1) Jakie dwie domeny zawiera każdy czynnik transkrypcyjny?
Do działania potrzebuje dwu domen:
- domeny wiążącej DNA – domena typu helisa-zwrot-helisa (HTH) (charakterystyczna dla białek zawierających 60-aminkowasową homeodomenę, kodowaną przez sekwencję określaną jako kaseta homeo); domena typu palca cynkowego (są dwie formy takich domen: typu C2H2 {Cys2His2} i C4 {Cys4};
- domeny oddziałującej z innymi białkami:
HAT, mediatorami, ogólnymi czynnikami transkrypcyjnymi, podjednostką α lub σ prokariotycznej pol RNA – aktywatory; HDAC – represory;
2) Opisz rolę snoRNA w dojrzewaniu transkryptów pol I RNA.
Dojrzewanie eukariotycznego pre-rRNA – modyfikacje rybozy i urydyny;
Są dwie podst. klasy snoRNA tj. snoRNA z C/D boxem, które jest związane z metylacją i snoRNA z H/ACA boxem, które jest związane z pseudourydylacją. Miejsca modyfikacji wyznacza komplementarność między snoRNA i pre-rRNA, modyfikacje zachodzą kotranskrypcyjnie i ułatwiają poprawne ufałdowanie rRNA.
3) Do czego prowadzi rekombinacja między dwoma powtórzeniami:- prostymi- odwróconymi
Rekombinacja pomiędzy powtórzeniami prostymi prowadzi do delecji;
Rekombinacja pomiędzy powtórzeniami odwróconymi prowadzi do inwersji;
4) Jaką rolę pełni domena CTD.
CTD – domena C-końcowa największej podjednostki pol II RNA, koordynuje transkrypcję i dojrzewanie pre-mRNA; zawiera powtórzenia (drożdże-26, ssaki-52) heptapeptydu (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser), Ser i Thr są substratami dla kinaz m.in. TFIIH, ich fosforylacja aktywuje pol II RNA,
CTD jest też miejscem wiązania licznych białek zw. srb lub mediatorami.
5) Funkcja miRNA i siRNA.
Regulatorowe RNA – 1-niciowe miRNA i 2-niciowe siRNA; mi/siRNA są składnikami opartego na RNA mechanizmu regulacji aktywności genów występującego u Eukariota; U roślin: miRNA biorą udział w sterowaniu procesami rozwojowymi i uruchamianiu mechanizmów obrony przed stresami abiotycznymi zaś siRNA głównie stanowią element obrony przed molekularnymi pasożytami tj. transpozonami, transgenami, wirusami, endogennymi genami, których transkrypcja jest zaburzona; miRNA – regulują ekspresję innych genów, wchodzą w skład kompleksów rybonukleoproteinowych blokujących specyficznie translację mRNA i nadają im specyficzność, zaangażowane w negatywną regulację ekspresji genów podczas rozwoju, mediatory mechanizmu inferencji z translacją mRNA;
siRNA - powodują wyciszanie genów o homologicznej sekwencji
6) Mechanizmy zmienności genomów.
a) duplikacje – (całego genomu, całych chromosomów, części chromosomów, genów, fragmentów genów kodujące domeny białkowe, eksonów); endoreplikacja, replikacyjny poślizg, nierówny crossing over, amplifikacja części DNA, krzyżówki międzygatunkowe, transpozycje – i następujące po nich mutacje różnicujące powstałe kopie.
b) delecje - replikacyjny poślizg, nierówny crossing over, transpozycje.
c) inwersje - pękanie/łączenie się chromosomów, rekombinacja umiejscowiona.
d) insercje - transpozycje elementów ruchomych.
e) rearanżacje chromosomowe - pękanie/łączenie się chromosomów, nierówny crossing over, infekcje wirusowe)
f) rekombinacja genów - losowy dobór osobników i gamet, losowy rozdział chromosomów homologicznych, crossing over.
g) poziomy transfer genów - koniugacja, transformacja, transdukcja u bakterii.
7) Opisz proces spicingu.
Splicing wymaga obecności w pre-mRNA pewnych sekwencji. Koniec 5’ większości intronów ma sekwencję 5’-GU-3’, a koniec 3’ to zwykle 5’-AG-3’. AG na końcu 3’ poprzedza sekwencja bogata w pirymidyny, zwana traktem polipirymidynowym. Około 10-40 reszt powyżej traktu polipirymidynowego znajduje się sekwencja zwana sekwencją rozgałęzienia, u kręgowców jest to sekwencja 5’-CURAY-3’ gdzie R – puryna Y – pirymidyna. Splicing przebiega w dwustopniowej reakcji. Na początku reakcji wiązanie przed G na końcu 5’ intronu w tzw. miejscu splicingowym 5’ jest atakowane przez 2’-hydroksyl reszty A z sekwencji rozgałęzienia tworząc cząsteczkę w kształcie lassa i wolny ekson . W drugim etapie zachodzi rozcięcie w miejscu splicingowym 3’ po reszcie G w sekwencji AG i dwie sekwencje eksonowe łączone są ze sobą. Intron uwalniany jest w postaci lassa i ostatecznie degradowany. Splicing jest katalizowany przez U1, U2, U4, U5, U6 snRNP, a również przez inne czynniki splicingowe. Cząsteczki RNA biorące udział w splicingu snRNP tworzą pary zasad z różnorodnymi konserwatywnymi sekwencjami w miejscach splicingowych 5’ i 3’ oraz w miejscu rozgałęzienia. Na początku procesu splicingu koniec 5’ U1 snRNP wiąże się do miejsca splicingowego 5’, a następnie U2 przyłącza się do miejsca rozgałęzienia. Trzyskładnikowy kompleks snRNP (U4, U5, U6) może się teraz przyłączyć i przez to intron zostaje „wypętlony”, a eksony 5’ i 3’ zbliżone są do siebie. Cząstki snRNP oddziałują ze sobą tworząc kompleks który umożliwia pre-mRNA przyjęcie konformacji właściwej dla splicingu. Taki kompleks snRNP i pre-mRNA utworzony w celu przestrzennego zbliżenia eksonów znajdujących się powyżej i poniżej intronu, podczas gdy intron zostaje wypętlony, nosi nazwę spliceosomu. Jeszcze zanim nastąpi dwustopniowa reakcja splicingu, prowadząca do uwolnienia intronu w formie lassa, w spliceosomie zachodzi rearanżacja.
8) Wymień procesy wymagające rekombinacji.
a) Tworzenie spor u Bacillus Subtilis – środowiskowy sygnał wyzwalający sporulację fosforyluje aktywatory genów sigF i sigE, które aktywują dalsze geny sigma, ekspresja końcowej sigmy w komórce macierzystej wymaga rekombinacji specyficznej dla miejsca.
b) Różnicowanie heterocyst (beztlenowych komórek z aktywną nitrogenezą zdolną przekształcić azot atmosferyczny w NH3) u sinic Klebsiella i Anabaena.
c) Somatyczna rekombinacja pomiędzy fragmentami V(D)J genów immunoglobulin w ssaczych komórkach odpornościowych. Genom ssaka zawiera tylko dwie kopie każdego z genów łańcuchów immunoglobulin lecz jest w stanie wytworzyć setki milionów różnych przeciwciał – odpowiada za to segmentowa budowa genów łańcuchów immunoglobulin w komórkach zarodkowych i ich rearanżacje w trakcie różnicowania się limfocytów B.
9) Wymień drogi rozpadu RNA.
- deadenylacja, - usunięcie czapeczki, - odsunięcie związanych białek, - zniszczenie struktury III-rzędowej, - cięcie endonukleolityczne;
10) Opisz wydarzenia poprzedzające u Procariota inicjację translacji.
Wydarzenia preinicjacyjne:
a) Naładowanie tRNA – 2 reakcje przeprowadzane rzez syntetazy aminoacylo-tRNA (syntetazy – jest ich 20 różnych po jednej na każdy aminokwas – katalizują obie reakcje i determinują ich specyficzność).
(i) aktywacja aminokwasu przez energię pochodzącą z ATP z utworzeniem aminoacylo-AMO i pirofosforanu.
(ii) energia aminoacylo-AMP jest zużywana do przeniesienia aminokwasu na tRNA, powstaje aminoacylo-tRNA.
b) Dycjacja rybosomów (dsocjują po każdej rundzie translacji, dysocjacja jest reakcją powolną w porównaniu do asocjacji) U E. coli dysocjacja wymaga IF-1 (promuje dysocjację) i IF-3 (wiąże się do uwolnionej podjednostki 30S i nie dopuszcza do reasocjacji z 50S.
11) U6snRNA ma sekwencję komplementarną do mRNA i jeszcze do dwóch innych RNA, jakich ?
U5snRNA i U4snRNA
12) Rola białka RecA w rekombinacji .
RecA – posiada trzy aktywności: wymiany nici, ATPazy, koproteazy (SOS); wymagane do zajścia wszystkich szlaków u E. coli (rekombinacja chromosomów, plazmidów, naprawa rekombinacyjna); wiąże się kooperatywnie do ssDNA, jeden monomer RecA na każde 4-6 nt, N-terminalna α helisa monomeru wiąże centralną domenę poprzedniego monomeru, 6 monomerów na jeden skręt filamentu RecA promującego wymianę nici; RecA promuje wymianę nici pomiędzy cząst. DNA gdy: -jedna z cząst. ma region ssDNA, do którego może się wiązać RecA; - dwie cząsteczki wykazują co najmniej 50 pz. region niemal identycznej homologii; - w obrębie rejonu homologii musi istnieć wolny koniec DNA, który inicjuje wymianę nici; Etapy reakcji wymiany nici: a) RecA wiąże się z ssDNA; b) wzajemne przyrównanie cząsteczek i wytworzenie 3- (lub 4-) -niciowej struktury; c) przemieszczenie jednej z nici starego dupleksu poza strukturę 3-niciową – migracja fi lamentu RecA wzdłuż cząsteczki w kierunku 5’-> 3’ – rozwijanie i zwijanie DNA dzięki hydrolizie ATP.
13) Rybozymy
- M1 RNazy P; - introny gr. I; - introny gr. II; - U2, U6 snRNA spliceosomu; - hammerhead; - hairpin; - varkud satellite; - HDV; 23 S RNA;
14) Scharakteryzuj polimerazy DNA eukariotyczne i krótko ich funkcje.
a) α i σ – uczestniczą w replikacji DNA: α rozpoczyna, σ wydłuża syntezę każdej z nici;
b) ß i ɛ - biorą udział w naprawie DNA;
c) γ – prawdopodobnie bierze udział w replikacji mitochondrialnego DNA;
15) Rodzaje intronów i które są bliskie sobie ewolucyjnie.
a) Introny grupy I – często samowycinające się introny, uwalniane w formie liniowej, wycięcie wymaga wolnego nukleotydu, występują w genach jądrowych niższych Eucariota, u Eubacteria i wirusów, mają konserwatywną strukturę II-rzędow;
b) Introny grupy II – często samowycinające się, intron usuwany w postaci pętli, konserwowana struktura II-rzędowa, występowanie – mitochondria grzybów, organella roślin wyższych i i glonów, sinice; c) Introny jądrowych pre-mRNA – konserwowane sekwencje, na końcach eksonów i intronów, intron wycinany w formie pętli; (b i c bliskie ewolucyjnie).
16) Mechanizm dzięki któremu każde miejsce ORI jest używane tylko raz w fazie S.
Podczas G1, gdy Cdk1 jest nieaktywne, na miejscach startu replikacji budują się kompleksy pre-RC. Pod koniec G1 Cdk1 staje się aktywne i fosforyluje niektóre składniki kompleksu, inicjacje replikacji wyzwala zwłaszcza fosforylacja Sld2 i Sld3. Po inicjacji z danego miejsca ORI oddysocjowują niektóre składniki i nie mogą być ponownie przyłączone do ORI zdolnych doreplikacji dopóki nie zostaną zdefoforylowane, zaś Cdk1 zostaje w G1 nieaktywne, co stanowi mechanizm zabezpieczający przed re-replikacją.
18) Opisz elongacje translacji.
Wraz z uformowaniem kompleksu inicjującego 70S może się rozpocząć cykl elongacyjny. Elongację można podzielić na trzy etapy: (i) dostarczenie aminoacylo-tRNA, (ii) tworzenie wiązań peptydowych (transpeptydację) i (iii) translokację (przemieszczenie). Mechanizm rozpoczyna się, gdy miejsce P jest zajęte, a A wolne. Podczas elongacji działają trzy czynniki elongacyjne: EF-Tu, EF-Ts oraz EF-G charakt. się masą 45, 30 i 80 kDa. Wszystkie czynniki są zdolne do wiązania GTP lub GDP. EF-Ts i EF-G są tak liczne jak rybosomy, natomiast cząsteczek EF-Tu jest prawie 10 razy więcej.
(i) Dotarczenie aminoacylo-tRNA. By dostarczyć aminoacylo-tRNA do miejsca A rybosomy, niezbędny jest udział EF-Tu oraz energia pochodząca z hydrolizy GTP. Uwolniony kompleks EF-Tu-GDP jest regenerowany przez EF-Ts. W cyklu wymiany EF-Tu~EF-Ts, EF-Ts usuwa GTP. Powstały kompleks EF-Tu-GDP jest znowu zdolny do związania kolejnego aminoacylo-tRNA i dostarczeniu go do rybosomy. Wszystkie aminoacylo-tRNA mogą tworzyć komple z EF-Tu z wyjątkiem inicjatorowego tRNA.
(ii) Tworzenie wiązania peptydowego. Po dostarczeniu aminoacylo-tRNA, miejsca A oraz P są zajęte i oba aminokwasy, które mają zostać połączone, znajdują się blisko siebie. Peptydylotransferaza, której aktywność zależy od podjednostki 50S, może utworzyć wiązanie peptydowe między tymi dwoma aminokwasami bez dostarczenia dodatkowej energii ponad tę, która pochodzi z ATP wykorzystanego w reakcji aminoacylacji tRNA.
(iii) Translokacja. Kompleks EF-G (translokaza) i GTP wiąże si do rybosomy, a następnie deacylowany tRNA jest usuwany z miejsca P (co wymaga nakładu energii), peptydylo-tRNA jest przesuwany z miejsca A do P, a mRNA przesuwa się o jeden kodon w stosunku do rybosomy. GDP oraz EF-G są uwalniane, a ten ostatni wykorzystywany ponownie w kolejnym cyklu reakcji elongacji. Nowy kodon znajduje się w wolnym miejscu A. Ostatnie badania sugerują, że u organizmów prokariotycznych deacylowany tRNA przenoszony jest najpierw do miejsca E (miejsce wyjścia). Następuje to wówczas, gdy wiązany jest następny aminoacylo-tRNA. Tym sposobem rybosom łączy się z mRNA za pośrednictwem 6 par zasad azotowych, co może się przyczynić do ograniczenia możliwości przesunięcia ramki odczytu.
Gdy jeden cykl trójetapowego cyklu elongacyjnego zostanie zakończony, rozpoczyna si następny, aż do momentu pojawienia się w miejscu A kodonu terminacyjnego.
19) Czym sie charakteryzuje chromatyna genów aktywnych transkrypcyjnie.
Euchromatyna to rozluźniona forma chromatyny. W euchromatynie występuje duża zawartość białek niehistonowych (fosfoprotein) i RNA oraz znaczna aktywność matrycowa.
20) Czym się charakteryzują geny fazy S.
Geny fazy S będące włączonymi: aktywny HAT
21) Jakie struktury biorą udział w łączeniu się czynników transkrypcyjnych z DNA.
HTH i palec cynkowy.
22) Dlaczego dużo czynników transkrypcyjnych łączych się z DNA występuje w formie dimerów identycznych lub podobnych cząstek.
Zwiększa się specyficzność wiązania ich do DNA, oraz zwiększa się ilość wiązań, czyli oddziaływanie jest większe.
23) Napisz argumenty przeciwko twierdzeniu 1 gen - 1 peptyd.
Zazwyczaj jeden gen nie koduje jednego peptydu, ponieważ zachodzi alternatywny splicing, są alternatywne miejsca poliadenylacji, są modyfikacje RNA potranskrypcyjne np. zamiana cytozyny na uracyl w genie APO-B100 i wtedy powstaje APO-B100 lub APO-B58.
24) Czy jeden i ten sam czynnik może być aktywatorem i represorem.
Operon arabinozowy – przy braku arabinozy aktywator operonu aktywuje translację (działanie aktywatora), w momencie kiedy zwiąże się z arabinozą działa jako represor.
25) W jakiej kolejności wiążą się do promotorów czynniki transkrypcyjne, kompleksy remodelujące chromatynę i kompleksy pol II RNA.
Najpierw wiążą się kompleksy remodelujące chromatynę w różnej kolejności ( a) najpierw może łączyć się SWI/SNF, następnie HAT, przed powstaniem PIC. b) najpierw HAT, które rekrutują SWI/SNF c)Najpierw PIC a następnie wiąże HAT i SWI/SNF)
Czynniki transkrypcyjne – TFIID (kompleks wielobiałkowy i tylko TBP) wiąże się z kasetą TATA, TFIIA do TFIID, TFIIB do TFIID (TFIIB wiąże też polimerazę RNA), przyłączenie TFIIF do kompleksu inicjatorowego, TFIIE, TFIIH asocjują do kompleksu.
26) Jeśli to mozliwe ponumeruj:
5’UTR, promotor, miejsce przyłączenia się rybosomu, kodon start, nukleotyd, gdzie została przyczepiona 7 – metyloguanozyna, początek intronu, miejsce rozgałęzienia, koniec intronu, kodon stop, sygnał do poliadenylacji, 3’UTR