SPRAWOZDANIE 2.04.2009r

Katarzyna Piaskowy

Biotechnologia, Grupa Chem2, sekcja 8

Temat:

I Trawienie DNA faga λ za pomoc a enzymu restrykcyjnego EcoRI

II Analiza elektroforetyczna produktów reakcji trawienia

III Oznaczanie DNA wyizolowanego z komórek.

1.Wstęp teoretyczny:

I. Trawienie DNA faga λ za pomoc a enzymu restrykcyjnego EcoRI .

Enzymy restrykcyjne- zwane także restryktazami, endonukleazami restrykcyjnymi)

są enzymami izolowanymi z bakterii, zdolnymi do rozpoznawania specyficznych

sekwencji w DNA i do przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA.

EcoRI- endonukleaza wyizolowana po raz pierwszy ze szczepu RY13 E.coli. Przy cięciu DNA tworzy on lepkie końce z przedłużonymi końcami 5’. Sekwencją rozpoznawaną i ciętą przez enzym jest palindromiczna sekwencja 5'-G^▼AATTC-3' (nić komplementarna 3'-CTTAA_▲G-5')

II. Analiza elektroforyczna produktów reakcji trawienia.

Elektroforeza jest procesem umożliwiającym rozdzielenie cząsteczek o różnych masach molekularnych. Proces ten opiera się o przemieszczanie się cząsteczek obdarzonych ładunkiem elektrycznym po umieszczeniu ich w stałym lub zmiennym polu elektrycznym. Oczywiście niezbędne jest do tego również podłoże umożliwiające taki ruch (np. żel agarozowy lub poliakrylamidowy). Do cząsteczek poddawanych elektroforezie dodaje się barwnika, co powoduje powstawanie w preparacie barwnych prążków umożliwiających oszacowanie ich masy molekularnej poprzez porównanie z markerem – cząstkami o znanej masie, które również poddano elektroforezie. Elektroforeza w żelach jest techniką stosowaną standardowo przy rozdziale, analizie i oczyszczaniu kwasów nukleinowych. Po umieszczeniu w polu elektrycznym cząsteczki te migrują w żelu zgodnie ze swym ładunkiem, przy czym szybkość migracji zależy od wielkości i kształtu cząsteczki.

Elektroforeza musi być przeprowadzana w odpowiednim buforze. Najczęściej stosowanym buforem jest TAE ( Tris-octan, EDTA) lub TBE ( Tris-boran, EDTA). Przed naniesieniem na żel próbki zawiesza się w buforze zawierającym „obciążacz” (glicerol,Ficoll lub sacharoza) oraz barwnik umożliwiający śledzenie przebiegu elektroforezy(Xylene cyanol niebieski, fioletowy Bromophenol blue lub pomarańczowy Orange G). DNA w żelu można uwidocznić dzięki barwieniu związkiem interkalującym – bromkiem etydyny, który fluoryzuje w świetle UV. Ponieważ cząsteczki DNA mają ładunek ujemny (pochodzący od grup fosforanowych) w polu elektrycznym wędrują w kierunku dodatniej elektrody (anody).

III .Oznaczanie DNA wyizolowanego z komórek.

Biofotometr przyrząd pomiarowy do szybkiego i pewnego oznaczania ilościowego dsDNA, ssDNA, RNA, oligonukleotydów, protein i bakteryjnej gęstości komórek (pomiary zmętnienia).

Do pomiaru czystości izolowanego DNA stosuje się spektrofotometrię w ultrafiolecie dla czterech długości fal – 230 nm (absorpcja w wiązaniach peptydowych i węglowodorach), 260 nm (maksimum absorpcji dla DNA), 280 nm (aminokwasy zawierające pierścienie aromatyczne i fenole) oraz 320 nm (inne zanieczyszczenia).

Przebieg ćwiczenia:

1.Trawienie enzymem restrykcyjnym EcoRI.

Mając do dyspozycji:

• DNA faga λ o stężeniu 0.25 µg/µl

• Bufor do trawienia 5x stężony

• Enzym restrykcyjny EcoRI 10 U/µl

• H₂O dejonizowana

Musiałyśmy sporządzić mieszaninę reakcyjną zawierającą:

• 0,5 µg DNA faga λ

• 5 U enzymu EcoRI

• w buforze do trawienia o składzie (1x):

• NaCl

• Tris:HCl pH 7.9

• MgCl₂

• 0,025% Triton X-100

Określając ilość potrzebnych substancji wykonałyśmy obliczenia:

0,25 μg/μl ⇒

0,25μg ↔1 μl

0,5 μl ↔ x lμl

$x = \frac{0,5\ }{0,25} = 2\ \mu l$ DNA faga

10 U ↔1 μl

5 U ↔ x μl

$x = \frac{5 \times 1}{10} = 0,5\ \mu l$ enzymu EcoRI

5 × stezony  ↔ chcemy otrzymac 1 × stezony

$\frac{1}{5} \times 10\mu l = 2\mu l$ buforu do trawienia

Woda dejonizowana:

10 μl (objętość końcowa)-(2μl+0,5μl+2μl)=5,5μl

Zmieszałyśmy wymagane stężenia w kolejności:

• H₂o

• bufor do trawienia

• DNA faga λ

• enzym EcoRI (dodany przez prowadzącego)

Po dodaniu kolejnych substratów mieszaninę worteksowałyśmy, a po dodaniu enzymu dodatkowo umieściłyśmy w wirówce z włączoną funkcją short (do 1400 obr/s), następnie wstawiłyśmy próbówkę do inkubacji na 1h (ostatecznie ten czas był dłuższy) w temperaturze 37 °C.

2. Przygotowanie przyrządów potrzebnych do elektroforezy (przygotowanie saneczek z grzebieniem na całą grupę).

Saneczki dobrze uszczelniono poprzez dokładne ich dokręcenie, aby płynna agaroza z nich nie wyciekała. Następnie w saneczkach umieszczono specjalny grzebień, dzięki któremu w stężonej agarozie zostały utworzone małe zagłębienia, zwane studzienkami. Został on umieszczony blisko jednego z brzegów saneczek.

3. Przygotowanie żelu agarozowego. (przygotowanie jednego żelu na całą grupę).

. Do przeprowadzenia elektroforezy użyto żeli agarazowych wykonanych przez poprzednie grupy. Żele umieszczone w kolbach zważono i podgrzano stopniowo w mikrofalówce aby cały żel przeszedł w fazę płynną.

Masa żelu z kolbą	Masa żelu z kolbą po podgrzaniu
88,2 g	88,2 g
123,2 g	123,2g
99,5g	99,3g =>należało dodać brakującą różnicę wody=0,2 g

Następnie zlano wszystkie żele do jednej kolby, zagotowano odłożono do ostygnięcia i powtórzono etap z bromkiem etydyny (dodano do r-u 2 μl bromku etydyny). Otrzymaną ciecz wlano na przygotowane saneczki (z blokadą i grzebieniem) i zostawiono do zżelowania.

4. Przygotowanie buforu do elektroforezy (TAE) (jeden na całą grupę).

Aby otrzymać 800 ml buforu 1xTAE z 50x TAE należy dodać:

800 : 50 =16 ml <= tyle buforu 1x stężonego

800-16=784 ml wody destylowanej

Wyjęto grzebień i blokady, wstawiono saneczki z żelem do aparatu i zalano buforem przewodzącym.

5. Przygotowanie prób DNA faga λ (na całą grupę).

Po 1 godz. 38 min. inkubacji wyjęłyśmy próbkę z inkubacji i dodałyśmy 2 μl buforu obciążającego (0,25 % błękit bromofenolowy, 0,25 % cjanol ksylenu, 30% glicerol) zwirowałyśmy (funkcja short) próbkę (bufor obciążający powodował zwiększenie gęstości próbce co uniemożliwiało jej wypłynięcia podczas elektroforezy). Obecność błękitu bromofenolowego była bardzo ważna, ponieważ umożliwiała nam śledzenie jak daleko zaszły najszybsze cząsteczki, ponieważ samego DNA w żelu nie widać. Następnie probówkę wytrząsaliśmy przez kilka sekund w wytrząsarce i włożyliśmy do wirówki sekund (funkcja short).

Dodatkowo jedna z sekcji przygotowała jedną próbę nietrawionego faga λ w składzie:

- 1 µl DNA faga λ

- 5 µl H₂O

- 1 µl buforu obciążającego.

6. Elektroforeza

Po stężeniu agarozy, delikatnie wyjęto z niej grzebień (dzięki temu otrzymano w niej małe studzienki). Wyjęto saneczki z aparatu uszczelniającego i włożono je do aparatu do elektroforezy. Wszystko zalaliśmy 600 ml buforu TAE tak, aby bufor zakrywa stężoną agarozę (kilka milimetrów ponad powierzchnią żelu agarozowego)(bufor zamyka obwód prądu).

Następnie każda sekcja umieszczała swoje próby DNA faga λ (8 lub10μl) za pomocą pipety automatycznej w studzienkach żelu agarozowego. W studzience pierwszej umieszczono 5 μl markerkera (cząsteczki DNA pocięte enzymami restrykcyjnymi o określonej i znanej masie cząsteczkowej), a w drugiej - próbę niestrawionego faga λ (8 μl).

Po wypełnieniu wszystkich studzienek próbami DNA przykryto przykrywką urządzenie do elektroforezy, w którym wzdłuż przeciwległych krawędzi agarozy biegną elektrody do których przykłada się napięcie elektryczne. Następnie podłączono przewody doprowadzające prąd w taki sposób, aby cząsteczki DNA przemieszczały się w stronę dalszego brzegu saneczek. DNA ma ładunek ujemny, dlatego migruje on w stronę anody. Podczas przepływu prądu widoczne były liczne pęcherzyki powietrza wydzielające się na elektrodach zanurzonych w buforze TAE. Elektroforezę przeprowadzono około 1 godziny, po czym wyłączono urządzenie i przenieśliśmy saneczki z agarozą do urządzenia emitującego promienie UV. Dzięki obecności bromku etydyny obserwowano rozdzielone DNA.

7.Oznaczanie DNA wyizolowanego na poprzednich ćwiczeniach.

Zmierzyłyśmy objętość roztworu (32 μl). Pobrałyśmy 2 μl do nowej próbówki zawierającej 98 μl wody, mieszaninę zwirowałyśmy (short). Wcześniej przygotowałyśmy próbę kontrolną czyli 100 μl H₂O dejonizowanej. W pierwszej kolejności przelałyśmy próbę z wodą do specjalnej kuwety i wstawiłyśmy do biospektrometru „zerując” urządzenie. Później do spektrometru wstawiłyśmy r-r z DNA. Wyniki:

• A₂₃₀=1,221

• A₂₆₀=2,475

• A₂₈₀=1,282

• A₃₂₀=0,028

$$\frac{A_{260}}{A_{280} = 1,93}$$

$$\frac{A_{260}}{A_{230} = 2,03}$$

Stężenie DNA:

C=(A₂₆₀-A₃₂₀) x rozcieńczenie x 0,05=2,447 x 50 x 0,05= 6,12 μg/μl

X= C x objętość badanego materiału= 6,12 x 32=195,84 μg

Wydajność odbiałczania:

400 μl(objętość fazy wodnej) ↔100 %

147 μl (objętość po odbiałczaniu) ↔y %

$$y = \frac{147 \times 100\ \%}{400} = 36,75\ \%$$

Porównanie wyników z innych sekcji:

	$$\frac{\mathbf{A}_{\mathbf{260}}}{\mathbf{A}_{\mathbf{280}}}$$	$$\frac{\mathbf{A}_{\mathbf{260}}}{\mathbf{A}_{\mathbf{230}}}$$
1.	2,13	2,06
2.	1,98	2,13
3.	0,301	0,13
4.	2,05	1,69
Nasz wynik:	1,93	2,03

Wydajność 1:
400 mikrolitrow (czyli faza wodna)- 100%
odbiałczanie ( masa po odbialczeniu)- x %

Wydajnosc 2:

najlepszy masa dna po izloacji - 100%
nasz wynik-  x %

36,75%

Wnioski:

1. Trawienie i elektroforeza.

Wyniki elektroforezy

W pierwszej studzience znajduje się marker a w drugiej próba niestrawionego DNA. W 10 rowku znajduje się próbka przygotowana przez naszą sekcję. W porównaniu do markera najlepiej rozdzielone DNA znajduje się w studzienkach 6, 12 i 13.

Można zaobserwować różnicę między poszczególnymi próbami DNA, być może jest to spowodowane nierówną objętością wprowadzonych próbek lub różnicą w sposobie wprowadzaniu materiału (różne umiejętności w pipetowaniu, precyzyjność w trafianiu do kieszonek w żelu). W niektórych sekcjach DNA jest bardzo słabo widoczne, co może świadczyć o zbyt małej ilości materiału lub zbyt dużemu strawieniu próbki, ale za to można stwierdzić że wszystkie próby uległy strawieniu. Niektóre są rozmazane co mogło być spowodowane dostaniem się powietrza do próby lub zbyt dużym rozcieńczeniem.

1. Analiza spektrometryczna.

Wykonaliśmy analizę spektrometryczną DNA wyizolowanego na poprzednich ćwiczeniach, sprawdzaliśmy czy DNA z komórek zostało wyizolowane i jakiej jest ono jakości. Stosunek długości fal A 260/A280 w niezanieczyszczony DNA powinna mieścić się w przedziale 1,6-1,8 a A260/A230 powyżej 2. Wartości A260/280 poniżej 1,6 świadczą o tym, że preparat jest zanieczyszczony białkami, jednak otrzymany przez nas wynik jest większy od 1,8 czyli zanieczyszczenia wynikają z pozostałości odczynników użytych w metodzie. Druga wartość (A260/230) jest nieznacznie powyżej dwóch, co również świadczy o zanieczyszczeniu białkami. Wydajność odbiałczania wyniosła 36, 75 % jest ona stosunkowo mała najprawdopodobniej dlatego że została ona przeprowadzona kilkakrotnie. Na tle wyników z części grupy można wywnioskować że otrzymane przez nas DNA jest stosunkowo czyste i dobrej jakości.