19 X 2009

WYKŁAD 3

by pupazzo

Panie i Panowie, zaczynamy kolejny dział, mianowicie enzymologia.

ENZYMOLOGIA KLINICZNA

Lekarza praktyka interesują enzymy w 2 aspektach. Po pierwsze, w aspekcie diagnostycznym, tym zajmuje się dział biochemii zwany enzymologią kliniczną. A drugi aspekt, który lekarza interesuje, to wpływ różnych czynników na aktywność enzymu, czyli przede wszystkim wpływ toksyn, które mogą zahamować aktywność enzymu w różnym mechanizmie lub cała plejada leków, których działanie na enzymy to jest bądź to aktywacja - rzadziej, bądź inhibicja - częściej. Na zajęciach seminaryjnych będą te zagadnienia szczegółowiej omawiane. Ja chcę Państwu jedynie dzisiaj jakąś ideę wykorzystania enzymów w diagnostyce laboratoryjnej, w diagnostyce medycznej dzisiaj przedstawić.

Badania, które należą do enzymologii klinicznej należą do bardzo częstych badań laboratoryjnych wykonywanych u człowieka, w diagnostyce chorób, w monitorowaniu. Praktycznie nie ma specjalizacji lekarskiej, która by w oparciu o enzymologię nie kształtowała swojego wizerunku na temat stanu zdrowia i choroby. Oczywiście idea jest taka, żeby przy pomocy badania laboratoryjnego w sposób czuły i swoisty rozpoznać chorobę, czyli ideałem byłoby, aby enzym był charakterystyczny bądź to dla narządu, bądź to dla stanu chorobowego. I w większości sytuacji tak jest. Ale tak jak to w życiu, życie przerosło kabaret, a postęp nauk podstawowych wyprzedził aplikację kliniczną. I wbrew temu, czego będziecie się Państwo uczyć, na dzień dzisiejszy, praktycznie w bardzo niewielu enzymach możliwe jest oznaczenie aktywności poszczególnych form, charakterystycznych dla narządu lub dla choroby. Ale ponieważ to się może zmienić, musimy mówić o ideach, które z czasem może się wprowadzą w czyn. Żeby można było diagnozować choroby lub mówić o funkcji narządów, konieczne jest rozróżnienie różnych form enzymów, czyli musimy zacząć od rozmowy o różnych formach enzymów, czyli ich heterogenności.

Heterogenność enzymów

Przyczyny:

• uwarunkowana genetycznie (izoenzymy)

• enzymy modyfikowane posttranslacyjnie

To, co wykorzystujemy w diagnostyce laboratoryjnej, to są formy, różne formy danego enzymu uwarunkowane genetycznie. I takie formy uwarunkowane genetycznie nazywamy izoenzymami.

Drugą przyczyną heterogenności, której to nie wykorzystujemy w diagnostyce laboratoryjnej, to jest heterogenność uwarunkowana modyfikacjami posttranslacyjnymi białek. I to nie są izoenzymy, mimo, że pod wieloma właściwościami od enzymu innego, zasadniczego, się różnią. Zaraz do tego dojdziemy.

NIE-IZOENZYMY

• fosforylacja

• mostki disiarczkowe

• α-amylazy

Zacznijmy od tych, które są nie-izoenzymami. No co my tu mamy.

Dobrze nam już znane modyfikacje o typie fosforylacji i defosforylacji. Czyli odpowiednio fosforylaza glikogenu, w formie ufosforylowanej i defosforylowanej - to nie są izoenzymy. To są formy tego samego enzymu zmodyfikowane posttranslacyjnie.

Inny przykład. Powstawanie lub usuwanie mostków disiarczkowych. Również taki enzym przed i po modyfikacji to nie są izoenzymy, nie są izoformy tego samego enzymu. Te 2 modyfikacje są bardzo charakterystyczne i istotne w przypadku jednego enzymu, mianowicie α-amylazy. α-amylaza, która posiada szereg izoenzymów obecnych w osoczu krwi, szczegóły w skrypcie i w podręcznikach, to nie jest przedmiot teraz naszych rozważań, może również wchodzić w modyfikacje nieizoenzymatyczne, np. może łączyć się z innymi białkami. Takim białkem może być komponent M, czyli γ-globulina monoklonalna występująca w niektórych chorobach układu hemopoetycznego - szpiczak mnogi, makroglobulinemia Waldenströma. No i taka przyłączona do innego białka α-amylaza dalej pozostaje α-amylazą, nie jest to izoenzym.

Kolejna modyfikacja dotycząca tego samego enzymu, mianowicie α-amylazy, tworzenie się agregatów, czyli jest to zaburzenie uwarunkowane genetycznie. Cząsteczki α-amylazy agregują ze sobą; tu łączyły się z innym białkiem w poprzedniej modyfikacji, a tu łączą się ze sobą. α-amylaza jest enzymem drobnocząsteczkowym, jako unikalną właściwością w sensie diagnostycznym jest fakt, że α-amylaza filtruje się w kłębkach nerkowych, można jej aktywność oznaczyć w zbiórce moczu, dobowej, godzinowej, sześciogodzinnej, dwunastogodzinnej. W przypadku wszelkich substancji drobnocząsteczkowych większą przydatność diagnostyczną ma oznaczenie zawartości takiej substancji w dobowej zbiórce moczu niż w jednorazowej porcji krwi. Bo skoro bez przeszkód się filtruje, to jej zmiany stężenia w surowicy krwi lub aktywności nie odzwierciedlają stanu patologicznego.

Jaką mamy charakterystyczną zmianę w przypadku tych dwóch modyfikacji? W przypadku połączenia się z innym białkiem lub w przypadku asocjacji ze sobą powstają takie konglomeraty tegoż białka enzymatycznego, które uniemożliwiają filtrację kłębkową i w rzeczywistości mamy sytuację taką: podwyższoną lub prawidłową aktywność w surowicy krwi przy nieobecności aktywności w moczu. Te dwa zjawiska, czyli tworzenie się agregatów ze sobą, lub tworzenie się agregatów z innymi białkami nosi nazwę makroamylazemii. Makroamylazemia. A wymiarem laboratoryjnym tych zaburzeń jest to, że w moczu, jak powiedziałem, aktywność α-amylazy równa się zero, przy prawidłowej lub podwyższonej aktywności w surowicy krwi.

Kolejny przykład czegoś, co nie jest izoenzymem. Proszę, tu mamy modyfikację posttranslacyjną, o typie ograniczonej proteolizy. Czyli tak np. pepsynogen przekształca się w pepsynę. Trypsynogen w trypsynę. Trypsynogen nie jest izoenzymem trypsyny, tak jak pepsyna nie jest izoenzymem pepsynogenu, to są modyfikacje posttranslacyjne.

Warunkiem uznania za izoenzym, jest uwarunkowanie tej modyfikacji, tej odmiany, genetycznie.

IZOENZYMY

Pochodzenie:

• multi loci kodujące białka enzymatyczne

na 1 chromosomie

na wielu chromosomach

• formy alleliczne genu kodującego białko enzymatyczne (alleloenzymy)

• heterogenność składu podjednostkowego (enzymy hybrydowe)

Skąd izoenzymy pochodzą? No mogą być to multi loci kodujące dane białka enzymatyczne zlokalizowane na jednym chromosomie, albo na wielu chromosomach, zaraz takie przykłady będziemy pokazywać.

Mogą to być odmiany alleliczne, tak zwane alleloenzymy.

I wreszcie przykład, z którym będziecie Państwo mieli bardzo wiele do czynienia, występowanie tzw. enzymów hybrydowych. Enzym charakteryzuje się tym, że zbudowany jest z wielu podjednostek, czyli jest to białko mające strukturę czwartorzędową i przez różną kompozycję podjednostek powstają izoenzymy, no taki klasyczny przykład - dehydrogenaza mleczanowa, jeden z częściej używanych enzymów w diagnostyce laboratoryjnej, LDH, czy enzym, o którym będziemy dzisiaj mówić, CPK, czyli kinaza kreatynowa. I tutaj właśnie taki przykład. W zależności proszę Państwa od tego, z ilu podjednostek jest zbudowany enzym, ten przykład bardzo dobrze pasuje do koncepcji dehydrogenzay mleczanowej, bo ten enzym jest tetrametrem, zbudowanym z 2 typów podjednostek, podjednostki H i podjednostki M. Możemy mieć do czynienia albo z jednorodnymi podjednostkami, czyli będzie homotetramer, podobnie jak tu, możemy mieć formy składające się z różnych podjednostek, czyli heterotetramery. Jeśli enzym zbudowany jest z 2 podjednostek, to, jak łatwo zobaczyć, liczba kombinacji tych podjednostek jest znacznie mniejsza.

IZOENZYMY

Zmiana profilu:

• zależna od rozwoju

• zależna od choroby

Ideałem, czy założeniem w diagnostyce jest to, aby znaleźć związek między aktywnością izoenzymu, lub, może należałoby powiedzieć, stężeniem izoenzymu, bo w takim kierunku to dzisiaj ewoluuje, a po pierwsze - fazą rozwoju, i dwa - chorobą.

Co to znaczy faza rozwoju? Żeby analizować aktywność danego enzymu warto się zainteresować, jak w przebiegu rozwoju ontogenetycznego aktywność enzymu się zmienia. Za chwilę pokażę to na przykładzie fosfatazy alkalicznej.

Dalej - warto zdać sobie sprawę, jak aktywność tego enzymu zmienia się w szczególnych okolicznościach życia człowieka, np. w ciąży.

No a kolejny aspekt zagadnienia to taki, należy sobie zadać pytanie, czy następują takie zmiany w aktywności enzymu w przebiegu patologii, które sprawiają, że enzym ma przydatność diagnostyczną, czy istnieje coś, co się nazywa wartością predykcyjną. Wartość predykcyjna - pod tym pojęciem rozumie się: jeśli objaw, to choroba. To znaczy, muszą istnieć takie wartości aktywności enzymu, które z dużym prawdopodobieństwem przy zaplanowanej czułości i swoistości mogą nam odróżnić populację zdrowych od chorych. I w takim sensie służy do rozpoznawania chorób, jest markerem diagnostycznym.

Kolejna sprawa. Musimy wiedzieć, w jakiej fazie choroby aktywność enzymu pojawia się w surowicy krwi i dwa, jak wygląda ewolucja zmian aktywności. Na konkretnych przykładach będę to Państwu omawiał.

No i wreszcie trzeba sobie zdać sprawę, że są enzymy, które są przydatne do rozpoznania choroby, ale do monitorowania tej choroby absolutnie się nie nadają. Po prostu nie potem już żadnej korelacji między procesem zdrowienia a powrotem aktywności niektórych enzymów do wartości prawidłowych.

PROFIL ENZYMATYCZNY

fosfataza alkaliczna

Zależność od fazy rozwoju. Enzym fosfataza alkaliczna. Fosfataza alkaliczna, obecna w surowicy krwi, składa się z kilku frakcji izoenzymatycznych, ale tak naprawdę znaczenie mają dwie.

U osoby dorosłej za aktywność fosfatazy alkalicznej obecnej w surowicy krwi w 80% odpowiada izoenzym wątrobowo-żółciowy. Natomiast 20% aktywności fosfatazy alkalicznej przypada na izoenzym kostny. Z tego wynika, że u osoby dorosłej w diagnostyce pewnej grupy chorób wątroby, jakie, to do tego dojdziemy, fosfataza alkaliczna jest bardzo wartościowym enzymem. Ale obserwacji tej nie możemy przenieść na dziecko, gdybyśmy chcieli diagnozować chorobę wątroby u dziecka stosując oznaczanie aktywności fosfatazy alkalicznej, to czeka nas ogromne rozczarowanie, a właściwie postawienie nieprawidłowego rozpoznania. Ponieważ u dziecka, no powiedzmy do 12-13 roku życia, aktywność fosfatazy alkalicznej pochodzenia kostnego znacznie przewyższa aktywność fosfatazy alkalicznej pochodzenia wątrobowego. I jest to fizjologia. Fosfataza alkaliczna pochodzenia kostnego jest enzymem wydzielanym przez osteoblasty, i w okresie tworzenia kośćca wysoka aktywność tego enzymu, który uwalnia się w sposób bierny z kości, przenika do krwioobiegu, fałszuje to rozpoznanie. Większość laboratoriów oznacza aktywność całkowitą, czyli to, co tu mamy - mieszaninę różnych frakcji. Jak ominąć tą niedogodność? Należałoby oznaczać aktywność izoenzymu, albo aktywność izoenzymu wątrobowego w przypadku diagnostyki chorób wątroby, albo aktywność izoenzymu kostnego w przypadku diagnostyki chorób kości. W przypadku tego enzymu jest to stosunkowo łatwe do wykonania. Natomiast oznaczając całkowitą aktywność u dziecka należy liczyć się z tym, że wynik znacznie odbiega od wartości referencyjnych dla osoby dorosłej, co wynika z tego slajdu.

Kolejny przykład na podstawie tego samego enzymu. Jak powiedziałem, loci kodujące białko, w tym przypadku to białko enzymatyczne, mogą być zlokalizowane na różnych chromosomach. I tak jest w przypadku również fosfatazy alkalicznej. Mianowicie na chromosomie 1 mamy tzw. enzymy tkankowo niespecyficzne, wśród których znajdujemy szereg enzymów, które stosujemy w diagnostyce, ale nie o tym chcę tutaj mówić. Mianowicie na chromosomie 2 znajdują się loci, które kodują izoenzymy fosfatazy alkalicznej, które, wydawałoby się lat temu kilkadziesiąt, że zrewolucjonizują diagnostykę laboratoryjną. Mianowicie mamy tutaj tzw. izoenzymy nowotworowe, ich nazwy są tutaj podane: izoenzym Regana, izoenzym Nagao i izoenzym Kasahara. Pierwsze badania, to jest koniec lat 30. XX wieku, kiedy Fishman diagnozując pacjentów z rakiem płuca wykazał, że mają oni podwyższoną aktywność fosfatazy alkalicznej, co ciekawe, o właściwościach jako żywo przypominającej fosfatazę pochodzenia łożyskowego. A byli to mężczyźni, i nie w ciąży! Powstała więc koncepcja, że w sytuacjach nowotworzenia następuje swoisty molekularny switching i tkanka nowotworowa zaczyna produkować izoenzymy, które normalnie w tkance prawidłowej nie występują. Początkowo uznano te izoenzymy jako tzw. markery nowotworów, kolejne lata badań, diagnostyki, wykazały, że ich przydatność diagnostyczna na dzień dzisiejszy, jest, powiedzmy, zerowa. To znaczy, mając kogoś z wysoką aktywnością fosfatazy alkalicznej, która ponadto zachowuje się jak fosfataza alkaliczna pochodzenia łożyskowego, a cechą charakterystyczną tego izoenzymu jest to, że jest termostabilny, czyli ulega bardzo trudno inaktywacji termicznej, no należy mocno rozmyślać, czy gdzieś jednak proces nowotworzenia nie zachodzi. Natomiast nie jest to marker w takim sensie, że jak u kogoś oznaczymy aktywność tego enzymu, jest ona wysoka, to z dużym prawdopodobieństwem możemy rozpoznawać chorobę nowotworową. Takich substancji w diagnostyce biochemicznej, jak dotąd, jest bardzo, bardzo niewiele.

IZOENZYMY

Zróżnicowanie właściwości

• ruchliwość elektroforetyczna

• rozpuszczalność

• oporność na inaktywację fizykochemiczną

• wrażliwość na inhibitory

• aktywność molekularna

• stała Michaelisa

• zdolność do katalizy reakcji z udziałem analogów substratów

• antygenowość

No wskutek różnic w budowie izoenzymy różnią się również swoimi właściwościami rozmaitymi, co znalazło zastosowanie w diagnostyce laboratoryjnej, no przede wszystkim różnią się ruchliwością elektroforetyczną. No z tego wynika prosty wniosek, że bardzo prostą techniką diagnostyczną, jaką jest elektroforeza, możemy poszczególne izoformy odróżnić. No, częstokroć, ponieważ zmiany w strukturze izoenzymów są niewielkie i wpływają one w bardzo niewielkim stopniu na ruchliwość elektroforetyczną, trzeba uciekać się do pewnych kruczków, do pewnych haczyków, żeby te izoformy odróżnić, nie jest to metoda, powiedzmy sobie najlepsza, w takiej diagnostyce pod strzechami.

Druga właściwość, zmiana rozpuszczalności. To praktycznie ma zastosowanie w jednej technice, mianowicie w tzw. próbie riwanolowej, stosowanej w odróżnieniu izoenzymów aminotransferaz.

Kolejna cecha, różnice w oporności na właściwości fizykochemiczne. To jest najczęściej używana metoda, tą metodą możemy m.in. odróżnić fosfatazę alkaliczną pochodzenia wątrobowego, czyli ten izoenzym wątrobowo-żółciowy od izoenzymu kostnego. Wykonuje się tzw. test cieplny, w temperaturze 56 ° poprzez 5 minut następuje inaktywacja praktycznie całkowita izoenzymu pochodzenia kostnego, a w próbce zostaje nie zahamowany tylko i wyłącznie izoenzym wątrobowo-żółciowy. Test cieplny. Jest to metoda szeroko stosowana.

Wrażliwość na inhibitory specyficzne. No przykład fosfataza kwaśna izoenzym sterczowy. Wrażliwość na L-winian, na kwas winowy. Podobnie alkohol etylowy.

No i inne właściwości, to aktywność molekularna, inna stała Michaelisa, rzadziej stosowane metody diagnostyczne, z wykorzystaniem swoistych substratów, natomiast właściwość, która stanowi pewien przełom w diagnostyce laboratoryjnej, to zmiana antygenowości.

Enzym, jak każde białko, cechuje się dwoma cechami: immunogennością i antygenowością. Immunogenność to zdolność do wytworzenia przeciwciał przeciwko temu białku, jeśli zaszczepimy odpowiednie zwierzę doświadczalne. W surowicy krwi tego zwierzęcia pojawią się przeciwciała przeciwko białku, którym zaszczepiliśmy je, czyli przeciwciała przeciwko konkretnemu izoenzymowi. A antygenowość to zdolność tego białka, tego naszego enzymu, do przereagowania z tymi ciałami, czyli do powstania kompleksu immunologicznego, który to metodami, dziś już stosowanymi powszechnie w diagnostyce laboratoryjnej, możemy wykorzystać do oceny, no właśnie - czego? Stężenia tego białka. No i tu się świat, proszę Państwa, wali. W przypadku enzymów zawsze miarą ich ilości była ocena ich aktywności, czyli poznawaliśmy je po czynach, po ubytku substratu lub na podstawie przyrostu produktu. Tym samym stosując te metody, metody immunologiczne oceny białek, z którymi na ćwiczeniach się Państwo spotkacie, oceniamy nie aktywność enzymu, tylko jego ilość. Jak to poznać? No jeśli wartości wyniku będziemy mieli podane w jednostkach międzynarodowych, w katalach, czy podwielokrotnościach katali, to wiemy, że został oceniony enzym ze względu na swoją aktywność, czyli to, co on zrobił, typową metodą kinetyczną. Jeśli enzym, jego zawartość, będzie wyrażona w jednostkach stężenia, czyli w mg, mmolach, etc., to wówczas wiemy, że zostało to ocenione metodą immunologiczną, czyli nie wiemy, czy ten enzym działa czy nie działa, wiemy tylko, ile go jest w surowicy krwi.

IZOENZYMY

Metody rozdziału:

• elektroforeza

• chromatografia

• inaktywacja chemiczna

• inaktywacja fizyczna

• właściwości katalityczne

• analogi substratu

• swoiste inhibitory

• immunologiczne

Zgodnie z tym zasadami, o których powiedziałem, istnieje kilka metod rozdziału. Wspomniana już metoda elektroforetyczna, chromatografia: powinowactwa, jonowymienna, rozmaite typy; inaktywacja chemiczna, czyli stosowanie odpowiednich inhibitorów, stosowanie głównie temperatury w inaktywacji fizycznej.

Przechodzimy proszę Państwa do clue programu.

Kliniczny podział enzymów wg Richtericha i Hessa

SEKRECYJNE
INDYKATOROWE
EKSKRECYJNE

Istnieje wiele podziałów enzymów. Podział, który interesuje biochemika, no i również Państwa musi interesować, to jest podział wg Międzynarodowej Unii Biochemicznej, na klasy główne enzymów. Według tej klasyfikacji każdy enzym ma przyporządkowany numer swój, dzięki temu można wiedzieć, o czym się mówi, ponieważ istnieje pewien bałagan nomenklaturowy: nazwy zwyczajowe, nazwy systematyczne, etc., etc. Natomiast lekarza interesuje podział utworzony przez Richtericha i Hessa, mianowicie podział kliniczny enzymów. A więc mówiąc o danym enzymie, jeśli ma on znaczenie diagnostyczne, to należy sobie zadać takie pytanie: do której kategorii głównej, do której klasy głównej on należy, proszę się przypadkiem tej nazwy EC, czyli Enzyme Commited czy Clasifocation nie uczyć na pamięć, bo my tego nie znamy na pamięć, a jak ktoś nam takie rzeczy napisze, to musimy sprawdzać w książkach, czy to jest taki numer, czy nie, no przydatność tego jest zerowa.

Trzeba wiedzieć, do jakiej klasy należy no i zadać sobie pytanie, do której klasy wg podziału klinicznego enzymów on należy. Bo z tego podziału do klasy klinicznej zależy cała filozofia wykorzystania diagnostycznego.

A ten podział jest bardzo prosty, on dzieli enzymy na enzymy sekrecyjne, czyli wydzielnicze, enzymy wskaźnikowe, czyli indykatorowe, nieładnie kiedyś nazywane nekroenzymami, czyli enzymami martwiczymi, ale od czasów nekroafery to lepiej zdecydowanie mówić indykatorowe. I trzecia kategoria enzymów to są enzymy ekskrecyjne, czyli enzymy wydalnicze. Te pierwsze były wydzielnicze, a te są wydalnicze. No i jak sobie odpowiemy na pytanie, który z interesujących nas enzymów do której klasy należy, to będziemy wiedzieć, czego po jego aktywności możemy się spodziewać. No ale będziemy to rozwijać na przykładach.

ENZYMY SEKRECYJNE

• czynniki krzepnięcia

• czynniki fibrynolizy

• nieswoista esteraza cholinowa

• ceruloplazmina

• lipaza lipoproteinowa (LPL)

• lipaza wątrobowa (HTGL)

• 
  acetylotransferaza lecytyna : cholesterol (LCAT)

Enzymy sekrecyjne mają coś istotnego do odegrania w surowicy krwi. Są wydzielane przez narządy, numer jeden pod tym względem to jest komórka miąższowa wątroby. Na wytworzenie tego enzymu, potrzeba po pierwsze sprawności komórki, czyli musi ona być pod względem funkcjonalnym sprawna i musi być pod względem strukturalnym sprawna. Wytworzenie takiego białka enzymatycznego na eksport, czyli do surowicy krwi, wymaga energii. Z tego płynie praktyczny wniosek. Jeśli dojdzie do uszkodzenia komórki wątrobowej dla przykładu, no bo to jest ten główny narząd produkujący enzymy sekrecyjne, pod wpływem różnych czynników: biologicznych, fizycznych, chemicznych, komórka miąższowa wątroby przestaje wytwarzać te enzymy. W zależności od okresu półtrwania, wahnięcie w aktywności lub stężeniu, w zależności, co będziemy oceniać, nastąpi wcześniej lub później. W świetle tego, co tu powiedziałem, w przypadku tych enzymów mówimy o dolnej granicy normy jedynie.

Bo wątroba nie jest taka głupia, żeby produkowała coś w nadmiarze. Nie ma możliwości, żeby czegoś było za dużo. Natomiast, jeśli dojdzie do jej uszkodzenia, może być ich za mało. Co to za czynniki uszkadzające komórkę miąższową wątroby?

Są dwie główne grupy. Czynnik biologiczny, czynnikiem biologicznym w Polsce robiący prawdziwe spustoszenie w zakresie uszkodzenia komórki miąższowej wątroby jest wirus wirusowego zapalenia wątroby typu B. Czyli jak kobiety z mięsnego mówią żółtaczka zakaźna, no ale student medycyny tak nie mówi, tylko nazywa to wirusowym zapaleniem wątroby typu B. Droga zakażenia krwiopochodna, najczęściej brudny sprzęt, bałagan, syf panujący w służbie zdrowia, to jest przyczyna wirusowego zapalenia wątroby typu B. Wirusowe zapalenie wątroby typu A, to jak ktoś się stołuje nie w tych miejscach, których należy, drogą pokarmową. No i na przestrzeni ostatnich kilkunastu lat zdecydowany wzrost zapalenia wątroby typu C. Niezwykle podstępnego, też drogą krwiopochodną przenoszonego, który nie przebiega w sposób, nazwijmy to, niezwykle ostry, niezwracający uwagę, natomiast tli się całymi latami prowadząc do raka wątroby lub marskości wątroby. To są czynniki biologiczne uszkadzające. Czynniki chemiczne to przede wszystkim leki, alkohol etylowy, grzyby nie należące do grzybów jadalnych według atlasu grzybów, i tak dalej i tak dalej…

Co my w tym repertuarze znajdujemy i co ma jaką przydatność diagnostyczną, bo repertuar to można sobie tworzyć taki jak litania do Matki Boskiej Częstochowskiej. No, co tu mamy.

Czynniki krzepnięcia, i bez wątpienia oznaczenie czasu protrombinowego, czyli ocena czynnika II, VII, IX, X, ma tutaj znaczenie kluczowe. I z mojego punktu widzenia to najlepszy marker oceny czynności wydzielniczej komórki miąższowej wątroby. Czas protrombinowy.

Do tej samej grupy należą czynniki fibrynolizy, no ale to rzadko kto oznacza.

Nieswoista esteraza cholinowa - jej poświęcimy za chwilę trochę więcej czasu.

Ceruloplazmina, bardzo ciekawe białko - z jednej strony białko o charakterze białka transportującego, z drugiej strony białko enzymatyczne biorące udział w zmianie stopnia utlenienia żelaza.

Dwa kolejne enzymy o bardzo podobnym mechanizmie działania, to jest lipaza lipoproteinowa LPL oraz lipaza wątrobowa, czyli HTGL. Ten skrót HTGL znaczy Hepatic TriGliceryde Lipase, lipaza wątrobowa trójglicerydowa, takiego skrótu będziemy używać. To są tzw. ektoenzymy. Obydwa enzymy są zakotwiczone na powierzchni śródbłonka naczyniowego. Pierwszy z tych enzymów, czyli lipaza lipoproteinowa, na komórkach śródbłonka naczyniowego występującego w obrębie tkanki mięśniowej, tkanki tłuszczowej. Natomiast drugi z tych enzymów, jak wynika z nazwy, zakotwiczony jest na śródbłonku zatok wątroby. Enzymy działają wewnątrz łożyska naczyniowego, ale nie wolno sobie pływając, tylko zakotwiczone są na śródbłonku. Szczegóły w przyszłym semestrze. Tak więc, gdybyśmy chcieli oznaczyć jej aktywność w surowicy krwi, to jest ona bardzo niska lub zerowa. Dopiero jak je oderwiemy od śródbłonka, są na to sposoby, metodą łagodnej perswazji, wtedy możemy aktywność tych enzymów oznaczyć.

Kolejny enzym tej samej kategorii, enzym badany w komórkach miąższowych wątroby, LCAT, czyli acylotransferaza lecytyna cholesterol, to jest enzym, który ma znaczenie kluczowe dla estryfikacji cholesterolu, lipoproteina frakcji HDL. Czyli jak coś się stanie złego z komórką miąższową wątroby, to aktywność tych enzymów lub ich stężenie, jak zwał, tak zwał, ulega obniżeniu, nie podwyższeniu.

ESTERAZY CHOLINOWE

Podział:

• acetylocholinesteraza

• esteraza cholinowa I

• prawdziwa cholinsteraza

• acylohydrolaza acylocholiny

• esteraza cholinowa II

• pseudocholinesteraza

• benzoilocholinesteraza

• 
  butyrylocholinesteraza

Jednym z enzymów należących do klasy enzymów sekrecyjnych, czyli wydzielniczych należy esteraza cholinowa. I tu najpierw musimy sobie ponazywać pewne rzeczy.

Istnieją takie dwie zasadnicze esterazy cholinowe. Jedna to jest acetylocholinesteraza, czyli taka acetylocholinesteraza prawdziwa. I jest to enzym, który katalizuje reakcję hydrolizy acetylocholiny do octanu i choliny. Acetylocholina, neuroprzekaźnik, po wykonaniu swojego działania, musi zostać dezaktywowana, czyli zhydrolizowana, no po to, żeby to przekaźnictwo miało ręce, nogi i głowę przede wszystkim.

Drugim enzymem należącym do cholinesteraz jest pseudocholinesteraza, którą tutaj mamy, ta wytwarzana właśnie w komórkach miąższowych wątroby. Ona ma kilka różnych nazw, to wszystko to samo. Warto zapamiętać tą ostatnią nazwę - butyrylocholinesteraza, bo najczęściej jest ona tak nazywana.

ESTERAZY CHOLINOWE

Występowanie:

• acetylocholinesteraza

• zakończenia nerwowe

• istota szara OUN

• erytrocyty

• płuca

• śledziona

• acylohydrolaza acylocholiny

• wątroba

• trzustka

• serce

• istota biała OUN

• osocze

Gdzie występuje pierwszy typ enzymu? No przede wszystkim w zakończeniach nerwowych, po co, to już powiedziałem, w istocie szarej ośrodkowego układu nerwowego, można ją także wykryć w erytrocytach, w płucach, śledzionie - po co tam występuje, do końca nie wiadomo.

Natomiast pseudocholinesteraza w różnych narządach, ta, która znajduje się w osoczu jest wytwarzana w komórkach miąższowych wątroby.

ESTERAZY CHOLINOWE

Charakterystyka

• rozdział elektroforetyczny

7-12 frakcji

• struktura molekularna

• formy atypowe

AA (O,3 - 0,5 % populacji)

• sukcynylocholina (suxamethonium)

• diagnostyka

oznaczanie aktywności

liczba dibukainowa

Jeśli dokonać rozdziału elektroforetycznego pseudocholinesterazy, można jako produkt uzyskać szereg frakcji. Z czego to wynika? Wynika ze struktury molekularnej pseudocholinesterazy. To jest polimer, natomiast ilość tych wagoników w pociągu jest bardzo zmienna, są formy małe, są formy duże, zbudowane z mniejszej, z większej liczby podjednostek, i to decyduje o rozdziale na frakcje.

Forma, która występuje u osoby zdrowej, czyli u większości populacji, nosi nazwę EE. Natomiast u pewnego niewielkiego odsetka, niewielkiego z punktu widzenia statystyki, dla każdej z tych osób to one są w 100%, także statystykę należy rozumieć wyłącznie w sensie badań naukowych, a nie w sensie leczenia ludzi czy rozprawiania o ich problemach, bo dla kogoś nikt nie jest jednym procentem jakiejś populacji, tylko jest jednostką dla siebie, dla swojej rodziny stuprocentową. Więc w tych trzech do pięciu osób na tysiąc populacji, ale już w milionowym mieście to będzie 3000 i 5000, występuje izoforma AA. To są osoby, które mają skrajnie obniżoną aktywność cholinesterazy w surowicy krwi.

Z punktu widzenia życie codziennego nie ma to absolutnie żadnego znaczenia, dopóki nie trafi się w łapy służby zdrowia. Żeby wykonać większość zabiegów operacyjnych u człowieka, człowiek musi być zwiotczony, żeby nie napinał mięśni. I podaje się w tym celu analog acetylocholiny, który się nazywa sukcynylocholina. Sukcynylocholina.

Jak za mało tej sukcynylocholiny otrzymał pacjent, to chirurg klepie pacjenta „panie Kowalski, nie boli pana nic? nie boli pana nic?”, to jest sygnał dla anestezjologa, czyli po drugiej stronie wału, żeby ilość leku zwiotczającego podać. To wszystko trwa pięknie, do momentu zakończenia zabiegu operacyjnego. Ten enzym wątrobowy ma zhydrolizować sukcynylocholinę. U osoby zdrowej tak się odbywa bez problemu, natomiast osoba, która ma odmianę AA, bardzo słabo radzi sobie z hydrolizą sukcynylocholiny, i następuje przetrwały stan zwiotczenia mięśni, nie trzeba chyba nikomu mówić, z jaką konsekwencją dla mięśni oddechowych. To jest nazwa międzynarodowa: suxamethonium.

No celem stwierdzenia, czy ta aktywność jest prawidłowa, czy nie, szczególnie u osób, które już jakieś perypetie życiowe w znieczuleniu ogólnym miały, można oznaczyć aktywność tego enzymu i oznaczyć, wyrazić to jako aktywność jako tzw. liczbę dibukainową, która jest miarą aktywności czy zdolności do degradacji sukcynylocholiny przez surowicę krwi pacjenta.

ENZYMY INDYKATOROWE

Narządowo swoiste

- wątroba

- mięśnie poprzecznie prążkowane

Narządowo nieswoiste

- glikoliza

- cykl pentozowy

- cykl Krebsa

- przemiana aminokwasów

Enzymy wskaźnikowe, czyli indykatorowe. To są enzymy wewnątrzkomórkowe, które pełnią bardzo istotne funkcje w obrębie komórki, mogą być zlokalizowane w różnych organellach komórkowych, mogą być w błonie, mogą być w cytozolu, w mitochondriach i tak dalej i tak dalej i normalnie ma ich, w cudzysłowie, nie być, w surowicy krwi. A są.

Skąd to się bierze? No bierze się stąd, że komórki obumierają, ulegają naturalnemu rozpadowi, i z tej niewielkiej ilości rozpadających się komórek, które prawidłowo kończą swój żywot, pewne kwantum tych enzymów przenika do krwioobiegu. Skoro w komórce jest ich dużo, a w surowiczy, czyli przestrzeni pozakomórkowej mało, to znaczy, że ich gradient chemiczny, czyli gradient stężeń jest skierowany na zewnątrz komórki. Po to, żeby nie uciekły, komórka musi użyć szeregu podstępów, przede wszystkim musi dbać o integralność błony, o jej, w cudzysłowie, szczelność. To wymaga energii. Podobnie jak to było w przypadku enzymów sekrecyjnych, te same czynniki, które uszkadzają komórkę miąższową wątroby lub innych narządów, doprowadzają do tego, że nie więcej niż w warunkach prawidłowych takiego enzymu ucieka z komórki. Czysto teoretycznie do sprawy podchodząc. Jeśli uszkodzenie komórki jest niewielkie, to uciekną głównie enzymy z cytozolu, jeśli destrukcjakomórki jest totalna, uciekną enzymy zlokalizowane również w innych przedziałach komórkowych. Nie ma to jak dotąd znaczenia czysto praktycznego, to jest tylko rozważanie czysto teoretyczne.

Enzymy indykatorowe dzielą się na 2 kategorie. Są to mianowicie enzymy narządowo swoiste, i tu mamy 2 takie narządy, są to wątroba i mięsień poprzecznie prążkowany. Enzymy należące do tej kategorii to pewnie Państwa zszokuje, nie zrobiły żadnej kariery diagnostycznej. Np. enzym narządowo swoisty dla wątroby - dehydrogenaza alkoholowa. Poza faktem, że ją mamy, a na przykład Azjaci mają bardzo niską aktywność, dlatego ich tolerancja na alkohol jest bardzo, ale to bardzo zła, to ten fakt nie ma żadnego znaczenia.

Zaskakujące, największą karierę w diagnostyce zrobiły enzymy narządowo nieswoiste. Dlaczego zrobiły taką karierę? Bo jest ich dużo. Łatwo je oznaczyć. I enzymy narządowo nieswoiste dzielimy według toru metabolicznego, w którym one uczestniczą. I zdecydowanie największą karierę, pośród tej kategorii enzymów, czyli enzymów indykatorowych, zrobiły enzymy uczestniczące w przemianie aminokwasów, a zwłaszcza w początkowych fazach tej przemiany, czyli w reakcjach transaminacji. Czyli są to aminotransferazy.

Aminotransferaz jest „naście”, ale w diagnostyce laboratoryjnej wykorzystujemy dwie. Pierwsza, to jest aminotransferaza asparaginianowa, w skrócie A duże es małe, pe małe, Asp, i duże A i duże T. Pod taką nazwą ten enzym jest wyłącznie w polskim piśmiennictwie. Jak komuś się marzy kariera międzynarodowa, to skrót międzynarodowy GOT, czyli Group Oxaloacetic Transaminase. Dżi-oł-ti. To jest skrót międzynarodowy. Druga, AlAT. Duże A, małe el, duże A, duże Te. Nazwa międzynarodowa tego enzymu to GPT. Glutamyl Pyruvic Transaminase. Dżi-pi-ti.

	AspAT (GOT)	AlAT (GPT)
serce	7800	450
wątroba	7100	2850
mięśnie	5000	300
nerka	4500	1200
trzustka	1400	130
śledziona	700	80
płuco	500	45
erytrocyt	15	7
surowica	1	1

Te dwa enzymy zrobiły karierę diagnostyczną ze względu na fakt bardo wysokiej zawartości tych enzymów w dwóch narządach, mianowicie w wątrobie i w mięśniu sercowym. Porównując z surowicą, gdzie aktywność, przyjmowana za 1, aktywność w tych dwóch narządach jest kilka tysięcy razy wyższa. Obydwa enzymy oznaczamy zawsze razem, nikt nie zleca „proszę zrobić AspAT, a u innego, Kowalskiego, proszę zrobić AlAT”. AspAT i AlAT rozpatruje się równolegle.

Przyjrzyjmy się mięśniu sercowemu. Transaminazy mają dwa izoenzymy. Izoenzym cytoplazmatyczny i izoenzym mitochondrialny.

Przyglądamy się mięśniu sercowemu AspAT - tu większość aktywności, ok. 80% występuje w cytoplazmie. 20% w mitochondriach. W przypadku AlAT dla mięśnia sercowego proporcje są odwrotne. 20% enzymu występuje w cytozolu, 80% występuje w mitochondrium. Z tego płynie prosty wniosek. Proszę patrzeć na slajd. Jeśli nastąpi uszkodzenie mięśnia sercowego, najczęściej jest to niedokrwienie z martwicą, czyli zawałem. To przede wszystkim ucieknie nam AspAT, bo jest w cytozolu, natomiast wysokie wzrosty aktywności AlAT mogą świadczyć o zupełnej destrukcji komórki, bowiem AlAT pochodzi z mitochondium, jak powiedziałem.

Sytuacja odmienna jest w przypadku komórki miąższowej wątroby. Tu AlAT w 80% zlokalizowany jest w cytozolu, a 20% znajduje się w mitochondrium. A AspAT odwrotnie: 20 % w cytozolu, 80% w mitochondrium.

Najczęstszą przyczyną wzrostu w przypadku chorób serca, jak powiedziałem, niedokrwienie i zawał, w przypadku chorób wątroby - ostre zapalenie wątroby lub uszkodzenie wątroby na innym tle. Rzadko kiedy w przypadku diagnostyki chorób mięśnia sercowego, zawałów serca, oznacza się AspAT i AlAT jako jedyne enzymy. Każdy z tych enzymów, których aktywność rośnie w przebiegu patologii ma pewien profil zmian aktywności, czyli wiadomo, kiedy następuje wzrost, kiedy osiąga maksimum i po jakim czasie ma nastąpić obniżenie do wartości prawidłowych. To nazywamy zmianą, czy ewolucją wartości enzymu w przebiegu jakiejś patologii, no w tym przypadku zawału serca. Najczęstszymi enzymami służącymi do tej diagnostyki mięśnia sercowego, zawału mięśnia sercowego, obok AlAT i AspAT, należy CPK, o którym za chwilę, LDH, czyli dehydrogenaza mleczanowa, GGTP, czyli γ-glutamylotranspeptydaza. I należy nauczyć się profilu zmian aktywności w przebiegu zawału mięśnia sercowego. Ponieważ w każdej książce jest to napisane inaczej, to zanim wyrobicie sobie Państwo własne zdanie w tej sprawie, to trzeba będzie znaleźć jakiś consensus, my rekomendujemy nauczenie się tego z obowiązującego dla studentów podręcznika interny, pod redakcją profesora Kokota. Jest tam rozdział „zawał mięśnia sercowego”, jest tabelka i należy sobie przyswoić, który enzym, w której fazie ma znaczenie diagnostyczne.

KINAZA KREATYNOWA

Izoenzymy

• cytoplazmatyczne

CK - 1 (BB)

CK - 2 (MB)

CK - 3 (MM)

• mitochondrialne

CK - Mt

Kolejny enzym z tej kategorii, czyli enzymów indykatorowych, czyli kinaza kreatynowa. Kinaza kreatynowa, to enzym, który fosforyzuje kreatynę i powstaje fosfokreatyna. Jaka funkcja tego związku - w magazynowaniu energii, w swoim czasie.

Kinaza kreatynowa występuje w postaci kilku izoenzymów, które możemy podzielić na izoenzymy cytoplazmatyczne, enzym, jak widać, jest dimerem, zbudowanym z 2 typów podjednostek. Podjednostka B, od Brain, czyli mózg, i podjednostka M, od Muscle, czyli mięsień. W diagnostyce laboratoryjnej wykorzystujemy nie całkowitą aktywność kinazy kreatynowej, jak to było w poprzednich enzymach omawianych, ale oznaczamy aktywność konkretnie tego jednego izoenzymu, czyli tzw. CK-MB, czyli heterodimeru, który jest enzymem wskaźnikowym dla mięśnia sercowego. Oprócz tego mamy izoenzym mitochondrialny, o znikomej, póki co, wartości diagnostycznej.

narząd	CK - 3 (%)	CK - 2 (%)	CK - 1 (%)
mięśnie	98,9	1,1	0,06
mózg	0	2,7	97,3
serce	78,7	20	1,3
nerka	2,8	0	97,2
płuco	27 - 72	0 - 4	18 - 69
łożysko	0	0	100
tarczyca	4 - 26	0 - 1	73 - 96

I teraz tak. Wykorzystujemy ten izoenzym CK-MB z następującego powodu. Jak widać, na załączonym obrazku, odsetkowo występuje on w największej zawartości właśnie w mięśniu sercowym, ale proszę nie mówić, że jest to główny izoenzym CPK, czy CK, jak kto woli, występujący w mięśniu sercowym, bo głównym jest CK-3, czyli ten charakterystyczny dla mięśni poprzecznie prążkowanych.

Spośród markerów enzymatycznych zawału mięśnia sercowego aktywność CK-MB rośnie najszybciej. Czyli są przydatne do wczesnej diagnostyki spośród markerów enzymatycznych, podkreślam. Co by nam dało, gdybyśmy oznaczali aktywność całkowitą CPK w zawale mięśnia sercowego. Ano nic, proszę Państwa. Ktoś przyjeżdża z zawałem mięśnia sercowego do szpitala, zostaje serię zastrzyków w rozmaite miejsca, no i z mięśni uwalnia się izoenzym mięśniowy, czyli CK-MM, i nawet jeśli nie ma zawału mięśnia sercowego, to aktywność CK jest podwyższona. Tylko i wyłącznie operujemy tutaj izoenzymem MB, czyli CK-2, którego, jak widać, w mięśniach szkieletowych jest relatywnie mało.

Możemy oprócz metod immunologicznych, które służą do oceny CK-MB, używać metod elektroforetycznych, widać wyraźnie, że w surowicy prawidłowej CK-MB jest niewiele, w przypadku uszkodzenia niedokrwiennego mięśnia sercowego aktywność CK-MB istotnie rośnie.

Przydatność CK-BB, czyli tego izoenzymu mózgowego jest znikoma, w literaturze opisują oczywiście ciekawostki przyrodnicze, że w przypadku udaru mózgu aktywność tego izoenzymu rośnie, natomiast myślę, że znacznie łatwiej rozpoznać ten udar mózgu innymi metodami niż poprzez oznaczanie CK-BB, i to się wykorzystuje w diagnostyce laboratoryjnej.

Metody rozdziału izoenzymów:

• elektroforeza wysokonapięciowa

• HPLC

• chromatoogniskowanie

• immunologiczne

Metody oznaczania kinazy kreatynowej różne różniste, najszerzej stosowana w diagnostyce laboratoryjnej metoda immunologiczna ze swoistymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko CK-MB, czyli z tego wynika, że oznaczamy stężenie, czy aktywność? Stężenie. A czy to dobrze, czy to źle, nie ważne.

Proszę Państwa, mamy to, o czym teraz mówimy. Mamy komórkę mięśnia sercowego. Zawał nie dzieje się ot, tak, jest poprzedzony długotrwałym niedokrwieniem mięśnia sercowego z reguły. Należy wobec tego przypuszczać, że enzymy, które znajdują się w takiej komórce mogą nie do końca być w pełni funkcjonalne. Dawniej stosowanymi metodami były metody typowo chemiczne, czyli mieliśmy substrat, na niego działał enzym uwolniony z komórek, na niego działał produkt. Ubytek substratu lub przyrost produktu był miarą aktywości uwolnionego enzymu. Ale o tym, ile powstanie produktu, lub ubędzie substratu nie decyduje tylko i wyłącznie, ile enzymu się uwolniło, również to, że enzym, jako białko enzymatyczne, jest sprawny, czy działa. A jak moja zapowiedź była wcześniej, może być to enzym W wyniku niedokrwienia niefunkcjonalny i mogłoby się okazać, że mimo, że uwolniło się go dużo, produktu wcale nie przybyło, czyli wynik byłby fałszywie ujemny.

Jeśli mamy metodę bazującą na następującym zjawisku, dysponujemy przeciwciałami znakowanymi przeciwko podjednostce CK-MB, to jest przeciwko temu izoenzymowi, a następnie ten enzym przyłączony, to szczegółowo wszystko przy metodach ELISA będzie jasne, katalizuje nam przemianę substratu w produkt, to nie jest taki substrat-produkt, jak tu, to jest substrat-produkt dla enzymu wskaźnikowego przyłączonego do przeciwciała. Wtedy dowiadujemy się, ile białka enzymatycznego się uwolniło, a to nas interesuje, czyli białko, które kardiomiocyt wydzielił uszkodzony, a nie to, czy enzym uwolniony działa, czy nie, bo to akurat nas nie interesuje.

To była typowa metoda kinetyczna, wyraża się ten wynik jako aktywność enzymu, natomiast tu mamy oznaczenie enzymu jako białka, czyli wyrażamy to w formie stężenia. Można sobie rysunek sporządzić, proszę bardzo, artystyczny, czas 30 sekund

Markery biochemiczne zawału serca:

• nieenzymatyczne

- mioglobina

- troponina T

• enzymatyczne

- CK - MB 1 i 2

Masa (stężęnie) CK-MB dagnostyczne dla AMI > 1,6 ng/ml.

Δ 24 h > 1,6 ng/ml

No i jesteśmy przy tych markerach zawału mięśnia sercowego. Mamy nieenzymatyczne: mioglobina, troponina T. Są w wielu ośrodkach mianowicie testy szybkie, szkiełkowe, które w sposób półilościowy potrafią nam powiedzieć czy wartość referencyjna jest przekroczona, czy nie. A dopiero potem zabawiamy się oceną stężenia, już dokładnie, konkretnie, ilościowo. Takie testy półilościowe, testy w warunkach izby przyjęć czy szpitalnego oddziału ratunkowego, jak kto woli.

No i testy enzymatyczne, w tych testach enzymatycznych nr 1 jest to CK-MB. Oprócz oznaczenia samego stężenia CK-MB uwolnionego z mięśnia sercowego, niektóre ośrodki dodatkowo wykonują oznaczenia funkcji czasu, jeśli Δ między oznaczeniem w punkcie 0 i po dwóch godzinach przekracza tą wartość podaną na slajdzie, to znaczy, że mięsień sercowy ulega stałej degradacji, kolejne molekuły CK-MB się uwalniają. Też jest to marker o znaczeniu diagnostycznym.

ENZYMY EKSKRECYJNE

• żółci

• soku trzustkowego

• śliny

• soku sterczowego

• gruczołów wydzielniczych żołądka

Trzecia kategoria enzymów wg Richtericha i Hessa, to są enzymy ekskrecyjne, czyli enzymy wydalnicze. Co to za enzymy? Są to enzymy produkowane o określonych gruczołach, wydzielane są do przewodu wyprowadzającego, większość z nich ma dotrzeć do jakiejś przestrzeni w naszym organizmie, w której będą pełnić funkcje określone. W warunkach prawidłowych… o… motyl, no chyba niegroźny… w warunkach prawidłowych, można powiedzieć, że podobnie jak w przypadku enzymów indykatorowych powinniśmy tych enzymów nie spotykać w surowicy krwi.

O, jeszcze jedna ważna uwaga. W przypadku enzymów sekrecyjnych mówiłem, że mówimy o dolnej granicy normy. Jak jest mniej, to jest niedobrze. W przypadku enzymów indykatorowych, nie ma pojęcia dolnej granicy normy: im mniej, tym lepiej. Natomiast istnieje pojęcie górnej granicy normy, której przekroczenie wskazuje na uszkodzenie tkankę.

No i teraz tak. Norma aktywności aminotransferaz wynosi 30 IU. Przyjdzie do Państwa sąsiadka z tego samego piętra, albo z piętra wyżej, bo dla ludzi z zewnątrz, taki student medycyny, to już jest pół-bóg (śmiech). Przychodzi z tym wynikiem badania laboratoryjnego, aktywność wynosi 32. To co powiecie tej sąsiadce? Żeby poszła do lekarza, tak? (śmiech) 32, to dobry wynik, czy niedobry wynik? Niedobry? Kto myśli, że niedobry 32, przy normie do 30, ręka w górę. (śmiech, bo prawie nikt nie podniósł) Nadgorliwi są szkodliwi, o dwie już osoby, kto jeszcze? Wynik jest jak najbardziej dobry, proszę Państwa. Trzeba się zastanowić, mechanizm, skąd się to bierze w surowicy krwi. Żeby była patologia, to muszą się masywnie rozpadać komórki, jeśli norma jest przekroczona kilkakrotnie, to ma to przydatność diagnostyczną. Jak jeden ma metr pięćdziesiąt, a drugi metr osiemdziesiąt i obaj należą do Homo sapiens, i myślą, są normalni, to norma 28 i 32 przy normie do 30, też ma wynik prawidłowy. Do wszystkiego trzeba podchodzić krytycznie.

Podobnie jak w przypadku enzymów indykatorowych, enzymy ekskrecyjne również mają górną granicę normy, której przekroczenie wskazuje na patologię.

Skąd wobec tego biorą się enzymy ekskrecyjne w surowicy krwi? Biorą się wtedy, gdy naturalny ich bieg do tego rezerwuaru - przewód pokarmowy, drogi moczowe - zostaje na jakimś etapie zablokowany. To może być przeszkoda w miejscu wydzielenia enzymu, defekt komórki wydzielającej, na konkretnych przykładach będziemy to omawiać. Wtedy w przewodzie wyprowadzającym rośnie ciśnienie, wydzielina, w której jest enzym, robi w tył zwrot, wnika do komórki, która wydzielała, uszkadza tą komórkę i przenika do krwioobiegu. Taka jest sekwencja zdarzeń. Podkreślam: uszkadza tą komórkę, która ją wydzieliła. Bo komórki, jak znacie Państwo z kursu histologii, przynajmniej w większości, są biegunowe, to znaczy wszystko odbywa się w określonym kierunku. Jak na drodze jednokierunkowej. Jak ktoś wjeżdża pod prąd, to może spowodować wypadek.

Jak dzielimy enzymy ekskrecyjne? Dzielimy wg wydzieliny, w której się znajdują. Najczęściej oznaczane enzymy ekskrecyjne znajdują się w żółci. I nazywamy je enzymami ekskrecyjnymi żółci. Do tej kategorii należą 3 enzymy, które w małym palcu trzeba mieć, bo będą przewijały się przez cały kurs biochemii. Do nich należy fosfataza alkaliczna, mam na myśli ten enzym wątrobowo-żółciowy. Drugim enzymem jest GGTP, czyli γ-glutamylotranspeptydaza, i trzecim enzymem jest LAP - leucyloaminopeptydaza. Kiedy aktywność tych enzymów rośnie? Ano w przypadku kamicy dróg żółciowych, proszę nie mówić kamicy pęcherzyka żółciowego, bo to dowodzi braku znajomości anatomii, jak kamień w pęcherzyku żółciowym, czyli złóg, mógłby zaburzać odpływ żółci. Następnie może być jakiś guz w obrębie brodawki Vatera, może być guz głowy trzustki uciskający na przewody wyprowadzające. Wtedy, jaka by przyczyna nie była, następuje wzrost ciśnienia żółci, żółć robi w tył zwrot, płynie do komórki miąższowej wątroby, przy dłużej trwającym zastoju wątroby czyli cholestazie, uszkadza tą komórkę miąższową wątroby, może prowadzić do marskości wątroby i tak przenika do krwioobiegu.

Druga kategoria enzymów, enzymy soku trzustkowego. I tu praktycznie zastosowanie diagnostyczne znalazł jeden, mianowicie α-amylaza, o którym już wcześniej powiedziałem. Ale do tej kategorii należy również lipaza, należy trypsyna, chymotrypsyna. Ich w celach diagnostycznych nie oznaczamy.

Kolejną wydzieliną jest ślina. Tutaj znajdujemy α-amylazę, ale w celach diagnostycznych nikt tego nie robi, bo jak ktoś ma zapalenie ślinianek, czy ma guza ślinianki, czy ma złogi w przewodach wyprowadzających, to technikami nie biochemicznymi się je wykrywa.

Enzymy soku sterczowego. Tu numerem jeden jest fosfataza kwaśna, izoenzym sterczowy.

Enzymy gruczołów wydzielniczych żołądka, no mamy pepsynę, ale też jej nikt nie oznacza. Po prostu jest. Wystarczy być.

No. Natomiast spośród tych enzymów, które weszły do arsenału badań laboratoryjnych w ostatnich latach, i które zdecydowanie wyparły fosfatazę kwaśną pochodzenia sterczowego jest PSA. Sobie starsi faceci mówią „robiłeś już sobie psa w tym roku?”. To jest właśnie PSA.

PSA

Charakterystyka

• monomeryczna glikoproteina

• rodzina proteaz kalikreinowych

• wydzielana przez prostatę do światła przewodów

• frakcje:

• niewykrywalna (z A2M)

• wykrywalna (z ACT, wolna)

• tkanka raka prostaty produkuje 10 x więcej PSA

• okres półtrwania 2-3 dni

PSA to jest do Prostatic Specific Antigen, czyli specyficzny antygen prostaty. Skąd taka kariera tego PSA? Mianowicie można śmiało powiedzieć, że jest to jedyny w biochemii klinicznej człowieka marker pozwalający wykryć wczesny nowotwór, w tym przypadku nowotwór prostaty. Także wszystkie te Fishmany, i badania dotyczące fosfatazy alkalicznej, to jest historia medycyny. Dziś nie ma to żadnej przydatności diagnostycznej, jedynie marker PSA, służący do wykrycia nowotworu, bo istnieje cała plejada markerów służąca do monitorowania nowotworu. To znaczy, że jeśli pojawiają się one po usunięciu nowotworu, to znaczy, że następuje wznowa, przerzuty, etc., a to pozwala u osoby zdrowej wykryć nowotwór. Znaczy u mężczyzn się to oznacza konkretnie. (śmiech)

Pod względem budowy chemicznej jest to glikoproteina. Należy do kalikrein, wydzielana przez prostatę, są 2 frakcje w surowicy krwi: frakcja wolna, frakcja związana, można oznaczać całkowitą, wolną formę. To, że PSA pojawia się w surowicy krwi, to nie tylko fakt, że nie może być odprowadzona do dróg moczowych przez fakt, że guz prostaty uciska na przewody wyprowadzające stercza, bo gdyby tak było, to nie byłoby wykrywanie wczesnego nowotworu, to polega na tym, że tkanka raka prostaty produkuje dziesięć razy więcej PSA niż tkanka prawidłowa. Czyli to przede wszystkim decyduje o pojawieniu się tej substancji wcześnie w surowicy krwi.

Również jeśli z tego się weźmie to pod uwagę ten ostatni fakt, to również się wie, że jeśli norma jest, załóżmy, hipotetyczna, bo nie wiem, jaka jest norma dla konkretnego laboratorium, powiedzmy, 5, to nie jest tak, że w jednym roku ktoś miał 3, a w następnym ma 20. Często to, co nakazuje z dużą uwagą patrzeć na wynik, że przez kilka lat z rzędu wynik był np. 1, 1.2, nagle się robi 2, 2.5, 3, 3.5 i dalej się mieści w normie, ale coś to zwiększone stężenie PSA pojawia się, więc nakazuje to rozszerzenie diagnostyki.

Okres półtrwania jest krótki, to oznacza, że jeśli skutecznie usunie się nowotwór prostaty, to po kilku dniach stężenie PSA powinno wrócić do normy. Jeśli co jakiś czas po takim zabiegu pacjenta się monitoruje wykonuje mu się PSA, cały czas było w normie i nagle pojawia się wzrost, no to łatwo zgadnąć, skąd ten wzrost może pochodzić.

PSA

Zestawienie

granding CA prostate	PAP	PSA
A	11%	67%
B	22%	73%
C	39%	80%
D	58%	88%

Jeśli porównać fosfatazę kwaśną pochodzenia sterczowego, w skrócie tak jak Polska Agencja Prasowa, to znaczy Prostatic Acid Phosphatise, czyli fosfataza kwaśna pochodzenia sterczowego, a tu PSA, w tym najwcześniejszym stopniu zaawansowania, czyli w stopniu A, który lepiej rokuje, zaledwie u 11% pacjentów jest podwyższona fosfataza kwaśna pochodzenia sterczowego, natomiast 2/3 pacjentów ma podwyższone PSA.

I to takiej ogólnej wizji enzymów powinno Państwu pozostać w głowie, natomiast szczegóły będziemy rozwijać podczas zajęć ćwiczeniowych, zajęć seminaryjnych. No enzymy są jednym z ważniejszych tematów w tym sezonie.

(część II wykładu - białka)

24

---