Biochemia

laboratorium

Ćwiczenie 5:

Kinetyka reakcji enzymatycznych (część I)

Wpływ pH, temperatury, aktywatorów i inhibitorów na szybkość reakcji enzymatycznych

Sprawozdanie poprawione 13.05.2011

grupa:

Katarzyna Kędzierska 144530

Dominika Kępska

Justyna Dabrowska

kierunek Biotechnologia

grupa dziekańska: III

semestr: IV

data wykonania ćwiczenia: 5.05.201

data oddania sprawozdania 16.05.2011

1. Wstęp teoretyczny:

Enzymy – są to wielkocząsteczkowe związki chemiczne, głównie białkowe. Ich podstawową funkcją jest katalizowanie (przyspieszanie) reakcji chemicznych, poprzez obniżenie ich energii aktywacji.

Zmiany energii w czasie reakcji. By przeprowadzić substraty (S) w stan przejściowy (S*) potrzeba dużej energii do pokonania progu aktywacji. Składniki reakcji w stanie przejściowym są konwertowane następnie w produkty końcowe (P). Enzym obniża energię aktywacji reakcji poprzez utworzenie alternatywnej ścieżki reakcji ze stanem pośrednim (ES*) o mniejszej energii oraz stabilizują go poprzez jego specyficzne wiązanie. Zmniejszenie energii aktywacji zwiększa szybkość reakcji.
Większość reakcji biochemicznych zachodziłaby znacznie wolniej bez katalitycznego działania enzymów. Enzymy są swoistymi katalizatorami danych reakcji, co oznacza, że w przeciwieństwie do katalizatorów niebiałkowych (H⁺, OH^-, jonów metali), każdy enzym katalizuje niewielką liczbę reakcji, a często tylko jedną. Zasadniczo wszystkie reakcje biochemiczne są katalizowane przez enzymy, co potwierdza ogromne znaczenie, jakie odgrywają te substancje. Enzymy przyspieszają reakcje chemiczne, lecz o szybkości reakcji nie decyduje jedynie stężenie enzymu i substratu.
Na działanie enzymów mają wpływ różne czynniki:

• stężenie jonów wodorowych (pH)

• temperatura reakcji

• niekiedy potencjał redukcyjno – oksydacyjny środowiska, w którym zachodzi reakcja

• obecność różnych związków niskocząsteczkowych (koenzymów, aktywatorów, inhibitorów)

• siła jonowa

• stała dielektryczna środowiska.

1. Część doświadczalna:
   

1. Wpływ pH na aktywność α-amylazy:

1. Wykonanie:
   Do 6 probówek odmierzyliśmy po 1 cm³ roztworów buforowych o pH: 3, 4, 5, 6, 7 i 8. Do każdego z odmierzonych roztworów buforowych dodaliśmy pipetą po 2 cm³ koloidalnego roztworu skrobi. W międzyczasie przygotowaliśmy płytki porcelanowe z zagłębieniami, do których wprowadziliśmy po 2 krople roztworu jodu w jodku potasu. Do zbuforowanych roztworów skrobi, dodawaliśmy pipetą w równych odstępach czasu (co 15 sekund) po 1 cm³ roztworu α-amylazy, a następnie całość natychmiast mieszaliśmy. Przy pomocy pipet pasterowskich pobieraliśmy w równych odstępach czasu (co 15 sekund) próby każdego z hydrolizatów, przenosząc je na płytki z roztworem jodu w jodku potasu. Obserwowaliśmy powstające na płytkach zabarwienie, wskazujące na stopień rozkładu skrobi w danej próbce. Pobieranie prób hydrolizatów przerwaliśmy w momencie, gdy jedna z prób w reakcji z jodem w jodku potasu zabarwiła się na jasnobrunatny (herbaciany) kolor. W tym momencie poczynając od pierwszej probówki, w równych odstępach czasu, dodawaliśmy pipetą do wszystkich 6 hydrolizatów po 2 krople roztworu jodu w jodku potasu. Natychmiast wymieszaliśmy zawartość probówek i zaobserwowaliśmy powstające zmiany.

2. Obserwacje:
   Tabela nr 1: Obserwacje zabarwienia produktów hydrolizy skrobi w reakcji z jodem w jodku potasu i wnioski dotyczące stopnia hydrolizy skrobi

pH	Zabarwienie hydrolizatu w reakcji z jodem w jodku potasu	Stopień hydrolizy skrobi (rodzaj produktu)
3	granatowy (najciemniejszy)	skrobia nierozłożona
4	fioletowo-niebieski	przewaga amylodekstryn
5	bladoróżowy (najjaśniejszy)	przewaga achrodekstryn + erytrodekstryny
6	jasnofioletowy	amylodekstryny + erytrodekstryny
7	ciemnofioletowy	przewaga amylodekstryn
8	granatowy	Skrobia nierozłożona

1. Wnioski:
   Z doświadczenia wnioskujemy, że optymalne pH, enzymu α-amylazy, to pH = 5. Potwierdza to fakt, że α-amylaza przy pH = 5 osiągnęła maksymalną aktywność (miała najlepsze działanie katalityczne), gdyż przy takim właśnie pH, w tym samym czasie, reakcja hydrolizy skrobi zaszła najdalej (skrobia została rozłożona do glukozy, maltozy, oligocukrów redukujących i achrodekstryn – związków nie barwiących się jodem). W innych probówkach otrzymaliśmy barwne roztwory, gdyż znajdowały się w nich inne substancje rozkładu skrobi, takie jak amylodekstryny, erytrodekstryny i sama nierozłożona skrobia, barwiące się z jodem. Oznacza to, że w tym samym czasie, w innym pH niż pH optymalne, reakcja przebiegała wolniej. α-amylaza miała słabsze działanie katalityczne dla reakcji hydrolizy skrobi, co wskazuje na to, że jej aktywność była niższa od jej maksymalnej aktywności uzyskanej w optymalnym pH. Zatem, aby reakcja katalizowana przez enzym białkowy przebiegała najszybciej (najbardziej efektywnie) należy ją przeprowadzać w pH optymalnym.
   Na aktywność enzymu α-amylazy, jak i na aktywność każdego innego enzymu, pH ma ogromny wpływ, ponieważ enzymy mają składnik białkowy. W zależności od stężenia jonów wodorowych, zmienia się stan jonowy białek, które przyjmują postać elektrododatniego kationu (w pH<pI), elektroobojętnego amfijonu (w pH=pI) bądź elektroujemnego anionu (w pH>pI). Z kolei ładunek cząsteczki białka enzymatycznego wpływa na działanie katalityczne enzymu, czyli na jego aktywność.

1. Wpływ temperatury na aktywność α-amylazy:
   

1. Wykonanie:
   Do 2 probówek odmierzyliśmy po 1 cm³ koloidalnego roztworu skrobi i po 0,5 cm³ buforu o pH optymalnym (czyli pH=5) dla działania badanego preparatu
   α-amylazy. Inkubowaliśmy każdą z probówek w ciągu 5 minut w łaźni wodnej utrzymującej temperaturę 50ºC. Równocześnie inne grupy laboratoryjne przeprowadzały analogiczne zadanie, ale używały łaźni wodnych utrzymujących inne temperatury (40, 60, 70, 80 ºC) lub inkubowały próbki w temperaturze pokojowej, na stole laboratoryjnym. Po 5 minutach do każdej probówki dodaliśmy po 0,5 cm³ roztworu α-amylazy. Natychmiast dokładnie wymieszaliśmy zawartość probówek i inkubowaliśmy je dalej w temperaturze 50ºC (inne grupy laboratoryjne w pozostałych temperaturach) przez kolejne 3 minuty. Dokładnie po upływie tego czasu, pobraliśmy 0,5 cm³ mieszaniny reakcyjnej i wprowadziliśmy do uprzednio przygotowanej probówki zawierającej 0,5 cm³ roztworu DNS. Wymieszaliśmy i umieściliśmy we wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Następnie schłodziliśmy probówki i dodaliśmy 4 cm³ wody destylowanej. Wymieszaliśmy ponownie i zmierzyliśmy absorbancję roztworu przy długości fali równej 540 nm wobec próby odczynnikowej, zawierającej 0,5 cm³ wody destylowanej zamiast mieszaniny reakcyjnej. Równocześnie inne grupy laboratoryjne zmierzyły absorbancję swoich roztworów (inkubowanych w innych temperaturach).

2. Obserwacje i obliczenia:
   Obliczenia dla uzyskanych wartości absorbancji: 0,535 i 0,543 dla fali długości λ=540 nm w zadanej temperaturze 50ºC:
   Z krzywej wzorcowej A₅₄₀ = f(c_maltozy): 0,1 – 0,2 mg maltozy/cm³
   (Oznacza to, że w badanym roztworze o absorbancji A₅₄₀ = 0,1, stężenie cukrów redukujących w przeliczeniu na maltozę wynosi: 0,2 mg maltozy/cm³)
   0,535 – x mg maltozy/cm³
   0,543 – y mg maltozy/cm³
   x = 1,070 mg maltozy/cm³
   y = 1,086 mg maltozy/cm³
   Tabela nr 2: Zmierzone wielkości absorbancji hydrolizatów inkubowanych w różnych temperaturach, oraz wyliczone stężenia cukrów redukujących [mg maltozy/cm³]

Temperatura hydrolizy skrobi katalizowanej przez α-amylaze [ºC]	pokojowa	40	50	60	70	80
Absorbancja A540	0,467 0,282	0,291 0,345	0,468 0,510	0,535 0,543	0,297 0,339	0,176 0,193
Doświadczalne stężenie cukrów redukujących [mg maltozy/cm^3]	0,934 0,564	0,582 0,690	0,936 1,020	1,070 1,086	0,596 0,678	0,352 0,386
Stężenie cukrów redukujących (średnie lub wybrane do punktów krzywej) [mg maltozy/cm^3]	0,612	0,978	1,078	0,637	0,369	0,350

Rys 1: Wykres wpływu temperatury hydrolizy skrobi, na aktywność enzymu α-amylazy, katalizującej tą reakcję.

1. Wnioski:
   Optymalną temperaturą dla enzymu α-amylazy jest 50°C, gdyż właśnie w tej temperaturze, przez ten sam okres czasu, powstaje najwięcej cukrów redukujących (co oznacza że reakcja zachodzi tu najdalej - najszybciej). Poniżej temperatury optymalnej (mniejsza energia kinetyczna cząsteczek) skuteczność katalityczna α-amylazy maleje, co oznacza, że w tym samym czasie reakcja hydrolizy skrobi katalizowana przez nasz enzym przebiega wolniej. Natomiast powyżej temperatury optymalnej działanie α-amylazy również maleje, ale jest to spowodowane innym faktem. Mianowicie α-amylaza jest enzymem białkowym i jako białko denaturuje w wysokich temperaturach i traci swą aktywność biologiczną. Aby przeprowadzić reakcje katalizowaną enzymatycznie najbardziej efektywnie i najszybciej należy prowadzić ją w temperaturze optymalnej
   danego wykorzystywanego do reakcji enzymu.
   Wzrost temperatury ma zasadniczy wpływ na szybkość reakcji chemicznych, gdyż zwiększa energie kinetyczną cząsteczek, ich ruchliwość, a co za tym idzie rośnie prawdopodobieństwo skutecznych zderzeń tych cząsteczek, prowadzących do zajścia reakcji.

2. Zasada metody wykorzystywanej do oznaczenia aktywności enzymu α-amylazy:
   Aktywność enzymu oznaczaliśmy mierząc przyrost cukrów redukujących, powstających w czasie reakcji hydrolizy skrobi, katalizowanej przez enzym α-amylaze. Cykry te oznaczaliśmy ilościowo stosując alkaliczny roztwór kwasu 3’,5’-dinitrosalicylowego (DNS).
   W środowisku alkalicznym i w temperaturze 100ºC DNS uległ redukcji pod działaniem cukrów redukujących, dając pochodną aminową, barwiącą się w środowisku alkalicznym na kolor pomarańczowy. Natężenie barwy, o maksimum absorbacji przy 540 nm, jest proporcjonalne do stężenia cukrów redukujących w badanym roztworze. Z krzywej wzorcowej: A₅₄₀ = f(c_maltozy) odczytuje się stężenie cukrów redukujących.

1. Badanie termostabilności α-amylazy:
   

1. Wykonanie:
   Do 2 probówek odmierzyliśmy po 1 cm³ roztworu α-amylazy i 1 cm³ buforu o pH optymalnym (pH=5), po czym każdą z probówek inkubowaliśmy w ciągu 10 minut w temperaturze 50ºC. Po 10 minutach roztwór enzymu schłodziliśmy pod bieżącą wodą, a następnie przez 5 minut pozostawiliśmy go na stole laboratoryjnym, aby uzyskał temperaturę pokojową. Dodaliśmy 2 cm³ koloidalnego roztworu skrobi i dokładnie wymieszaliśmy. Inkubowaliśmy w temperaturze pokojowej (na stole laboratoryjnym) w ciągu 3 minut, po czym pobraliśmy 0,5 cm³ mieszaniny reakcyjnej i wprowadziliśmy do probówki zawierającej 0,5 cm³ roztworu DNS. Wymieszaliśmy i umieściliśmy na 5 minut we wrzącej łaźni wodnej, schłodziliśmy, dodaliśmy 4 cm³ wody destylowanej i dokładnie wymieszaliśmy. Zmierzyliśmy ekstynkcję roztworu przy 540 nm wobec próby odczynnikowej, zawierającej 0,5 cm³ wody destylowanej zamiast mieszaniny reakcyjnej. Równocześnie inne grupy laboratoryjne wykonały analogiczne czynności, ale wykorzystując inną temperaturę preinkubacji: pokojową, 40, 60, 70, 80ºC.

2. Obserwacje i obliczenia:
   Obliczenia dla uzyskanych wartości absorbancji: 0,112 i 0,099 dla długości fali λ=540 nm i temperatury preinkubacji: 50ºC dla 10 minutowego czasu preinkubacji:
   Z krzywej wzorcowej A₅₄₀ = f(c_maltozy): 0,1 – 0,2 mg maltozy/cm³
   (Oznacza to, że w badanym roztworze o absorbancji A₅₄₀ = 0,1, stężenie cukrów redukujących w przeliczeniu na maltozę wynosi: 0,2 mg maltozy/cm³)
   0,112 – x mg maltozy/cm³
   0,099 – y mg maltozy/cm³
   x = 0,210 mg maltozy/cm³
   y = 0,218 mg maltozy/cm³

Tabela nr 3: Zmierzone wartości absorbancji hydrolizatów po preinkubacji enzymu w różnych temperaturach oraz wyliczone stężenia cukrów redukujących [mg maltozy/cm³]

Temperatura preinkubacji enzymu α-amylazy [ºC]	pokojowa	40	50	60	70	80
Absorbancja A540	0,303 0,289	0,217 0,224	0,255 0,357	0,112 0,099	0,105 0,109	0,091 0,117
Doświadczalne stężenie cukrów redukujących [mg maltozy/cm^3]	0,606 0,578	0,434 0,448	0,510 0,714	0,227 0,196	0,210 0,218	0,182 0,234
Stężenie cukrów redukujących (średnie lub wybrane do punktów krzywej) [mg maltozy/cm^3]	0,517	0,510	0,227	0,222	0,182	0,180

Rys 2: Wpływ 10 minutowej preinkubacji enzymu α-amylazy, w różnych temperaturach, na jego aktywność w reakcji hydrolizy skrobi.

1. Wnioski:

Enzym α-amylaza jest termostabilna do dla 10 minutowego okresu preinkubacji. Potwierdzamy to faktem, że pod wpływem 10 minutowego preinkubowania, enzym ten nie zmniejsza swojej aktywności jedynie w temperaturze pokojowej i 40°C. Natomiast 10 minutowe preinkubowanie w wyższych temperaturach (50 - 80°C) osłabia katalityczne działanie α-amylazy (jej aktywność), co wnioskujemy po zmniejszającym się stężeniu cukrów redukujących, świadczącym o postępie reakcji.
Termostabilność enzymu, jest to najwyższa temperatura, w której w określonym czasie, dany enzym nie traci jeszcze swojej aktywności (nie dochodzi do termicznej inaktywacji enzymu). Termostabilnośc wyznacza się w nieobecności substratu.

1. Wpływ aktywatorów i inhibitorów na α-amylazę ślinową:
   

1. Wykonanie:
   Do 3 probówek odmierzyliśmy po 3 cm³ koloidalnego roztworu skrobi i kolejno do pierwszej dodaliśmy 0,5 cm³ wody destylowanej, do drugiej 0,5 cm³ roztworu NaCl, do trzeciej 0,5 cm³ CuSO₄, a do wszystkich po 1 cm³ roztworu α-amylazy śliny (przygotowanego przez jedną osobę z grupy, poprzez pobranie do ust porcji wody destylowanej oraz przepłukiwanie jamy ustnej tą wodą przez parę minut). Badaliśmy stopień hydrolizy skrobi pobierając z każdej probówki po kropli hydrolizatu celem wykonania reakcji z jodem w jodku potasu (na przygotowanych płytkach porcelanowych). W chwili gdy jedna z prób barwiła się na kolor herbaciany, dodaliśmy pipetą do wszystkich probówek po 4 krople roztworu jodu w jodku potasu i natychmiast wymieszaliśmy zawartość probówek.

2. Obserwacje:
   Tabela nr 4: Wpływ chlorku sodu i siarczanu miedzi (II) na przebieg hydrolizy skrobi, katalizowanej enzymatycznie przez α-amylazę ślinową (z użyciem wody destylowanej jako odnośnika). Obserwacje postępu hydrolizy poprzez zaobserwowanie barwy hydrolizatu w reakcji z jodem w jodku potasu.

Użyty odczynnik	Woda destylowana	NaCl	CuSO4
Zabarwienie hydrolizatu po dodaniu do probówki roztworu jodu w jodku potasu	fioletowy	herbaciany	granatowy

1. Wnioski:
   W tym samym czasie, skrobia została zhydrolizowana przez enzym α-amylaze ślinową w największym stopniu, w obecności NaCl (kolor najjaśniejszy świadczy o powstaniu dalszych produktów hydrolizy – glukozy, maltozy, oligocukrów redukujących oraz achrodekstryn), co oznacza, że jony Cl^- są aktywatorami dla α-amylazy ślinowej. Jest to cecha charakterystyczna tego enzymu i wyjątek, gdyż aniony wywierają niewielki wpływ na aktywność enzymów. W tym samym czasie skrobia została zhydrolizowana, przez enzym α-amylaze ślinową w najmniejszym stopniu, w obecności CuSO₄ (kolor ciemniejszy, granatowy świadczy o obecności praktycznie samej niezhydrolizowanej skrobi) co oznacza, że jony Cu²⁺ sa inhibitorami dla enzymu α-amylazy ślinowej. W tym samym czasie skrobia została zhydrolizowana w stopniu pośrednim w obecności wody destylowanej (kolor fioletowy świadczy o powstaniu produktów pośrednich hydrolizy – erytrodekstryn, amylodekstryn oraz obecności niezhydrolizowanej jeszcze skrobi) co oznacza, że woda destylowana jest obojętna w stosunku do
   α-amylazy ślinowej. Wykorzystujemy ją jako punkt odniesienia.