Wykrywanie kw. nukl. w ekstr. drozdz-biochemia, Biochemia


Wykrywanie cukrowców oraz kwasów nukleinowych (DNA)

w ekstrakcie drożdżowym

Kwasy rybonukleinowe i dezoksyrybonukleinowych można wykrywać i odróżniać na podstawie analizy składnika cukrowego, zasady azotowej oraz kwasu azotofosforowego.

Celem ćwiczenia jest poznanie reakcji barwnych umożliwiających wykrywanie składników cukrowych. Wykazanie obecności tych składników następuje po ich uwolnieniu w wyniku częściowej lub całkowitej hydrolizy. Całkowite uwolnienie zasad, cukrów i kwasu ortofosforowego z DNA i RNA następuje pod działaniem kwasów w podwyższonej temperaturze. Przez łagodną hydrolizę, przeprowadzoną zasadami lub enzymami, uzyskuje się większe fragmenty kwasów nukleinowych - nukleotydy i nukleozydy.

1. Otrzymywanie kwasów nukleinowych z drożdży

Drożdże są dogodnym źródłem kwasów nukleinowych. Kwasy te izoluje się w środowisku alkalicznym lub obojętnym, gdyż przy niższych wartościach pH następuje degradacja DNA. Do wytrącania kwasów nukleinowych z roztworów stosuje się etanol, a delipidację otrzymanego osadu prowadzi się przy pomocy eteru.

Wykonanie doświadczenia: Ze względu na czasochłonność wykonania ekstraktu kwasów nukleinowych każda sekcja otrzyma na zajęciach gotowy ekstrakt.

2. Hydroliza kwasów nukleinowych

Całkowitą hydrolizę kwasów nukleinowych do zasad azotowych, kwasu fosforowego i pentozy prowadzi się przy pomocy kwasu siarkowego w podwyższonej temperaturze.

Wykonanie doświadczenia

Do małej ilości kwasów nukleinowych dodać 5 ml 2n H2SO4, wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. Hydrolizat zobojętnić ługiem sodowym wobec papierka wskaźnikowego.

3. Wykrywanie cukrowców

W hydrolizacie kwasów nukleinowych wykazać można obecność pentoz przy pomocy reakcji Molischa na cukrowce i reakcji Biala na pentozy. Natomiast odróżnienie 2-dezoksyrybozy od rybozy może nastąpić za pomocą reakcji z dwufenyloaminą (reakcja Dischego). W środowisku kwaśnym 2-dezoksyryboza z dwufenyloaminą tworzy produkt kondensacji o barwie niebieskiej, a ryboza w tych warunkach nie reaguje.

3.1. Odróżnianie cukrowców od innych związków organicznych (próba Molischa).

Cukrowce pod wpływem stężonego kwasu siarkowego ulegają odwodnieniu przekształcając się w pochodne furfuralowe. Z pentoz powstaje furfural, natomiast z heksoz - hydroksymetylofurfural.

Wytworzone związki, posiadające grupę aldehydową połączone z heterocyklicznym układem furanowym, reagują z fenolami tworząc barwne produkty. W przypadku reakcji Molischa wynikiem kondensacji z naftolem jest produkt o fioletowej barwie.

Dodatni wynik z odczynnikiem Molischa dają również w większym stężeniu niektóre inne związki organiczne (aldehydy, kwasy, aceton).

Wykonanie doświadczenia

Odmierzyć l ml próbki oraz dodać po 4 krople odczynnika Molischa, a następnie podwarstwić trzema mililitrami stężonego kwasu siarkowego (pipetą po ścianie skośnie ustawionej probówki).

Na granicy warstw w obecności cukrowca winien pojawić się fioletowy pierścień; często poniżej powstaje zielony krążek pochodzący od zanieczyszczeń α-naftolu.

3.2. Próba Biała na pentozy

Reakcja Biala pozwala na odróżnienie pentoz od heksoz. Tworzący się z pentoz pod wpływem ogrzewania z kwasem solnym furfural reaguje z orcyną (metylowa pochodna dwufenolu - rezorcyny), tworząc kompleks o zielonym zabarwieniu.

W tych samych warunkach dodatni wynik dają również dezoksypentozy, ale w słabym stopniu. Natomiast heksozy przekształcają się w hydroksymetylofurfural rozkładający się dalej. Związek ten tworzy z orcyną żółtobrązowy produkt.

Wykonanie doświadczenia

Do probówki odmierzyć 5 ml odczynnika Biala. (Uwaga: pobierać pipetą z gruszką) i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut. Następnie do probówki wprowadzić l ml badanego roztworu. Ogrzewać przez kilka minut i zanotować wynik.

3.3 Wykrywanie DNA metodą dwufenyloaminową

Powszechnie stosowana metoda oznaczenia dezoksypentozy opiera się na reakcji z dwufenyloaminą. Reakcja ta polega na tworzeniu niebieskiego zabarwienia podczas ogrzewania DNA z dwufenyloaminą, kwasem octowym i siarkowym o temperaturze 100° przez kilka minut. Znacznie lepszą czułość reakcji otrzymuje się przez dodanie kwasu nadchlorowego oraz aldehydu octowego i rozwijanie koloru przez 17 godzin w 30°C, jednakże ze względów czasowych w ćwiczeniu wykorzystany jest pierwszy sposób prowadzenia reakcji. W reakcji bierze też udział wolna deoksyryboza.

Wykonanie ćwiczenie

Do probówki wprowadzić 1 ml badanej próbki oraz 4 ml odczynnika dwufenyloaminowego i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Zanotować wynik.

Sprawozdanie:

Omówić wyniki uzyskanych obserwacji odpowiadając jednocześnie na pytania:

Czy w badanej próbie występują cukrowce?

Czy w badanej próbie występują DNA i/lub RNA?

Jeżeli podczas wykonywania ćwiczenia natknięto się na rozbieżności w stosunku do informacji zawartych w instrukcji (np. czas inkubacji w łaźni wodnej), należy przedstawić własne obserwacje.

Na podstawie składu chemicznego DNA i RNA wskazać sposób odróżnienia tych dwóch kwasów nukleinowych (najlepiej wykonać tabelę porównawczą).



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
kw nukl, Studia Zootechnika, Biochemia Zwierząt
sprawko kw nukl
aminokwasy,kw nukl i bios białek
pyt kw nukl rozwiązane
Aminokwasy - REAKCJE NA WYKRYWANIE, Biochemia, Biochemia, aminokwasy
Biochemia VIII, Reakcja na wykrywanie tyminy:
Wykrywanie obecności enzymów - instrukcja, BIOCHEMIA
KWASY NUKLEINOWE, Ogrodnictwo UP Lbn, Biochemia, kwasy nukl
kw nukleid22222, AWF Wychowanie fizyczne, Biochemia
Wykrywanie obecności enzymów - wnioski, BIOCHEMIA
Zasada heterocykliczna, Ogrodnictwo UP Lbn, Biochemia, kwasy nukl
Biochemia, biochemia kolos 2, Lipidy (alkohole i kwasy tłuszczowe) Kw
11 BIOCHEMIA horyzontalny transfer genów
Biochemia z biofizyką Seminarium 2
Podstawy biochemii
08 BIOCHEMIA mechanizmy adaptac mikroor ANG 2id 7389 ppt

więcej podobnych podstron