Wnioski

Preparat enzymatyczny przygotowany z świeżo utartego chrzanu wykazywał dużo większą aktywność niż preparat przygotowany (wg ćw. 3) z suszonej pietruszki. Świadczyło o tym dużo intensywniejsze zabarwienie roztworów w probówkach oraz pojawienie się w nich piany. Zmiana koloru nastąpiła zaraz po dodaniu odczynników natomiast w probówkach z preparatem z pietruszki powolna zmiana barwy nastąpiła po ok. 2 min. Większa aktywności preparatu z chrzanu jest spowodowana większą zawartością hydroperoksydaz , a także tym, że w świeżym chrzanie występowały również oksydazy. Pietruszka po ekstrakcji i suszeniu pozbawiona była oksydaz i w preparacie znajdowały się same hydroperoksydazy. Poza tym ilość pietruszki wykorzystanej do przygotowania preparatu była mniejsza niż ilość chrzanu.

W probówkach z preparatem ze świeżo utartego chrzanu powstało dużo gęstej piany. Jest to dowód na obecność katalaz, które w reakcji z H₂O₂ powodują powstanie tlenu. Ilość powstałej piany świadczy o tym, że katalaza z korzenia chrzanu jest bardzo aktywna. Brak piany w probówkach z preparatem z pietruszki spowodowany jest brakiem katalaz, lub ich bardzo małym stężeniem.

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Wnioski do części 5 w lab „wykrywanie obecności enzymów”

5a)

Po dodaniu H₂O₂ do probówek z ekstraktem ziemniaczanym i chrzanem w obu przypadkach zaobserwowano wydzielenie tlenu, jednak w ekstrakcie z ziemniaka wydzielenie to było intensywniejsze. Możemy zatem wywnioskować, że wyciąg z ziemniaka zawierał większe stężenie katalazy.

5b)

• Po ogrzaniu do wrzenia:

Nie zaobserwowano wydzielenia tlenu (brak piany). Powodem jest denaturacja białka enzymu spowodowana wysoką temperaturą.

• Po wstawieniu na 15 minut do lodówki:

W obu probówkach zaobserwowano wydzielenie piany. Spodziewano się, że będzie ono jednak nieznaczne, a na pewno mniej intensywne niż w doświadczeniu 5a) jednak z powodu dodania większej ilości H₂O₂ obserwowana piana była porównywalna. Można stąd wywnioskować, że katalaza jest aktywna nawet w obniżonej temperaturze.

• Po dodaniu NaCN:

W obu przypadkach zaobserwowano nieznaczne wydzielenie tlenu. NaCN zahamował częściowo działanie katalazy (jony CN- są inhibitorami) nieznaczne pojawienie się piany może świadczyć o dużym nadmiarze katalazy w stosunku do użytego inhibitora, poprzez co nie wszystkie cząsteczki enzymu utraciły swą aktywność.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Zadanie 4

Porównanie wrażliwości oksydaz i peroksydaz na temperaturę

1 probówka - po ogrzaniu dodano 10 kropli pirokatechiny - jasny kolor brązowy

2 probówka-po ogrzaniu dodano 10 kropli pirokatechiny oraz 10 kropli H₂O₂- ciemny kolor brązowy; brak piany

Wnioski:

Po dodaniu odczynników do probówek zaobserwowano zmianę zabarwienia jednak było ono słabsze niż w przypadku tych samych prób, które nie były poddane działaniu wysokiej temperatury. Jasny kolor roztworu w probówce pierwszej świadczy o słabym utlenieniu pirokatechiny przez oksydazy, a wynika to z faktu małej odporności tych enzymów na wysoka temperaturę.

W przypadku probówki numer 2 obserwowano zmianę zabarwienia na ciemniejszy kolor brązowy co wynika z powstania chinonów w wyniku utlenienia pirokatechiny co potwierdza fakt, że peroksydazy są mało wrażliwe na działanie wysokiej temperatury. Peroksydazy wykorzystują nadtlenek wodoru w reakcji utlenienia pirokatechiny. Nie zaobserwowano piany nad roztworem w probówce co świadczy o braku katalaz, które zaobserwowano w próbach nie poddanych ogrzewaniu w łaźni wodnej. Z tego wynika, że katalazy są wrażliwe na wysoką temperaturę.

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Zadanie 6.

Chrzan słoiczkowy zalano wodą destylowaną, następnie przesączono.

Nr próby	Odczynniki	Obserwacje
1	pirokatechina, H2O2	zmiana barwy z białego na brązowy
2	pirogalol, H2O2	zmiana barwy z białego na czerwono brązowy, ceglasty
3	benzydyna, H2O2	zmiana barwy z białego na granatowy

WNIOSKI

Zaobserwowana zmiana zabarwienia w próbie z pirokatechiną oraz pirogalolem świadczy o wytworzeniu się chinonów, a zatem obecności enzymów takich jak hydroperoksydazy i oksydazy. Ponieważ jednak dodawaliśmy nadtlenku wodoru badaliśmy w tym doświadczeniu głównie peroksydazy. O występowaniu tych enzymów mówi nam także uzyskanie koloru granatowego w próbie z benzydyną.

W porównaniu do chrzanu tartego zabarwienie okazało znacznie mniej intensywne oraz w przypadku chrzanu słoiczkowego nie zaobserwowano piany.

Brak piany jest to informacja, że w roztworze nie występują katalazy, zaś jaśniejszy kolor świadczy o tym, że zawartość tych enzymów jest mniejsza niż w świeżym chrzanie. Najprawdopodobniej są to skutki przetwarzania chrzanu w procesie przemysłowym (np. obróbka termiczna, konserwanty).

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Nr probówki	Badany materiał	odczynnik	Warunki	Obserwacje
1	Wyciąg z ziemniaka	H2O2	Normalne	Powstanie piany
2	Wyciąg z chrzanu	H2O2	Normalne	Powstanie piany
3	Wyciąg z ziemniaka	H2O2	Próbka poddane działaniu wysokiej temperatury	Wytrącenie się osadu, zmiana barwy
4	Wyciąg z chrzanu	H2O2	Próbka poddane działaniu wysokiej temperatury	Wytrącenie się osadu
5	Wyciąg z ziemniaka	H2O2	Próbka poddane działaniu niskiej temperatury	Powstanie piany
6	Wyciąg z chrzanu	H2O2	Próbka poddane działaniu niskiej temperatury	Powstanie piany
7	Wyciąg z ziemniaka	H2O2, NaCN	Normalne	Powstanie niewielkiej ilości piany
8	Wyciąg z chrzanu	H2O2 , NaCN	Normalne wytrącił	Powstanie niewielkiej ilości piany

Wnioski do części 5 w lab „wykrywanie obecności enzymów”

5a)

Po dodaniu H₂O₂ do probówek z ekstraktem ziemniaczanym i chrzanem w obu przypadkach zaobserwowano wydzielenie tlenu, jednak w ekstrakcie z ziemniaka wydzielenie to było intensywniejsze. Możemy zatem wywnioskować, że wyciąg z ziemniaka zawierał większe stężenie katalazy.

5b)

• Po ogrzaniu do wrzenia:

Nie zaobserwowano wydzielenia tlenu (brak piany). Powodem jest denaturacja białka enzymu spowodowana wysoką temperaturą o której świadczy wytrącenie się kłaczków osadu.

• Po wstawieniu na 15 minut do lodówki:

W obu probówkach zaobserwowano wydzielenie piany. Spodziewano się, że będzie ono jednak nieznaczne, a na pewno mniej intensywne niż w doświadczeniu 5a) jednak z powodu dodania większej ilości H₂O₂ obserwowana piana była porównywalna. Można stąd wywnioskować, że katalaza jest aktywna nawet w obniżonej temperaturze.

• Po dodaniu NaCN:

W obu przypadkach zaobserwowano nieznaczne wydzielenie tlenu. NaCN zahamował częściowo działanie katalazy (jony CN- są inhibitorami) nieznaczne pojawienie się piany może świadczyć o dużym nadmiarze katalazy w stosunku do użytego inhibitora, poprzez co nie wszystkie cząsteczki enzymu utraciły swą aktywność.

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Wykrywanie oksydaz w ziemniaku
Numer probówki	Odczynnik	Zmiana barwy
1	fenol	Po 10 minutach od dodania odczynnika próba zmienia barwę na bladoróżowy
2	pirokatechina	Po 1 minucie zmiana barwy na brunatny, 2 minuta kolor ciemnieje cała próbka odbarwiła się na kolor herbaciany, 13 minuta kolor ciemnieje a przy powierzchni pojawia się kolor ciemno żółty
3	pirogalol	Po 30 sekundach pojawia się kolor brudnożółty, w następnych minutach kolor lekko ciemnieje

Wykrywanie oksydaz w ziemniaku
Numer probówki	Odczynnik	Zmiana barwy
1	fenol + NaCN	Po 21 minucie próbka przy powierzchni brunatnieje
2	pirokatechina + NaCN	Nie zaobserwowano zmian
3	pirogalol + NaCN	Po 3 minutach próbka przy powierzchni odbarwia się na kolor żółtobrązowy 14 minuta bez zmian

WNIOSKI

Z pierwszej części ćwiczenia wynika, że w wyciągu z ziemniaka znajdują się oksydazy, które powodują utlenianie fenolu, pirokatechiny i pirogalolu do chinonów, które charakteryzują się ciemnobrunatną barwą. Największe odbarwienie zaobserwowano przy pirokatechinie i pirogalolu. Dzieje się tak gdyż są to związki, które łatwo się utlenieniają. W pierwszej próbce reakcja zachodzi bardzo powoli, wręcz niezauważalnie, ponieważ fenol musi być utleniony najpierw do pirokatechiny by mógł być przekształcony w benzochinon. Prawdopodobnie zostawienie próbki nr 1 na dłuższy okres spowodowałoby, że reakcja zaszłaby do końca a uzyskany kolor byłby taki sam jak w próbce nr 2.

Druga część zadania pokazuje inhibicje oksydaz z wyciągu z ziemniaka przez jony CN^-. Jednak pomimo dodania znacznej ilości NaCN reakcja nie została całkowicie zatrzymana. Przy powierzchni pojawiały się odbarwienia, co oznacza, że do przeprowadzenia reakcji niezbędny jest kontakt z tlenem.

Z pierwszej części ćwiczenia wynika, że w wyciągu z ziemniaka znajdują się oksydazy, które powodują utlenianie fenolu, pirokatechiny i pirogalolu barwnych chinonów. W przypadku probówek z pirokatechiną i pirogalolem zmiana koloru następuje praktycznie natychmiast po dodaniu odczynnika. Wynika z tego, że związki te łatwo ulegają utlenieniu, w przeciwieństwie do fenolu, który najpierw musi zostać przekształcony do pirokatechiny. Przypuszczalnie gdyby mieszaninę reakcyjna postawiono na dłuższy okres czasu, to kolor byłby identyczny z kolorem roztworu w probówce z pirokatechiną.

Poprzez drugą część zadania zbadano wpływ jonów CN- na postęp reakcji enzymatycznej. W doświadczeniu tym spoedziwano się całkowitej inhibicji oksydaz. Jednak w przypadku próby z pirogalolem reakcja zaszła od razu (w b. niewielkim stopniu), natomiast w probówce z fenolem po ok. 25 minutach pojawił się brązowy pierścień, co również wskazuje na nie całkowite zatrzymanie reakcji. Prawdopodobnie było to spowodowane za małym stężeniem jonów CN- w mieszaninie reakcyjnej. Jedynie w probówce z pirokatechiną nie odnotowano reakcji, co potwierdza, że cyjanki użyte w odpowiednim stężeniu są inhibitorami enzymów.

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Zadanie 4

Porównanie wrażliwości oksydaz i peroksydaz na temperaturę

1 probówka - po ogrzaniu dodano 10 kropli pirokatechiny - jasny kolor brązowy

2 probówka-po ogrzaniu dodano 10 kropli pirokatechiny oraz 10 kropli H₂O₂- ciemny kolor brązowy; brak piany

Wnioski:

Po dodaniu odczynników do probówek zaobserwowano zmianę zabarwienia jednak było ono słabsze niż w przypadku tych samych prób, które nie były poddane działaniu wysokiej temperatury. Jasny kolor roztworu w probówce pierwszej świadczy o słabym utlenieniu pirokatechiny przez oksydazy, a wynika to z faktu małej odporności tych enzymów na wysoka temperaturę.

W przypadku probówki numer 2 obserwowano zmianę zabarwienia na ciemniejszy kolor brązowy co wynika z powstania chinonów w wyniku utlenienia pirokatechiny co potwierdza fakt, że peroksydazy są mało wrażliwe na działanie wysokiej temperatury. Peroksydazy wykorzystują nadtlenek wodoru w reakcji utlenienia pirokatechiny. Nie zaobserwowano piany nad roztworem w probówce co świadczy o braku katalaz, które zaobserwowano w próbach nie poddanych ogrzewaniu w łaźni wodnej. Z tego wynika, że katalazy są wrażliwe na wysoką temperaturę.

Zad2:

Gosia i Flora: wykrywanie peroksydaz w ziemniaku

wszystkie 4 reakcje zaszły (wszystkie substraty zostały utlenione), o czym świadczą zmiana zabarwienia i pojawienie się piany.
pojawienie się piany związane jest z silnym wydzielaniem tlenu, co spowodowane było obecnością w wyciągu ziemniaczanym oksydaz jak i peroksydaz
w próbie benzydynowej, na skutek utleniania benzydyny, (H2O2 został wykorzystany przez peroksydazy do utlenienia) pojawiły się niewielkie ilości blękitu benzydynowego
zmiany, które zaszły w probówkach, spowodowane zostały utlenieniem substratu przez dodawany nadtlenek wodoru.

---