Paulina Krzemińska 19.10.2011 r.

Opis doświadczenia 3:
Otrzymywanie i badanie hydrolizatu RNA z drożdży.

1. Izolacja hydrolizatu RNA z drożdży:

   1. Zmieszałam 20,57 g drożdży z 24 ml wody destylowanej w celu rozpuszczenia ich i przeprowadzenia do roztworu wodnego.

   2. Do roztworu dodałam 5 ml 40%-owego roztworu NaOH w celu przeprowadzenia hydrolizy kwasu nukleinowego, roztwór pozostawiłam na 7 minut.

   3. Do roztworu dodałam 4 ml stężonego roztworu HCl, a następnie ok. 1,5 ml lodowatego kwasu octowego tak, aby pH roztworu miało wartość pomiędzy 4, a 5. Po około 8 minutach odsączyłam powstały osad białek na lejku Schotta i otrzymałam klarowny, jasnożółty roztwór kwasu nukleinowego.

   4. Pobrałam 10 ml przesączu i dodałam do niego 2 ml 6%-owego roztworu MgSO₄, a następnie niewielką ilość HCl, aby wytrącił się osad soli magnezu z kwasem nukleinowym.

   5. Osad odwirowałam, a następnie odrzuciłam klarowny roztwór i przeniosłam osad do dwóch probówek eppendorfa.

   6. Przemyłam i wytrząsałam osad 3 razy etanolem i raz eterem (niżej wrzący, łatwiej odparował z osadu).

   7. Otrzymałam hydrolizat RNA niezbędny do dalszych badań.

2. Przeprowadzone doświadczenia:

Przed przystąpieniem do analizy jakościowej otrzymanego hydrolizatu, przygotowałam 0,1-molowy roztwór RNA poprzez rozpuszczenie zawartości eppendorfa, w którym było więcej hydrolizatu, w
10 ml H₂O. Osad całkowicie się rozpuścił i tego roztworu używałam do przeprowadzenia następujących reakcji:

1. Badanie rozpuszczalności:

Dodany odczynnik	RNA	DNA
HCl/obserwacje	Brak zmian	Brak zmian
NaOH/obserwacje	Brak zmian	Brak zmian
Wnioski	Na podstawie tego doświadczenia można napisać, iż DNA i RNA rozpuszczają się w kwasie i w zasadzie. Nie jest to prawda, ponieważ kwasy nukleinowe rozpuszczają się tylko w zasadach. Zafałszowanie wyników doświadczenia mogło być spowodowane za małym dodatkiem kwasu lub nieczystością odczynników z których korzystałam.
Et-OH/obserwacje	Zmętnienie	Zmętnienie
Wnioski	Kwasy nukleinowe nie rozpuszczają się w alkoholach. Jest to spowodowane zmianą polarności, jaką niesie ze sobą dodatek alkoholu, przez co zaburza strukturę kwasów.

1. Reakcja orcynolowa:

Dodany odczynnik	RNA	DNA	ryboza	galaktoza	H2O
Odczynnik orcynolowy + ogrzewanie/ obserwacje	Ciemnozielony roztwór	Jasnozielony roztwór	Ciemnozielony roztwór	Jasnozielony roztwór	Brak zmian / żółty roztwór
Wnioski	Reakcja orcynolowa ma na celu wykrycie cukru – pentozy. Według literatury deoksyryboza z oryną i FeCl3 daje dziesięciokrotnie słabszy kompleks podczas tej reakcji, niż ryboza, natomiast galaktoza jest heksozą. Na podstawie tych informacji można wnioskować, iż przeprowadzone przeze mnie doświadczenie przebiegło w pożądany sposób.

1. Reakcja z floroglucyną:

Dodany odczynnik	RNA	DNA	ryboza	galaktoza	H­2O
HCl + floroglucyna + ogrzewanie/ obserwacje	Czerwono – brązowy roztwór	Brudnozielony roztwór	Bardzo ciemno – brązowy roztwór	Czerwono – brązowy roztwór	Brak zmian
Wnioski	Ta reakcja mana celu wykrycie również pentozy, ponieważ wiadomo, iż w obecności floroglucyny te cukry barwią roztwór na czerwono. Przeprowadzone przeze mnie doświadczenia niestety nie potwierdziły obecności pentozy w DNA (a powinno), oraz co dziwne, wynik galaktozy wyszedł w sposób, jakby była ona właśnie pięciowęglowym cukrem, a nim nie jest. Czerwono-brązowe lub brązowe zabarwienie potraktowałam jako pozytywny wynik próby ze względu na wiek odczynników.

1. Reakcja Dischego:

Dodany odczynnik	RNA	DNA	ryboza	2’-deoksyryboza	H2O
Odczynnik difenyloaminowy + ogrzewanie / obserwacje	Brak zabarwienia	Granatowy roztwór	Brak zabarwienia	Granatowy roztwór	Brak zabarwienia
Wnioski	Odczynnik difenyloaminowy pozwala na odróżnienia DNA od RNA, ponieważ tylko z deoksyrybozą daje granatowe zabarwienie. Moje doświadczenie potwierdziło całkowicie domyślny przebieg reakcji.

1. Reakcja z molibdenianem amonu:

Do tej reakcji przygotowałam osobny roztwór poprzez rozpuszczenie mniejszej części uzyskanego na początku hydrolizatu RNA z 2 ml 0,1-molowej NaOH. Jest to 0,2%-owy roztwór RNA.

Do 0,2%-owego roztworu RNA dodałam 2 ml 1-molowego H2SO4 i ogrzewałam przez około 45 minut. Otrzymałam RNA po hydrolizie kwasowej.

Dodany odczynnik	RNA	RNA po hydrolizie kwasowej	Fosforan wzorcowy	H2O
Roztwór molibdenianu amonu + ogrzewanie + metol/ obserwacje	Kanarkowo – żółty osad i lekko zabarwiony roztwór o tym samym kolorze	Intensywnie zabarwiony osad i roztwór o kolorze kanarkowym	Intensywnie zabarwiony osad i roztwór o kolorze kanarkowym	Brak zmian
Wnioski	Reakcja ta ma na celu wykrycie jonów PO4^2-. Potwierdziła obecność fosforanów w RNA i pozwoliła na przypuszczanie, iż hydroliza kwasowa spowodowała oderwanie się fosforanów od cząsteczki RNA, co można było obserwować poprzez intensywniejszą barwę roztworu w RNA po hydrolizie kwasowej.

(NH₄)₆Mo₇O₂₄ + PO₄²⁻(NH₄)₃P(Mo₃O₁₀)₄

1. Oszacowanie czystości hydrolizatu RNA na podstawie oznaczenia spektrofotometrycznego.

Z przygotowanego na początku 0,1%-owego roztworu zhydrolizowanego RNA odpipetowałam 0,1ml i przeniosłam do 15-mililitrowego falconu, po czym dopełniłam do 5 ml. Po dokładnym rozmieszaniu roztworu napełniłam nim szklaną kuwetę i przeprowadziłam pomiar spektrofotometryczny w zakresie długości fal od 230 do 300 nm.

Pomiar jest prowadzony w takim zakresie długości fal, ponieważ zasady azotowe pochodzące od puryny i pirymidyny mają maksimum absorpcji właśnie około 260 nm. Nasza próbka ma maksimum absorpcji przy długości fali 257,5 nm. Świadczy to o nieobecności białek w próbce, które powodowałyby dodatkowe maksima w widmie.

Długość fali [nm]	Absorpcja
257,5	0,819
280,0	0,360

Czystość próbki obliczamy w następujący sposób:

$$\frac{A_{280}}{A_{260}} = \frac{0,360}{0,819} = 0,44$$

Powyższa wartość jest niższa, niż 0,49, więc możemy przyjąć, iż nasza próbka nie zawiera białek i jest względnie czysta.