Kinetyka reakcji enzymatycznych

Teoria Michaelisa-Menten i Briggsa-

Haldane’a

Kinetyka reakcji z jednym i z dwoma

substratami

Kinetyka enzymów allosterycznych

Stałe kinetyczne reakcji

Stała wydajności (specyficzności)

katalitycznej

Inhibicja enzymów i jej kinetyka

Kinetyka enzymów immobilizowanych

Cele badań kinetyki reakcji
enzymatycznych:



uzyskanie informacji o przebiegu reakcji w czasie,

a więc o:



szybkości zaniku substratów i powstawania

produktów



liczby i kolejności przyłączania cząsteczek

substratów do enzymu i odłączania cząsteczek

produktów z kompleksu aktywnego



liczby kompleksów pośrednich i izomeryzujących

form enzymu



o efektach czynników modyfikujących przebieg

reakcji – inhibitorów i aktywatorów

Energia aktywacji

Jest to energia, którą muszą mieć cząsteczki (jony, atomy), aby były zdolne do
określonej reakcji chemicznej. Energię aktywacji wyraża się zwykle w kJ/mol
reagujących cząsteczek. Im mniejsza jest energia aktywacji, tym reakcja zachodzi
szybciej. (Energia aktywacji, najmniejsza

energia

, jaką muszą posiadać cząsteczki

substratów, by wskutek zderzenia tych cząsteczek, mogła zajść

reakcja chemiczna

.;

różnica energii swobodnej między stanem przejściowym a substratem. )

Szybkość reakcji jest miara ilości zużywanych substratów lub

powstających produktów w jednostce czasu. Opisujemy ją wzorem:



Gdzie: - współczynniki stechiometryczne reagentów

A- substraty
B- produkty

Doświadczalnie wyznaczone równanie tego typu nosi nazwę równania

kinetycznego, przyjmuje ono postać:

Współczynnik k nosi nazwę stałej szybkości reakcji, jest niezależna od

stężeń reagentów, a zależna m.in. od temperatury. Wykładniki
potęgowe nie wynikają z równania sumarycznego, a jedynie z
mechanizmu reakcji. Wykładniki te mogą mieć zarówno wartości
całkowite jak i ułamkowe.

dt

v

dc

dt

v

dc

r

B

B

A

A







B

A

v

v ,

   

...

b

a

B

A

k

v 

Jednostki enzymatyczne:



Najpowszechniejsza- podawana jako wartość

w czasie zerowym- czyli jako początkową
szybkość reakcji Vo, jednostka: µmol/min



2 standardowe jednostki aktywności

enzymatycznej:



Jednostka enzymatyczna (U)



Katal (kat)



Jednostka enzymatyczna-czyli taka ilość

enzymu, która katalizuje przemianę 1 μmola
substratu w ciągi 1 minuty w temperaturze
30°C i określonym pH



katal (kat), czyli ilość enzymu katalizująca

przemianę 1 mola substratu w ciągu 1
sekundy.



1 µmol/min=1U=16.67 nanokat

Aktywność:



Całkowita- odnosi się do całkowitej liczby
jednostek enzymatycznych w próbce



Specyficzna- liczba jednostek enzymatycznych
na miligram białka, miara czystości enzymu

Model Michaelisa-Menten:
model oparty na założeniu o nieodwracalnym
mechanizmie reakcji

Stała Michaelisa:



jest wyrazem powinowactwa enzymu do substratu



enzymy o niskiej wartości stałej Michaelisa działają

znacznie sprawniej niż enzymy o wysokiej jej wartości



szybkość tworzenia produktu zależy od [ES], a więc im

wartość [ES] jest większa, a tym samym stała

Michaelisa mniejsza, tym szybsze powstawanie

produktu.



dla większości enzymów stała Michaelisa mieści się w

przedziale od 10

-1

do 10

-7

M



zależy ona od substratu, a także warunków

zewnętrznych takich jak: temperatura i siła jonowa



oznacza ona takie stężenie substratu, w którym połowa

miejsc aktywnych jest obsadzona



kiedy znamy jej wartość możemy obliczyć ułamek

obsadzonych miejsc dla każdego stężenia substratu

Model Briggsa Haldane

’

a



Model oparty o założenie obecności stanu

stacjonarnego w układzie nieodwracalnym

Porównanie modeli:

1

1

'

k

k

m

K





]

[

]

[

S

m

K

S

m

V

v





]

0

[

2

E

k

m

V 

1

2

1

k

k

k

m

K







Michaelis-Menten

kiedy k

2

<< k-1,

1

2

1

'

k

k

k

m

K

m

K









]

[

'

]

[

S

m

K

S

m

V

v





]

0

[

2

E

k

m

V 

Briggs-Haldane

d[ES]/dt ≈
0

]

[

1

]

][

[

1

ES

k

S

E

k





założenie:

równanie:

Prędkość
maksymalna:

Stała:

Kinetyka reakcji z wieloma
substratami

Reakcje z kilkoma substratami można podzielić na dwie
klasy:

 Przeniesienie sekwencyjne

 Przeniesienie podwójne (reakcje ping-pong)

Reakcje z kilkoma substratami można podzielić na dwie
klasy:

 Przeniesienie sekwencyjne

 Przeniesienie podwójne (reakcje ping-pong)

Q

P

B

A









Przeniesienie sekwencyjne



W tej grupie wszystkie substraty muszą się

związać z enzymem. Jeżeli są dwa substraty to
powstaje trójskładnikowy kompleks enzymu z
obydwoma Substra- tami. Kolejność wiązania
substratów z enzymem może być uporządkowana
– czyli substraty wiążą się w ściśle określonej
kolejności lub przypadkowa.



Przykładem reakcji uporządkowanej jest przekształcenie

pirogronianu w mleczan



Pirogronian + NADH + H+ ↔ mleczan + NAD+



W uporządkowanym mechanizmie sekwencyjnym koenzym

zawsze wiąże

się jako pierwszy i dysocjuje od enzymu jako ostatni.

Diagram Clelanda:



W mechanizmie przypadkowym kolejność jest

dowolna:

Kreatyna + ATP ↔ fosfokreatyna + ADP



W reakcjach podwójnego przeniesienia jeden z
substratów jest uwalniany przed związaniem wszystkich
substratów przez enzym.



Cechą charakterystyczną jest związanie przenoszonej grupy
przez enzym i późniejsze przeniesienie jej na drugi substrat

Asparaginian + ketoglutaran ↔ glutaminian + szczawiooctan

Sekwencje zdarzeń opisuje diagram:

Enzymy allosteryczne- zbudowane z kilku podjednostek,
mające najczęściej dwa rodzaje centrów:

• Centra aktywne- decydujące o właściwościach
katalitycznych

• Centra regulatorowe (miejsca allosteryczne, efektorowe)-
zostają w nich związane związki niskocząsteczkowe zwane
efektorami lub ligandami allosterycznymi.

Przyłączenie efektora powoduje modyfikację działania enzymu.
Jest to tzw. kooperacja, będąca jedną z głównych cech
zjawiska allosterii.

Kooperacja dodatnia powoduje, że związanie jednego
reagenta zwiększa siłę wiązania następnego i w rezultacie
otrzymujemy krzywą sigmoidalną a nie hiperboliczną.

Właściwości katalityczne enzymów allosterycznych, w których
występują efekty kooperacyjne, opisuje się za pomocą dwóch
podstawowych modeli:

• sprzężonego czyli jednoprzejściowego

• sekwencyjnego

Model sprzężony- zakłada, że enzym istnieje w dwóch
stanach znajdujących się w równowadze:

• w stanie rozluźnionym R (ang. relaxed)- o silnym
powinowactwie do reagentów

• w stanie napiętym T (ang. tense)- o słabym
powinowactwie

Przejście konformacyjne pomiędzy stanami T i R zachodzi
jednocześnie we wszystkich protomerach

danej

cząsteczki enzymu i ma charakter sprzężony. Ligandy
przesuwają stan równowagi enzymu w jedną lub drugą stronę
i konformacja podjednostek zmienia się w tym samym czasie
symetrycznie- nie ma stanów hybrydowych.

Powinowactwo miejsca wiążącego dany ligand zależy od
konformacji protomeru. Pewne ligandy wiążą się
preferencyjnie z jedną konformacją oligomeru, podczas,
gdy inne ligandy- z drugą.

Związanie ligandu z jedną poszczególną konformacją
powoduje przesunięcie równowagi na korzyść konformacji,
z którą związany jest dany ligand.

W formie wolnej przeważa stan T. Równowaga R

0

 T

0

jest

więc przesunięta w prawo w kierunku formy o słabym
powinowactwie do ligandu.

L=T

0

/R

0

stała równowagi

sprzężonej

Powinowactwo reagenta A do
protomerów w stanie R i T określone
jest przez dwie stałe dysocjacji K

R

i K

T

:

[R

0

]

[A]

[R

1

]

K

R

=

[T

0

]

[A]

K

T

=

[T

1

]

K

R

/K

T

= c  współczynnik

wiązania

Kooperatywność

wiązania

substratu

zależy od wartości L i c. Krzywa
szybkości reakcji staje się bardziej
sigmoidalna, gdy wzrasta L, tj. gdy
równowaga przesunięta jest na korzyść
T i kiedy zmniejsza się wartość c,
czyli wtedy, gdy powinowactwo formy T
do substratu zmniejsza się w stosunku
do formy R.

Model

sekwencyjny-

zakłada,

że

związanie substratu (lub innego ligandu)
z jedną z podjednostek indukuje
powstawanie zmian konformacyjnych w
tej

podjednostce,

które

zmieniają

powinowactwo do substratu innych
wolnych miejsc wiążących. W efekcie
tego,

każda

związana

cząsteczka

substratu ułatwia wiązanie następnej.

Na

podstawie

właściwości

wiązania

substratów,

które

uwzględnia

model

sekwencyjny można wyprowadzić równanie:

v

0

V

max

[S]

n

K’ + [S]

n

=

Równanie to znane jest jako równanie Hilla,
gdzie:

n- liczba miejsc wiążących substrat w
cząsteczce enzymu, czyli tzw. współczynnik
interakcji Hilla;

K’-

stała

uwzględniająca

czynniki

współdziałania i stałą dysocjacji K

s

Wartość K’ jest w pewnym sensie
odpowiednikiem

Km,

ponieważ

również odnosi się ona do [S], przy
którym v = Vmax/2, ale nie
jest równa temu stężeniu (w
przeciwieństwie do Km).

k

A

= k

kat

/K

m

Stała katalityczna
enzymu k

3

, liczba obrotów

enzymu

Stała wydajności (specyficzności)-
sprawność katalityczna

Porównanie stałych specyficzności enzymu dla dwóch
różnych substratów jest miarą selektywności enzymu
wobec jednego substratu w stosunku do innego
substratu.

Dla reakcji gdzie [S]>>K

m

, k

3

jest stałą reakcji I rz.

Dla reakcji gdzie [S]<<K

m

, k

A

jest stałą reakcji II rz.

V

max

= k

3

[E

T

]



„Biochemia” J.M. Berg; J.L. Tymoczko; L. Stryer Wyd.

Naukowe PWN W-wa 2005



„Biochemia Tom I Wprowadzające wiadomości z

chemii ogólnej, składniki chemiczne ustrojów

metabolizmu (enzymy)” B. Filipowski; W.Więchowski

PWN wyd. V W-wa – Łódź 1983



„Biochemia ilustrowany przewodnik” J. Koolman;
K.H.Rochm Wyd.Lekarskie PZWL W-wa 2005



„ Chemia bioorganiczna”, P. Kafarski, B. Lejczak.



„Chemia fizyczna dla biologów. Termodynamika i
kinetyka”- G. Bartosz, Wydawnictwo Uniwersytetu
Rzeszowskiego, Rzeszów 2005



„Obliczenia biochemiczne”- A. Zgirski, R. Gondko,
PWN W-wa 1998