Reakcja Millona

Do probówki zawierającej 2 ml roztworu białka lub tyrozyny dodawać kroplami odczynnik Millona. Odczynnik Millona otrzymywany jest przez rozpuszczenie 100 gramów rtęci metalicznej w 140 mililitrach stężonego kwasu azotowego HNO₃. Reakcji towarzyszy wydzielanie dużej ilości rudo zabarwionego gazu, dlatego odczynnik należy przygotowywać pod wyciągiem. Reakcja Millona jest charakterystyczna dla tyrozyny. Roztwór zabarwia się na czerwono. W przypadku białek zawierających tyrozynę powstają pomarańczowe lub czerwone strąty. Następuje reagowanie jonów rtęciowych ze słabo kwaśną grupą fenolową. Należy pamiętać, że dodatnią reakcję z odczynnikiem Millona dają fenole. Jest to tzw. rtęciowanie pierścienia fenolowego. Odczynnik Millona zawiera azotan rtęciowy, azotan rtęciawy i wolny kwas azotowy.

Wiązanie peptydowe - umowna nazwa wiązania amidowego występującego między aminokwasami peptydów i białek. Wiązanie peptydowe łączy grupę α-aminową jednego aminokwasu z grupą α-karboksylową drugiego aminokwasu.

Wiązanie peptydowe

Występuje ono w dwóch formach izomerycznych: cis i trans. W wiązaniu peptydowym wyróżnić można dwie formy mezomeryczne (rezonansowe), nadające wiązaniu węgiel-azot częściowy charakter wiązania podwójnego. Efekt ten wzmacnia siłę wiązania oraz silnie hamuje rotację wokół wiązania C-N, dzięki czemu wiązanie jest płaskie. Możliwa natomiast jest rotacja wokół wiązań z grupami bocznymi.

Formy mezomeryczne wiązania peptydowego

Aminokwasy połączone wiązaniami peptydowymi tworzy oligopeptydy (umownie, do 10 reszt aminokwasowych), polipeptydy (do 100 reszt) oraz białka (powyżej 100 reszt).

Najczęściej obiema cząsteczkami są α-aminokwasy naturalne. Polimery naturalne powstałe z połączenia aminokwasów wiązaniami peptydowymi to białka. Wiązania peptydowe występują też w polimerach syntetycznych zwanych poliamidami, w tym przypadku jednak identyczne chemicznie wiązania są nazywane wiązaniami amidowymi.

Fragment białka z zaznaczonym na niebiesko wiązaniem peptydowym

Wiązanie peptydowe tworzą też często łańcuchy boczne aminokwasów w białkach, takich jak lizyna, z cząsteczkami przyłączonymi do białka (koenzymami).

Połączenie lizyny białka z kwasem liponowym

Reakcja biuretowa (reakcja Piotrowskiego[1]) – charakterystyczna reakcja chemiczna pozwalająca na wykrywanie wiązań peptydowych w rozmaitych związkach organicznych, głównie w białkach i peptydach. Warunkiem koniecznym dla pozytywnego wyniku próby jest występowanie co najmniej dwóch wiązań peptydowych bezpośrednio obok siebie lub przedzielonych nie więcej niż jednym atomem węgla. Nazwa testu pochodzi od najprostszego związku, który ulega tej reakcji, a mianowicie biuretu, czyli dimeru mocznika (NH2CONHCONH2)[2].

Spis treści

1 Historia

2 Opis testu

3 Zastosowanie w medycynie

4 Przypisy

Historia

Reakcja biuretowa została opisana po raz pierwszy w roku 1833 przez Ferdinanda Rosego[3]. W roku 1857 opisał ją niezależnie polski fizjolog Gustaw Piotrowski[4] i od jego nazwiska pochodzi nazwa alternatywna testu, reakcja Piotrowskiego.

Opis testu

Test biuretowy polega na dodaniu do analizowanej mieszaniny roztworu silnej zasady (NaOH lub KOH) oraz siarczanu miedzi(II). Jeżeli w roztworze obecne są związki zawierające bliskie wiązania peptydowe, to roztwór zmienia barwę z niebieskiej na fioletową (λmax = 505 nm). Jest to spowodowane powstawaniem anionowych związków kompleksowych[2], w których jon Cu2+ jest kompleksowany przez minimum dwie grupy peptydowe. W przypadku reakcji biuretu z miedzią(II), wyizolowano krystaliczny kompleks K2[Cu(NHCONHCONH)2]·4H2O i rentgenograficznie ustalono jego dokładną budowę[2].

W przypadku występowania dimerów aminokwasów, w których występuje tylko jedno wiązanie peptydowe układ zabarwia się na różowo. Wolne aminokwasy nie zmieniają barwy roztworu.

Test może być stosowany zarówno w analizie jakościowej, jak i ilościowej. W tym drugim przypadku wykorzystuje się liniową zależność zmiany barwy od stężenia protein, a ściślej biorąc od liczby podwójnych wiązań peptydowych, którą ustala się kolorymetrycznie oraz stosuje odczynnik biuretowy, np: 7,5 g CuSO4·5H2O, 100 ml 50% NaOH, 25 g winianu sodowo-potasowego oraz taka objętość wody aby uzyskać 1 dm3 roztworu.

Zastosowanie w medycynie

Test ten jest powszechnie stosowany do sprawdzania obecności wolnego białka we krwi i innych płynach ustrojowych człowieka i zwierząt. Występowanie dużych ilości takiego białka wskazuje zwykle na uszkodzenia organów wewnętrznych, np: na marskość wątroby. Test nie działa poprawnie w przypadku występowania w środowisku reakcji znacznego stężenia jonów potasu, stąd nie można go stosować na przykład do testowania soków owocowych na zawartość białka.