1.czesc teoretyczna:
Szybkość katalizowanej przez enzym przemiany danego substratu w określony produkt jest ściśle uzależniona od stężenia zarówno enzymu, jak i substratu. Nie są to jednak jedyne czynniki determinujące przebieg reakcji. Na katalityczne działanie enzymów maja również wpływ:
-Stężenie jonów wodorowych (pH);
-Temperatura reakcji;
-W niektórych przypadkach Potencjał redukcyjno-oksydacyjny środowiska, w którym zachodzi reakcja;
-Obecność rozmaitych związków niskocząsteczkowych (koenzymów, aktywatorów, inhibitorów);
-Siła jonowa i stała dielektryczna środowiska.
2.część praktyczna:
Cel ćwiczenia:
2.1. wpływ pH na aktywność α-amylazy;
Wykonanie: do 6 probówek odmierzyłyśmy po 1cm3 roztworów buforowych o pH: 3, 4, 5, 6, 7 i 8. Do każdego z odmierzonych roztworów buforowych dodałyśmy pipetą po 2cm3 koloidalnego roztworu skrobi. W międzyczasie przygotowałyśmy płytki ceramiczne z zagłębieniami, do których wprowadziłyśmy po 2 krople roztworu jodu w jodku potasu. Do zbuforowanych roztworów skrobi, dodałyśmy pipetą w równych odstępach czasu, co 15s., po 1cm3 roztworu α-amylazy. Zawartość probówek natychmiast wymieszałyśmy. Przy pomocy pipetek pasterowskich pobierałyśmy co 15s. próby każdego z hydrolizatów i przenosiłyśmy je na uprzednio przygotowane płytki z roztworem jodu w jodku potasu. Obserwowałyśmy powstające na płytkach zabarwienie, wskazujące na stopień rozkładu skrobi w danej próbie. Pobierałyśmy próby hydrolizatów, aż do momentu, gdy jedna z nich w reakcji z jodem w jodku potasu zabarwił się na jasnobrązowy kolor. W tym momencie począwszy od pierwszej probówki w równych odstępach czasu, dodałyśmy pipetą do wszystkich 6 hydrolizatów po 3 krople roztworu jodku w jodku potasu. Natychmiast wymieszałyśmy zawartość probówek i obserwowałyśmy zabarwienie powstałe na skutek reakcji dekstryn-produktów hydrolizy- z roztworem jadu w jodku potasu.
Obserwacje:
Tabela nr 1. Tytuł tabeli:
| pH | Zabarwienie hydrolizatu w reakcji z jodem w jodku potasu | Stopień hydrolizy skrobi |
|---|---|---|
| 3 | Fioletowy | Amylodekstryny |
| 4 | Czerwonobrunatny | Amylodekstryny, erytrodekstryny |
| 5 | Lekko różowy | Achrodekstryny, erytrodekstryny |
| 6 | Ciemnobrunatny | Erytrodekstryny, amylodekstryny |
| 7 | Granatowy | Skrobia nierozłożona |
| 8 | Granatowy | Skrobia nierozłożona |
Wnioski:
2.2.wpływ temperatury na szybkość reakcji enzymatycznej
Wykonanie: do 6 probówek odmierzyłyśmy po 1cm3 koloidalnego roztworu skrobi i po 0,5cm3 buforu o pH 5 (optymalne pH dla działania badanego preparatu α-amylazy, odczytane z zadania poprzedniego). Następnie inkubowaliśmy każdą z probówek w ciągu 15minut w następujących temperaturach: pokojowa(25oC), 40, 50, 60, 70 i 80 oC(łaźnie wodne). Po 5minutach gdy temperatura w probówkach ustali się na żądanym poziomie, do każdej z nich dodaliśmy po 0,5cm3 roztworu α-amylazy. Natychmiast dokładnie wymieszaliśmy zawartość probówek i inkubowaliśmy je nadal w podanych temperaturach w ciągu 3minut. Po tym czasie pobraliśmy do uprzednio przygotowanej probówki zawierającej 0,5cm3 roztworu DNS. Wymieszaliśmy i umieściliśmy na 5minut we wrzącej łaźni wodnej, po czym schłodziliśmy i dodaliśmy 4cm3 wody destylowanej. Wymieszaliśmy ponownie i zmierzyliśmy absorbancję roztworu przy długości fali równej 540nm wobec próby odczynnikowej, zawierającej 0,5cm3 wody destylowanej zamiast mieszaniny reakcyjnej.
Obserwacje:
Tabela nr 2; tytuł tabeli:
| Temperatury hydrolitu [oC] | 25 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Stężenie cukrów redukcyjnych [mg maltozy/cm3] |
Wnioski: w oparciu o wykres zauważyłyśmy, że optymalną temperaturą działania enzymu na skrobię jest temperatura 50oC. powyżej tej temperatury bardzo intensywnie zachodziły zmiany denaturacyjne, które przekładały się na wydajność enzymu.
2.3.badanie termostabilności α-amylazy
Wykonanie: do 6 probówek odmierzyłyśmy po 1cm3 roztworu α-amylazy i 1cm3 buforu o pH 5, po czym każdą z probówek inkubowałyśmy w ciągu 10minut w następujących temperaturach: pokojowa(25oC), 40, 50, 60, 70 i 80 oC. po 10minutach roztwór enzymu chłodziłyśmy pod bieżącą wodą do temperatury pokojowej, następnie dodałyśmy 2cm3 koloidalnego roztworu skrobi i dokładnie wymieszałyśmy. Inkubowałyśmy w ciągu 3 minut w temperaturze pokojowej, po czym pobrałyśmy 0,5cm3 mieszaniny reakcyjnej i wprowadziłyśmy do probówki zawierającej 0,5cm3 roztworu DNS. Wymieszałyśmy i umieściłyśmy na 5minut we wrzącej łaźni wodnej, schłodziłyśmy, dodałyśmy 4cm3 wody destylowanej i ponownie dokładnie wymieszałyśmy. Zmierzyłyśmy ekstynkcję przy 540nm wobec próby odczynnikowej zawierającej 0,5cm3 wody destylowanej zamiast mieszaniny reakcyjnej.
Obserwacje:
Tabela nr 3; temat:
| Temperatura preinkubacji [oC] | pokojowa | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Stężenie cukrów redukujących [mg maltozy/cm3] | 0,826 | 0,77 |
Wnioski:
2.4. wpływ aktywatorów i inhibitorów na α-amylazę
Wykonanie: do 3 probówek odmierzyłyśmy po 3cm3 koloidalnego roztworu skrobi i kolejno dodałyśmy do pierwszej 0,5cm3 wody destylowanej, do drugiej 0,5cm3 NaCl, a do trzeciej 0,5cm3 CuSO4 i do wszystkich 1cm3 α-amylazy śliny. Badałyśmy stopień hydrolizy skrobi pobierając z każdej probówki po kropli hydrolizatu celem wykonania reakcji z jodem w jodku potasu na płytkach ceramicznych. W chwili gdy próba jednego z hydrolizatów, dała z reagentem reakcje ujemną, dodałyśmy pipetą do każdej z probówek po 4 krople roztworu jodu w jodku potasu. Natychmiast wymieszałyśmy zawartość probówek.
Obserwacje: próba z CuSO4 zabarwiła się na kolor granatowy, a próba z NaCl przybrała barwę brunatną, natomiast próba z woda zabarwiła się na czerwonofioletowo.
Wnioski: jony miedzi(II) były inhibitorem α-amylazy slinowej w badanej próbie, a jony Cl- aktywatorem. Inhibitor Cu2+ obniża aktywność enzymu, a anion Cl- jest jonem aktywującym enzymy.