gotowanie ze stężonym kwasem siarkowym w obecności następujących katalizatorów: siarczanu miedzi, rtęci, mieszaniny selenowo-miedziowej. Prowadzi do przekształcenia organicznej formy azotu w jon amonowy (NH₄⁺) zgodnie z równaniem:

Azot organiczny + xH₂SO₄ → xCO₂ + y(NH₄)₂SO₄ + zSO₂

1. Destylacja

Dodanie zasady np. sodowej (NaOH) w celu neutralizacji kwasu, powoduje w następstwie konwersję jonu NH₄⁺ do amoniaku (NH₃) (1), który odzyskiwany jest w wyniku destylacji, a następnie wiązany w nadmiarze kwasu borowego (H₃BO₃) lub kwasu solnego (HCl). Kwas tworzy z amoniakiem rozpuszczalne jony amonowe zgodnie z równaniem 2 i 3:

1. (NH₄)₂SO₄ + 2NaOH → Na₂SO₄ + 2H₂O + 2NH₃↑

2. NH₃ + 2H₃BO₃ → 2NH₄H₂BO₃

3. HCl + NH₃ → NH₄Cl

1. Miareczkowanie

Oddestylowany amoniak miareczkuje się mianowanym roztworem HCl (1) lub H₂SO₄ (2) do momentu zmiany barwy z zielonej na fioletowo-różową. Zmiana barwy wynika z dodatku wskaźnika Toshiro (mieszanina czerwieni metylowej i błękitu mety-lenowego w alkoholowym roztworze) na etapie destylacji do kwasu borowego. Na podstawie wyników miareczkowania oblicza się następnie zawartość azotu w badanym materiale.

1. 2NH₄H₂BO₃ + HCl → 2NH₄Cl + 2H₃BO₃

2NH₃ + HCl → 2NH₄Cl

1. 2NH₄H₂BO₃ + H₂SO₄ → (NH₄)₂SO₄ + 2H₃BO₃

2NH₃ + H₂SO₄ → (NH₄)₂SO₄

Tabela 3 przedstawia zawartość białka dla wybranych produktów spożywczych.

Tabela 3. Zawartość białka w wybranych produktach spożywczych [Klepacka, 2005]

Produkt spożywczy	Zawartość białka (%)
owoce	<1,0
ziemniak	2,0
mleko	3-4
twaróg	20
mięso	12-22
jaja	12
nasiona strączkowe	27-44

Nowoczesne urządzenia analityczne posiadają wysoce zautomatyzowany system oznaczania azotu, który zwiększa szybkość i dokładność oznaczania. W jego skład wchodzą między innymi: aparat do mineralizacji, jednostka do destylacji oraz miareczkowania [Klepacka, 2005].

4.2. Chemiczne metody analizy składu aminokwasowego próbki

Metody chemiczne w sposób szybki i prosty dostarczają informacji o jakości danego białka. Nie uwzględniają natomiast czynników biologicznych związanych z ustrojem, przez co są mniej precyzyjne. Opierają się na wyznaczeniu składu aminokwasowego badanego białka i porównaniu go do składu białka wzorcowego [Gawęcki, 2010]. Analiza może ponadto obejmować oznaczenie tzw. profilu wolnych aminokwasów lub też określenie zawartości w badanym materiale aminokwasów specyficznych takich jak tryptofan czy aminokwasy siarkowe. Analiza aminokwasowa składa się z dwóch zasadniczych etapów: przygotowania próbki i właściwej analizy aminokwasów [Gałkowska i Gałkowska-Pachota, 2010].

Znajomość profilu aminokwasów ma duże znaczenie przy wzbogacaniu żywności w aminokwasy egzogenne i produkcji środków specjalnego przeznaczenia żywieniowego [Gałkowska i Gałkowska-Pachota, 2010].

4.2.1. Przygotowanie próbki do oznaczenia składu aminokwasowego

Analiza aminokwasów jest niezbędnym etapem do określenia całkowitego profilu aminokwasów jako głównego czynnika warunkującego wartość odżywczą białek. Umożliwia ona tym samym wyznaczenie wskaźników chemicznych jakości białka i współczynników strawności in vitro. Rozdział mieszaniny aminokwasów dokonuje się głównie za pomocą jednej z technik chromatograficznych lub elektroforetycznych po uprzedniej hydrolizie badanego białka [Gałkowska i Gałkowska-Pachota, 2010].

Zarówno hydroliza białka, rozdział mieszaniny aminokwasów jak i ich późniejsza detekcja nie są łatwymi procesami. Powstałe trudności spowodowane są głównie: wysoką polarnością, niską lotnością oraz brakiem mocnych grup chromoforowych w cząsteczkach poszczególnych aminokwasów [Petritis i inni, 2002]. W większości przypadków nie jest możliwe ilościowe oznaczenie wszystkich aminokwasów wchodzących w skład badanego białka. Glutamina i asparagina mogą być hydrolizowane do odpowiednio kwasu glutaminowego i kwasu asparaginowego. Tryptofan ulega całkowitej destrukcji w procesie hydrolizy kwasowej, natomiast cysteina w takich warunkach może ulec oksydacji. Prolina nie może być wykrywa w przypadku zastosowania aldehydu ortoftalowego (OPA) jako czynnika derywatyzującego, gdyż nie posiada ona podstawowej grupy aminowej, niezbędnej do procesu upochadniania. Dopiero zastosowanie podchlorynu sodu oraz chloraminy jako czynnika utleniającego umożliwia detekcję drugorzędowych amin [Salchert i inni, 2003].

Hydroliza

Hydroliza białka jest pierwszym etapem w analizie białek, prowadzącym do ich rozłożenia na poszczególne aminokwasy. Poprawnie i kompletnie przeprowadzony proces zasadniczo wpływa na efektywność analizy. Wybór odpowiedniej metody hydrolizy zależy od celu przeprowadzanej analizy [Weiss i inni, 1998].

Klasyczną i najpowszechniejszą metodą hydrolizy jest hydroliza kwasowa, w której stosuje 6-molowy kwas solny w temp. 110°C przez 20-24h. W przypadku białek zawierających dużo wiązań między takimi aminokwasami jak: walina, izoleucyna i leucyna, wymagane jest wydłużenie czasu hydrolizy nawet do powyżej 72h [Kroll i inni, 1998]. Do oznaczenia metioniny i tryptofanu używa się głównie kwasu metanosulfonowego (MSA) [Weiss i inni, 1997], zmniejszając tym samym stopień racemizacji aminokwasów w porównaniu do hydrolizy kwasem solnym [Weiss i inni, 1997].

Hydroliza kwasowa może spowodować całkowitą lub częściową destrukcję niektórych aminokwasów. Najbardziej wrażliwy na ten typ hydrolizy jest tryptofan, który ulega całkowitemu rozkładowi, seryna i treonina niszczone są natomiast częściowo [Engelhad i inni, 1990]. Do oznaczania specyficznych aminokwasów takich jak: tryptofan, metionina, cystyna i cysteina oraz glutamina i asparagina, wprowadza się różne modyfikacje, które ograniczają ich destrukcję podczas hydrolizy (tabela 3) [Gałkowska i Gałkowska-Pachota, 2010].

Innym stosowanym rodzajem hydrolizy jest hydroliza zasadowa, stosowana w przypadku oznaczania tryptofanu oraz produktów zawierających dużą ilość węglowodanów. Do tego celu używa się głównie NaOH lub KOH. Nie jest do jednak powszechnie stosowana metoda ze względu na całkowitą destrukcję takich aminokwasów jak: seryna, treonina, arginina i cysteina oraz na ryzyko racemizacji pozostałych [Fountoulakis, 1998].

Tabela 4. Sposoby modyfikacji hydrolizy kwasowej białek

	CZYNNIK	EFEKT DZIAŁANIA
Modyfikacje parametrów procesu	Zastosowanie do ogrzewania próbki promieniowania mikrofalowego (750W)	Redukcja czasu hydrolizy (najbardziej optymalne wyniki po 2h), wzrost racemizacji aminokwasów, większe straty seryny i treoniny [Weiss i inni, 1997; Kroll i inni, 1998].
	Zastosowanie obojętnego gazu (argonu)- hydroliza w stanie gazowym	Zmniejszenie stopnia oksydacji [Weiss i inni, 1997].
	Wzrost stężenia kwasu solnego	Wzrost ilości uwolnionej waliny i izoleucyny, znaczny wzrost degradacji tyrozyny i seryny (przy stężeniu powyżej 6M) największe ilości rozdzielonej treoniny przy 6 M HCl [Albin i inni, 2000].
Dodatek substancji chemicznych	Kwas tioglikolowy, fenol, tryptamina	Chroni tryptofan, cysteinę i metioninę przed rozkładem [Fountoulakis i Lahm, 1998].
	Kwas nadmrówkowy (PFA)	Utlenia cysteinę i metioninę do stabilniejszej formy kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny, redukując straty tych aminokwasów podczas hydrolizy [Albert i inni, 2008].
	Azydek sodu 0,2%	Zapobiega procesowi oksydacji cysteiny i metioniny przeprowadzając je w stabilniejsze formy odpo-wiednio kwasu cysteinowego, sulfonu i sulfotlenku metioniny [Manneberg i inni, 1995].
	Kwas merkatanoetanosulfonowy (MES-OH)	Zamiana utlenionej formy metioniny do metioniny i ochrona indolowej grupy tryptofanu przed utlenie-niem [Csapó i inni, 2008].
	Mieszanina 30% H2O2 i 88% kwasu mrówkowego (1:9, obj.)- przed hydrolizą	Redukcja strat aminokwasów siarkowych: metioniny i cysteiny [Gałkowska i Gałkowska-Pachota, 2010; Wang i inni, 2009].
	Substancje przeciwutleniające: -fenol -siarczan(IV) sodu -dwusiarczyn sodu (SMBS)	Ochrona labilnych aminokwasów, seryny, treoniny [Gałkowska i Gałkowska-Pachota, 2010; Lisiewska i inni, 2008,], argininy i fenyloalaniny [Janssen i inni, 1986].

Hydroliza enzymatyczna jest najłagodniejszą i najbardziej zbliżoną do tej zachodzącej w przewodzie pokarmowym. Nie powoduje rozkładu i racemizacji aminokwasów. Ze względu na powolny i skomplikowany przebieg reakcji oraz niepełną hydrolizę białka (spowodowaną między innymi obecnością inhibitorów proteaz), metoda ta nie znajduje szerszego zastosowania [Wei i Zhimin, 2006]. Parametry procesu ustala się według stosowanych preparatów enzymatycznych (głównie jest nim mieszanina trypsyny, chymotrypsyny i pepsyny). Optymalne pH dla trypsyny i chymotrypsyny wynosi 8, natomiast dla pepsyny 2. Zastosowanie wyższego ciśnienia rzędu 100-200 MPa przez 15 min w temp. 37°C przyczynia się do wzrostu koncentracji aminokwasów. Powyżej ciśnienia 300 MPa zauważa się z kolei gwałtowny spadek ilości aminokwasów, co jest najprawdopodobniej spowodowane ich agregacją [Peñas i inni, 2004].

4.2.2. Derywatyzacja

Reakcje derywatyzacji (upochadniania) aminokwasów umożliwiają powstanie cząsteczek o mocniejszych grupach chromoforowych lub też fluoroforowych, co eliminuje w dużej mierze problemy związane z ich późniejszą detekcją. Następuje ponadto wzrost ich lipofilowości, co z kolei umożliwia ich dokładniejszy rozdział. Najczęściej derywatyzacja aminokwasów przeprowadzana jest podczas analizy chromatograficznej. Ma to wpływ na podstawowe parametry tego procesu: selektywność, rozdzielczość i kształt pików [Petritis i inni, 2002]. Proces przekształcania oznaczanych substancji w pochodne schematycznie przedstawia rysunek 3.

Wyróżnia się dwie główne metody derywatyzacji [Fountoulakis i Lahm, 1998]:

1. Derywatyzacja przed detekcją (post-column derivatisation)- po wyjściu badanych substancji z kolumny. Rozwinęła się jako pierwsza, stosowana głównie w połączeniu z kationowowymienną chromatografią cieczową. Głównym odczynnikiem stosowanym w tej metodzie jest ninhydryna. Jej zaletą jest niezawodność i powtarzalność wyników oraz możliwość zastosowania do oznaczania większości aminokwasów. Metoda z zastosowaniem ninhydryny odznacza się jednak małą czułością (analiza substancji o stężeniu powyżej 100 pmol). Innymi stosowanymi odczynnikami są: fluorescamina (obniżona granica wykrywalności do 20 pmol), 2-merkaptoetanol- ME, aldehyd ortoftalowy (OPA) (oznaczenie związków o stężeniu 1 pmol). Nie wchodzą one jednak w reakcję z proliną, jeżeli pierścień imidazolowy nie zostanie otwarty w wyniku oksydacji [Fountoulakis i Lahm, 1998].

2. Derywatyzacja przed wprowadzeniem analitu do kolumny (pre-column derivatisation). Stosowana głównie z wysokosprawną chromatografią cieczową z odwróconym układem faz (RP- HPLC). Odznacza się wysoką czułością, granica wykrywalności wynosi około 1 pmol. Powszechnie stosowanymi odczynnikami w tej metodzie są: OPA, fluorometylooksykarbonyl (FMOC), chlorek fluorometylo-oksykarbamylu (FMOC-Cl), fenylotiokarbamyl (PTC), fluoresceino-tiokarbamyl (FTC), chlorek dansylu, chlorek dabsylu (DABS-Cl), karbaminian 6-aminochinolilo-N-hydroksysukcinimidylu (AQC) [Fountoulakis i Lahm, 1998], izotiocyjanian fenylu (PITC) [Albin i inni, 2000].

W przypadku chromatografii cieczowej z odwróconym układem faz preferowana jest derywatyzacja przed wprowadzeniem analitu na kolumnę ze względu na lepszą separację mniej polarnych pochodnych w porównaniu z niezmienioną formą aminokwasów [Hušek i Šimek, 2001]. Jednym z powszechniej używanych odczynników jest OPA [Fountoulakis i Lahm, 1998].

OPA w obecności grup surhydylowych reaguje z podstawowymi grupami aminowymi aminokwasów w tym z grupami ε-aminowymi lizyny, dając fluoryzujące pochodne (rysunek 4). W celu korekty pH (optymalne pH dla reakcji 6-9) stosuje się jako roztwory buforowe (bufor fosforanowy- PBS lub boran sodu). Reakcja z OPA przebiega w ten sam sposób co reakcja z fluorescaminą. OPA jest jednak odczynnikiem trwalszym, lepiej rozpuszczalnym, o większej czułości [Held, 2001].

Rysunek 4. Reakcja aldehydu ortoftalowego z podstawowymi grupami aminowymi [Held, 2001]

Csapó ze współpracownikami (2008) w swoim doświadczeniu zbadali wpływ kwasu merkatanoetanosulfonowego (MES-OH) na efekt rozdziału mieszaniny aminokwasów oznaczanych za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconym układem faz (RP-HPLC) w połączeniu z OPA. Przedmiotem analiz była kukurydza, soja i produkt mięsny. Uzyskane wyniki zostały porównane z tymi uzyskanymi przy zastosowaniu chromatografii jonowymiennej i ninhydryny jako czynnika upochadniającego. Na ich podstawie stwierdzili, że MES-OH może poprawić efekt hydrolizy, a także umożliwia przekształcenie aminokwasów w odpowiednie pochodne. W połączeniu z OPA dokładniej oznaczane są takie aminokwasy jak: treonina, seryna, metionina i tyrozyna, niżeli jest to w przypadku zastosowania ninhydryny jako czynnika upochadniającego i IEC jako metody rozdziału. Nie jest możliwe natomiast oznaczenie cysteiny i tryptofanu w próbkach zawierających dużą ilość węglowodanów.

4.2.3. Chromatograficzne metody rozdziału mieszaniny aminokwasów

Chromatografia jest metodą rozdziału składników pomiędzy dwie fazy: ruchomą (mobilną) i nieruchomą (stacjonarną). Faza stacjonarna może być w postaci ciała stałego, cieczy na nośniku lub też żelu. Fazę ruchomą z kolei tworzy: ciecz, gaz, lub ciecz w stanie nadkrytycznym (fluid). Znalazła ona szerokie zastosowanie zarówno w analizie jakościowej jak i ilościowej mieszanin. W połączeniu z metodami spektroskopowymi możliwa jest analiza nawet najbardziej skomplikowanych układów [Szczepaniak,2002].

Oznaczenie ilościowe opiera się na zależności między powierzchnią lub wysokością danego piku, a jego stężeniem lub masą w analizowanej próbce [Kamiński i Kartanowicz, 2004].

Retencja i stopień rozdziału zależny jest od następujących parametrów [Kamiński i Kartanowicz, 2004]:

• typ powierzchni sorpcyjnej wypełnienia kolumny;

• uboczne oddziaływania na powierzchni sorbentu;

• powierzchnia właściwa fazy stacjonarnej;

• wielkość i porowatość ziaren wypełnienia kolumny;

• skład, pH, temperatura i prędkość przepływu eluentu;

• ciśnienie podczas rozdziału.

Najczęściej stosowanymi metodami chromatograficznymi rozdziału mieszaniny aminokwasów są: chromatografia jonowowymienna (z ang. Ion Exchange Chromatography- IEC), wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconym układem faz (z ang. Reverse Phase- Hight Performance Liquid Chromatography- RP-HPLC) oraz chromatografia gazowa, głównie do oznaczania metioniny i cysteiny w żywności [Gałkowska i Gałkowska-Pachota, 2010].

W celu poprawy dokładności metody analizy aminokwasów stosowane są wzorce wewnętrzne. Umożliwiają one monitorowanie fizycznych strat i zmian chemicznych zachodzących podczas oznaczenia. Wzorzec wewnętrzny najczęściej dodawany jest już na etapie hydrolizy lub jak to jest w przypadku oznaczania wolnych aminokwasów, które zachowują się one inaczej, niżeli aminokwasy związane w białkach- przed wprowadzeniem mieszaniny na kolumnę [Internet 2]. Najczęściej stosowanymi wzorcami wewnętrznymi w analizie aminokwasów są: norleucyna, α-metylotryptofan (oznaczanie ilościowe tryptofanu) oraz norwalina [Csapó i inni, 2008].

4.2.3.1. Chromatografia jonowymienna (IEC)

Zasada rozdziału w chromatografii jonowymiennej opiera się na różnicy w ładunku jonów między substancją badaną a powierzchnią sorpcyjną kolumny (tzw. wymieniaczem jonowym), stanowiącym w układzie fazę nieruchomą (stacjonarną) [Kamiński, 2004]. Reakcje wymiany zachodzą stechiometrycznie i są to reakcje odwracalne [Michalski i Łyko, 2008].

Proces rozdziału przebiega przez następujące etapy [Wierciński, 2004]:

1. Dyfuzja jonów badanej substancji do powierzchni ziaren jonitu;

2. Dalsze przenikanie jonów elektrolitu do wnętrza ziaren;

3. Wyparcie jonu jonitu z kompleksu jonowego wypełniacza;

4. Dyfuzja wypartego jonu do roztworu.

Poszczególne jony pochodzące z próbki zatrzymywane są przez jonit w różnym stopniu, zależnym od stopnia ich powinowactwa do fazy stacjonarnej [Michalski i Łyko, 2008]. Stosując odpowiedni gradient soli lub też zmieniając pH roztworu buforu, przepuszczanego przez kolumnę, dokonuje się stopniowej elucji substancji związanych z powierzchnią wymieniacza [Głod, 2009].

Wymieniacze jonowe należą do wielkocząsteczkowych, nierozpuszczalnych w wodzie i większości rozpuszczalników organicznych substancji o budowie jonowej. Posiadają one zdolność wymiany własnych jonów na jony występujące w roztworze.

Fazę ruchomą w chromatografii jonowymiennej stanowią najczęściej wodne roztwory buforowe, których moc elucyjna zależy od odpowiedniego pH. Zwiększenie pH może spowodować w przypadku chromatografii kationowowymiennej wzrost czasu retencji, natomiast w przypadku chromatografii anionowowymiennej jego spadek [Szczepaniak, 2002].

Stosując odpowiedni gradient soli lub też zmieniając pH roztworu buforu dokonuje się stopniowej elucji substancji związanych z powierzchnią wymieniacza [Głod, 2009]. Yu ze współpracownikami (2003) wykazali w swoim eksperymencie, iż zastosowanie samego wodorotlenku sodu jako eluentu nie pozwala oznaczyć takich aminokwasów jak: kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, cysteina, tyrozyna. Dopiero zastosowanie mocniejszego buforu, takiego jak octan sodu pozwala wymyć powyższe aminokwasy. Ma to związek z ilością grup karboksylowych- aminokwasy o dwóch takich grupach mocniej wiążą się z wymieniaczem przez co trudniej jest je wymyć z kolumny. Dodatkowo wzrost koncentracji octanu sodu w większym stopniu wpływa na czas retencji aminokwasów z dwiema grupami karboksylowymi o większym ładunku. Wzrost temperatury kolumny w zakresie 25-40°C powoduje wzrost czasu retencji dla waliny, izoleucyny i leucyny oraz jego spadek dla seryny i metioniny. Spowodowane jest to najprawdopodobniej tym, iż retencja aminokwasów może być zarówno procesem egzo- jak i endotermicznym. Jest to pomocne przy rozdziale pików blisko siebie eluujących aminokwasów takich jak np. seryna i prolina, które w temp. 25°C dają wspólny pik, natomiast w temp. 35°C dają już oddzielne piki.

Następnym etapem w analizie chromatograficznej jest detekcja otrzymanych aminokwasów. Zarówno w chromatografii jonowowymiennej jak i RP-HPLC można stosować te same detektory takie jak: detektor spektrofotometryczny pracujący w zakresie UV/Vis lub detektor fluorescencyjny (z ang. Fluorescens Detector- FLD) [Jaćkowska i inni, 2009].

Yokojama ze współpracownikami (1996) dokonali analizy 18 aminokwasów w sokach owocowych za pomocą chromatografii kationowowymiennej. Temperatura pracy kolumny o wymiarach 150x4,6mm wynosiła 30°C. Wypełnienie kolumny stanowiła modyfikowana, porowata krzemionka o wysokiej czystości. Do elucji użyto odpowiednio: 5-mM soli siarczanu dodecylu (SDS), 10-mM kwasu chlorowego VII (HClO₄) i acetonitrylu (ACN). Derywatyzację za pomocą OPA-ME została przeprowadzona po wyjściu badanych substancji z kolumny przed detekcją fluorymetryczną (FLD) (przy długości fali wzbudzenia λ_wz= 340nm i emisji λ_em= 430nm) [cyt za Molnár-Perl, 2003].

W przypadku chromatografii jonowymiennej na uwagę zasługuje tzw. automatyczny analizator aminokwasów –AAA (ang. Amino Acid Analyzer), skonstruowany po raz pierwszy przez Spackmanna, Moora i Steina. Rozdziału mieszaniny aminokwasów dokonano na kolumnie jonowymiennej (K), stosując octan sodu (bufor) jako eluent, wprowadzany w sposób ciągły przez pompę (P). Uzyskane anality zostały następnie przekształcone w pochodne za pomocą ninhydryny w teflonowym wężu kapilarnym (W). Powstałe zabarwienie zmierzono za pomocą detektora kolorymetrycznego (D) i zapisano w rejestratorze (R). Zasadę działania pierwszego AAA przedstawia rysunek 5 [Jakubke i Jeschkeit, 1989].

Rysunek 5. Schemat automatycznej analizy aminokwasów według Spackmanna, Moore’a i Steina [Jakubke i Jeschkeit, 1989]

Współcześnie, wiele firm takich jak Sykam, Dionex, INGOS ciągle dokonuje ulepszeń AAA mających na celu skrócenie czasu i poprawę dokładności przeprowadzanych oznaczeń. Firma Dionex proponuje takie rozwiązanie (AAA-Direct), w którym to proces derywatyzacji nie jest konieczny. Umożliwia on analizę aminokwasów znajdujących się w mięsie, sokach owocowych i warzywnych, piwie, winie metodą anionowowymiennej chromatografii w połączeniu z detektorem amperometrycznym (z ang. Integrated Pulsed Amperometric Detection (IPAD)) [Instrukcja 1].

System Dionex zastosował Yu ze współpracownikami (2003), dokonując analizy 19 aminokwasów (Arg, Lys, Glu, Asp, Ala, Thr, Gly, Val, Ser, Pro, Iso, Leu, Met, His, Phe, Glu, Asp, Cys, Tyr) o granicy wykrywalności 0,15-4,54 pmol w czasie ok. 60 min. Do wymycia oznaczanych substancji zastosowano trzystopniową elucję gradientową z zastosowaniem wody, 250-mM wodorotlenku sodu i 1-M octanu sodu. Wypełnienie kolumny o wymiarach 250 x 2 mm stanowiła hydrofobowa żywica.

4.2.3.2. Wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconym układem faz (RP-HPLC)

Wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconym układem jest to chromatografia adsorpcyjna, w której retencja i rozdział składników substancji zależy od stopnia hydrofobowości molekuł. Faza stacjonarna stanowi układ niepolarny w przeciwieństwie do fazy ruchomej, będącej fazą polarną [Ackley i Caruso, 2003].

Faza stacjonarna modyfikowna najczęściej grupami oktadecylowymi (C₁₈) (określana też jako faza związana) posiada na swojej powierzchni niepolarne łańcuchy węglowodorowe lub też alkilonitrylowe. Stopień hydrofobowości fazy nieruchomej wzrasta wraz ze zwiększającą się liczbą atomów węgla w łańcuchu węglowodorowym. Do najczęściej stosowanych sorbentów należą fazy związane na bazie żelu krzemionkowego, polimery poli(styreno-diwinylobenzenu), poliakrylany i polimetakrylany o małych ziarnach (3-10 μm). Jedne z nowszych wypełnień- tzw. fazy monolityczne otrzymywane są poprzez modyfikację żelu krzemionkowego lub polimeru w postaci kolumny z wnętrzem w postaci porowatego prętu. Takie rozwiązanie gwarantuje mniejsze zużycie rozpuszczalników i skrócenie czasu analizy. Faza ta stosowana jest głównie w przypadku połączenia chromatografii cieczowej z spektrometrem mas [Kamiński i Kartanowicz, 2004].

Fazę ruchomą stanowi natomiast mieszanina wody i rozpuszczalnika organicznego (najczęściej jest nim acetonitryl- ACN, metanol- MeOH i tetrahydrofuran- THF). Zmniej-szenie czasu retencji następuje przy wzroście siły elucyjnej, spowodowanej zmianą składu fazy ruchomej. W przypadku znacznych różnic w czasach retencji rozdzielanych związków zmiana ta może przebiegać w sposób ciągły lub skokowy. Jest to tak zwana elucja gradientowa. Najpierw rozdzielane są substancje najbardziej polarne, niskocząsteczkowe, a na końcu niepolarne, wysokocząsteczkowe [Kamiński i Kartanowicz, 2004; Coenegracht i inni, 1989].

Bezpośredni wpływ na rozdział badanych substancji ma wpływ temperatura komuny. Większość kolumn umieszczona jest w termostacie, przez co możliwa jest regulacja temperatury jej pracy, a także modyfikacja czasów retencji. Najczęściej temperatura pracy kolumny wynosi 40°C. Wyższa, mimo iż polepsza jakość pików, może skrócić czas życia kolumny, powodując uszkodzenia fazy stacjonarnej [Guzzetta, 2001].

RP-HPLC jako metodę rozdziału mieszaniny aminokwasów w połączeniu z detektorem UV/VIS (detekcja przy długości fali λ= 254nm), wykorzystali w swoim eksperymencie Janssen ze współpracownikami (1986). Dokonali oni rozdziału 23 aminokwasów (Cya, Asp, Glu, Cys (Cm)- karboksymetylocysteina, Hyp, Ser, Gly, His, Arg, Thr, Ala, Pro, Met (O₂), Tyr, Val, Met, (Cys)₂, Ile, Leu, Nle- norleucyna, Phe, Trp, Lys) w kolumnie z wypełnieniem na bazie żelu krzemionkowego modyfikowanego grupami oktadecylowymi (ODS) o wielkości ziaren 5μm. Temperatura pracy kolumny wynosiła 45°C. Fazę ruchomą stanowiły następujące odczynniki: octan sodu, trietyloamina, kwas octowy. Derywatyzację oznaczanych związków przeprowadzono przed wprowadzeniem analitu do kolumny za pomocą PTC.

Analizy aminokwasów w serze dokonał Bütikofer ze współpracownikami (1991) w układzie wyposażonym w kolumnę z fazą ODS i detektorem fluorescencyjnym. Fazę ruchomą stanowił wodny roztwór octanu sodu, zasady sodowej i tetrahydrofuranu oraz mieszanina trójhydratu octanu sodu, zasady sodowej i acetonitrylu. Temperatura pracy kolumny wynosiła 42°C Do derywatyzacji został użyty OPA i FMOC. Wzorcem wewnętrznym była norwalina. Powyższe warunki umożliwiły analizę 16 następujących aminokwasów: Asx (kwas asparaginowy i asparagina), Glx (kwas glutaminowy i glutamina), Ser, His, Gly, Thr, Ala, Arg, Tyr, Val, Met, Ile, Phe, Leu, Lys, Pro.

Niezwykle trudna ze względu na dużą zawartość cukru, jest analiza wolnych aminokwasów w winie. Herbert ze współpracownikami (2000) stosując wysokosprawną chromatografię cieczową w połączeniu z detektorem fluorescencyjnym przeprowadzili analizę wina typu porto. Zarówno proces derywatyzacji, rozdziału jak i detekcji był w pełni zautomatyzowany. Udało im się oznaczyć 21 aminokwasów: Asp, Glu, Asn- asparagina, Ser, Gln, His, Gly, Thr, Ala, Arg, Tyr, Val, Met, Trp, The, Ile, Leu, Lys, Pro, Hyp- hydroxyprolina. Wzorcami wewnętrznymi była norwalina dla aminokwasów pierwszo-rzędowych i sarkozyna w przypadku aminokwasów drugorzędowych. Odczynnikiem użytym do derywatyzacji był OPA i FMOC-Cl. Rozdziału dokonano na kolumnie C18 HP AminoAcid Analysis o wymiarach 200x2,1 mm, stosując elucję gradientową. Długość fali wzbudzenia i emisji dla podstawowych aminokwasów wynosiły odpowiednio λ_wz=340nm i λ_em= 450nm, natomiast dla aminokwasów drugorzędowych λ_wz=337nm i λ_em= 340nm.

4.2.3.3. Chromatografia gazowa (GC)

Chromatografia gazowa należy do jednej ze skuteczniejszych metod rozdziału złożonych mieszanin związków lotnych [Szczepaniak, 2002]. Daje ona porównywalne wyniki jak chromatografia jonowymienna [Fountuulakis i Lahm, 1988].

W chromatografii gazowej badana próbka wprowadzana jest do dozownika, gdzie ulega odparowaniu (temperatura dozownika wynosi 150-250°C), po czym mieszana jest ze strumieniem gazu nośnego i wprowadzana do kolumny. Objętość wprowadzanej do kolumny kapilarnej próbki wynosi od 0,01 do 0,001μl, dlatego często stosuje się dzielniki strumienia redukujące o 100-300 razy ilość badanej próbki. Dzięki dzieleniu strumienia uzyskuje się bardziej ostre piki, łatwiejsze do analizy. Niewykorzystana pozostałość usuwana jest bezpowrotnie na zewnątrz. Rozdzielone substancje trafiają dalej do detektora i powodują powstanie w nich sygnałów elektrycznych, które po odpowiednim wzmocnieniu są rejestrowane w komputerze lub rejestratorze [Szczepaniak, 2002].

Gaz nośny (wodór, hel, argon, azot), stanowiący fazę ruchomą odpowiada za transport par analizowanych substancji do systemu chromatograficznego bez interakcji z jego składnikami. Źródłem gazu jest wysokociśnieniowa butla. Ważne jest, by gaz pozbawiony był tlenu i wilgoci. Nawet niewielka ich ilość może przyczynić się do zniszczenia kolumny i detektora. By tego uniknąć stosuje się specjalne skrubery. Wybór odpowiedniego gazu może być uzależniony od stosowanego detektora. Najczęściej stosowanym do detekcji związków organicznych gazem nośnym jest wodór [Patnaik i Pradyot, 2004].

W chromatografii gazowej przeważnie stosuje się kolumny kapilarne o średnicy od 0,1 do 1 mm i długości do 300m. Wykonane są one ze szkła lub stopionego kwarcu. Długość kolumny ma znaczący wpływ na analizę otrzymanych pików. Im jest ona dłuższa, tym czasy retencji są większe a różnice między czasami retencji dwóch substancji są wyraźniejsze. Dłuższy jest także czas analizy, co powoduje większe rozmycie się pików. Sprawność kolumny w takim przypadku jest zdecydowanie gorsza. Innym ważnym parametrem decydującym o jakości rozdziału jest temperatura kolumny [Szczepaniak, 2002]. By wyeliminować zjawisko jonizacji cząsteczek fazy ciekłej, związanej z separacją składników rozdzielanej mieszaniny, nie powinna ona przekraczać temperatury równej górnemu limitowi pracy kolumny pomniejszonemu o 50°C [Muth i inni, 2007].

Wypełnienia kolumn stanowi ciało stałe (adsorbent) lub też ciecz umieszczona na nośniku. Adsorbentami o najszerszym zastosowaniu w GC są: kopolimery diwinylobenzenu i styrenu, diwinylobenzenu i etylostyrenu, diwinylobenzenu i akrylonitrylu. W przypadku fazy ciekłej najczęściej stosuje się średniopolarne silikony [Szczepaniak, 2002].

Niezwykle ważny przy uzyskaniu jak najlepszych wyników pomiaru jest proces derywatyzacji aminokwasów. W chromatografii gazowej warto zwrócić uwagę na dwie metody derywatyzacji ze względu na ich prostotę i szybkość. Pierwsza z nich bazuje na jednoczesnej reakcji grupy α-aminowej i karboksylowej z 1,3-dichlorotetrafluoroacetonem, po której następuje acylacja łańcucha bocznego w obojętnym medium. Druga natomiast polega na modyfikacji grup aminokwasowych diazometanem w eterowym ekstrakcie. Takie metody upochadniania w połączeniu z GC umożliwiają analizę aminokwasów w czasie ok 30 min [Hušek i Šimek, 2001].

Najczęściej stosowanymi detektorem w chromatografii gazowej jest uniwersalny detektor płomieniowo-jonizacyjny (z ang. Flame Ionization Detector- FID), czuły na prawie wszystkie związki organiczne. Składniki próbki spalane są w płomieniu wodorowym, przez co następuje jonizacja. Powstały w ten sposób prąd jonowy jest odpowiednio wzmacniany i rejestrowany przez potencjometr. Sygnał z detektora jest w przybliżeniu proporcjonalny do masy danej substancji [Patnaik i Pradyot, 2004].

Chromatograf gazowy w połączeniu z detektorem FID wykorzystali Montilla ze współpracownikami (2007) do analizy lizynoalaniny w gotowanych jajach oraz w serze. Taki układ umożliwia także analizę pozostałych aminokwasów takich jak: lizyna i arginina. Próbki zostały zhydrolizowane za pomocą 6 mol/dm³ HCl, poddane derywatyzacji N-metylo-N-(t-butylodimetylosililanem) trifluoroacetamidu (MTBSTFA) a następnie wprowadzane na kolumnę z wypełnieniem na bazie krzemionki. Gazem nośnym był azot o natężeniu prze-pływu 20 ml/min. Temperatura pracy dozownika i detektora wynosiła 280 i 300°C. Jako wzorzec wewnętrzny został zastosowany kwas 2,6-diaminopimelinowy (DPA).

4.2.3.4. Metody sprzężone

Chromatografia gazowa w połączeniu ze spektrometrem mas (GC-MS)

Spektrometria mas w połączeniu z technikami chromatograficznymi jest jedną z najskuteczniejszych metod analizy jakościowej, ilościowej i strukturalnej złożonych związków o niewielkim stężeniu badanego składnika [Szczepaniak, 2002]. Charakteryzuje się wysoką czułością i selektywnością. Próg wykrywalności waha się w granicach 10^-9 mol/dm³ do 10¹² mol/dm³ [Muth i inni,2007].

Chromatograf gazowy może być połączony z detektorem MS bezpośrednio lub za pomocą separatora. Zadaniem separatora jest usunięcie gazu nośnego, by próbka docierająca do spektrometru była pod ciśnieniem atmosferycznym [Szczepaniak, 2002].

Metoda oznaczenia badanych substancji zachodzi w analizatorze mas po procesie jonizacji. Opiera się ona na segregacji jonów według stosunku ich mas do ładunku (m/z) [Ruszczyńska i Bulska, 2005].

Jonizacja

Wyróżnia się wiele sposobów jonizacji. Poniżej zostaną opisane dwie najpowszechniejsze: jonizacja elektronami i jonizacja chemiczna.

W jonizacji elektronami wykorzystuje się wiązkę elektronów (obdarzonych energią najczęściej 70eV), której źródłem jest katoda ogrzewana prądowo do temperatury kilku tysięcy stopni, wykonana z trudno topliwych metali: wolframu lub renu. Wiązka ta, zderzając się z badanymi cząstkami, powoduje oderwanie się od nich elektronów i powstanie tzw. jonów molekularnych (M^+* ) :

M + e → M^+* + 2e

Nadmiar dostarczanej energii może powodować dalszy rozpad jonów molekularnych na jony fragmentacyjne (parzysto-elektronowe (A⁺) i nieparzysto-elektronowe (A^+*), które z kolei mogą ulegać dalszym rozkładom, dając nowe jony fragmentacyjne [Muth i inni, 2007; Zieliński, 2000]:

M^+* → A⁺ + R^* (rodnik)

M^+* → A^+* + m (cząsteczka obojętna)

Jonizacja elektronami stosowana najczęściej przy detekcji mieszanin rozdzielanych metodami chromatografii gazowej [Ruszczyńka i Bulska, 2006].

Podczas jonizacji chemicznej dochodzi do zderzenia wiązki elektronów z gazem reagującym (metan, izobutan, amoniak) co skutkuje powstaniem jonu molekularnego CH₄⁺ . Ten z kolei reaguje dalej tworząc jony wtórne (CH₅⁺ i C₂H₅⁺). Jony wtórne gazu reagującego łatwo oddają proton badanym cząsteczkom:

CH₅⁺ + M → MH⁺ + CH₄

C₂H₅⁺ + M → MH⁺ + C₂H₄

Powstałe jony MH⁺ są to tak zwane pozorne jony molekularne o dużej stabilności i intensywności (intensywność względna nawet 100%).

Wysoka próżnia w komorze jonizacyjnej uniemożliwia wzajemne zderzenie się cząsteczek i jonów analitu, przez co możliwe jest uzyskanie powtarzalnych widm masowych podczas kolejnych analiz. Powstałe jony pod wpływem napięcia rzędu 2-8 kV, po opuszczeniu źródła trafiają do analizatora (separatora mas) [Muth i inni, 2007; Zieliński, 2000].

Analizator mas stanowi najważniejszy element, który warunkuje parametry pracy spektrometru mas. Do najczęściej używanych należą analizatory kwadrupolowe (z ang. Ion Trap Detector- ITD) w połączeniu z jonizacją w plazmie wzbudzonej. Analizatory kwadrupolowe zbudowane są z czterech hiperbolicznych lub walcowatych elektrod o średnicy 1,2 cm i długości 25 cm ułożonych na planie kwadratu. Odznaczają się odpornością na próżnię rzędu ok. 667*10⁵Pa, prostą budową, niewielkim rozmiarami a także niską ceną. Rozdzielczość m/z takiego filtru wynosi ok. 300, przy zakresie rozdzielanych substancji nieprzekraczającym 3000u. Istnieje ponadto możliwość modyfikacji powyższych parametrów, zmieniając składowe polaryzacji (stałe i zmienne napięcie przykładane do prętów kwadrupola) [Ruszczyńska i Bulska, 2005].

Oznaczenia aminokwasów w serze i gotowanych jajkach przy pomocy GC-MS z jonizacją elektronami, dokonała Montilla wraz ze swoimi współpracownikami (2007). Chromatograf gazowy został połączony z analizatorem kwadrupolowym. Do rozdziału użyto kolumnę HP-5MS o wymiarach 30 m x 0,25 mm. Derywatyzację za pomocą N-metylo-N-(t-butylodimetylosililanem) trifluoroacetamidu (MTBSTFA), przeprowadzono przed wpro-wadzeniem analizowanych substancji na kolumnę. Gazem nośnym był hel. Temperatura pracy układu zmieniała się w zakresie od 80°C do 300°C.

Podobny układ do oznaczania ok 25 aminokwasów (Ala, Gly, Val, Leu, Iso, Pro, Asp, Gln, Met, Ser, Thr, Phe, Asp, Cys, Cys-Cys, Glu, Hyp, Asn, Lys, His, Tyr, Trp) opisuje Stenerson (2007). Analizę wykonano przy użyciu kolumny SLB-5ms z pokryciem opartym o 5% fazę fenylową. Temperatura w dozowniku wynosiła 250°C, natomiast temperatura pieca zmieniała się w zakresie 100-360°C. Jako gaz nośny został zastosowany hel o natężeniu przepływu 1 ml/min. Zakres przemiatania filtru kwadrupolowego wynosił 40-450 m/z.

Przykład zastosowania techniki sprzężonej- EZ: faast

Metoda służąca szybkiej i precyzyjnej analizie aminokwasów w czasie nieprzekraczającym 15 min (24 min dla LC/MS) nawet w bardzo złożonych matrycach. Zestaw zawiera wszystkie elementy niezbędne do przeprowadzenia oczyszczania, derywatyzacji i ulepszenia analizy aminokwasów przy pomocy GC/FID, GC/MS oraz LC/MS w około 384 próbkach. Granica wykrywalności dla większości aminokwasów wynosi 1nmol/ml. Zestaw testowy do LC/MS umożliwia jednorazowe oznaczenie co najmniej 50 aminokwasów. W przypadku zastosowania GC/MS nie jest możliwy pomiar między innymi takich aminokwasów jak arginina i cysteina [Badawy i inni, 2008].

Metoda z wykorzystaniem EZ:faast składa się z 8 następujących po sobie etapów [Internet 6]:

1. Łączenie badanej próbki z wewnętrznym standardem (norwaliną).

2. Wprowadzenie próbki do końcówki (tipsu) zawierającej sorbent SPE.

3. Usuwanie zanieczyszczeń ze złoża SPE za pomocą roztworu oczyszczającego (np. 1-propanolu).

4. Przeniesienie aminokwasów wraz z sorbentem do fiolki, unikając tym samym strat aminokwasów.

5. Derywatyzacja w temperaturze pokojowej za pomocą chloromrówczanu alkylu.

6. Wprowadzenie na kolumnę chromatograficzną fazy organicznej zawierającej aminokwasy przy użyciu automatycznego podajnika próbek. Jednocześnie dokonuje się kolejnego oczyszczania próbki.

7. Rozdział na kolumnie chromatograficznej.

8. Analiza otrzymanych pików.

Przykłady zastosowań Ez:faast w różnych produktach spożywczych na podstawie katalogu firmy Phenomenex z 2009 r. przedstawia tabela 5. Analizy mieszanin aminokwasów zostały przeprowadzone metodą chromatografii gazowej w połączeniu z spektrometrem mas lub detektorem płomieniowo-jonizacyjnym. Temperatura w dozowniku i detektorze FID dla każdego oznaczenia wynosiła odpowiednio 250°C i 320°C. Jako wzorzec wewnętrzny została zastosowana norwalina o stężeniu 200μmol/l.

Tabela 5. Przykłady zastosowań EZ:faast w analizie składu aminokwasowego białek różnych produktów spożywczych [Instrukcja 2]

Produkt spożywczy	Detektor	Gaz nośny	Natężenie przepływu gazu nośnego	Temperatura pracy kolumny	Oznaczane aminokwasy
Piwo	FID	Hel	1,1 ml/min	110°C- 320°C, wzrost temp o 30°C na każdą min.	Ala, Gly, Val, Nor, Leu, Iso, Ser, Pro, Asp, Asn, Glu, Phe, His, Tyr, Trp
Herbata	MS, 45-450 m/z	Hel	1,1 ml/min	110°C- 320°C, wzrost temp o 32°C na każdą min	Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Pro, Asn, Asp, Glu, Phe, Tyr, Trp
Hydrolizat mąki kukurydzianej	FID	Hel	1,5 ml/min	110°C- 320°C, wzrost temp o 30°C na każdą min.	Ala, Gly, Val, Leu, Iso, Thr, Ser, Pro, Asp, Met, Hyp, Glu, Phe, Lys, His, Tyr
Ziemniak	FID	Hel	1,5 ml/min	110°C- 320°C, wzrost temp o 30°C na każdą min.	Ala, Gly, Val, Leu, Iso, Thr, Ser Pro, Asn, Asp, Met, Glu, Phe, Gln, Lys, His, Tyr, Trp, Ser
Sok pomarańczowy	FID	Hel	1,5 ml/min	110°C- 320°C, wzrost temp o 32°C na każdą min.	Ala, Gly, Val, Leu, Iso, Thr, Ser, Pro, Asn, Asp, Met, Glu, Phe, Gln, Lys, His, Tyr, Trp

Chromatografia cieczowa w połączeniu ze spektrometrem mas i analizatorem czasu przelotu (LC-TOF-MS)

Idealny instrument do szybkiego rozdziału i identyfikacji związków w matrycach próbki charakteryzujących się złożonym składem. Zaletami tej metody są między innymi: szybkość pozyskania danych, szeroki zakres dynamiki oraz wysoka czułość. Technika ta umożliwia szybką analizę ok 19 aminokwasów w czasie ok. 3 min przy użyciu monolitycznej kolumny, z prędkością rozdziału równą 2ml/min. W metodzie tej jako odczynnik parujący jony stosuje się kwas tetrafluoroheksanokarboksylowy [Kennedy, 2005].

W powyższej technice wykorzystywany jest analizator czasu przelotu (z ang. Time of Flight- TOF). Podstawą rozdziału jest różniąca prędkości jonów o różnych masach w polu elektrycznym. Czas przelotu poszczególnych jonów wynika z ich masy, ładunku i energii kinetycznej [Ruszczyńska i Bulska, 2005].

W chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrem mas stosuje się krótkie (30-100 mm) kolumny z wypełnieniem na bazie krzemionki, które pracują tak dobrze jak i te dłuższe, przy czym są tańsze i charakteryzują się mniejszymi stratami ciśnienia [Guzzetta, 2001].

Chromatografia cieczowa w połączeniu ze spektrometrem mas i elektrorozpylaniem (LC-ESI-MS)

Połączenie chromatografii cieczowej z spektrometrem mas, w której to jony powstają w wyniku rozpylania w silnym polu elektrycznym (3kV-6kV)- (z ang. Electrospray Ionisation- ESI). Zastosowanie takiego źródła jonów pozwala oznaczyć substancje występu-jące w ilości rzędu pikomoli (pmol). Jako fazę ruchomą zaleca się stosowanie acetonitrylu i 0,05% wodnego roztworu kwasu nonafluorowalerianowego (NFVA). Technika ta znajduje zastosowanie przy oznaczaniu wolnych aminokwasów w takich produktach jak: napoje bezalkoholowe, sake, ocet, surowce roślinne- ekstrakty herbaty [Erxleben, 2009; Ruszczyńska i Bulska, 2006].

Elektrorozpylanie jako technika jonizacji odpowiednia jest przy analizie aminokwasów ze względu na obojnaczy i zależy od pH ujemny charakter jonów. Polega na odparowaniu rozpuszczalnika z kropelek, które następnie kurczą się i są rozrywane. Kropelki rozczepiają się na coraz to mniejsze do momentu, aż pole elektryczne będzie na tyle silne by spowodować ich desorpcję [Ruszczyńska i Bulska, 2006].

4.2.4. Inne metody rozdzielcze- elektroforeza kapilarna (CE)

Elektroforeza kapilarna należy do jednej z nowszych metod analitycznych. Po raz pierwszy wykorzystana na przełomie lat 80 i 90 ubiegłego stulecia. Współcześnie, technika ta znajduje zastosowanie w analizie żywności, zanieczyszczeń środowiska, badaniach klinicznych, farmaceutycznych, biochemicznych. Umożliwia oznaczenia aminokwasów w takich produktach jak: soki, piwo, wino [Cieślik i inni, 2008].

Zasada rozdziału w elektroforezie kapilarnej opiera się na różnicy w prędkościach jonów obdarzonych ładunkiem w stałym polu elektrycznym [Szczepaniak, 2002]. W technice tej stosuje się zazwyczaj kwarcowe kapilary o średnicy 25-100μm i długości 20-100cm. Wypełnienie kapilary stanowi roztwór elektrolitu (bufor) o określonym pH, który również znajduje się w naczynku w którym umieszcza się kapilarę razem z elektrodami.

Odmianą CE jest między innymi micelarna chromatografia elektrokinetyczna (Micellar Electrokinetc Chromatography- MEKC). Podczas rozdziału cząstki polarne pozostają w buforze, natomiast niepolarne wnikają w micele, utworzone w wyniku dodania tzw. surfaktanta (związek powierzchniowo czynny). Metoda ta umożliwia zatem rozdział cząsteczek obdarzonych ładunkiem jak i tych elektrycznie obojętnych [Cieślik i inni, 2008].

W połączeniu z różnymi technikami detekcji takimi jak: FLD, MS, detektor laserowy fotodyspersyjny (z ang. Laser Light Scattering Detector- LLSD), detektor z matrycą diodową (z ang. Diode Array Detector- DAD), dostarcza nowych możliwości w analizie między innymi aminokwasów. Poniżej zostanie opisany jedynie detektor laserowy fotodyspersyjny ze względu na jego cechy, szczególne przydatne w analizie aminokwasów [Hušek i Šimek, 2001].

Detektor laserowy fotodyspersyjny działa na zasadzie odparowania rozpuszczalnika w rozpylaczu, po czym następuje pomiar światła rozproszonego przez zawieszone w strumieniu gazu (azotu) cząstki nielotne w celi pomiarowej. Pary rozpuszczalnika nie wpływają na wynik pomiaru dlatego ten typ detektora dobrze się sprawuje w warunkach eluucji gradientowej. LLSD umożliwia detekcję związków obecnych w niewielkiej ilości (10-20ng) bez procesu upochadniania. Czas pełnej analizy wynosi 40-80min [Hušek i Šimek, 2001].

Elektroforezę kapilarną jako metodę rozdziału aminokwasów zawartych w piwie i brzeczce w kwarcowej kapilarze opisuje firma Lumex w swojej instrukcji. Aminokwasy zostają przekształcone w pochodne za pomocą PTC, a następnie oznaczone poprzez pomiar ich absorbancji przy długości fali λ= 254 nm. Napięcie prądu elektrycznego wynosiło +25kV. Powyższe warunki umożliwiają analizę następujących 16 aminokwasów: Arg, Lys, Tyr, Phe, His, Leu, Iso, Met, Val, Pro, Ala, Gly, Cys, Try, Asp, Glu [Instrukcja 3].

4.2.5. Wyznaczanie chemicznych wskaźników wartości odżywczej białek

Wskaźnik aminokwasu ograniczającego (WAO)- z ang. Amino Acid Score (AAS) lub Chemical Score (CS)

Metoda Blocka i Mitchela (1946). Określa stosunek zawartości ograniczającego aminokwasu egzogennego w badanym białku (a_x) do zawartości tego samego aminokwasu w białku standardowym (a_s) zgodnie ze wzorem [Bobko i inni, 2009]:

$$CS = \ \frac{a_{x}}{a_{s}} \times 100$$

Aminokwas ograniczający, jest to aminokwas egzogenny występujący w najmniejszej ilości w porównaniu do wzorca, przez co nie jest możliwe zupełne wykorzystanie pozostałych aminokwasów zawartych w pożywieniu [Gawęcki, 2010].

Zintegrowany wskaźnik aminokwasów egzogennych – z ang. Essential Amino Acids Index (EAAI)

Obliczany jako średnia geometryczna stosunku zawartości aminokwasów egzogennych (a₁, …, a_n) oraz histydyny (w przypadku produktów przeznaczonych dla niemowląt) w badanym białku do zawartości tych aminokwasów w białku standardowym (a_as,…, a_ns) z następujących wzorów [Bobko i inni, 2009]:

EAAI =  10^logEAA

gdzie log EAA:

$$\log{\text{EAA} = \ \frac{1}{10}}\ (\log\frac{a_{1}}{a_{1s}} \times 100 \times log\frac{a_{2}}{a_{2s}} \times 100 + \ldots + \log\frac{a_{n}}{a_{\text{ns}}} \times 100)$$

W tabeli 6 zostały przedstawione wartości powyższych wskaźników dla białek wybranych produktów spożywczych.

Tabela 6. Wartość współczynnika AAS i EAAI dla wybranych produktów spożywczych [Jabłoński, 2000]

Produkt spożywczy	AAS	Aminokwas ograniczający	EAAI
mleko w proszku	0,61	aminokwasy siarkowe	0,88
cielęcina	0,56	aminokwasy siarkowe	0,78
kasza manna	0,50	Lys	0,80
dorsz	0,71	Fen + Tyr	0,84
sernik	0,60	aminokwasy siarkowe	0,87
kapusta biała	0,53	aminokwasy siarkowe	0,82
soja	0,61	aminokwasy siarkowe	0,78
żelatyna	0,05	Try	0,24

4.2.6. Metody badania strawności białek in vitro

Metody in vitro badania strawności białek polegają na imitacji warunków jakie panują podczas rozkładu białek w układzie trawiennym ssaków.

Badane białko trawione jest za pomocą określonej sekwencji lub mieszaniny enzymów proteolitycznych występujących w żołądku i trzustce [Castro i inni, 2000]. Następnie stosując głównie techniki chromatograficzne przeprowadza się rozdział mieszaniny na poszczególne aminokwasy [Tuan i inni, 1999]. Uzyskane w ten sposób informacje służą do określenia wskaźników jakości białka z wykorzystaniem metod matematycznych, bazujących na niebudzących wątpliwości danych, dotyczących głównie strawności białek. Metody badań in vitro są tańsze i mniej czasochłonne niż metody biologiczne [Phimphilai i inni, 2006].

Pepsin Digest Reside Index (PDR)

Wskaźnik wyznaczony przez Sheffnera w 1956r. Określony poprzez połączenie procesu trawienia białek in vitro z wzorcem niezbędnych aminokwasów.

Próbka zawierająca 1g badanego białka inkubowana jest z dodatkiem 25mg pepsyny i 30ml 0,1-molowego roztworu kwasu siarkowego VI (H₂SO₄) przez 24 godziny. Niestrawione białka strąca się za pomocą wolframianu VI sodu i 0,66- molowego kwasu siarkowego (VI). Znając profil aminokwasów dla substratu i rozpuszczalnego wyciągu po hydrolizie (określony metodami mikrobiologicznymi), można wyznaczyć model aminokwasów dla niestrawionej pozostałości odejmując te wartości od siebie. Zawartość każdego aminokwasu wyrażana jest w procentach w stosunku do zawartości wszystkich niezbędnych aminokwasów. Obie kolumny danych porównywane są następnie ze wzorcem białka jaja kurzego [cyt za Owusu-Apenten, 2002].

Pepsin Pancreatin Digest Index (PPD)

Współczynnik wprowadzony przez Akesona i Stahmnanna w 1964r.

Próbka białek hydrolizowana jest pepsyną w niskim pH, zneutralizowana i następnie traktowana pankreatyną. Tak rozpuszczony produkt jest zagęszczany, suszony liofilizacyjnie i poddany analizie aminokwasów przy użyciu jonowymiennej chromatografii. Metoda obliczania PPD jest taka sama jak w przypadku PDR [Owusu-Apenten, 2002].

Wskaźnik PPD wykazuje wysoką współzależność ze wskaźnikiem BV (z ang. Biological Value), otrzymanym metodami biologicznymi [Raghunath i Narasinga Rao, 1984].

Strawność in vitro- In Vitro Digestability Estimate (IVD)

Wyznaczany metodą wieloeznymatyczną wg Hsu w 1977 przy użyciu 3 enzymów: trypsyny, chymotrypsyny i peptydazy [cyt za Boody i Desborough, 1984]. Roztwór białka doprowadza się najpierw do pH=8, a następnie dodaje mieszaninę 3 enzymów. Strawność IVDE oblicza się po 10 min do doświadczenia zgodnie ze wzorem [Christa i Soral-Śmietana, 2008]:

IVD = 201, 464  18, 103A

gdzie A- pH próbki po 10 min.

Computed Protein Efficiency Ratio (C-PER) i Discriminant Computed Protein Efficiency Ratio (DC-PER)- wg AOAC

Jednoczesne użycie metody C-PER I DC-PER zapewnia dokładną analizę jakości białka obecnego w większości produktów i składników żywności [AOAC Official Method 982.30, 1982]. Szacowana jest na podstawie profilu aminokwasów i strawności badanej in vitro. Do hydrolizy używa się takich enzymów jak trypsyna trzustkowa, peptydaza jelitowa, α-chymotrypsyna trzustkowa, proteaza bakteryjna. DC-PER liczony jest podobnie jak C-PER, z tą różnicą, iż do obliczeń wykorzystuje się strawność wyznaczoną na podstawie profilu aminokwasów. Oba współczynniki wyznacza się w porównaniu z kazeiną jako białkiem standardowym [Phimphilai i inni, 2006].

Tabela 7 przedstawia przykładowe wartości powyższych wskaźników dla różnych produktów i surowców spożywczych.

Tabela 7. Wskaźniki wartości odżywczej białka wyznaczanego metodą in vitro [Boody i Desborough, 1984; Phimphilai i inni, 2006, Sawaya i inni, 1984]

Rodzaj białka/ produktu spożywczego	PDR (%)	PPD (%)	IVD (%)	C-PER	DC-PER
jaja kurze	100	100	100	bd*	bd
mleko krowie	bd	87	bd	bd	bd
gryka	bd	bd	83	bd	bd
soja	73	68	75,2	bd	bd
ziemniak	bd	bd	72,5	bd	bd
albumina	91	bd	69	bd	1,72-2,18
kazeina	63	79	90	2,5	bd
mąka jaglana	bd	bd	bd	1,38	bd
odtłuszczone zarodki pszenne	bd	bd	bd	2,14	2,39

bd*- brak danych

4.3. Metody biologiczne badania strawności białek in vivo

Metody te oparte na oznaczaniu przydatności białka w pożywieniu, do budowy nowych i wymiany białek w już istniejących tkankach organizmu zwierząt doświadczalnych. Wyrażane są w jednostkach bezwzględnych albo w porównaniu z białkiem standarowym, którego wartość przyjmuje się za 100% [Rutkowska, 1981].

Wydajność wzrostowa białka (WZB)- z ang. Protein Efficiency Ratio (PER)

Wyznaczana jako przyrost masy ciała szczurów karmionych dietą testową zawierającą 10-12% białka przez 6 tygodni. Zgodnie ze wzorem [Gawęcki, 2010]:

$$\text{PER} = \frac{\text{przyrost}\ \text{masy}\ ciala\ \lbrack g\rbrack}{spozycie\ bialka\ \lbrack g\rbrack}$$

Ilość spożytego białka określa się na podstawie różnicy w zawartości azotu zawartego w paszy i azotu w odchodach metodą Klejdahla, stosując współczynnik przeliczeniowy na białko- 6,25 [Delisle i inni, 1985].

Względna wydajność wzrostowa białka- z ang. Relative Protein Efficiency Ratio (RPER)

Liczona jako stosunek PER badanego białka (PER_x) do PER białka wzorcowego (PER_w) [Jabłoński, 2000].

$$\text{RPER} = \ \frac{\text{PER}_{X}}{\text{PER}_{W}}$$

Retencja białka netto- z ang. Net Protein Retention (NPR)

Modyfikacja metody PER. Określa przyrost masy ciała zwierząt karmionych dietą białkową z uwzględnieniem strat masy ciała zwierząt żywionych dietą bezbiałkową [Kotlarz, 2000]:

$$NPR = \frac{\text{przyrost\ m.c.}\left\lbrack g \right\rbrack ubytek\ m.c.na\ diecie\ bezbiakowej\ \lbrack g\rbrack}{\text{ilo}sc\text{\ spo}z\text{ytego\ bia}lka\ \lbrack g\rbrack}$$

Wartość biologiczna białka (WBB)- z ang. Biological Value (BV)

Określa stosunek azotu zatrzymanego w ustroju uwzględniając poprawki na ilość wydzielonego azotu z kałem i moczem w okresie karmienia dietą bezbiałkową [Gawęcki, 2010]:

$$BV = \frac{N - \lbrack\left( N_{k} - N_{\text{ko}} \right) - (N_{m} - N_{\text{mo}})}{N_{\text{spo}z} - (N_{k} - N_{\text{ko}})}*100\%$$

gdzie:

N_spoż- ilość azotu spożytego;

N_k- ilość azotu wydalanego z kałem w okresie karmienia testowaną dietą

N_m- ilość azotu wydalanego z moczem w okresie karmienia testowaną dietą

N_ko- ilość azotu wydalanego z kałem w okresie karmienia dietą bezbiałkową

Wykorzystanie białka netto (WBN)- z ang. Net Protein Utilisation (NPU)

Określa ilość azotu zatrzymanego w ustroju 21-30 dniowych szczurów, karmionych przez 10 dni dietą z badanym białkiem [Gawęcki, 2010]:

$$NPU = \frac{N_{b} - N_{\text{bo}}}{N_{spoz}} \times 100\%$$

gdzie:

N_b- ilość azotu oznaczoną w tuszkach karmionych dietą zbadanym białkiem

N_bo- ilość azotu oznaczoną w tuszkach karmionych dietą bezbiałkową

N_spoż- ilość azotu spożytego

Tabela 8 przedstawia zestawienie powyższych współczynników dla wybranych produktów spożywczych.

Tabela 8. Wartość odżywcza białka wybranych produktów spożywczych mierzona różnymi wskaźnikami [Gawęcki, 2010; Jabłoński, 2000; Kotlarz, 2000]

Produkt spożywczy	PER	RPER (%)	NPR	BV (%)	NPU (%)
jaja kurze	3,8	136	bd	93	94
wieprzowina	2,1-2,5	bd	bd	80	78
drób	2,1-2,5	96	bd	77	75
mleko krowie	2,8	124	bd	91	82
pszenica	1,5	44	2,48	bd	50
żyto	bd	bd	2,51	bd	65
soja	2,1	120	bd	bd	66

4.4. Metoda krzyżowa badania wartości odżywczej białek

Wskaźnik aminokwasu ograniczającego skorygowany o współczynnik strawności rzeczywistej – ( z ang. Protein Digestibility Corrected Amino Acid Score- PDCAAS)

Metoda uznana przez FAO/WHO za najbardziej odpowiednią metodę oceny jakości białek w produktach spożywczych. Uwzględnia zarówno zawartość badanego białka w próbce, jego profil aminokwasowy i strawność [Gilani i Sepehr, 2003].

PDCAAS jest połączeniem metody chemicznej z metodą biologiczną badania jakości białek. W badanej próbce oznacza się zawartość azotu metodą Kjeldahla i przelicza na ilość białka stosując mnożnik- 6,25 [Owusu-Apenten, 2002]. Następnie, badane białko poddaje się hydrolizie i rozdziela na kolumnie chromatograficznej. Strawność wyznacza się na podstawie badania in vivo jako współczynnik strawności rzeczywistej TD (True Digestability) zgodnie ze wzorem [Castro i inni,2000]:

$$\text{TD}\left( \% \right); = \left\{ \frac{\left\lbrack N_{\text{spo}z} - \left( N_{k} - M_{k} \right) \right\rbrack}{N_{spoz}} \right\} \times 100\%$$

gdzie:

N_spoż- ilość azotu spożytego

N_k- ilość azotu wydalanego z kałem

M_k- metaboliczne straty azotu wydalonego z kałem

$$PDCAAS = \frac{\text{zawarto}sc\text{\ aminokwas}o\text{w\ }\left( \text{mg} \right)w\ 1\ g\ badanego\ bial\text{ka}}{\text{zawarto}sc\text{\ aminokwas}o\text{w\ }\left( \text{mg} \right)w\ 1\ g\ bial\text{ka\ wzorcowego}} \times \text{TD}$$

Przykładowe wartości współczynnika PDCAAS wyznaczone na podstawie doświadczenia przeprowadzonego na pięcio-tygodniowych szczurach przedstawia tabela 9.

Tabela 9. Wartości wskaźnika PDCAAS dla wybranych produktów spożywczych [Gilani i Sepehr, 2003]

Produkt spożywczy	PDCAAS (%)
kazeina	100
laktoalbumina	100
mleko w proszku	100
soja	82
bób	73

Podsumowanie

Białka stanowią jeden z najważniejszych składników żywności. Ich źródłem są zarówno produkty pochodzenia roślinnego jak i zwierzęcego.

Białka pełnią w organizmie człowieka funkcje budulcowe, katalityczne, transportowe, regulatorowe, odpornościowe oraz lokomotoryczne. Istotny z punktu widzenia wartości odżywczej tego składnika jest jego skład aminokwasowy, a w szczególności dotyczy to składu aminokwasów egzogennych.

W przewodzie pokarmowym dochodzi do rozkładu białek na poszczególne aminokwasy, które z kolei mogą być bezpośrednio wykorzystane do np. budowy nowych tkanek, lub też ulegać dalszym przemianom, prowadzącym do powstania innych związków w tym tłuszczu i cukru.

Białka ulegają różnorodnym przemianom także podczas przetwarzania i przechowy-wania żywności. Przemiany te mogą wpływać korzystnie na ich wartość odżywczą, jak również wykazywać skutki negatywne. Zastosowanie odpowiednich parametrów obróbki cieplnej wpływa korzystnie na dostępność tego składnika, natomiast nadmierna temperatura prowadzi do degradacji aminokwasów i powstania związków o niekorzystnych, a nawet toksycznych właściwościach. Reakcje utleniania w większej mierze powodują pogorszenie strawności i przyswajalności takich aminokwasów jak: lizyna, metionina, cysteina czy tyrozyna.

Aktualnie dostępnych jest wiele metod badania wartości odżywczej białka. Dzieli się je na metody biologiczne, chemiczne i krzyżowe (biologiczno-chemiczne). Metody chemiczne wymagają określenia profilu aminokwasów, dlatego też niezbędny jest tu etap hydrolizy. Najczęściej jest nią hydroliza kwasowa, która podlega różnym modyfikacjom w celu zmniejszenia strat, szczególnie takich aminokwasów jak: tryptofan, seryna, treonina, cysteina, metionina. Uzyskana w jej wyniku mieszanina aminokwasów jest rozdzielana, a następnie oznaczana za pomocą różnych technik detekcji. W metodach rozdzielczych główną rolę pełnią metody chromatograficzne (IEC, RP-HPLC, GC), coraz to większe znaczenie mają ponadto techniki elektroforetyczne. Do najczęściej wyznaczanych wskaźników chemicznych należą: CS, EAAI, PDR, PPD, IVD, C-PER, DC-PER. W metodach biologicznych oceny jakości białek do oznaczeń wykorzystuje się żywe zwierzęta- głównie szczury. Metody te możliwiają wyznaczenie następujących wskaźników wartości odżywczej białka: PER, NPR, BV, NPU. Dzięki metodzie krzyżowej możliwe jest z kolei wyznaczenie wskaźnika PDCAAS.

Spis piśmiennictwa

1. Ackley K.L., Caruso J.A., (2003): Handbook of Elemental Speciation- Techniques and Methodology, 4, 147-161

2. Albert C., Lóki K., pohn G., Varga-Visi É, Csapó J., (2008): Investigation of performic acid oxidation in case of thiol-containing amino acid enantiomers, Acta Universitatis Sapientiae, Alimentaria, 1, 73-80

3. Albin D.M., Wubben J.E., Gabert V.M., (2000): The influence of hydrochloric acid concentration and measurement method on the determination of amino acid levels in soya bean products, Animal Feed Science and Technology, 87, 173-186

4. AOAC (1982) Official method 982.30, Protein Efficiency Ratio, Calculation Method, First Action.

5. Badawy A.A.B., Morgan C.J., Turner J.A., (2008): Application of the Phenomenex EZ:faast amino acid analysis kit for rapid gas-chromatographic determination of concentrations of plasma tryptophan and its brain uptake competitors, Amino acids, 34, 587-596

6. Bannon G.A., (2004): What makes a food protein allergen?, Current Allergy and Asthma Reports, 4, 43-46

7. Bobko K., Biel W., Petryshak R., Jaskowska I., (2009): Analiza składu chemicznego i wartości odżywczej białka zbóż pochodzących z gospodarstwa ekologicznego, Folia Pomeranae Universitatis Technologiae Stetinensis, 272, (11), 5–12

8. Boody G., Desborough S., (1984): In vitro digestibility and calculated PER as rapid methods ror the nutritional evaluation of potato protein, Quality plant foods for human nutrition, 34, 27-39

9. Bos C., Gaudichon C., Tomé D., (2000): Nutritional and physiological criteria in the assessment of milk protein quality for humans, Journal of the American College of Nutrition, (19), 2, 191–205

10. Brandt A., Zorena K., Myśliwiec M., (2008): Diabetologia Praktyczna. Końcowe produkty glikacji- źródło pochodzenia a rozwój powikłań cukrzycowych, Wydawnictwo Medyczne Via Medica, Gdańsk, 9, 1, 12-17

11. Bütikofer U., Fuchs D., Bosse J.O., Gmür W., (1991): Automated HPLC- amino acid determination of protein hydrolysates by precolumn derivatization with OPA and FMOC and comparison with classical ion exchange chromatography , Chromatographia, (31), 9/10, 441-447

12. Castro I., Tirapeguil J., Silva R.S., (2000): Protein mixtures and their nutritional properties optimized by response surface methodology, Nutrition Research, (20), 9, 1341-1353

13. Christa K., Soral-Śmietana., (2008): Wpływ procesu prażenia na dostępność enzymatyczną białek ziarniaków gryki zwyczajnej (Fagopyrum Esculentum Moench), Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, (60), 5, 52 – 62

14. Cieślik E., Niedośpiał A., Mickowska B., (2008): Wykorzystanie elektroforezy kapilarnej w analizie żywności, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, (57), 2, 5-14

15. Coenegracht P.m.J., Metting H.J., Smilde A.K., Coenehracht-Lamers P.J.M., (1989): A chemometric investigation of the selectivity of multisolvent mobile phase systems in RP-HPLC, Chromatographia, (27), 2/3, 135-141

16. Csapó J., Lóki K., Albert C., Csapó-Kiss Z., (2008): Mercaptoethanesulfonic acid as the reductive thiol-containing reagent employed for the derivatization of amino acids with o-phthaldiaaldehyde analysis Acta Universitatis Sapientiae-Alimentaria, 1, 49-60

17. Delisle J., Amiot J., Goulet G., Brisson G-J., Jones J.D., (1985): Nutritive value of soybean, rapeseed and wheat proteins, and various blends of these vegetable proteins and their fractions in rats, Quality plant foods for human nutrition, 35, 131-137

18. Engelhardt H., Krämer M., Waldhoff H., (1990): Enhancement of protein detection by microwave-induced hydrolysis and OPA derivatization, Chromatographia, 30, 9/10, 523-526

19. Ettre L.S., Gehrke C.W., (2006): The Development of the Amino Acid Analyzer, LCGC North America, (24) , 4

20. Fountoulakis M., Lahm H.W., (1998): Hydrolysis and amino acid composition analysis of proteins, Journal of Chromatography A (826), 109-134

21. Friedman M., (1996): The Maillard Reaction: Consequences for the Chemical and Life Science The impact of the Maillard Reaction on the Nutritional Value of food protein, John Wiley & Sons, London, 6, 105-128

22. Gałkowska D., Gałkowska-PAchota, (2010): Oznaczanie aminokwasów w żywności i suplementach diety. Przygotowanie próbek, Laboratorium, 9-10, 44-48

23. Gawęcki J. (red), (2010): Żywienie człowieka. Podstawy nauki o żywieniu, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 204-216

24. Gertig H., Przysławski J., (2006): Bromatologia. Zarys nauki o żywności i żywieniu, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 42-64

25. Gilani G.S., Sepehr E., (2003): Protein digestibility and quality in products containing nutritional factors are adversely affected by old age in rats, The Journal of Nutrition, 133, 220-225

26. Głod B.K. (red), (2009): Postępy chromatografii, Wydawnictwo Akademii Podlaskiej, Siedlce, 113-137

27. Herbert P., Barros P., Ratola N., Alves A., (2000): HPLC determination od amino acids in musts and port wine using OPA/FMOC derivates, Food Chemistry and Toxicology, (65), 7, 1130-1133.

28. Hęś M., Korczak J., (2007): Wpływ produktów utleniania lipidów na wartość odżywczą białka, Nauka. Przyroda. Technologie, 1, 1, 4

29. Hušek P., Šimek P., (2001): Advances in amino acid analysis, LCGC, (19), 9, 986-999.

30. Instrukcja 1: Dionex, AAA-Direct ^TM Amino acid analysis system, http://www.dionex-france.com/library/literature/data_sheets/DS_AAA-Direct_Nov03_LPN1113-03.pdf

31. Instrukcja 2: Katalog firmy Phenomenex, (2009): HPLC. GC. SPE. Chromatography Product Guide, 335-336, http://www.nxtbook.com/nxtbooks/phenomenex/2009catalog-intl/

32. Instrukcja 3: Capillary electrophoresis system, (2006): Determination of amino acids in beer and wort by capillary electrophoresis, http://www.dichrom.com/ downloads/Application Notes/Lumex/07AE03.08.06-1.pdf

33. Jabłoński E., (2000): Czynniki determinujące i modyfikujące wartość odżywczą białka, Pediatria Współczesna. Gastroenterologia, Hepatologia i Żywienie Dziecka, 2, 2, 83-87

34. Jaćkowska M., Kosobucki P., Buszewski B., (2009): Chromatografia jonowa na przełomie wieków, Analityka, 4, 22-26

35. Jakubke H-D, Jeschkeit H., (1989): Aminowasy, peptydy, białka, Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa, 60-61

36. Janssen P.S.L., Nispen J.W., Melgers P.A.T.A., Bogaart H.W.M., Hamelinck R.L.A.E., Goverde B.C., (1986): HPLC Analysis of phenylthiocarbamyl (PTC) amino acids. I ewaluation and optimization of the procedure, Chromatographia, (22), 7-22, 345-350

37. Kamiński M., Kartanowicz R. (red), (2004): Chromatografia cieczowa, Centrum Doskonałości Analityki Monitoringu środowiskowego, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska

38. Kennedy P., (2005): Ultra-fast amino acid analysis by LC-TOF-MS, http://chromatographyonline.findanalytichem.com/lcgc/data/articlestandard//lcgc/282005/169250/article.pdf

39. Klepacka M. (red), (2005): Analiza żywności, Fundacja „Rozwój SGGW”, Warszawa, 72-75

40. Kotlarz A., (2000): Wartość pokarmowa nasion łubinów oraz wartość biologiczna białka zestawów zbożowo-łubianowych w badaniach na szczurach laboratoryjnych, Zastosowanie metod statystycznym w badaniach naukowych, StatSoft, Kraków

41. Kroll J., Rawel H., Kröck R., (1998): Microwave digestion of proteins, Z Lebensm Unters Forsch A, 2007, 202-206

42. Lisiewska Z., Słupski J., Kmiecik W., (2008): Effect of pre-freezing and culinary treatment on the content, Acta Scientiarum Polonrum. Technologia Alimentaria, (4), 7, 5-14

43. Mańkowska D., Grzymisławski M., (2000): Praktyczne aspekty żywienia pozajelitowego i dojelitowego, Nowiny Lekarskie, 69, 6, 509-518

44. Manneberg M., Lahm H-W., Fountoulakis M., (1995): Oxidation of cysteine and methionine residues during acid hydrolysis of proteins in the presence of sodium azide, Analytical Biochemistry, 224, 122-127

45. Michalska A., Zieliński H., (2007): Produkty reakcji Maillarda w Żywności, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, (51), 2, 5 – 16

46. Michalski R., Łyko A., (2008): Kolumny analityczne do chromatografii jonowej, Laboratorium, 11, 10-16

47. Millward J., Layman D.K., Tomé D., Schaafsma G., (2008): Protein quality assessment: impact of expanding understanding of protein and amino acid needs for optimal health, American Journal of Clinical Nutrition, (87), 5, 1576-1581

48. Molnár-Perl I., (2003): Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liguid chromatography, either simultaneously or separately, Journal of Chromatography A, 987, 291-309

49. Montilla A., Gómez-Ruiz J.Á., Olano A., Dolores del Castillo M., (2007): A GC-FID method for analysis of lysinoalanine, Molecular Nutrition and Food Research, 51, 415-422

50. Muth D., Kachlicki P., Stobiecki, (2007): Spektrometria mas – możliwości wykorzystania w badaniach metabolomu roślinnego, Biotechnologia 1, (76), 156-175

51. Namieśnik J., Jamrógiewicz Z.,Pilarczyk M., Torres L., (2000): Przygotowanie próbek środowiskowych do analiz, WNT, Warszawa

52. Owusu-Apenten R.K., (2002): Food protein analysis. Quantitative effects on processing, Marcel Dekker, New York, 6, 374-380

53. Patnaik, Pradyot, (2004): Dean’s analytical chemistry handbook, McGraw-Hill, New York, 5, 5.3-5.111

54. Peñas E., Préstamo G., Gomez R., (2004): High pressure and the enzymatic hydrolysis of soybean whey proteins, Food Chemistry, 85, 641-648

55. Petritis K., Elfakir C., Dreux M., (2002): A comparative study of commercial liquid chromatographic detectors for the analysis of underivatized amino acids, Journal of Chromatography A, 961, 9-21

56. Phimphilai S., Galyean R.D. ,Wardlaw F.B., (2006): Relationship of two in vitro assays in protein efficiency ratio determination on selected agricultural by-products, Songklanakarin Journal of Science and Technology, 28, 81-87

57. Raghunath M., Narasinga Rao B.S., (1984): Relationship between relative protein value and some in vitro indices of protein quality, Journal of Bioscience, (6), 655-661

58. Report of a Joint WHO/FAO/UNU Expert Consultation, Protein and amino acid requirements in human nutrition, http://whqlibdoc.who.int/trs/WHO_TRS_935_eng.pdf

59. Rhoads M. J., Wu G., (2009): Glutamine, arginine, and leucine signaling in the intestine, Amino Acids 37, 111-122

60. Ruszczyńska A., Bulska E., (2005): Spektrometria mas we współczesnej analityce. Cz. 1. Jak zaczął się rozwój spektrometrii mas?, Analityka, 4, 28-31

61. Rutkowska U. (red), (1981): Wybrane metody badania składu i wartości odżywczej żywności, Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich, Warszawa, 31-73

62. Ruszczyńska A., Bulska E., (2006): Spektrometria mas we współczesnej analityce. Cz. 2. Układy pomiarowe spektrometrii mas, Analityka, 1, 13-15

63. Salchert K., Pompe T., Sperling C., Werner C., (2003): Quantitative analysis of immobilized proteins and protein mixtures by amino acid analysis, Journal of Chromatography A, 1005, 113-122

64. Sikorski Z. (red), (2007): Chemia żywności. Odżywcze i zdrowotne właściwości składników żywności, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa, 6, 178-181

65. Stenerson K. K., (2007): GC-MS Analysis of amino acids, Chromatography Techniques, Sigma-Aldrich/Supelco, Bellefonte, 23

66. Szczepaniak W. (2002): Metody instrumentalne w analizie chemicznej, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 265-358

67. Tuan Y., Phillips D.,Dove R., (1999): Predicting integrated protein nutritional quality part 2: Integrated protein nutritional quality predicted from amino acid availability corrected amino acid score (AACAAS), Nutrition Research, (19), 12, 1807-1816

68. Vegarud G. E., Langsrud T., Syenning C., (2000): Mineral-binding milk proteins and peptides; occurrence, biochemical and technological characteristics, British Journal of Nutrition, 84, 1, 91-98

69. Vlassara H., Palace M.R., ( 2002): Diabetes and advanced glycation endproducts, Journal of Internal Medicine, 251, 87-101

70. Wang H., Faris R.J., Wang T., Spurlock M.E., Gabler N., (2009): Increased in vitro and in vivo digestability of soy protein by chemical modification of disulfide bonds, Journal of the American Oil Chemists’ Society, 86, 1093-1099

71. Wang W.W., Qiao S.Y., Li D.F.,(2009): Amino acid and gut function, Amino Acid 37, 105-110

72. Wei Q.,Zhimin H. (2006): Enzymatic hydrolysis of protein: mechanism ad kinetic model, Frontiers of Chemistry in China, 3, 308-314

73. Weiss M., Manneberg M., Juranville J-F, Lahm H-W., Fountoulakis, (1998): Effect of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of proteins, Journal of Chromatography A, 795, 263-275

74. Wierciński J., (2004): Instrumentalna analiza chemicznych składników żywności, Wydawnictwo Akademii Rolniczej, Lublin, 10-13

75. Wu G., (2009): Amino acids: metabolism, functions, and nutrition, Amino Acids 37, 1-17

76. Yu H., Ding Y-S., Mou S-F., (2003): Some factors affecting separation and detection of amino acids by high-performance anion-exchange chromatography with integrated pulsed amperometric detection, journal of Chromatography A, 997, 145-153

77. Zieliński W., (2000): Metody spektroskopowe i ich zastosowanie do identyfikacji związków organicznych, Wydawnictwo Naukowo-Techniczne, Warszawa, 443-448.

Strony internetowe:

1. Internet 1:

http://www.knfm.awf.katowice.pl/upload/metabolizmbialek[1].pdf, stan na 10.12.2010, godz. 14:00

1. Internet 2:

Proposal global dokument, (2002): Amino acid analysis, http://www.nihs.go.jp/dbcb/Bio-Topic/amino.pdf, stan na 02.01.2011, godz. 13:12.

1. Internet 3:

Erxleben B-T., (2009): Analysis of amino acids in foods using LC-MS, http://chromatographyonline.findanalytichem.com/lcgc/Analysis-of-Amino-Acids-in-Foods-using-LCndashMS/ArticleStandard/Article/detail/645127, stan na 3.02.2011, godz. 15:30

1. Internet 4:

Guzzetta A., (2001): Reverse Phase HPLC Basics for LC/MS, http://www.ionsource.com/ tutorial/chromatography/rphplc.htm, stan na 3.02.2011, godz. 16:05

1. Internet 5:

Held P., (2001): Total Protein Quantification using OPA, http://www.biotek.com/ resources/articles/total-protein-opa.html, stan na 3.02.2011, godz. 16:07

1. Internet 6:

http://www.phenomenex.com/cms400min/product.aspx?id=262, stan na 6.11.2010, godz. 15:00

Wyrażam zgodę na udostępnianie mojej pracy w czytelni Biblioteki SGGW

……………………………………………….

(czytelny podpis autora)