KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNYCH.

INHIBICJA. TERMOSTABILNOŚĆ.

Celem badań kinetyki reakcji enzymatycznych jest uzyskanie informacji o ich przebiegu w czasie, a więc zaniku substratów i powstawania produktów, liczby i kolejności przyłączania cząsteczek substratów do enzymu i odłączania cząsteczek produktów z kompleksu aktywnego, liczby kompleksów pośrednich oraz o efektach czynników modyfikujących przebieg reakcji – inhibitorów i aktywatorów. Badania te prowadzą do stworzenia modelu kinetycznego reakcji uwzględniającego wszystkie etapy reakcji. Każdy etap charakteryzują 2 wielkości, noszące nazwę stałych szybkości reakcji, które pozwalają sprawdzić, czy przyjęty model kinetyczny dobrze opisuje badany układ. Doświadczenie stałych szybkości reakcji jest bardzo uciążliwe.

Przy pomocy modelu kinetycznego można przewidywać szybkość i kierunek przebiegu danej reakcji w łańcuchu lub cyklu metabolicznym, czyli może on być podstawą do określenia katalitycznej sprawności enzymu w organizmie.

Aktywność enzymu określa nam ilość enzymu niezbędną do wytworzenia określonej ilości produktu reakcji w określonej jednostce czasu przy zachowaniu standardowych warunków oznaczenia, zwykle optymalnych dla działania enzymu.

Oznaczanie aktywności enzymów prowadzi się różnymi metodami, opierającymi się na pomiarze ilości wytworzonego produktu, ilości zużytego substratu, względnie zmian fizykochemicznych w środowisku reakcyjnym (np. zmiany lepkości, zmiany pH, zużycia tlenu).

Szybkość przebiegu reakcji enzymatycznej zależy od wielu czynników środowiskowych, tj. stężenie enzymu, stężenie substratu. Temperatura, pH, siła jonowa, potencjał oksyredukcyjny, obecność inhibitorów i aktywatorów.

O kierunku przebiegu reakcji decydują przede wszystkim stężenie substratu i produktów reakcji. Przy wysokim stężeniu substratu, a tak jest zwykle na początku reakcji, reakcja przebiega w kierunku tworzenia się produktów. Ilość reagującego substratu jest tym większa, im większa jest koncentracja enzymu na początku rekcji, co gwarantuje natychmiastowy kontakt wszystkich cząsteczek enzymu z substratem. Zaznaczyć jednak

należy, że w sytuacji, gdy cała ilość substratu jest związana z enzymem, nadmiar enzymu jest praktycznie bezużyteczny.

Na początkową szybkość reakcji decydujący wpływ ma stężenie substratu. Wraz ze wzrostem stężenia krzywa V-S przybiera formę hiperboliczną, co oznacza, ze tempo wzrostu szybkości reakcji maleje w miarę wzrostu stężenia substratu, dochodząc do wartości maksymalnej. Przy dalszym dodatku substratu wartość Vmax nie ulega zmianie, co związane jest z pełnym wysyceniem cząsteczek enzymu przez substrat. Wzrost Vmax może mieć miejsce wówczas, gdy w mieszaninie reakcyjnej zostanie zwiększone stężenie enzymu.

• Kinetyka hiperboliczna reakcji z 1 substratem.

Nieodwracalna reakcja enzymatyczna przebiega wg schematu:

A + E <-> EA -> E + P

W schemacie tym A, E, P, i EA oznaczają kolejno substrat, enzym, produkt i kompleks przejściowy lub aktywny. Substraty, produkty, inhibitory i inne czynniki biorące udział w reakcji nazywamy reaktantami. Enzym, po rozpadzie kompleksu aktywnego wchodzi powtórnie w reakcję, katalizując przemianę następnej cząsteczki substratu.

Zmiany stężenia poszczególnych składników reakcji enzymatycznej przedstawiono na rysunku:

Na powyższym wykresie literami a, b i c oznaczono stany przebiegu reakcji. Litera „a” to stan prestacjonalny, tj. okres początkowy reakcji, poprzedzający ustalenie stanu stacjonarnego. „b” to stan stacjonarny, w którym stężenie kompleksu aktywnego EA jest wartością stałą. Później następuje stan poststacjonarny „c”, który posiada małe znaczenie w badaniach kinetyki reakcji enzymatycznych.

Interpretacja kinetyki hipernolicznej w ujęciu Michaelis’a-Menten

Interpretacja kinetyki hipernolicznej opiera się na założeniu, że podczas przebiegu reakcji enzymatycznej istnieje taki stan, w którym stężenie kompleksu EA jest wielkością stałą.

SCHEMAT NIEODWRACALNEJ REAKCJI ENZYMATYCZNEJ:

ZAŁOŻENIE: Istnieje taki moment reakcji, w którym szybkość syntezy kompleksu enzym-substrat równa się szybkości jego rozpadu ([EA] = const)

k₊₁[A][E] = k_-1[EA] + k₊₂ [EA]

ponieważ:

[E] = [E0] – [EA]

to:

ponieważ szybkość powstawania produktu wynosi: V₀ = k₊₂ [EA]

zakładając, że:

Vmax = k₊₂[E0]

Wartość Km jest miarą powinowactwa enzymu do substratu; większe Km – mniejsze powinowactwo. Km jest to taka ilość substratu, przy której reakcja enzymatyczna przebiega z połową maksymalnej szybkości.

Aby uniknąć trudności w określaniu wartości Vmax i Km kinetykę reakcji przedstawia się w formie wykresu Lineweavera-Burka (linearyzacja Lineweavera-Burka – jest to odwrotność końcowego wzoru w teorii Michaelis’a-Menten).

• Metody relaksacyjne w badaniach mechanizmów reakcji enzymatycznych.

Metody relaksacyjne opierają się na wywołaniu chwilowych zaburzeń w układzie znajdującym się w stanie równowagi termodynamicznej i następnie obserwacji kinetyki ustalania się nowego stanu równowagi termodynamicznej, czyli relaksacji. Szybkość ustalania się nowego stanu jest miarą szybkości reakcji przebiegających w badanym układzie.

W badaniach biologicznych najczęściej stosowane są badania relaksacji ciśnieniowej i temperaturowej (metody skoku ciśnienia lub temperatury).

• Hamowanie reakcji enzymatycznych.

Szybkość reakcji enzymatycznych może być znacznie ograniczona przez czynniki środowiskowe. Ich działanie można określić jako: niespecyficzne – pH, temperatura, metale ciężkie itp. powodują najczęściej nieodwracalną inaktywację białek enzymatycznych;

specyficzne – niektóre związki modyfikują cząsteczkę enzymu (blokada centrum aktywnego, modyfikacja struktury przestrzennej), przy czym modyfikacja taka jest z reguły odwracalna.

Temperatura jest jednym z czynników istotnie wpływających na szybkość reakcji enzymatycznych. Wraz z jej wzrostem wzrasta szybkość katalizowanych przez enzymy reakcji. Jednakże w podwyższonej temperaturze dochodzi na ogół do denaturacji cieplnej enzymów, a przez to do ich inaktywacji. Większość enzymów posiada optimum swojego działania w temperaturze 30-50 °C. Natomiast już kilkuminutowa inkubacja w temp. 70 °C inaktywuje większość znanych do tej pory enzymów, choć istnieją też także enzymy, które pełnią aktywność nawet po inkubacji w 100 °C.

W niektórych przypadkach te same enzymy, ale izolowane z 2 różnych organizmów charakteryzują się różną termostabilnością. a-amylaza z Bacillus stearotermophilius charakteryzują swą aktywność po inkubacji w 90 °C, natomiast ten sam enzym izolowany z Aspergillus oryzae ulega pełnej inaktywacji już po 15 min inkubacji w 60 °C.

Denaturacja termiczna w odniesieniu do niektórych enzymów jest odwracalna. Przykładem jest tu pirofosforaza nukleotydowa z Proteus vulgaris. Enzym ten traci całkowicie aktywność po 10 min inkubacji w 70 °C, ale odzyskuje ją całkowicie po ochłodzeniu do 37 °C.

Inaktywacja enzymów może również następować w temperaturach poniżej 10 °C. W tych przypadkach zjawisko to ma charakter bardziej kompleksowy, gdyż szybkość inaktywacji zależy tu również od stężenia enzymu, stężenia soli i pH środowiska. Taka inaktywacja dotyczy prawdopodobnie tylko enzymów oligometrycznych, które w obniżonej temperaturze dysocjują na podjednostki, a po ponownym podwyższeniu temperatury podjednostki te nie asocjują się już w aktywny enzym (np. dekarboksylacja glutaminowa z E. coli).

Enzymów inaktywujących się w niskich temperaturach jest jednak bardzo mało; większość enzymów ulega inaktywacji w podwyższonej temperaturze.

Istnieje możliwość wpływania na termo-stabilność enzymów poprzez stosowanie związków ochronnych, które wiążą się z enzymem, przez co obserwuje się mniejszy spadek jego aktywności. Stabilizująco działają substraty i analogi strukturalne, jony metali, koenzymy, a także stabilizatory nieswoiste – albuminy osocza, dekstran, glikol polietylenowy (PEG), glicerol.

ŹRÓDŁA ENZYMÓW

1. Enzymy pochodzenia roślinnego:

- peroksydaza - chrzan

- proteinazy – fasola szparagowa

- a-amylaza – jęczmień, słodkie ziemniaki

2. Enzymy pochodzenia zwierzęcego:

- katalaza – bydło

- lipaza – świnia

- lizozym – jaja kurze

- pepsyna – świnia

- a-amylaza - świnia

3. Enzymy pochodzenia mikrobiologicznego:

• enzymy wytwarzane przez bakterie:

- katalaza – Micrococcus lysodeiktus

- proteazy – Bacillus sp., Streptomyces sp.

- kolagenaza – Clostridium histoliticum, Rydopseudomonas spheroides

- a-amylaza – Bacillus sp.

- b-galaktozydaza – Escherichia coli

• enzymy wytwarzane przez grzyby:

- glukozydaza – Aspergillus niger

- lipaza – Aspergillus sp., Mucor sp., Rhizopus sp.

- a-amylaza - Aspergillus sp.

- b-amylaza - Aspergillus sp.

- amyloglukooksydaza - Aspergillus niger

- b-1,3-glukanaza – Basidomycete sp., Sclereltina libertiana

- pektynazy - Aspergillus niger

- celulazy – Trichoderma viride, Basidomyces sp.

- proteazy - Aspergillus sp., Tritirachium sp.

Biorąc pod uwagę rodzaj oddziaływania między cząsteczkami enzymu i inhibitora inhibicję specyficzną dzielimy na 3 typy:

1. inhibicja współzawodnicza (kompetycyjna) – polega na konkurencji pomiędzy inhibitorem i substratem o centrum aktywne enzymu; inhibitory tego typu są zwykle podobne pod wzgl. struktury chemicznej do substratu; inhibicję tego typu można zwykle znieść przez zwiększenie stężenia substratu; przy tego typu inhibicji zmniejsza się powinowactwo enzymu do substratu (Km rośnie), Vmax nie zmienia się

2. inhibicja niewspółzawodnicza (niekompetycyjna) – inhibitor tak wiąże się z enzymem, że zmienia jego aktywność katalityczną; maleje Vmax powinowactwo pozostaje na tym samym poziomie (Km = const)

3. inhibicja allosteryczna – inhibitor tak modyfikuje cząsteczkę enzymu, że zmienia się zarówno powinowactwo enzymu do substratu (Km) jak i szybkość maksymalna (Vmax); przykładem tego typu inhibicji może być inhibicja przez sprzężenie zwrotne, gdzie produkt reakcji hamuje jeden z pierwszych etapów tej reakcji.

Na rysunku przedstawiono graficzną interpretację różnych typów inhibicji na wykresie Lineweavera-Burka.