PROCESY MEMBRANOWE

W PRZEMYŚLE SPOŻYWCZYM

Współczesna technologia zna wiele metod oczyszczania produktów, jak np. chromatografię wielkoskładnikową, wytrącanie, krystalizację, wirowanie, destylację, sedymentację i inne. Membranowe techniki rozdzielania mieszanin przez długi okres czasu traktowane były jako pomocnicze metody separacyjne w skali laboratoryjnej. Ostatnie lata sprawiły, że możliwym stało się stosowanie technik membranowych na dużą skalę. Związane to jest z rozwojem chemii tworzyw sztucznych, szczególnie polimerów syntetycznych, z których zbudowana jest większość wysoce przepuszczalnych i selektywnych membran.

W technologii żywności stosuje się z powodzeniem takie odmiany technik membranowych, jak: mikrofiltracja, ultrafiltracja, odwrócona osmoza, elektrodializa, nanofiltracja. Korzyści wynikające ze stosowania wyżej wymienionych metod to przede wszystkim:

- możliwość jednoczesnego zagęszczania, frakcjonowania i oczyszczania roztworów

- redukcja do minimum termicznej degradacji składników żywności i mikroorganizmów

- niskie zużycie energii

- eliminacja przemian fazowych rozdzielanych składników (jak np. przy destylacji)

- prosta, modułowa budowa urządzeń.

PODSTAWOWE POJĘCIA I PARAMETRY OPISUJĄCE TECHNIKI MEMBRANOWE

Permeat – filtrat; roztwór przenikający przez membranę filtracyjną, zawierający rozpuszczalnik wraz z cząstkami, które nie zostały zatrzymane na filtrze.

Retentat – roztwór zawierający zatrzymane na filtrze cząstki.

Polaryzacja stężeniowa membrany – zjawisko adsorpcji drobin na powierzchni membrany, powodujące zalepianie się por. pod wpływem adsorpcji na powierzchni membrany, powodujące zlepianie się por. pod wpływem działającego na membranę ciśnienia, zatrzymane na niej cząstki akumulują się tworząc warstwę żelową lub tzw. Wtórną membranę. Powoduje to spadek szybkości filtrowania.

Strumień objętości (flux rate)

Wyraża objętość otrzymanego permeatu na jednostkę powierzchni filtra. W początkowym etapie filtracji, gdy filtr nie jest jeszcze zapchany, przyjmuje wartość:

gdzie:

DP – transmembranowa różnica ciśnień

DP - różnica ciśnień osmotycznych filtrowanego roztworu i permeatu

Rg – opór hydraulityczny warstwy żelu

Rm – opór hydraulityczny membrany.

Ponieważ ciśnienie osmotyczne dla makromolekuł w roztworze jest bardzo niskie i rośnie dopiero w przypadku wysokiej koncentracji warstwy żelowej na membranie, to wzór ma postać:

Gdy membrana ulega polaryzacji, tworzy się na niej warstwa żelu, wówczas strumień objętości wyrażamy jako:

gdzie:

K – współczynnik przenikania masy

Cg – koncentracja warstwy żelu

Cs – koncentracja filtrowanego roztworu.

Współczynnik odrzucenia R – wyraża ilość materiału, który przechodzi przez membranę lub jest przez nią odrzucany. Gdy R ma wartość równą 1, to 100 % materiału jest odrzucane, gdy wartość ta wynosi 0, to membrana jest całkowicie przepuszczalna. Wyraża to wzór:

gdzie:

Cf – końcowa koncentracja roztworu w retentacie

C0 – początkowa koncentracja roztworu

V0 – początkowa objętość roztworu

Vf – końcowa objętość retentatu.

Równanie to jest prawidłowe przy założeniu, że retentat jest całkowicie homogenny, co jest jednak warunkiem do osiągnięcia z powodu tworzącej się na membranie warstwy żelowej. Wartość współczynnika R jest funkcją molekularnej wielkości i kształtu rozdzielonych cząstek.

Punkt odcięcia (cut-off) – masa molekularna, przy której co najmniej 90 % cząstek globularnych o tej właśnie masie jest na danym filtrze zatrzymywane. W wielu przypadkach punkt odcięcia jest właśnie tą wielkością, którą producent podaje na opakowaniu, jako różnicującą poszczególne filtry.

MODYFIKACJE PROCESÓW MEMBRANOWYCH

Przeciwdziałanie zjawiskom powodującym zanieczyszczenia membran spowodowało duży postęp w dziedzinie konfiguracji modułów membranowych, materiałów membran i optymalizacji dynamiki cieczy w sąsiedztwie membrany. Wydajność procesów membranowych znacznie się zwiększyła po opracowaniu systemu wykorzystującego przegrody (cross-flow).

Jednym z parametrów charakterystycznych dla filtracji stycznej jest ciśnienie transmembranowe, które przyjmuje tu wartość:

gdzie:

Pi – ciśnienie na wejściu

P0 – ciśnienie na wyjściu

Pf – ciśnienie filtratu

Zaletą tego układu jest stosunkowo wolniejsze niż w typowej filtracji zapychanie się membrany, a to dzięki temu, iż styczny ruch cieczy nieustannie zmywa tworzącą się na powierzchni filtra warstwę zanieczyszczeń. Wydajność i efektywność procesów membranowych jest dodatkowo polepszana poprzez niewielkie wymiary przekrojów przepływu zawiesin i roztworów. Zapewnia to burzliwy ruch cieczy i duże siły ścinające na powierzchni membrany. Znane są też rozwiązania konstrukcyjne mikrofiltrów z wirującymi

powierzchniami filtrującymi, a także układy, w których zachodzi przepływ pulsacyjny lub też kierunek przepływu zawiesiny jest co pewien czas odwracalny tak, aby zakłócić ustalony profil polaryzacji stężeniowej i usunąć cząstki z powierzchni membrany.

RODZAJE FILTRÓW STOSOWANYCH W PROCESACH MEMBRANOWYCH

Filtry stosowane w procesach membranowych są zwykle wykonane z materiałów ceramicznych lub syntetycznych polimerów, takich jak polisulfon, teflon czy octan celulozy. Materiały te nie są cytotoksyczne, ani też w żaden inny sposób nie wpływają na filtrowany roztwór.

Ściany membran filtrów charakteryzują się anizotropową strukturą, tzn. kanały por rozszerzają się od powierzchni membrany w głąb jej struktury. Dzięki temu cząsteczki, które są zatrzymywane przez daną membranę, zatrzymują się na jej powierzchni i nie zapychają światła kapilar w jej wnętrzu.

Stosowane są 3 podstawowe typy filtrów:

- płaskie

- spiralne

- kapilarne.

Filtry płaskie (flat disc) stosuje się często w konfiguracji z innymi rodzajami separatorów, np. wirowaniem

komórek.

Filtry kapilarne zbudowane są z wiązki cienkich rurek umieszczonych w cylindrycznym pojemniku. Ciecz zawierająca oddzielane cząstki przepływa przez kapilary, gdzie ulega rozdzieleniu: cząsteczki małe przenikają przez ściany membrany na zewnątrz do przestrzeni między-kapilarnej, zaś cząsteczki duże opuszczają kapilary.

Filtry spiralne zbudowane są z membran nawiniętych spiralnie na cylindryczny przewód odbierający filtrat.

Wybór stosowanej membrany zależy od wielu czynników, np. strumienia objętości przepływu, masy molekularnej odcinanych cząstek, lepkości roztworu, stopnia adsorpcji białek, itp.

PODZIAŁ I CHARAKTERYSTYKA PROCESÓW MEMBRANOWYCH

Podział procesów membranowych przedstawiony poniżej opiera się na wielkości rozdzielanych w danej metodzie cząstek za pomocą tradycyjnych metod separacji można rozdzielić cząstki o wielkości nie mniejszej niż 2 mm. Wszystkie mniejsze cząstki mogą być wydzielane z roztworów za pomocą technik membranowych. Wielkość rozdzielanych cząstek jest podstawą przedstawionego poniżej podziału.

Mikrofiltracja (MF)

W mikrofiltracji używa się membran o porach rzędu 0,1-5 mm. Za pomocą mikrofiltracji usuwa się z roztworu drobne zawiesiny, komórki bakteryjne, niektóre wirusy, drobiny surowców roślinnych, cząstki tłuszczu w emulsjach (np. mleka). Wizualnym efektem tego procesu może być zmiana barwy filtratu, obniżenie się mętności, spadek intensywności rozpraszania światła. Głównym zastosowaniem mikrofiltracji jest więc klasyfikacja roztworów, wydzielanie biomas komórkowych, a także sterylizacja pożywek (tzw. Sterylizacja „na zimno”).

Siła napędową procesu mikrofiltracji jest różnica ciśnień hydrostatycznych po obu stronach przegrody, rzędu 0,05-0,5 MPa. Mikrofiltrację prowadzi się często w układzie stycznym (filtracja styczna, ang. „crossflow”, „tangential flow”, co w większej mierze zapobiega odkładaniu się osadu na powierzchni membrany.

Ultrafiltracja (UF)

Membrany stosowane w ultrafiltracji mają pory rzędu 0,005-0,1 mm (5-100 nm), a różnica ciśnień na membranie w tym procesie wynosi 0,2-1,0 MPa.

Proces UF umożliwia jednoczesne frakcjonowanie i zagęszczanie wybranych składników cieczy. Permeat po UF nie zawiera już białek, polisacharydów, wirusów, niektórych barwników, enzymów i witamin, natomiast pozostają w nim proste cukry, kwasy organiczne, zdysocjowane jony nieorganiczne i większość produktów degradacji cieplnej. Mętność ultrafiltratu całkowicie zanika i nie obserwuje się już zjawiska rozpraszania światła.

Nanofiltracja (NF)

Nanofiltracja to proces, który obejmuje zakres separacji o wymiarach w granicach 0,001-0,005 mm (1-5 nm). Zatrzymywane są tu aminokwasy, proste cukry, enzymy i niektóre jony. Frakcja ta zawiera więc większość substancji pochłaniających promieniowanie ultrafioletowe (cukry i produkty ich rozpadu), substancje odpowiedzialne za smak i zapach, substancje zabarwiające. Permeat jest jasno zabarwiony, klarowny, zawiera tylko niektóre sole i cząstki o małej masie cząsteczkowej (np. alkohole).

Sposób separacji składników w procesie NF jest połączeniem przepływu kapilarnego, typowego dla MF i UF, z mechanizmem rozpuszczająco-dyfuzyjnym, charakterystycznym dla odwróconej osmozy (RO). Membrany nanofiltracyjne posiadają różne zakresy selektywności, począwszy od przegród o wysokiej nieprzepuszczalności dla NaCl, poprzez membrany wybiórczo zatrzymujące niektóre jony, do takich, które zatrzymują cząsteczki kwasów.

Odwrócona osmoza (RO)

Proces ten przebiega na membranach o średnicy por 0,0001-0,001 mm (0,1-1,0 nm). Przez taką przegródkę przenika wyłącznie rozpuszczalnik, tak więc RO może być uważana bardziej za proces zagęszczania niż separacji. Przepływ rozpuszczalnika następuje przeciwnie do ciśnienia osmotycznego, toteż, aby proces RO mógł zajść musi być wytworzona duża różnica ciśnień po obu stronach membrany, rzędu 1-10 MPa. Mechanizm selektywnego działania membran RO tłumaczy się modelem rozpuszczająco-dyfuzyjnym, gdzie znaczenie ma powinowactwo membrany i składników roztworu oraz szybkość ich transportu w membranie. Składniki o większym powinowactwie do materiału membrany, rozpuszczają się w niej łatwiej od innych składników, a membrana spełnia funkcję fazy ekstrakcyjnej. W dalszym etapie procesu zachodzi transport składników w membranie na zasadzie dyfuzji molekularnej, zaś różnice w dyfuzyjności danego składnika decydują o przepuszczalności membrany. Selektywność membran RO jest więc połączonym efektem rozpuszczalności

i dyfuzyjności składników zagęszczonego roztworu.

Membrany stosowane w RO mają strukturę niesymetryczną, z warstewką selektywną o submikronowej grubości, wykonaną najczęściej z octanu i innych estrów celulozy oraz z poliamidów, naniesioną na 2-gą, grubszą warstwę podporową o większej porowatości.

Proces RO stosuje się od wielu lat na dużą skalę do otrzymywania wody pitnej z wód morskich i wód zasolonych oraz do uzdatniania wody w przemyśle farmaceutycznym i elektronicznym.

Perwaporacja (PV)

Perwaporacja pozwala na rozdzielenie ciekłej mieszaniny z częściowym jej odparowaniem – permeat występuje w postaci pary.

Membrany stosowane w PV mają porowatość podobną jak w RO, a transport masy zachodzi na zasadzie mechanizmu sorpcyjno-dyfuzyjnego. Tak więc, po 1 stronie membrany następuje adsorpcja i rozpuszczanie się składników danego roztworu; następnie rozpuszczone cząsteczki dyfundują w membranie i z jej strony ulegają desorpcji („odparowaniu”).

Efekt rozdzielania składników roztworu wynika, podobnie jak w RO, z różnic sorpcji i rozpuszczalności w membranie. Różnice te są natomiast efektem specyficzności oddziaływań układu membrana-ciecz lub też wynikiem uprzywilejowanej sorpcji cząstek o mniejszym rozmiarze.

Praktyczne zastosowanie procesu perwaporacji zmierza do zastąpienia tym procesem konwencjonalnej destylacji.

Elektrodializa (ED)

Elektrodializa to proces membranowego rozdzielania roztworów ciekłych, których składniki jonowe (sole, kwasy, zasady) przenikają przez membrany pod wpływem różnicy potencjałów zewnętrznego pola elektrycznego. W procesie tym membrany są jonowymienne, mają albo ładunek dodatni (przepuszczalne dla anionów – anionity), albo ładunek ujemny (przepuszczalne dla kationów - kationity). Kationity wytwarzane są poprzez fizyczne lub chemiczne unieruchomienie w cienkich foliach wykonanych z polimerów, grup sulfonowych o właściwościach silnie kwaśnych lub grup karboksylowych o właściwościach słabo kwaśnych. Anionity natomiast mają unieruchomione grupy amoniowe, silnie zasadowe lub słabo zasadowe grupy aminowe czy też fenolowe. W ostatnich opracowano już membranę dwupolarną, umożliwiającą elektrodializę w pojedynczej membranie.

Proces ED ma zastosowanie do odsalania morskiej oraz uzdatniania wody technologicznej, a także do innych procesów demineralizacji.

Omówione wyżej procesy membranowe przedstawiono na schemacie, uwzględniając wymiarowe spektrum różnych substancji występujących w ciekłych artykułach żywnościowych.

ZASTOSOWANIE PROCESÓW SEPARACJI MEMBRANOWEJ W PRZEMYŚLE SPOŻYWCZYM

Procesy membranowe są w technologii żywności atrakcyjną alternatywą do tradycyjnie stosowanych metod separacyjnych, a to ze względu na niedestrukcyjne oddziaływanie na produkt i niskie zużycie energii.

Przemysł mleczarski

Pierwsze zastosowania procesów ultrafiltracji w mleczarstwie dotyczyły utylizacji serwatki. Serwatkę najpierw poddawano procesowi UF, w którym oddzielano frakcję białkową, a następnie RO, otrzymując zagęszczony roztwór laktozy oraz permeat o niskim BZT. Korzyści wynikające zatem ze stosowania procesów membranowych, w tym przypadku polegają na możliwości otrzymywania 30-80 % koncentratów białkowych pozbawionych laktozy, zagęszczonego do ok. 25 % roztworu laktozy, a przy tym powstający ściek ma niskie BZT.

Stosując dalej odpowiednio dobrane membrany, białka można jeszcze rozdzielić na a-laktoalbuminę i b-laktoglobulinę, laktoferynę, laktoperoksydazę i glikomakropeptyd.

W serowarstwie powszechną praktyką jest wstępne zagęszczanie mleka przy użyciu UF, poprzedzające koagulację. Poprzez to wartość odżywcza sera jest wyższa dzięki wzbogaceniu go w białka, witaminy i niektóre substancje mineralne, tracone w serwatce w tradycyjnym procesie.

Ważną zaletą technik membranowych jest możliwość „zimnej” sterylizacji. Mleko poddawane procesowi MF jest nikrobiologicznie czyste i nie jest wówczas wymagana typowa pasteryzacja. Pojawiają się jednak doniesienia mówiące o tym, że przy stosowaniu membran, które pozwalają na zachowanie przez mleko wszystkich jego białkowych składników, w permeacie zostaje część drobnoustrojów.

Przemysł owocowo-warzywny

W przemyśle tym procesy membranowe stosuje się do klarowania i zagęszczania soków, moszczów oraz wina, do wydzielania substancji aromatycznych z ekstraktów owocowych, do zagęszczania barwników roślinnych oraz do usuwania alkoholu z wina.

Dzięki technologiom membranowym można wyeliminować tak uciążliwe procesy jak filtracja przy użyciu ziemi okrzemkowej, bentonitu, zolu krzemionkowego i żelatyny. Jednocześnie, stosując instalacje membranowe, mniejsza jest powierzchnia produkcyjna, mniejsze jest zużycie energii czy też preparatów enzymatycznych.

Połączone systemy UF i RO stosowane do odzyskiwania substancji aromatycznych zawartych w skórkach owoców cytrusowych, w dużej mierze wpływają na lepszą jakość produktu i wydajność procesu. Ultrafiltrację stosuje się też do pozyskiwania i zagęszczania naturalnych barwników tj. antocyjany i betanina. Zawartość tych składników w roztworach wodnych jest bardzo niska (ok. 0,1 %), a w przewadze występują pektyny, białka i cukry. W tradycyjnym procesie sok lub ekstrakt jest filtrowany, zagęszczany na wyparkach i suszony rozpyłowo. Natomiast już jednokrotna UF pozwala 2-krotnie zwiększyć zawartość barwników a suchej masie.

W produkcji winiarskiej zastosowanie MF i UF moszczów lub gotowego wina zapewnia z jednej strony usunięcie niepożądanej mikroflory, zaś z 2 pozbawienie wina związków powodujących jego mętność. W ten sposób eliminuje się z procesu produkcyjnego uciążliwe etapy filtracji z użyciem środków klarujących oraz siarkowanie, jako czynnik niszczący mikroflorę. Z kolei użycie membran RO umożliwia częściowe lub całkowite usunięcie alkoholu z wina lub też jego zagęszczenie. Otrzymuje się produkt o bardziej intensywnej barwie i zwiększonej zawartości alkoholu.

Biotechnologia

Biotechnologia, jako szeroka dziedzina, stwarza też bardzo szerokie możliwości stosowania technik membranowych. Począwszy od „zimnej” sterylizacji pożywek przy użyciu MF, moduły membranowe są zastosowane w reaktorach z recyrkulacją komórek i ciągłym odbieraniem produktów oraz do separacji i zagęszczania produktów fermentacji.

Fermentor z recyrkulacją komórek.

Taki układ umożliwia ciągłość pracy fermentatora, gdyż produkty procesu są w kontrolowany sposób odprowadzane i ich wzrastająca koncentracja nie inhibuje przebiegu prowadzonej reakcji. Dodatkowo też następuje ciągłe zawracanie komórek do reaktora, co zwiększa ich stężenie i powoduje tym samym wzrost wydajności procesu. Według podanego obok schematu przeprowadza się produkcję etanolu z surowców skrobiowych i serwatki, a także kwasu mlekowego, octowego i propionowego. Selektywne przegrody o różnych konfiguracjach, Z unieruchomionymi komórkami lub enzymami, służą do budowy fermentorów nazywanych reaktorami membranowymi. Reaktory takie mogą być stosowane do prowadzenia fermentacji alkoholowej, mlekowej, octowej oraz do enzymatycznej hydrolizy sacharozy. W fermentacji alkoholowej aplikacją zyskuje proces perwaporacji. Etanol odprowadzany w ten sposób z cieczy fermentacyjnej ma stężenie ok. 40 %, a koszt

produkcji jest o 29 % niższy od produkowanego tradycyjnie.

Fermentacja alkoholowa z ciągłym usuwaniem etanolu za pomocą perwaporacji i recyrkulacją komórek.

Przy użyciu PV można też odprowadzać z cieczy fermentacyjnej substancje zapachowe. Opracowana w ostatnich latach membrana 2-polarna, stosowana w elektrodializie, pozwala na otrzymywanie kwasu mlekowego bez konieczności jego oczyszczania, co jest wymagane w tradycyjnych metodach.

Inne zastosowania procesów membranowych.

Techniki membranowe, przede wszystkim UF, stosuje się do zagęszczania białka jaja kurzego. Proces ten stosuje się też do odsalania białka jaja. Pozyskane w ten sposób czyste białko nie różni się wskaźnikami jakościowymi od białka negatywnego.

UF stosuje się też w produkcji koncentratów białkowych z roślin oleistych. Dzięki technice membranowej, można usunąć z ekstraktu białkowego niepożądane niskocząsteczkowe składniki (przede wszystkim fenole), odpowiedzialne za nieprzyjemny zapach.

Przemysł spożywczy stosuje też w niektórych przypadkach techniki membranowe na rzecz OŚ. Znane są przykłady poddawania procesowi MF solanek peklujących, w celu ich wielokrotnego użycia, a także przykłady membranowego oczyszczania wód odpadowych.

WARUNKI HODOWLI DROŻDŻY

Do osiągnięcia właściwego przyrostu biomasy w odpowiednim czasie konieczna jest obecność podstawowych składników pożywki we właściwych proporcjach. Niezbędne są: woda, źródła węgla i azotu, magnezu, mikroelementów, witamin i innych substancji wzrostowych. Drożdże najlepiej rozwijają się na pożywkach zawierających cukry proste. Podstawowymi monosacharydami wykorzystywanymi przez drożdże są D-glukoza, D-fruktoza, D-mannoza. Disacharydem powszechnie metabolizowanym w warunkach tlenowych i beztlenowych jest sacharoza. Niektóre gatunki drożdży mają zdolność wykorzystywania laktozy, rafinozy, L-sorbozy, D-ksylozy, L-arabinozy czy celobiozy. Źródłem węgla mogą być także: skrobia rozpuszczalna, pektyna, etanol, metanol, etanodiol, glicerol, niektóre kwasy organiczne i in. Do prawidłowego wzrostu wymagają obecności substancji stymulujących m.in.: biotyny, kwasu pantenowego, mezoinozytu. Bazę podłoża

do hodowli drożdży stanowi melasa buraczana lub trzcinowa oraz brzeczka słodowa. Optymalne pH pożywki wynosi 4-5, zawartość wody 30 % min.

Większość gatunków drożdży najszybciej rozmnaża się w temperaturach 25-32 °C, chociaż występują gatunki, dla których optymalna temperatura wzrostu wynosi 37 (gat. termofilne) lub 20 °C (gat. psychrofilne). Najniższa temperatura, w której zaobserwowano rozmnażanie się drożdży wynosi 2 °C a najniższa 46 °C i wartości te przyjmuje się, jako punkty krytyczne.

Charakterystyka wzrostu mikroorganizmów

Wzrost mikroorganizmów można przedstawić na wykresie zależności logarytmu liczby komórek do czasu hodowli. Powstanie krzywa wzrostu, na której można wyróżnić 6 podstawowych faz wzrostu: faza wzrostu utajonego, faza początku rozmnażania, faza logarytmiczna (wykładnicza), faza wzrostu zwolnionego, faza stacjonarna i faza zamierania.

Faza wzrostu utajonego – okres adaptacji komórek do nowego środowiska. Następuje w niej energetyczna adaptacja do środowiska i uruchomienie mechanizmów umożliwiających transportowanie składników pożywki do wnętrza komórek. Następują syntezy enzymów, białek budujących odpowiednie kanały transportowe itp. Istnieje zasada oszczędności energetycznej, tzn., że komórka adaptuje swój metabolizm do asymilacji najłatwiej dostępnego źródła węgla. Ilość komórek nie zmienia się tzn. x = x0 = const.

Efektywność procesów tlenowych zależy od:

- szybkości mieszanie pożywki

- ilość doprowadzenia gazu

- temperatura hodowli

- stężenie substancji rozpuszczalnych

- obecność substancji zmniejsza lub zwiększa napięcie powierzchniowe.

Faza początku rozmnażania się komórek (x > x0) – opanowanie środowiska jest tym szybsze im większe było inokulum komórkowe. Ilość i szybkość podziałów zależy od warunków hodowli (pH, temperatury, potencjału red-ox, siły jonowej i koncentracji O2). W sprzyjających warunkach hodowla przechodzi do fazy 3 faza wzrostu utajonego i faza początku rozmnażania są czasami ujmowane w 1 fazę, tzw. lagfazę.

Faza logarytmiczna (wykładnicza) – charakteryzuje się stałym minimalnym czasem generacji a tym samym maksymalną szybkością wzrostu mikroorganicznego. Często wielkość komórek i zawartość w nich białek w tej fazie jest stała, co umożliwia stosowanie pośrednich metod pomiaru biomasy. O takiej hodowli mówi się, że zawiera ona „komórki standardowe”.

gdzie:

xk – końcowa masa komórek

n – ilość podziałów

W tej fazie szybkość wzrostu populacji (m) jest stała i jest funkcją logarytmiczną:

t - czas

Faza logarytmiczna trwa tak długo, dopóki nie nastąpi wyczerpanie jakiegoś składnika pożywki lub dopóki nie wzrośnie stężenie toksycznych metabolitów do wartości krytycznej (do pojawienia się czynnika limitującego wzrost). Określa to zależność Monoda:

gdzie:

μmax – maksymalna właściwa szybkość wzrostu

Ks – stała półnasycenia (stała hamowania),

S – stężenie substratu ograniczającego:

gdzie:

μmax – maksymalna właściwa szybkość wzrostu

Kp – stężenie produktu toksycznego, przy którym m = 0,5 × mmax

P - stężenie produktu toksycznego.

W momencie pojawienia się czynnika ograniczającego następuje zmniejszenie m i przejście do fazy wzrostu zwolnionego.

Faza wzrostu zwolnionego (właściwa szybkość wzrostu maleje aż do momentu, kiedy ilość komórek jest stała) i faza stacjonarna – rozpoczyna się w momencie, gdy komórki nie mogą się już rozmnażać. Ponieważ szybkość wzrostu zależy m.in. od stężenia substratów, (które maleje podczas hodowli), szybkość wzrostu hodowli zaczyna się zmniejszać jeszcze przed całkowitym wyczerpaniem substratu. Dlatego przejście od fazy logarytmicznej do stacjonarnej jest zazwyczaj stopniowe. Poza ograniczeniem ilości substratu. Także inne czynniki, tj. duża gęstość populacji, niskie ciśnienie parcjalne tlenu czy nagromadzenie toksycznych produktów metabolizmu (np. etanol dla drożdży), mogą prowadzić do spowolnienia szybkości wzrostu i zainicjowania fazy stacjonarnej.

W wielu produkcyjnych procesach biotechnologicznych nastawionych na wytwarzanie wtórnych metabolitów (np. produkcja penicyliny) faza stacjonarna jest główną fazą produkcyjną. Dlatego w biotechnologii rozróżnia się trofofazę, czyli fazę wzrostu i idiofazę – fazę produkcji. Mimo, że w idiofazie komórki już nie rosną, potrafią one wykorzystywać podawany substrat oraz włączać związki prekursorowe do produktu końcowego.

Faza zamierania – po pewnym czasie hodowli komórki zaczynają zamierać. Często przyczyną jest nagromadzenie w pożywce hodowlanej toksycznych metabolitów. W niektórych wypadkach następuje liza (autoliza) komórek wskutek działania wydzielanych przez mikroorganizmy do podłoża enzymów.

TLENOWA HODOWLA DROŻDŻY

Bardzo ważny jest odpowiedni poziom natleniania i stężenia cukru w pożywce. Ludwik Pasteur wykazał, że w obecności tlenu wydajność biomasy ze zużytej glukozy jest znacznie wyższa oraz, że tlen silnie hamuje fermentację alkoholową. Dotyczy to mikroorganizmów, które mogą rozwijać się zarówno w warunkach tlenowych jak i beztlenowych (np. E. coli, S. cerevisiae). Od nazwiska odkrywcy zjawisko to nosi nazwę efektu Pasteura. Jego mechanizm polega na represji i hamowaniu enzymów szlaku EMP (Embden-Meyrhofa-Parnasa) w obecności tlenu. W warunkach tlenowych następuje represja, a w warunkach beztlenowych indukcja, m.in. fosfofruktokinazy, aldolazy i kinazy pirogronianowej. Przy mniejszej podaży tlenu zachodzi fermentacja etanolowa.

W tlenowych hodowlach drobnoustrojów obserwuje się także częściowe hamowanie oddychania komórek w warunkach stężenia glukozy ponad 1-2 [g/dm3]. Jest to tzw. Efekt Crabtree. Wysokie stężenie glukozy wzmaga glikolizę, przy równoczesnym ograniczeniu szlaków metabolicznych związanych z oddychaniem tlenowym (np. cykl Krebsa czy cykl pentozofosforanowy – PP), zwłaszcza podczas hodowli drobnoustrojów w podłożu kompleksowym. Represji i hamowaniu mogą podlegać u różnych drobnoustrojów m.in. dehydrogenaza NADH i elementy pierwszej fosforylacji w łańcuchu oddechowym oraz dehydrogenazy funkcjonujące w cyklu Krebsa, np. izocytrynianowa, bursztynianowa i inne. Indukowana jest natomiast synteza enzymów szlaku EMP (fermentacja alkoholowa).

Wykazano, że nie tylko wysokie stężenie glukozy, ale duża szybkość wzrostu drożdży sprzyja procesowi fermentacji alkoholowej. Przykładowo – przy właściwej szybkości wzrostu m = 0,1 h-1 fermentacja tlenowa zachodzi powyżej 2 g glukozy w litrze, przy m = 0,2 h-1 ten sam efekt fizjologiczny uzyskuje się przy stężeniu glukozy 1g w litrze. Uważa się, że nie sama glukoza, jako związek chemiczny, lecz szybkość przemian katabolicznych decyduje o kierunku jej metabolizmu. Wynika z tego, że warunki natlenienia, stężenie glukozy i szybkość jej metabolizmu wpływają na wydajność masy komórkowej. Przy wysokim stężeniu glukozy i dużej szybkości wzrostu drożdży, wydajność biomasy w warunkach tlenowych ulega redukcji, gdyż przy dostatecznym poziomie ATP, zabezpieczającym potrzeby energetyczne komórki, nadmiar substratu oddechowego NADH powoduje hamowanie procesów związanych z pozyskiwaniem energii metabolicznej. Nadmiar NADH sprzyja też redukcji metabolitów powstających w procesie glikolizy. W wyniku takiej gospodarki równoważnikami redukującymi, w warunkach dobrego natlenienia i dużego stężenia glukozy,

powstają normalne produkty fermentacji, np. etanol, czy kwas mlekowy, analogicznie jak w procesie beztlenowym. Zjawisko to jest wykorzystywane w początkowych etapach propagacji drożdży. Produkcja niewielkich ilości etanolu daje dodatkowy efekt sterylizujący i zabezpiecza przed rozwojem niepożądanej mikroflory.

Natlenienie pożywek

Efektywność procesów tlenowych zależy w dużym stopniu od szybkości tranferu tlenu z fazy gazowej do ciekłej. Parametr ten jest determinowany przez następujące czynniki:

- stopień dyspersji pęcherzyków powietrza w fazie wodnej, co wpływa na powierzchnię wymiany międzyfazowej

- szybkość mieszania cieczy, co wpływa na rozdrobnienie pęcherzyków oraz czas ich przebywania w cieczy

- temperatura cieczy; zgodnie z prawem Henry’ego, rozpuszczalność gazów w cieczy maleje w miarę wzrostu temperatury; woda o temp. 25 °C może przyjąć max 20 mg tlenu na litr; pożywki mikrobiologiczne ciekłe są zdolne do rozpuszczenie ok. 5-7 mg tlenu na litr

- obecność w cieczy substancji rozpuszczonych (sole, cukry, białka); im większe ich stężenie tym niższa rozpuszczalność tlenu w cieczy

- obecność substancji obniżających napięcie powierzchniowe cieczy (niekorzystnie oddziałują na transfer tlenu do cieczy)

- stopień nasycenia tlenem danej cieczy; im większa jest różnica między stanem nasycenia tlenem a stanem faktycznym, tym szybszy jest transfer tlenu do cieczy.

Zwiększenie transferu tlenu do cieczy można technicznie osiągnąć przez:

- zwiększenie szybkości mieszania (zwiększenie powierzchni kontaktu gaz-ciecz)

- zwiększenie napowietrzania (tzn. dostarczenie większej ilości tlenu)

METODY HODOWLI MIKROORGANIZMÓW

Hodowle okresowe (batch culture) – są najczęściej stosowaną metodą hodowli mikroorganizmów. Metoda okresowa ma wady, z których najważniejszymi są: zmienność środowiska w czasie hodowli wynikająca ze zmiany stężenia składników pokarmowych i nagromadzenia toksycznych metabolitów oraz stosunkowo niską gęstość kultury komórkowej i tym samym niewielka produktywność objętościowa bioreaktora. W procesach okresowych nie wykorzystuje się w pełni potencjału metabolicznego komórek, gdyż optymalne warunki dla ich rozwoju utrzymywane są tylko przez krótki czas hodowli. Jednym ze sposobów redukcji tego problemu jest zastosowanie okresowo-dolewowej, półciągłej lub ciągłej metody hodowli.

Hodowle ciągłe – polegają na stałym zasilaniu kultury świeżą pożywką z jednoczesnym usuwaniem zużytego medium wraz z komórkami lub bez komórek. Metoda ta jest dostosowana głównie do produkcji biomasy komórkowej lub jej pierwszorzędowych metabolitów. Wzrost komórek odbywa się cały czas w logarytmicznej fazie wzrostu, przy całkowitym braku ograniczających ich rozwój. Najprostszą technologią procesów ciągłych jest zastosowanie reaktora przepływowego ze stałym dostarczaniem świeżej pożywki i odbieraniem zużytej wraz z komórkami przy zachowaniu stałej objętości roboczej bioreaktora. Warunkiem utrzymania hodowli ciągłej jest zachowanie równowagi pomiędzy ilością komórek wymywanych i ponownie namnożonych w wyniku podziałów komórkowych. Szybkość pożywki powinna być tak dobrana, by zapewnić stałą, wysoką koncentrację komórek w bioreaktorze i utrzymanie hodowli w stanie chemostatu. W tym przypadku gęstość komórek i stężenie substratu mają wartości stałe, a więc miernikiem właściwej szybkości wzrostu komórek jest szybkość rozcieńczania pożywki.

Hodowle okresowo-dolewowe (fed-batch culture) polega na wprowadzeniu do hodowli pod koniec fazy logarytmicznego wzrostu świeżej pożywki lub mieszaniny najważniejszych jej składników. W tym przypadku początkowe wypełnienie bioreaktora wynosi 30-50 % a kolejne porcje pożywki są dostarczane ze stałą lub zmienną szybkością. W metodzie FBC występują tylko 2 fazy cyklu komórkowego: fazy logarytmiczne oddzielone krótkotrwałymi fazami adaptacyjnymi, zapoczątkowanymi przez wprowadzenie świeżej pożywki. Dlatego, hodowle okresowo-dolewowe, w porównaniu z hodowlami okresowymi, pozwalają na uzyskanie kilkukrotnie większych gęstości komórek i produktywności bioreaktora. Innym sposobem prowadzenia hodowli okresowo-dolewowej jest metoda półciągła, która realizowana jest przez okresowe odbieranie części hodowli i zastępowanie jej porcją świeżej pożywki.

Proces ciągły wyróżnia się wieloma zaletami, do których należą:

- wyeliminowanie wpływu czasu hodowli na zmiany warunków hodowli i fizjologię komórek

- możliwość prowadzenia hodowli dowolnie długo w ustalonych, najbardziej korzystnych warunkach - możliwość regulacji stanu fizjologicznego komórek przez dobór szybkości zasilania i składu podłoża zasilającego hodowlę

- stosunkowo duża jednorodność fizyczna i chemiczna hodowli

- możliwość automatyzacji procesów

- możliwość maksymalnego wykorzystania aparatury przy jednoczesnym równomiernym jej obciążeniu przez cały czas trwania procesu.

W hodowlach ciągłych mogą pojawiać się problemy związane z niestałością czynnika biologicznego, np.:

- degeneracja szczepów lub pojawienie się niekorzystnych mutacji i opanowanie hodowli przez populacje komórek o pogorszonych właściwościach produkcyjnych

- trudności w utrzymaniu warunków aseptycznych procesu w bioreaktorze przez dłuższy czas

- niekorzystny dla hodowli ciągłej sposób rozwoju niektórych droboustrojów, tworzących układy wielkokomórkowe, skupiska w postaci kłaczków i kuleczek a także układy wielkokomórkowe, skupiska w postaci kłaczków i kuleczek a także tendencja do obrastania przewodów i innych elementów bioreaktora

- niekorzystna relacja pomiędzy wzrostem drobnoustrojów a tworzeniem niektórych produktów metabolizmu syntetyzowanych przez komórki nie rosnące

- niedostateczna znajomość dynamicznych właściwości drobnoustrojów w hodowli ciągłej.