Slajd 1:
Naszym tematem był kwas hialuronowy – prawdopodobnie znany wszystkim no ale od początku czyli czym właściwie jest kwas hialuronowy

Slajd 2:
Kwas hialuronowy należy do grupy glikozaminoglikanów (GAG). Jest to liniowy biopolimer którego masa cząsteczkowa dochodzi do milionów Daltonów ,a jego lepko-sprężyste oraz reologiczne właściwości predysponują go do odgrywania ważnych fizjologicznych ról w żywych organizmach i sprawiają ,że jest on atrakcyjnym biomateriałem dla różnych medycznych zastosowań.

Slajd 3:

Monomery kwasu hialuronowego są disacharydami złożonymi z N-acetyl-D-glukozaminy i kwasu glukuronowego połączonymi wiązaniami β(1→4) i β(1→3) glikozydowymi.

Slajd 4:

Czyta teoria za nami więc teraz o występowaniu KH w przyrodzie – jest to środek naturalny obecny we wszystkich organizmach kręgowych i niektórych bakteriach choć jego największą ilość pozyskiwało się dawniej z grzebieni ptaków grzebiących, skóry rekina czy oczu krętorogich.

Slajd 5:
W ciele ludzkim kwas hialuronowy występuje w największym stężeniu w mazi stawowej, w pępowinie, oraz w ciele szklistym oka. Ponad połowa HA naszego organizmu zlokalizowana jest wewnątrz komórek skóry gdzie może osiągać stężenie 2.5g/l. Dla człowieka o wadze 70kg ilość HA w jego organizmie to 15g z czego 1/3 jest codziennie zastępowana. HA wiąże wodę w tkance przez co reguluje jej jędrność, może także wpływać na proliferacje oraz różnicowanie się komórek oraz naprawę tkanek. Zmniejszanie się ilości HA zachodzące pod wpływem starzenia się organizmu, zasklepianiem się ran czy zakażeń „degeneracyjnych” jeszcze bardziej podkreślają jego znaczenie dla skóry.

Slajd 6:

W skórze będącej największym organem naszego organizmu oraz główną ochroną dla znajdujących się pod nią tkanek kwas hialuronowy odgrywa rolę związku zbierającego wolne rodniki powstające pod wpływem promieniowania słonecznego. Promieniowanie ultrafioletowe wywiera „stres oksydacyjny” na komórki i może uszkadzać ich materiał genetyczny powodując ich degenerację i śmierć.

W mazi stawowej wysoka koncentracja kwasu hialuronowego o wysokiej masie molarnej zapewnia lubrykację niezbędną dla pracy stawu oraz działa jako „shock absorber” zmniejszając tarcie kości i zużywanie się stawu. W przypadkach zapaleń stawów takich jak te występujące przy chorobie zwyrodnieniowej stawów(osteoarthritis) czy zmianom reumatoidalnym masa molekularna HA jest obniżana przez reaktywny tlen który zmniejsza jego lepkość i upośledza jego właściwości lubrykujące powodując utrudnione ruchy stawu i ból.
HA odgrywa także ważną rolę w embriogenezie, transdukcji sygnałów, czy gwałtownych ruchach komórek (cell motility).

Slajd 7: Hyaluronan is synthesized by a class of integral membrane proteins called hyaluronan synthases, of which vertebrates have three types: HAS1, HAS2, and HAS3. These enzymes lengthen hyaluronan by repeatedly adding glucuronic acid and N-acetylglucosamine to the nascent polysaccharide as it is extruded via ABC-transporter through the cell membrane into the extracellular space

Hialuronian jest syntetyzowany przez klasę integralnych białek błonowych nazywaną syntetazą hialuronową w skład której wchodzą 3 jej typy: HAS1, HAS2 I HAS3. Enzymy te wydłużają łańcuch hialuronowy poprzez naprzemienne dodawanie kwasu glukuronowego i N-acetyloglucosaminy do ostatniego polisacharydu w momęcie jego wypychania przez ABC-transporter przez błonę komórki do przestrzeni zewnątrzkomórkowej

Slajd 8:

Co ciekawe pomimo swojej prostej budowy pojedynczej cząsteczki polimeru HA często posiadają przeciwne do siebie funkcje w zależności od rozmiaru molekuły. Duże polimery występujące w przestrzeni między komórkowej spełniają funkcje anty-angiogeniczne oraz immunosupresywne podczas gdy średnio duże polimery składające się z 25-50 disacharydów działają zapalnie, immunostymulująco oraz oraz angiogenicznie. Jeszcze mniejsze oligosachardy chamują Apoptozę oraz stymulują produkcję białek szoku termicznego – wydają się działać jako endogeniczne sygnalizatory niebezpieczeństwa – w zależności od rozmiaru transdukują zupełnie inne drogi sygnałowe.

Slajd 9:

Jako że HA jest niezbędnym komponentem do prawidłowego funkcjonowania niemalże wszystkich tkanek kręgowców , wiele z tych tkanek tj. wspomniane grzebienie kogutów, skóra rekina czy oczy podrodziny Bovinae (ssaki krętorogie tj. bizon) były używane jako źródło do izolacji i produkcji wysoko molarnego HA. Ponieważ HA w tkankach biologicznych występuje zazwyczaj w postaci związanej z innymi biopolimerami zastosowanych musiało zostać kilka różnych procedur jego otrzymywania w postaci czystego związku chemicznego, między innymi są to trawienie proteazami, strącanie w postaci zdysocjonowanej, ultrafiltracja na membranach i/lub liofilizacja.

Surowa masa molarna dostępnych komercyjnie środków z „ekstrakcyjnym” HA pozyskanym z tkanek zwierzęcych w większości wynosi od kilkuset tysięcy Da do około 2.5 MDa. Do niedawna, zapotrzebowanie na materiały z HA dopuszczone do stosowania w medycynie było zaspokajane z użyciem grzebieni kogutów – np. Healon – środek używany w chirurgicznym wszepianiu implantów do oka posiada masę molekularną około 2.5 MDa. Rynek dla HA na rok 2006 był oceniany na około bilion dolarów rocznie, obecnie może to być nawet kilkanaście bilionów dolarów.
Pomimo,że tkanki zwierzęce były wykorzystywane na wstępnych etapach produkcji klinicznie sprawdzonych materiałów zatwierdzonych przez Food and Drug Administration (FDA) dokonywano prób pozyskiwania HA z mikroorganizmów takich jak niektóre szczepy Streptococcus zooepidemicus, S. equi etc. Do niedawna był on dostępny w ofercie kilku firm nawet do kilku ton roczni, niestety ryzyko mutacji szczepów bakteryjnych, możliwa ko-produkcja różnych toksyn, immunogenów etc. Uniemożliwiła jego szersze użycie w praktyce klinicznej.

To jeden z powodów dla których HA pozyskiwany z grzebieni kogucich nadal jest preferowany w przypadku gdy potrzebne jest jego wstrzyknięcie np. w oko, staw. Choć i to nie jest idealnym źródłem i wszystkie produkty na jego bazie muszą być oznakowane odpowiednim ostrzeżeniem dla osób uczulonych na produkty pochodzenia ptasiego. Dlatego nadal poszukuje się alternatywnych metod jego produkcji.


Slajd 10:

Jednym z najbardziej obiecujących kandydatów okazał się genetycznie-modyfikowany szczep bakterii Bacillus subtilis, będący nosicielem genu hasA ze Streptococcus equisimilis kodujący enzym syntazę hialuronową – tak zmieniony szczep był w stanie wyprodukować HA o masie około 1MDa.

Schemat przedstawia konstrukcje kaset ekspresyjnych genu hasA.
A – Plazmid użyty do konstrukcji sztucznych operonów has.
B – Plazmid użyty do wprowadzenia kaset ekspresyjnych do chromosomu B. subtilis w miejscu amyE
C – Organizacja genów w sztucznym operonie has oraz szczep B.subtilis będący ich nosicielem, miejsca cięcia przez enzymy restrykcyjne użyte w procesie także zostały ukazane.

Construction of hasA expression cassettes. (A) Plasmid used to construct artificial has operons. (B) Plasmid used for introducing the expression cassettes into the chromosome of B. subtilis in the amyE locus. (C) Organization of genes in the artificial has operons and the B. subtilis strains which harbor them; restriction enzyme sites that were used in their construction are shown.

Slajd 11:

Tutaj natomiast mamy ukazaną zaproponowaną przez naukowców prowadzących badania drogę syntezy kwasu hialuronowego w zmodyfikowanej b.subtilis

(Bill Widner,1,* Régine Behr,1 Steve Von Dollen,1 Maria Tang,1 Tia Heu,1 Alan Sloma,1 Dave Sternberg,1 Paul L. DeAngelis,2 Paul H. Weigel,2 and Steve Brown)
“Proposed biosynthetic pathway for HA production in recombinant B. subtilis strains. This pathway is based on the reported HA biosynthetic pathway in group A and C streptococci (26, 27), homology searches against the published B. subtilis genome sequence, and the B. subtilis metabolic pathways described in the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (http://bioinformatics.weizmann.ac.il:3456/kegg/kegg.html). Gene designations are highlighted in boldface. The B. subtilis homologs of streptococcal has genes are in parentheses.”

Slajd 12:

B. Subtilis okazał się znakomitym biorcą genu has ze względu na kilka kryteriów:

Zarówno jego ilość jak i jakość były bardzo dobre ,a sam kwas hialuronowy nie był wiązany w komórce lecz znajdował się w otaczającym ją medium, dodatkowym atutem jest możliwość hodowania b.subtilis na podłożu minimalnym z glukozą jako jedynym źródłem węgla. na zdjęciu A – kolonia zmodyfikowanych b.subtilis wychodowana na podłożu minimalnym, oraz B – ten sam szczep niemodyfikowany genetycznie.

Przewaga jaką daje użycie B.subtilis to łatwość jej kultywacji na dużą skalę i brak endo i egzotoksyn – wiele produktów wytworzonych z użyciem tej bakterii otrzymało oznakowanie GRAS (Generally recognized as safe). Ponadto B, subtilis nie produkuje hialuronidazy mogącej zdegradować zsyntetyzowany HA. Obecnie HA pochodzenia mikrobiologicznego został dopuszczony w leczeniu powierzchownych ran oraz przemyśle kosmetycznym.

Dość często pomijany jest fakt ,że zarówno fermentowany jak i ekstraktywny HA może zawierać ślady pewnych substancji zanieczyszczających takich jak śladowe ilości protein – ich obecność może wpłynąć na tak istotną nie-immunogenność preparatów wymaganą do ich zatwierdzenia. Ponadto obecność związanej w kompleksowe związki wody wraz ze śladami przenoszonych kationów metali może wprowadzać potencjalne ryzyko zmniejszenia wysokiej masy molarnej HA poprzez jego degradacje przez tlen cząsteczkowy - Uwagę należy zwrócić na fakt ,że najważniejszą cechą charakteryzującą dany produkt z HA jest długość jego polimerów ,a jak zostało już zaznaczone cząsteczki o ,krótszym łańcuchu mogą mieć diametralnie różne efekty. Dlatego właśnie eliminowanie możliwości wystąpienia krótszych łańcuchów w wysoko molarnych preparatach kwasu hialuronowego jest dość poważnym wyzwaniem.

Slajd 13:

Biomedyczne zastosowania HA

1. chirurgia – w celu ochrony delikatnych tkanek i zapewnieniu przestrzeni podczas manipulacji chirurgicznych podobnie jak w okulistyce

2. Powiększanie – do wypełnienia i zwiększenia przestrzeni zajmowanej przez tkankę, jak np. skóra, mięśnie zwieracza, fałdy głosowe oraz tkanki gardła.

3. Separacja - do wyodrębnienia powierzchni tkanek łącznych po traumie wywołanej operacją chirurgiczną lub kontuzją w celu zapobieganiu adhezji i zbyt dużego bliznowacenia tkanek

4. Suplementacja - do wymiany lub suplementacji cieczy tkankowych tj. wymiana mazi stawowej w celu ulżenia bólu przy bolesnym zapaleniu stawów

5. Składnik płynów do przechowywania soczewek kontaktowych

6. Szerokie zastosowanie kosmetologiczne – ujędrnianie skóry i wyrównywanie zmarszczek.

7. Ochrona– w celu ochrony zdrowej, uszkodzonej lub zranionej powierzchni tkanki przed wysychaniem lub szkodliwymi czynnikami środowiskowymi oraz w celu przyspieszenia leczenia takiej tkanki.

Slajd 14:

Okulistyka

hA jest jednym z głównych komponentów ciała szklistego oka i kluczową makromolekułą w okulistyce. Ze względu na swoje lepko elastyczne właściwości, HA jest używany w kluczowych zabiegach okulistycznych. Preparaty HA chronią delikatne tkanki oka oraz zapewniają przestrzeń w trakcie manipulacji chirurgicznej. Ich głównym zadaniem jednak jest bycie substytutem lub zamiennikiem płynnego ciała szklistego utraconego w procedurach takich jak chirurgiczne usuwanie katarakty czy implementacja soczewek. Pierwszym użytym w tych celach produktem był Healon otrzymywany z grzebieni ptaków grzebiących wprowadzony na rynek w roku 1979 – szybko po nim podążyły inne podobne preparaty.

Slajd 15:

Drugim dużym zastosowaniem HA jest suplementacja stawów dotkniętych zapaleniem. Normalny/zdrowy staw pozwala na praktycznie beztarciowy i wolny od bólu ruch. W momencie uszkodzenia lub dotknięcia zapaleniem, stawy stają się sztywne i obolałe. Z ponad stu różnych patologii zapaleniowych choroba zwyrodnieniowa stawów oraz reumatoidalne zapalenie stawów są najczęściej spotkanymi stanami przewlekłymi u osób starszych. Podczas gdy pierwsze jest degenerującym zakażeniem chrząstki i kości charakteryzującym się sztywnością i boleścią stawów o tyle zapalenie reumatoidalne skutkuje oprócz bólu stawów również zmianami zwyrodnieniowymi w innych organach takich jak płuca, serce czy krew. Szacuje się ,że ponad 10% wszystkich ludzi po 55 roku życia dotkniętych jest chorobą zwyrodnieniową stawów.

Od końca lat 80 zastrzyki z HA bezpośrednio do stawu zostały skutecznie zastosowana u milionów osób dotkniętych tą chorobą. Masa molarna mazi stawowej u zdrowej dorosłej osoby wacha się pomiędzy 2 a 7 MDa, a dostępne już wtedy produkty takie jak Healon wpadały właśnie w ten przedział choć stosowano ,także średnio cząsteczkowe produkty takie jak Hyalgan (około 1MDa).
Podczas gdy terapia wysoko cząsteczkowymi zastrzykami wymagała ponad 3 tygodni o tyle średnio cząsteczkowymi musiała ona trwać co najmniej 5 tygodni. W czasach dzisiejszych Stosuje się już pojedyncze zastrzyki ,które usprawniają działanie stawu na 6 lub więcej miesięcy.

Slajd 16:

Otolaryngologia:

Zaburzenia głosu spowodowane niepełnym zwarciem szpary głośni podczas fonacji są istotnym problemem klinicznym w codziennej praktyce foniatrycznej. Dysfunkcja ta przejawia się głosem astenicznym, o zabarwieniu „chuchającym“, powoduje chrypkę, osłabienie i męczliwość głosu, jak również zawężenie zakresu dynamicznego głosu. Często inicjuje to powstanie w ramach kompensacji nadmiernych napięć w obrębie mięśni krtani i szyi. Przyczynami takich zaburzeń głosu są m.in. presbyfonia, jednostronne porażenie fałdów głosowych, niewydolność fonacyjna głośni w przebiegu czynnościowych zaburzeń głosu, blizny fałdów głosowych czy rowek głośni.

Na przestrzeni ostatnich kilku dekad wykorzystywano do augmentacji różne preparaty, takie jak teflon, kolagen wołowy, kolagen autogenny, kolagen homogenny, oraz tłuszcz autogenny. W ostatnim czasie wielu fonochirurgów stosuje kwas hialuronowy , który nie daje odczynów zapalnych w obrębie fałdów głosowych. Kwas hialuronowy jest jednym z naturalnych składników przestrzeni Reinkego, zapewnia po iniekcji elastyczność warstwy powierzchownej blaszki właściwej, wykazuje dość długą trwałość po wstrzyknięciu do fałdu głosowego oraz, jak wskazują wstępne badania histologiczne, ma zdolność pobudzania produkcji endogennego kolagenu, kwasu hialuronowego i fibroblastów

Slajd 17:

Ginekologia

W ginekologii przywraca właściwe funkcję pochwy, pomagając w regeneracji błony śluzowej i szyjki macicy. Taka potrzeba występuje m.in. po porodzie i operacjach ginekologicznych. Kwas hialuronowy wiąże wodę, zapobiega wypływowi krwi z uszkodzonych naczyń, wspomaga proces gojenia, naprawia uszkodzony nabłonek oraz aktywuje naturalne mechanizmy obronne.

Farmakologia

Karboksylowe grupy kwasu hialuronowego są używane w celu stworzenia hydrożelu unieruchamiającego DNA oraz używanego w implementacji leków. Kwas hialuronowy może być dodany bezpośrednio do leku lub użyty w celu przygotowania mikrokapsułki dla optymalnej implementacji. HA używa się ,także w celu poprawienia biokompatybilności innych materiałów używanych do produkcji mikrokapsułek (mikrosferyczny chitozan). HA jest również używany w dostarczaniu plazmidowego DNA i przeciwciał monoklonalnych w inżynierii genetycznej.

Slajd 18:

Kwas hialuronowy odgrywa istotną rolę we wszystkich fazach procesu gojenia ran i uszkodzeń skóry oraz błon śluzowych .

W fazie homeostazy wiążę się z fibryną i fibronektyną w celu utworzenia macierzy tymaczsowej w łożysku rany;

W fasie zapalnej (1-4dni) stymuluje uwalnianie cytokin i innych czynników aktywujących fibroblasty, limfocyty i wielojądrzaste granulocyty obojętnochłonne oraz pobudza adhezję limfocytów i usuwanie wolnych rodników;

W fazie ziarninowania (proliferacji ; 4-42dzien) stabilizuje i uelastycznia skrzep, stymuluje aktywność fagocytarną, wpływa n amigrację i proliferację komórek, syntezę kolagenu oraz angiogenezę;

W fazie epitalializacji wpływa na proliferację i migrację keratynocytów tworzących nowy naskórek;

W fazie przebudowy (remodellingu) wpływa na obkurczanie powierzchni rany i dojrzewanie ziarniny, z jednoczesną redukcją tworzenia się blizn.

Miejscowo stosowany kwas hialuronowy znacząco skraca czas gojenia, przyspieszajć proces epitalializacji zarówno drobnych uszkodzeń skóry i błon śluzowych jak i ran w tym także opornych na leczenie owrzodzeń podudzi i parzeń.Duże znaczenie w procesie gojenia ma zapewnianie przez HA odpowiedniego uwodnienia między komórkami, zmniejszającego przesuszenie tkanek. HA zmniejsza także odczucie bólu wywołanego uszkodzeniem tkanki, prawdopodobnie wskutek oddziaływań na zakończenia nerwowe oraz wpływa na zmniejszenie ryzyka powstawania blizn.

Slajd 19:

Niewątpliwie najbardziej popularne zastosowanie kwasu hialuronowego to kosmetologia. HA od lat reklamowany jest jako jedna z najbardziej skutecznych metod pozbywania się zmarszczek czy upiększania swojego ciała (powiększanie ust itp.).
W kosmetologii wyróżniamy 2 sfery stosowania HA, są to kosmetyki i zabiegi kosmetologiczne.

Kwas hialuronowy wchodzi w skład wielu kosmetyków. Można go znaleźć oczywiście w preparatch anti-aging, których zadaniem jest powstrzymanie procesów starzenia. Oprócz tego przemysł kosmetyczny wykorzystuje kwas hialuronowy jako cenny składnik kremów ochronnych, nawilżających i ujędrniających. To właśnie dzięki niemu zauważamy poprawę napięcia i sprężystości skóry.

Zabiegi kosmetologiczne znajdują się w ofercie salonów kosmetycznych i Spa, które również zajmują się medycyną estetyczną. Kwas hialuronowy wykorzystywany jest w zabiegach nawilżających. Ale stosuje się go przede wszystkim aby zatrzymać oznaki upływającego czasu lub skorygować niedostatki urody. Najpopularniejsze zabiegi kwasem hialuronowym to m.in.

- zabiegi nawilżające

- wypełnianie zmarszczek

- powiększanie biustu

- powiększaniu ust

- modelowanie pośladków

- modelowanie ud i łydek

- poprawianie owalu twarzy

- podniesienie policzków

- korekta nosa

- korekta uszu

- korekcja brody

- podniesienie brwi.

Slajd 21:

Różne molekuły wchodzące w interakcje z HA przyczyniają się do powstawania przerzutu nowotworego na wielu jego etapach.

Syntetaza hialuronowa na przykład odgrywa kluczową rolę w przerzucie nowotworowym we wszystkich jego stadiach. Poprzez produkcję anty-adhezyjnego kwasu hialuronowego, HAS pozwala na odłączenie się komórek nowotworowych od pierwotnego guza. Poprzez współpracę z receptorami rozpoznającymi HA takimi jak CD44 aktywuje się Rho GTPaza ,która promuje EMT komórek rakowych.

EMT- epithelial-mesenchymal transition – process w którym komórki tkanki nabłonkowej tracą swoją polarność i adhezję międzykomórkową zyskując możliwość migracji.

Ponadto wchodząc w konakt z receptorem CD44 lub RHAMM pozwala komórkom nowotworowym na inflitrację układu limfatycznego i oddechowego – a w trakcie ich migracji przez te układy HA chroni komórki rakowe przed uszkodzeniem fizycznym.

W końcu, produkowany przez HAS kwas hialuronowy pozwala komórkom rakowym na interakcję z komórkami docelowymi i wytworzenie nowego guza.

Slajd 22:

KONIEC

Kwas hialuronowy jest bardzo atrakcyjnym produktem z punktu widzenia biotechnologii. Może być pozyskiwany z różnych naturalnych źródeł – przez co opisanie właściwych biotechnologicznych procedur w celu otrzymania gotowego produktu spełniającego wymagania molekularne i biologiczne jest niezbędne, a rosnące pole zastosowań terapeutycznych kwasu hialuronowego nadaje impetu rozwojowi biotechnologicznych procesów jego pozyskiwania i optymalizacji

FAQ:
Wiązanie O-glikozydowe – rodzaj wiązania glikozydowego łączący grupę hydroksylową (−OH) pierścieniowej formy węglowodanu z grupą hydroksylową innego związku. Najczęściej występują w dwucukrach lub wielocukrach. Z chemicznego punktu widzenia O-glikozydy są acetalami.

Apoptoza- naturalny proces zaprogramowanej śmierci komórki w organizmie wielokomórkowym. Dzięki temu mechanizmowi z organizmu usuwane są zużyte lub uszkodzone komórki.

Angiogeneza - Angiogeneza (gr. Angeion = naczynie + genesis = pochodzenie, powstawanie), inaczej neowaskularyzacja - to proces tworzenia nowych naczyń włosowatych. Zachodzi w rozwoju embrionalnym, może także zachodzić w życiu pozapłodowym zarówno jako proces fizjologiczny jak i patologiczny.

Angiogenezę możemy zaobserwować podczas:

rozwoju zmiany nowotworowej,

gojenia się ran,

w agregacji płytek,

u kobiet w regeneracji endometrium,

w regulacji metabolizmu jonów.

Saturacja (łac. saturatio) - oznacza nasycenie cieczy gazem.

Przeciwciała monoklonalne (mAb – ang. Monoclonal AntiBodies) – zbiór przeciwciał, które wykazują jednakową swoistość względem danego antygenu i ewentualnie takie samo lub podobne powinowactwo. Nazwa wywodzi się stąd, że wszystkie takie przeciwciała są otrzymywane z jednego klonu limfocytów B.