Kinetyka reakcji enzymatycznych:

a/ założenia Michaelisa - Menten (M-M):

• tworzenie się kompleksu enzym-substrat - E∗S

• reakcja jednosubstratowa - E + S ↔ E∗S ↔ E∗P ↔ E + P

analiza przebiegu reakcji w początkowym (v_o), bardzo krótkim przedziale czasu; tylko wówczas znamy stężenie substratu ([S_o]) i można pominąć wpływ bardzo niskiego stężenia produktu a powyższa reakcja upraszcza się do - k₁ k₂

E + S ↔ E∗S → E + P

k_-1

• stężenie molowe substratu wielokrotnie wyższe niż stężenie molowe enzymu, utrzymuje się tzw. stan stacjonarny - stałe stężenie kompleksu E∗S przy zmieniających się stężeniach substratu (maleje) i produktu (wzrasta)

b/ analiza stanu stacjonarnego - stanu zrównoważonych szybkości tworzenia i rozpadu

E∗S - prowadzi do zależności początkowej szybkości reakcji enzymatycznej (v_o)

od początkowego stężenia substratu ([S_o]):

V_max • [S_o]

v_o = K_m = k_-1 + k₂ / k₊₁ - stała M-M, V_max - szybkość maksymalna

K_m + [S_o] wykresem tej zależności v_o od [S_o] jest krzywa hiperboliczna

c/ znaczenie poszczególnych parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznej:

• K_m - określa powinowactwo substratu do enzymu; stężenie substratu, przy

  którym szybkość reakcji równa się 0.5•V_max; jednostki stężenia [=] M;

  najczęstsze wartości w zakresie stężeń µM-mM

• k₂ ≡ k_kat - stała szybkości reakcji powstawania produktu, tzw. liczba obrotów - ilość moli produktu tworzonych w jednostce czasu (s) przez jeden mol enzymu; jednostki odwrotności czasu [=] s^-1, wartości wahają się w granicach od rzędu 10⁶ do mniejszych niż 1

• V_max - maksymalna prędkość katalizowanej reakcji przy danym stężeniu enzymu - aktywność enzymu; jednostki stężenia/czas, najczęściej stosowane µM/s lub mM/s

• k_kat /K_m - najlepiej określa skuteczność enzymu, jego sprawność przy stężeniach substratu znacznie poniżej wartości K_m (odpowiada to często warunkom fizjologicznym); dla najskuteczniejszych enzymów k_kat /K_m ≈ k₁ co oznacza, że wydajność katalizowanych przez nie reakcji jest ograniczona jedynie dyfuzją cząsteczek w roztworze i nie może przekroczyć wartości 10⁸-10⁹ M^-1s^-1

• wyznaczanie wartości K_m i V_max - stosowanie odwróconej postaci zależności M-M; wyrażenie Lineweavera-Burka - 1/v_o = 1/V_max + K_m/V_max • 1/[S_o] - wykres zależności 1/v_o od 1/[S_o] to linia prosta z charakterystycznymi punktami przecięcia osi 1/[S_o] = -1/ K_m a osi 1/v_o = 1/V_max

Wyznaczanie i sposoby wyrażania aktywności enzymów - konieczność znajomości i stosowania optymalnych warunków przebiegu reakcji katalizowanej przez dany enzym:

a/ K_m - stosuje się wysycające stężenia substratów - [S] > K_m

b/ niezbędne kofaktory - indywidualny dobór rodzaju i stężeń

c/ pH - indywidualna zależność

d/ temperatura (T) - zasadniczo jednakowa zależność dla większości enzymów z

maksimum aktywności dla około 40^oC

e/ jednostki aktywności:

• jednostki międzynarodowe (IU, U): 1U to aktywność wytwarzająca 1µmol produktu/min

• katale: 1kat to aktywność wytwarzająca 1 mol produktu/s; 1katal=6•10⁷ U, 1U=16.67 nKat

Kinetyka niehiperboliczna:

• wiele enzymów nie wykazuje hiperbolicznej zależności v_o od [S_o], wykres ma najczęściej kształt sigmoidalny (przypomina krzywą wysycenia Hb tlenem) co generalnie sygnalizuje zjawisko allosterii z dodatnią kooperacją co najmniej dwóch centrów aktywnych - są to tzw. enzymy allosteryczne, zbudowane zasadniczo z wielu identycznych lub różnych podjednostek, które współpracują, kooperują ze sobą (patrz HEMOGLOBINA p. 8 i 9)

• zależność v_o od [S_o] dla enzymów allosterycznych najlepiej opisuje wyrażenie Hilla - v_o/V_max = [S_o]ⁿ/(K_0.5) ⁿ + [S_o]ⁿ - gdzie K_0.5 odpowiada K_m dla enzymów M-M, a n (n_H) to współczynnik kooperacji Hilla; gdy wartość n_H > 1 krzywa wykazuje typowy dla niemal wszystkich enzymów allosterycznych kształt sigmoidalny (wyraz kooperacji pozytywnej (patrz też Y w funkcji pO₂ dla Hb)); natomiast gdy n_H = 1 to otrzymujemy zależność M-M !; wykres Lineweavera-Burka (1/v_o od 1/[S_o]) dla enzymów allosterycznych nie jest linia prostą!

• efektory allosteryczne - inne niż substrat(y) ligandy enzymów allosterycznych, które wiążąc się do enzymu odwracalnie w miejscach innych niż centrum(a) aktywne zmieniają ich aktywność względem katalizowanej reakcji:

  - inhibitory allosteryczne - zmniejszają aktywność enzymu - krzywa

  sigmoidalna „przesuwa się w prawo” (kładzie się)

  - aktywatory allosteryczne - zwiększają aktywność enzymu - krzywa

  sigmoidalna „przesuwa się w lewo” (podnosi się)

• modele funkcjonowania enzymów allosterycznych:

- jednoprzejściowy (Monod-Wyman-Changeau) zakłada, że efektor

allosteryczny wiążąc się do jednej tylko podjednostki wywołuje analogiczne

zmiany powinowactwa i aktywności wszystkich podjednostek danego

enzymu

- sekwecyjny (Koshlanda) zakłada, że efektor allosteryczny wiążąc się do

jednej podjednostki wywołuje zmiany powinowactwa i aktywności tej

podjednostki i nic nie potrafimy powiedzieć na temat charakteru zmian

powinowactwa i aktywności pozostałych podjednostek danego enzymu

• enzymy allosteryczne ”klasy K” - efektory allosteryczne nie zmieniają szybkości maksymalnej V_max z jaką enzym katalizuje daną reakcję natomiast inhibitor allosteryczny zmniejsza aktywność takiego enzymu poprzez zwiększanie wartości K_0.5 dla substratu(ów) a aktywator allosteryczny zwiększa aktywność enzymu poprzez zmniejszenie K_0.5 - zdecydowana większość enzymów allosterycznych naturalnie funkcjonujących w żywych organizmach należy do ”klasy K”

Kontrola aktywności enzymów występująca w organizmie:

a/ zwiększenie lub zmniejszenie efektywności ekspresji genu(ów) kodującego(ych)

enzym - synteza enzymu lub jej zahamowanie (zmiana ilości enzymu)

b/ aktywacja zymogenowa - aktywacja enzymu syntetyzowanego i występującego w

postaci nieaktywnego proenzymu (zymogenu); dotyczy m.in. enzymów

proteolitycznych przewodu pokarmowego jak pepsynogen (pepsyna), trypsynogen

(trypsyna), chymotrypsynogen (chymotrypsyna), proelastaza (elastaza) czy kaskady

krzepnięcia krwi (protrombina -trombina) i polega na usunięciu różnej długości

fragmentów łańcuchów polipeptydowych tych proenzymów

c/ regulacja aktywności enzymów allosterycznych poprzez efektory allosteryczne,

których stężenia zmieniają się w trakcie przemian zachodzących w organizmie

d/ modyfikacja kowalencyjna - regulacja aktywności enzymu występującego w

komórce poprzez odwracalne, kowalencyjne przyłączanie do łańcuchów bocznych

niektórych aminokwasów czynnika modyfikującego: głównie jest to fosforylacja

grup hydroksylowych seryn, treonin lub tyrozyn ale także pierścienia imidazolowego

histydyny

Hamowanie aktywności enzymów czynnikami (inhibitory) nie będącymi naturalnymi

składnikami środowiska katalizowanych przez nie reakcji:

a/ inhibicja nieodwracalna - najczęściej kowalencyjna modyfikacja łańcuchów bocznych

aminokwasów centrum aktywnego lub katalitycznego, organizm nie posiada

enzymów, które mogłyby rozciąć tak powstałe wiązanie, stąd nosi ono charakter

trwałego i wyłącza zmodyfikowane cząsteczki enzymu z udziału w katalizie

- aspiryna (kwas acetylosalicylowy) acetyluje serynę (via grupa -OH) centrum

aktywnego cyklooksygenazy i wpływa w ten sposób na przemiany kwasu

arachidonowego i syntezę związków uczestniczących i towarzyszących

szeroko rozumianemu procesowi zapalnemu

- DFP (diizopropylofluorofosforan) i inne halogenopochodne związków

fosforoorganicznych (np. sarin - gaz bojowy czy liczne pestycydy) reagują z

grupą -OH seryny centrum aktywnego wielu hydrolaz jak np.

acetylocholinesterazy, enzymu odpowiedzialnego za hydrolizę acetylocholiny,

zahamowanie jego aktywności powoduje utrzymujące się pobudzenie

cholinergicznych zakończeń nerwowych; podobne pochodne siarczanów

organicznych jak PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu) reagują z grupami -

OH reszt seryn licznych proteaz serynowych jak np. trypsyna

- jodooctan lub amid kwasu jodooctowego reagują z grupami -SH łańcuchów

bocznych cystein obecnych w centrum aktywnym wielu enzymów; podobną

reaktywność wykazują jony metali ciężkich jak rtęci czy ołowiu (Hg⁺², Pb⁺²)

- penicylina należy do inhibitorów przypominających działanie tzw.

”substratów samobójców”- modyfikuje kowalencyjnie centrum aktywne

peptydylotransferazy glikopeptydów, której aktywność jest niezbędna licznym

szczepom bakterii dla budowania szczelnych ścian komórkowych; penicylina

jako analog ”stanu przejściowego” wiąże się efektywnie z centrum aktywnym

tego enzymu i tworzy estrowe połączenie z łańcuchem bocznym obecnej tam

seryny nie dopuszczając do budowania przez bakterie zabezpieczających je

ścian komórkowych

b/ inhibicja odwracalna - przejściowe, odwracalne wiązanie inhibitorów co prowadzi do

czasowego wyłączenia cząsteczek enzymów wiążących inhibitor z udziału w katalizie

• hamowanie kompetycyjne - inhibitor wykazuje strukturalne podobieństwo do substratu i konkuruje, współzawodniczy z nim o związanie się w centrum aktywnym (E∗): wytworzenie kompleksu z inhibitorem (E∗I) wyłącza enzymu z udziału w katalizie ale wzrost stężenia substratu usuwa efekt działania inhibitora - ↑[S] ⇒ ↑v_o , V^I_max = V_max , K^I_m = K_m•(1+ [I]/K_i) ; analiza wykresów obrazujących zależność v od [S] i 1/v od 1/[S];

  poszukiwania inhibitorów kompetycyjnych znajdują się w centrum

  zainteresowania nauk biomedycznych (na przykład metotreksat i amino-

  pteryny jako inhibitory przemian kwasu foliowego i syntezy DNA w leczeniu

  nowotworów, azaseryna jako analog kwasu glutaminowego i sulfonamidy

  jako analogi kwasu p-aminobenzoesowego stosowane w zwalczaniu infekcji

  bakteryjnych poprzez blokowanie syntezy kwasu foliowego)

• hamowanie niekompetycyjne (klasyczne) - inhibitor nie wykazuje podobieństwa do substratu i łączy się zarówno z samym enzymem (E◊I) jak i z kompleksem enzym-substrat (I◊E∗S) w innym niż substrat miejscu powodując w obu przypadkach wyłączenie enzymu z udziału w katalizie, spadek jego aktywności (szybkości maksymalnej), w tym wypadku wzrost stężenia substratu nie wpływa na efekt działania inhibitora - ↑[S] v_o , K^I_m = K_m , V^I_max = V_max/(1+ [I]/K_i); analiza wykresów obrazujących zależność v od [S] i 1/v od 1/[S]

• hamowanie akompetycyjne - inhibitor nie wykazuje podobieństwa do substratu a łączy się tylko z kompleksem enzym-substrat (I◊E∗S) w innym niż substrat miejscu powodując wyłączenie enzymu z udziału w katalizie, spadkowi aktywności enzymu (szybkości maksymalnej) towarzyszy spadek K_m co najczęściej tłumaczone jest zmniejszonym oddysocjowywaniem substratu pod wpływem inhibitora, w tym wypadku wzrost stężenia substratu zmniejsza szybkość reakcji - ↑[S] ⇒ ↓v_o , V^I_max = V_max/(1 + [I]/K_i), K^I_m = K_m/(1+ [I]/K_i); z tym typem hamowania mamy głównie do czynienia w reakcjach wielosubstratowych; analiza wykresów obrazujących zależność v od [S] i 1/v od 1/[S]

Klasyfikacja enzymów z uwzględnieniem koenzymów (grup prostetycznych):

a/ oksydoreduktazy - A_oks + B_red ⇔ A_red + B_oks - reakcje utleniania-redukcji

• dehydrogenazy - AH₂ + NAD⁺ (FAD) ⇔ A + NADH + H⁺ (FADH₂) koenzymy:

NAD⁺, rzadziej NADP⁺ - pochodne niacyny, witaminy PP (B₃)

FAD, rzadziej FMN - pochodne ryboflawiny, witaminy B₂

(przykłady - dehydrogenaza mleczanowa i bursztynianowa oraz mechanizmy

przenoszenia elektronów z udziałem tych koenzymów)

DPT (difosfotiamina) - pochodna tiaminy, witaminy B₁ , która wraz z

liponianem są niezbędnym elementem funkcjonalnym dehydrogenaz α-

ketokwasów (pirogronian, α-ketoglutaran i inne pochodne aminokwasów)

• oksydazy - AH₂ + O₂ ⇔ A + H₂O₂ ; koenzymy: FAD, FMN (przykłady - oksydaza glukozy, oksydazy L- i D-aminokwasów)

• oksygenazy:

- dioksygenazy - AH₂ + O₂ ⇔ A(OH) ₂ (niezbyt często występujące)

- monooksygenazy - AH + O₂ + NADP⁺ ⇔ A(OH) + H₂O + NAPDH

(hydroksylazy); koenzymem obok NADPH + H⁺ jest hem (cytochrom

P450, wiele reakcji przemian steroidów; procesy detoksykacji) a także

witamina C (np. reakcja hydroksylacji proliny w trakcie syntezy

kolagenu - hydroksylaza proliny)

• peroksydazy - AH₂ + H₂O₂ ⇔ A + 2H₂O ; koenzym - hem (przykład - peroksydaza glutationowa: 2GSH + H₂O₂ ⇔ GSSG + 2H₂O; enzym z selenocysteiną, uczestniczy w procesach usuwania reaktywnych form tlenu)

• katalaza - H₂O₂ + H₂O₂ ⇔ O₂ + 2H₂O; koenzym - hem (ważny enzym uczestniczący w procesach usuwania reaktywnych form tlenu)

b/ transferazy - A-B + C ⇔ A + B-C - reakcje przenoszenia fragmentów substratów

przykładem transferaz są kinazy, enzymy przenoszące resztę fosforanową (-P), której

najczęstszym donorem (kosubstratem) jest ATP- adenozynotrifosoforan: gluko- lub

heksokinaza katalizują reakcję: glukoza + ATP ⇔ glukozo-6-P + ADP

koenzymy:

DPT (difosfotiamina) - pochodna tiaminy, witaminy B₁ (transketolazy)

PLP( fosforan pirydoksalu) - pochodna pirydoksaminy, witaminy B₆

(aminotransferazy)

KoA (koenzym A) - pochodna kwasu pantoteinowego, witaminy B₅ (przenoszenie

reszt acetylowych - −CO(CH₃) i acylowych - −CO(R))

THF (tetrahydrofolian) - pochodna kwasu foliowego (przenoszenie licznych tzw.

fragmentów jednowęglowych)

metylokobalamina - pochodna cyjankobalaminy, witaminy B₁₂ (metylotransferaza

homocysteinowa)

c/ hydrolazy - A-B + H₂O ⇔ A-H + B-OH - reakcje hydrolitycznego rozczepienia

substratów: np. proteinazy i peptydazy - hydroliza wiązania peptydowego białek i

peptydów (chymotrypsyna, trypsyna, kolagenazy i inne); glikozydazy - hydroliza

wiązania glikozydowego oligo- i polisacharydów (przykładem jest lizozym); esterazy

jak choćby fosfatazy - glukozo-6-P + H₂O ⇔ glukoza + P_i (fosfataza glukozo-6-P),

nukleazy - hydroliza wiązań fosfodiestrowych w DNA i RNA czy lipazy - hydroliza

wiązań estrowych estrów kwasów karboksylowych

d/ liazy - A-B ⇔ A + B - reakcje rozczepienia lub tworzenia wiązań na innej drodze niż

hydroliza czy reakcje redoks

przykładem liaz są: dehydrataza węglanowa (Zn⁺²) - H₂O + CO₂ ⇔ HCO₃⁻ + H⁺

czy dekarboksylaza pirogronianowa, której koenzymem jest DPT (difosfotiamina)

a także liczne dekarboksylazy współpracujące z PLP (fosforanem pirydoksalu) jako

koenzymem

e/ izomerazy - A ⇔ izo-A - reakcje przekształcenia substratu w jego izomer

przykładem może być izomeraza fosfotrioz katalizująca reakcje:

aldehyd-3-fosfoglicerynowy ⇔ fosfodihydroksyaceton a także

mutaza metylomalonylo-KoA współpracująca z deoksyadenozylokobalaminą

jako koenzymem (pochodna witaminy B₁₂)

f/ ligazy - A + B + ATP ⇔ A-B + ADP + P_i - reakcje łączenia substratów (tworzenia

wiązań) w sprzężeniu z hydrolizy związku ”wysokoenergetycznego)

przykładem ligaz (zwanych czasami syntetazami) są karboksylazy współpracujące

często z biotyną jako koenzymem, jak choćby karboksylaza pirogronianowa:

pirogronian + CO₂ + ATP ⇔ szczawiooctan + ADP + P_i

Strategie katalityczne najczęściej wykorzystywane w reakcjach enzymatycznych:

a/ ogólna kataliza kwasowo-zasadowa - wykorzystanie możliwości przekazywania jonu

H⁺ pomiędzy substratem i łańcuchami bocznymi niektórych aminokwasów -

przykład hydrolitycznego rozczepiania przez rybonukleazę wiązań fosfodiestrowych

w RNA (rola histydyny) oraz przez lizozym wiązań glikozydowych w

polisacharydach ścian bakteryjnych (rola glutaminianu i asparaginianu, optimum pH)

b/ kataliza kowalencyjna - tworzenie przejściowego tetraedrycznego połączenia

enzymu z substratem (produktem) reakcji co umożliwia rozerwanie wiązania w

substracie, powstanie kowalencyjnego intermediatu enzym-substrat (produkt) i

uwolnienie ostatecznego produktu - przykład hydrolitycznego rozczepiania przez

chymotrypsynę niektórych wiązań peptydowych w białkach (centrum aktywne -

miejsce wiązania substratu; centrum katalityczne - rola triady katalitycznej

”asparaginian 102−histydyna 57−seryna 195”, nukleofilowy atak tlenu

grupy -OH ”aktywnej seryny” na węgiel wiązania peptydowego)

c/ kataliza z udziałem jonów metali - wykorzystanie jonów niektórych metali do

jonizacji H₂O i dzięki temu wytworzeniu warunków do zajścia katalizy

nukleofilowej - przykład syntezy kwasu węglowego przez dehydratazę węglanową

(liaza) z udziałem jonów Zn⁺² (rola histydyn w koordynacji jonu)oraz ataku

nukleofilowego grupy wodorotlenowej na węgiel CO₂ z ostatecznym wytworzeniem

jonu wodorowęglanowego (HCO₃⁻ ) i jonu H⁺

Wykorzystanie wiedzy o enzymach w medycynie:

a/ w diagnostyce - enzymy oznaczane (najczęściej w surowicy krwi) ze względu na

mniej lub bardziej specyficzne towarzyszenie (wzrost aktywności) schorzeniom: amylaza

trzustkowa (ostre zapalenie trzustki) , alkaliczna fosfataza (żółtaczka mechaniczna,

nowotwory kości i wątroby), aminotransferaza alaninowa - ALAT (schorzenia wątroby) i

asparaginianowa - ASPAT (niedotlenienie mięśnia sercowego, schorzenia mięśni

szkieletowych), kinaza kreatynowa^# (niedotlenienie mięśnia sercowego - CK2, dystrofia

mięśniowa - CK3), dehydrogenaza mleczanowa^# (niedotlenienie mięśnia sercowego -

LDH1 > LDH2, schorzenia nerek - LDH1, uszkodzenia mięśni, wątroby - LDH5)

^# izoenzymy - enzymy występujące w różnych formach molekularnych co jest

przeważnie wynikiem różnej kombinacji najczęściej dwóch niejednakowych

podjednostek w struktury wielopodjednostkowe katalizujące tę samą reakcję;

prowadzi to często do różnic we własnościach fizykochemicznych jak np. ruchliwość

elektroforetyczna a także w lokalizacji komórkowej lub tkankowej:

• kinaza kreatynowa (CK, CPK) - dwie różne podjednostki tworzące dimery:

M - mięśnie, B - mózg : MM - różne tkanki, MB - występuje tylko w mięśniu

sercowym, BB - głównie mózg)

katalizuje reakcję - kreatyna + ATP ⇔ fosfokreatyna + ADP

• dehydrogenaza mleczanowa (LDH) - dwie różne podjednostki tworzące

tetramery: H - mięsień sercowy, M - wątroba i mięsień szkieletowy: H4

(LD1) - mięsień sercowy i erytrocyty; H3M (LD2) - mięsień sercowy i

erytrocyty; H2M2 (LD3) - mózg, nerki; HM4 (LD5) - wątroba, mięsień

szkieletowy

katalizują reakcję - mleczan + NAD⁺ ⇔ pirogronian + NADH + H⁺

b/ w terapii - poznanie kinetyki i mechanizmu reakcji enzymatycznej coraz częściej pozwala

na skuteczne ingerowanie w jej przebieg przez stosowanie np. precyzyjnie

dopasowanych inhibitorów kompetycyjnych, analogów stanu przejściowego lub

”substratów samobójców” - przykładami mogą być wspomniane wyżej leki-inhibitory jak

penicylina, metotreksat, azaseryna czy sulfonamidy (punkt 5) a także wykorzystanie

allopurynolu w leczeniu skazy moczanowej (Dna) oraz leczenie nadciśnienia tętniczego

m.in. takimi inhibitorami enzymu konwertującego angiotensynę I (ACE) jak kaptopril

czy enalapril