Monika Wrońska

Daria Świerczyńska

Dawid Piątkowski

LABORATORIUM Z BIOCHEMII.

ĆWICZENIE 6

Kinetyka reakcji enzymatycznych

Data wykonania ćwiczenia: 13 .04.2011 r.

Data oddania sprawozdania: 20.04.2011 r.

Semestr IV

Grupa V

Środa 14¹⁵- 18⁰⁰

Kinetyka enzymów opisuje mechanizmy wiązania substratów przez enzymy oraz ich przekształcania w produkty. Dane wykorzystywane do analizy kinetycznej pochodzą z reakcji enzymatycznych przeprowadzonych w kontrolowanych warunkach umożliwiających śledzenie zmieniających się parametrów w czasie.

W 1902 roku Victor Henri^[62] zaproponował kwantytatywną teorię kinetyki enzymów, ale wyniki jego badań okazały się nieprzydatne, ponieważ zaniedbał on wpływ stężenia jonów wodorowych (pH). Dopiero kilka lat później, w 1909 roku, Peter Lauritz Sørensen zdefiniował logarytmiczną skalę pH oraz zaproponował koncepcję roztworów buforowych^[63]. Niemiecki chemik Leonor Michaelis i jego kanadyjska współpracowniczka odbywająca staż podoktorski Maud Leonora Menten, powtórzyli wtedy eksperymenty, które przeprowadzał Henri i zaproponowali prosty model kinetyki aktywności enzymatycznej znany jako kinetyka Henri-Michaelis-Menten (znany również jako kinetyka Michaelis-Menten^[64]). Ich dzieło rozwinęli później G. E. Briggs i J. B. S. Haldane, których równania kinetyki aktywności enzymatycznej są do dziś używane w niezmienionej formie^[65].

Głównym założeniem jakie podał Henri, był dwuetapowy przebieg reakcji katalizowanej przez enzymy. W pierwszym etapie substraty wiążą się odwracalnie z enzymem, tworząc ze stałą szybkości k₁, kompleks enzym-substrat (ES), nazywany czasem kompleksem Michaelisa. W następnym etapie, kompleks ten może się rozpaść na dwa różne sposoby. Może dysocjować do E i S ze stałą szybkości k_-1 lub może dojść do chemicznej zmiany substratów i uwolnienia produktów ze stałą szybkości k₂, przy czym zakłada się, że produkt reakcji nie może ulec powrotnemu przekształceniu w wyjściowy substrat. Wyrażenie wiążące szybkość katalizy ze stężeniem substratu i enzymu oraz z szybkościami poszczególnych etapów reakcji nazywamy równaniem Michaelisa-Menten:

Krzywa wysycenia dla reakcji enzymatycznej ukazująca zależność szybkości reakcji (V) od stężenia substratu ([S])

gdzie: V₀ – szybkość początkowa, S – stężenie substratu, K_m – stała Michaelisa-Menten.

Enzymy mogą katalizować powyżej kilku milionów reakcji na sekundę, gdzie te same reakcje bez ich obecności mają czasy połowicznej przemiany substratu, tzn. czas w jakim pod nieobecność enzymu, połowa dostępnego substratu zostanie zużyta, kilkanaście rzędów wielkości dłuższy (21 rzędów wielkości to najwyższe znane przyspieszenie reakcji enzymatycznej, z tryliona lat do dziesiątek milisekund^[66]). Przykładem jest reakcja katalizowana przez dekarboksylazę orotydyno 5'-monofosforanu. Czas połowicznej przemiany reakcji nieenzymatycznej wynosi 78 mln lat, a czas połowicznej przemiany tej samej reakcji, ale z udziałem dekarboksylazy orotydyno 5'-monofosforanu, wynosi 25 milisekund^[67]. Bezpośrednia szybkość z jaką działają enzymy zależy od stężenia substratów w roztworze (dodatkowo szybkość enzymów zależy od ogólnych parametrów fizykochemicznych środowiska, tak jak w przypadku aktywności każdego białka, patrz: Aktywność a parametry środowiska). By znaleźć maksymalną szybkość reakcji katalizowanej enzymatycznie, określa się ilość tworzonego produktu w funkcji czasu, przy stopniowym zwiększaniu stężenia substratu, ale jednoczesnym zachowaniu innych warunków, do momentu, w którym dalszy wzrost jego stężenia nie powoduje dalszego przyśpieszania reakcji. Szybkość początkowa w takim eksperymencie (V₀), rośnie do wartości maksymalnej (V_max) i nie przekracza jej mimo dalszego wzrostu stężenia substratu. W chwili osiągnięcia stanu równowagi (reakcji katalizowanej ze stałą szybkości k₂ i reakcji do niej przeciwnej zachodzącej ze stałą szybkości k_-2), nie obserwujemy zmiany netto stężenia substratów i produktów. Zależność szybkości reakcji od stężenia substratu dla prostej reakcji wg kinetyki Michaelisa-Menten, przy założeniu, że kompleks ES jest koniecznym etapem pośrednim procesu katalitycznego, przedstawia krzywa Michaelisa-Menten. Wysycanie enzymu substratem (zbliżanie się do szybkości maksymalnej) oznacza, że maleje liczba wolnych cząsteczek enzymu, gdyż rośnie ilość tych związanych w kompleksie z substratem (ES). Osiągana asymptotycznie maksymalna szybkość (V_max) reakcji enzymatycznej, oznacza, że praktycznie wszystkie miejsca aktywne enzymu (wolne enzymy) zostają wysycone substratem, a wówczas suma ilości (stężenie) kompleksów ES jest miarą ilości samego enzymu. Niemniej jednak, V_max jest tylko jedną stałą kinetyczną opisującą enzym. Inną jest ilość substratu (stężenie) potrzebne do osiągnięcia ustalonej szybkości reakcji. Zwykle używa się do tego celu stałej Michaelisa-Menten (K_m), która jest takim stężeniem substratu przy którym szybkość reakcji osiąga połowę swojej maksymalnej wartości. Każdy enzym ma swoją charakterystyczną wartość K_m dla danego substratu, która charakteryzuje również siłę wiązania substratu w miejscu aktywnym enzymu. Inną użyteczną stałą jest szybkość katalizy (k_kat), która jest liczbą obrotów jednego miejsca aktywnego enzymu w czasie jednej sekundy (liczba reakcji przeprowadzana przez jedno miejsce aktywne w czasie jednej sekundy).

Innymi jednostkami używanymi do opisu aktywności enzymów są: jednostka enzymu (U), czyli taka ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 μmola substratu w czasie 1 minuty w temperaturze 30 °C i określonym pH oraz katal (kat), czyli ilość enzymu katalizująca przemianę 1 mola substratu w czasie 1 sekundy. Dodatkowo dla niektórych enzymów używa się jednostek umownych, definiowanych przez zastosowany pomiar aktywności. Na przykład przyrost absorbancji światła o danej długości fali w danej jednostce czasu, gdy wynikiem reakcji enzymatycznej jest barwny produkt. W preparatyce biochemicznej dodatkowo używa się aktywności właściwej, która określa liczbę jednostek enzymu (lub jednostek umownych aktywności) przypadających na 1 mg białka (w danym preparacie)^[68].

W sytuacji, gdy stężenie substratu znacznie przewyższa K_m, szybkość katalizy jest równa k_kat, liczbie obrotów. Jednak w warunkach fizjologicznych, większość enzymów nie jest wysycona substratem, zatem stosunek [S]/K_m mieści się w granicach od 0,01 do 1,0. Gdy stężenie substratu ([S]) jest dużo mniejsze od K_m ([S]<<K_m), wówczas szybkość katalizowanej reakcji jest znacznie mniejsza od k_kat, ponieważ większość miejsc aktywnych nie jest zajęta. Do scharakteryzowania kinetyki enzymów w tych warunkach służy równanie V₀=k_kat/K_m[E][S], powstałe z połączenia dwóch innych równań: V₀=k₂ [ES] oraz [ES]=[E][S] / K_m. W przedstawionej sytuacji, gdy [S]<<K_m to stężenie wolnego enzymu jest niemal równe całkowitemu stężeniu enzymu. W tych warunkach stosunek k_kat/K_m jest stałą szybkości oddziaływania S i E i może być użyty jako miara wydajności katalitycznej. Ponieważ stosunek k_kat/K_m odzwierciedla zarówno powinowactwo chemiczne, jak i zdolność katalityczną, jest używany do porównywania różnych enzymów względem siebie lub preferencji jednego enzymu do różnych substratów. W sytuacji, gdy szybkość tworzenia produktu (k_kat) jest znacznie szybsza niż szybkość dysocjacji kompleksu ES, wartość k_kat/K_m zbliża się do wartości stałej tworzenia kompleksu ES. Z tego wynika, że górna granica wartości k_kat/K_m jest ograniczana przez szybkość tworzenia kompleksu ES, która nie może być większa niż częstość z jaka spotykają się enzym i jego substrat na skutek dyfuzji. Częstość ta mieści się w granicach od 10⁸ do 10⁹ (M^-1 s^-1) i jest to jednocześnie górna granica k_kat/K_m. W tym punkcie, każde zderzenie enzymu z jego substratem będzie powodowało katalizę i szybkość formowania produktu nie jest limitowana przez szybkość reakcji ale przez szybkość dyfuzji. Enzymy posiadające tą własność nazywamy katalitycznie perfekcyjnymi lub kinetycznie perfekcyjnymi. Przykładami takich enzymów są: izomeraza triozofosforanowa, anhydraza węglanowa, esteraza acetylocholinowa, katalaza, fumaraza, β-laktamaza i dysmutaza ponadtlenkowa^[58].

Kinetyka niektórych enzymów charakteryzuje się szybkością większą od teoretycznej szybkości dyfuzji. Jest to możliwe, gdyż wiązanie substratów przez enzym (krok limitowany przez szybkość dyfuzji) i tworzenie kompleksu ES są wspomagane dodatkowymi efektami niezależnymi od samej dyfuzji. Niektóre białka enzymatyczne aktywnie przeorientowują substraty za pomocą pól elektrycznych generowanych przez cząsteczki (reszty) dipolowe. Inne opierają się na kwantowym zjawisku tunelowym, w którym proton lub elektron może pokonać barierę potencjału o energii większej niż jego energia, nie przez "przeskakiwanie nad barierą", a przez "przebijanie się przez nią", chociaż dla protonu ten model wciąż jest przedmiotem dyskusji^[69][70]. Jakkolwiek zjawisko tunelowania zostało zaobserwowane w reakcji utleniania tryptaminy przez dehydrogenazę amin aromatycznych (ang. aromatic amine dehydrogenase, AADH)^[71].

2. Część doświadczalna:

Odczynniki, materiały i sprzęt:

• preparat beta-fruktofuranozydazy z drożdży (inwertazy)

• roztwory sacharozy w 0,1M buforze sodowo-octanowym o pH 4,7 o stężeniach: 31,2mM ; 62,5mM ; 125mM ; 250mM

• 0,1M bufor sodowo-octanowy o pH 4,7

• 1% alkaliczny roztwór kwasu 3’5’-dinitrosalicylowego (DNS)

• Probówki ze statywem, pipety, stoper, forokalorymetr

Przygotowanie prób właściwych:

Każdą z prób właściwych przygotowaliśmy w dwóch powtórzeniach, celem obliczenia średniej A_540. Do 0,5 ml roztworu enzymu dodawaliśmy 0,5 ml roztworu sacharozy o określonym stężeniu. Po wymieszaniu mieszaniny reakcyjnej inkubowaliśmy ja przez określony czas w określonej temperaturze. Reakcję hydrolizy przerywaliśmy dodając 1 ml DNS, a po wymieszaniu próby umieszczaliśmy ją na 5min we wrzącej łaźni wodnej. Następnie próby schładzaliśmy w zimnej wodzie i uzupełnialiśmy 8 ml wody destylowanej. Po dokładnym wymieszaniu dokonywaliśmy pomiaru absorbancji przy 540 nm wobec próby odczynnikowej.

Przygotowanie próby odczynnikowej:

Wykonaliśmy tylko jedną próbę odczynnikową, która nam służyła do wszystkich doświadczeń. Do 0,5 ml wody destylowanej dodaliśmy 0,5 ml DNS, wymieszaliśmy i inkubowaliśmy przez 5min we wrzącej łaźni wodnej. Po schłodzeniu dodaliśmy 4 ml wody destylowanej i zastosowaliśmy do kalibracjo spektrofotometrycznej.

1. Doświadczenie I:

Cel: Określenie przedziału czasu, w którym reakcja rozkładu sacharozy pod wpływem beta-fruktofuranozydazy ma charakter zerowego rzędu, czyli wyznaczenie krzywej progresji reakcji i obliczenie początkowej szybkości reakcji.

Przygotowanie próby właściwej: Do 6 probówek odmierzyliśmy po 0,5 ml 250mM roztworu sacharozy. Następnie dodawaliśmy w równych odstępach czasu po 0,5 ml roztworu enzymu i inkubowaliśmy tak przygotowane mieszaniny reakcyjne w temperaturze pokojowej w ciągu odpowiednio: 5, 10, 20 minut (po dwie probówki do każdego podanych czasów). Po upływie kolejnych czasów reakcji przerwaliśmy hydrolizę sacharozy dodając po 1 ml roztworu DNS. Po wymieszaniu zawartości probówek, inkubowaliśmy je w ciągu 5min we wrzącej łaźni wodnej, schłodziliśmy w zimnej wodzie, dodaliśmy 8 ml wody destylowanej i zmierzyliśmy A₅₄₀ prób wobec wcześniej przygotowanej próby kontrolnej.

Tabela 1. Wyniki A₅₄₀ badanych prób.

Czas [min]	Pomiary
	Nr.I
5	0,207
10	0,411
20	0,802

Na podstawie deltaA₅₄₀ obliczamy przyrost stężenia substratu cukrów redukujących uwolnionych w różnym czasie reakcji oraz odpowiadającą im szybkość reakcji enzymatycznej:

Wykres 1. v = f(t_rakcji).

Dla 5 minut:

A₅₄₀= $\frac{0,207 + 0,222}{2} = 0,2145$

0, 1 − 0, 55 ∖ n0, 2145 − x₁

X₁ = 1,179 [μmol cuk. red./ ml]

P₁ = X₁ * 2= 2,358

Dla 10 minut:

A₅₄₀=$\frac{0,411 + 0,393}{2} = 0,402$

0, 1 − 0, 55 ∖ n0, 402 − x₂

X₂ = 2,211 [μmol cuk. red./ ml]

P₂ = X₂ * 2= 4,422

Dla 20 minut:

A₅₄₀=$\frac{0,802 + 0,838}{2} = 0,82$

0, 1 − 0, 55 ∖ n0, 82 − x₂

X₃ = 4,51 [μmol cuk. red./ ml]

P₃ = X₃ * 2= 9,02

$$V_{0} = \ \frac{P_{1} - \ P_{0}}{\tau_{1} - \ \tau_{0}} = \ \frac{1 - 0}{2,4 - 0} = 0,42\ \lbrack\frac{\text{μmol}}{ml*min}\rbrack$$

Obliczamy aktywność preparatu beta-fruktofuranozydazy dla 10 minut:

Stężenie roztworu enzymu wynosi 0,02 [mg/ml]

$$A = \ \frac{x}{10*0,02} = \ \frac{2,211}{0,2} = 11,055\ \lbrack\mu mol\ substratu/\min{*mg\rbrack}$$

Wnioski:

1. Doświadczenie II:

Cel: Wyznaczenie wpływu stężenia substratu na szybkość reakcji enzymatycznej.

Przygotowanie próby właściwej: Do 8 probówek odmierzyliśmy kolejno po 0,5 ml roztworu sacharozy o stężeniu 31,2 ; 62,5 ; 125 ; 250 mM ( w dwóch powtórzeniach). Następnie w równych odstępach czasu dodawaliśmy do każdej probówki po 0,5 ml roztworu beta-fruktofuranozydazy i natychmiast dokładnie mieszaliśmy. Tak przygotowane mieszaniny inkubowaliśmy w temperaturze pokojowej w ciągu 10min od momentu rozpoczęcia reakcji, czyli od momentu dodania roztworu enzymu do substratu. Po 10min reakcji dodaliśmy do każdej probówki po 1 ml roztworu DNS. Po dokładnym wymieszaniu inkubowaliśmy 5 min we wrzącej łaźni wodnej, po czym schłodziliśmy pod wodą, dadaliśmy 8 ml wody destylowanej, dokładnie wymieszaliśmy i zmierzyliśmy A₅₄₀ prób wobec próby odczynnikowej.

Tabela 2. Wyniki A₅₄₀ badanych prób.

Stężenia [Mm]	Pomiary
	Nr.I
31,2	0,142
62,5	0,217
125	0,303
250	0,290

Wyniki znajdujące się w nawiasach znacznie odbiegają od reszty, dlatego pominiemy je w obliczeniach.

Na podstawie wartości A₅₄₀ obliczamy deltaA₅₄₀ i ustalamy przyrost stężenia cukrów redukujących w każdej z mieszanin reakcyjnych:

Obliczamy dla każdego ze stężeń sacharozy szybkość reakcji katalizowanej przez enzym (v_o):

Wykres 2. v _o = f(S _sacharozy)

Wykres3. 1/v = f(1/S _sacharozy)

K_m =

Wnioski:

1. Doświadczenie III:

Cel: Wyznaczenie wpływu stężenia enzymu na szybkość reakcji enzymatycznej.

Przygotowanie prób właściwych: Do 6 probówek odmierzyliśmy kolejno po 0,5 ml każdego z czterech wcześniej odpowiednio przygotowanych roztworów enzymu (w dwóch powtórzeniach). Następnie w równych odstępach czasu dodawaliśmy po 0,5 ml 250mM roztworu sacharozy, wymieszaliśmy i przeprowadzaliśmy enzymatyczną hydrolizę sacharozy w temperaturze pokojowej w ciągu 10 min od chwili dodania enzymu do substratu. Reakcję zakończyliśmy dodając do probówek po 1 ml roztworu DNS. Po wymieszaniu próbek inkubowaliśmy je przez 5 min we wrzącej łaźni wodnej, po czym schłodziliśmy ich zawartość pod wodą i dodaliśmy 8 ml wody destylowanej, a następnie zmierzyliśmy A₅₄₀ wobec próby odczynnikowej.

Tabela 3. Wyniki A₅₄₀ badanych prób.

Stężenia [Mm]	Pomiary
	Nr.I
250	0,473
125	0,234
62,5	0,120

Obliczamy przyrost stężenia cukrów redukujących w każdej z mieszanin reakcyjnych oraz początkową szybkość reakcji (v_o):

Wykres 3. V _o = f(E)

Wnioski: