Zaplanowanie reakcji trawienia restrykcyjnego badanego genu i plazmidu

- enzym SalI wytnie większy fragment MCS, jednak enzymy te nie będą miały wtedy 100% aktywności w jednym buforze. Zdecydowałam, więc, że enzym EcoRI również wytnie stosunkowo duży fragment MCS a będzie miał z enzymem XhoI 100% aktywność w buforze 2XTango.

oba wybrane enzymy restrykcyjne wpisałam do programu Double Digest. Buforem, w którym oba z nich mają 100% aktywność jest bufor 2XTango.

Inkubacja w 37°C.

Oznacza to, że bufor ten jest 10x stężony, a ja mam uzyskać na końcu stężenie w reakcji 2x

Osobno w 2 ependorfkach przygotowujemy reakcje dla wstawki i dla wektora (plazmidu). Pomimo ze enzym nie tnie wstawki ale przygotowuje końce.

Reakcję planują na 20µl dla wstawki:

- buforu: 4 µl

- enzymu XhoI: 0,1 U/ µg DNA [ na stronie Life Technologies jest że 10U na 1 µl]

- enzymu EcoRI: 0,2 U/ µg DNA [tak samo]

- plazmid: 1 000 ng = 1 µg

- uzupełnienie MiliQ do 20 µl

Reakcja dla plazmidu:

- buforu: 4 µl

- enzymu XhoI: 0,1 x 2,5 = 0,25 U/ µg

- enzymu EcoRI: 0,2 x 2,5 = 0,5 U/ µg

- wstawka: 1 000 ng = 1 µg

- woda do 20 µl

37st na całą noc

Jednostki enzymów są podane w tabeli wyżej ;)

1. Zaplanowanie reakcji ligacji w celu połączenia sekwencji badanego genu i plazmidu z genem białka fluorescencyjnego

- XhoI zostawia lepkie końce

- EcoRI zostawia lepkie końce

Użyję ligazy DNA T4 (5 Weiss U/ µl ) z uwagi na to, że jest dostępna i popularna oraz łączy lepkie końce

Temp. 14-16st C

Stosunek molarny ilości plazmidu do wstawki: 1:1

Ilość jednostek ligazy na reakcję:

Wielkość plazmidu: 4 700 bp

Wielkość genu: 3081 bp

Ile insertu wrowadzic w stosunku do wektora;

*We wzorze używamy 50 ng wektora

(50 x 3081)/4700 x 3:1 = 98,33 ng wstawki

Planowanie reakcji ligacji:

- 50 ng plazmidu i 98,33 ng wstawki

- stosunek 3:1

- ligazy 1 U

- wody do dopełnienia.

16 stC na całą noc (pomimo, ze napisali w protokole inaczej) – najbardziej efektywnie

Enzymy, które nie tną wstawki (bialka)