PRECYPITACJA W ŚRODOWISKU PŁYNNYM
ODCZYN PRECYPITACJI PIERŚCIENIOWEJ
Najprostszy odczyn precypitacji jakościowej
wykonanie: w probówkach lub rurkach kapilarnych
jest mało czuła (przy małym stężeniu nie zadziała)
antygeny białkowe rozpuszczalne w H2O
Do wykonanie potrzebne są:
Wzorcowy roztwór Ag
Badany roztwór Ag
Wzorcowa surowica odpornościowa
0.15 M roztwór NaCl
I probówka: surowica wzorcowa odpornościowa, wzorcowy roztwór Ag KONTROLA DODATNIA
II probówka: surowica wzorcowa odpornościowa, 0,15 M roztwór NaCl KONTROLA UJEMNA
III probówka: surowica wzorcowa odpornościowa, badany roztwór Ag PRÓBA BADANA
W kontroli dodatniej pojawia się pierścień precypitat na granicy
ZASTOSOWANIE:
W medycynie sądowej - poszukiwanie wstępne krwi ludzkiej, pochodzenie plam krwi np. morderstwa
W mikrobiologii – klasyfikacja bakterii, wykrywanie antygenów bakteryjnych w tkankach
Wykrywanie obcych białek w fałszowanych produktach spożywczych
ODCZYN FLOKULACYJNY (VDRL)
antygen kardiolipinowy podobny do antygenów chorób ma te same epitopy co krętek blady (KIŁA!!) (alkoholowy roztwór kardiolipinowy de novo), przygotowuje się go mieszając buforowany 0,15 M roztwór NaCl z alkoholowym roztworem kardiolipinowym
próbę wykonuje się na szkiełku Lindnera
precypitaty tworzą luźne kłaczki
szkiełka intensywnie wstrząsamy
wynik około po 4 minutach
Do wykonania potrzebne są:
Surowica ujemna
Surowica dodatnia
Surowica badana (musi być wcześniej inaktywowana)
Antygen kardiolipinowy
szkiełko I surowica dodatnia, antygen kardiolipinowy KONTROLA DODATNIA
szkiełko II surowica ujemna, antygen kardiolipinowy KONTROLA UJEMNA
szkiełko III surowica badana, antygen kardiolipinowy PRÓBA BADANA
ZASTOSOWANIE:
-diagnostyka kiły
POJEDYNCZA IMMUNODYFUZJA PŁYTKOWA – IMMUNODYFUZJA RADIALNA WG METODY MANCINIEGO
przeciwciała są unieruchomione w żelu agarowym, antygen dyfunduje
Do wykonania potrzebne są:
przeciwciała o danej swoistości
płynny agar
roztwór badanego antygenu
roztwór antygenu o znanym stężeniu
przeciwciała o odpowiednim stężeniu + płynny agar wylać na płytkę
po zastygnięciu wycinamy studzienki
studzienki wypełniamy roztworem badanego antygenu
dyfuzja antygenu do agaru powstaje kompleks immunologiczny:
blisko studzienek duże stężenie antygenu kompleks rozpuszczalny
dalej od studzienki małe stężenie antygenu kompleks nierozpuszczalny
Wynik:
- pierścienie wokół studzienek
- im większe stężenie antygenu tym większa średnica pierścienia przy stałym stężeniu przeciwciał
- stężenie badanego antygenu wylicza się porównując ze stężeniem znanego antygenu
ZASTOSOWANIE:
- w praktyce klinicznej do oceny stężenia białek w surowicy i płynach ustrojowych
- oznaczenie poziomu immunoglobulin (M, G, E)/ mała wartość diagnostyczna
- oznaczenie stężenia podklas IgG
- oznaczenie stężenia składowych dopełniacza i innych białek
IMMUNOELEKTROFOREZA WG METODY SCHEIDEGGERA
połączenie elektroforezy z podwójną immunodyfuzją
na szkiełkach przedmiotowych z żelem agarowym
Do wykonania potrzebne są:
antysurowica z przeciwciałami
surowica kontrolna
surowica badana
wycinamy studzienki na szkiełkach z agarem
dodajemy do jednego surowicę kontrolną a do drugiego surowicę badaną (pacjenta)
poddajemy elektroforezie i następuje rozdział białek surowicy na poszczególne frakcje
wycinamy rowek w agarze i dodajemy do niego antysurowicę z przeciwciałami
inkubujemy w temp. pokojowej przez 24-48 godz. (immunodyfuzja)
Wynik:
- widoczne linie precypitacyjne zwykle w kształcie łuków
- oceniamy :
~ obecność lub brak linii precypitacyjnej
~ szerokość, kształt, położenie łuku
~ ostrość linii
~ intensywność barwy precypitatu
~ pojawienie się łuków dodatkowych
ZASTOSOWANIE:
- wykrywanie zaburzeń w syntezie białek
- ocena składu białek surowicy ludzkiej
- rozpoznanie niedoborów odpornościowych (brak linii prcypitacyjnej)
- rozpoznawanie nadprodukcji niektórych białek (pogrubione linie precypitacyjne)
- metoda identyfikacji białek Bence-Jonesa w moczu (szpiczak mnogi)
AGLUTYNACJA
-antygen upostaciowany (jest częścią czegoś większego)
-antygen jest większy, mogą się odpychać na zasadzie ładunków elektrostatycznych-jednoimiennych
-bardziej czuła
-zależne pH, temperatura, siła jonowa roztworu
AGLUTYNACJA BEZPOŚREDNIA (CZYNNA)
METODA SZKIEŁKOWA
metoda jakościowa
na szkiełkach przedmiotowych lub z łezką
Do wykonania potrzebne są:
zawiesina badanego aglutynogenu
surowica zawierająca swoiste przeciwciała (zinaktywowana)
0,85 % roztwór NaCl
I SZKIEŁKO: zawiesina badanego aglutynogenu, kropla surowicy zawierającej swoiste przeciwciała PRÓBA BADANA
II SZIEŁKO: zawiesina badanego aglutynogenu, kropla 0,85% roztworu NaCl PRÓBA KONTROLNA
Wynik:
- odczytujemy makroskopowo lub pod lupą na dnie kropli wyraźny strąt
DO OZNACZANIA GRUP KRWI W ZAKRESIE UKŁADU AB0 (AB0 na wszystkich komórkach)
Do wykonania potrzebne są:
5% zawiesina badanych erytrocytów w 0,85% roztworze NaCl
Surowica wzorcowa anty-A
Surowica wzorcowa anty-B
Surowica wzorcowa anty-A anty- B
Zawiesina erytrocytów wzorcowych grupy A
Zawiesina erytrocytów wzorcowych grupy B
Zawiesina erytrocytów wzorcowych grupy 0
Surowica badana
PRÓBY BADANE:
SZKIEŁKO I: Surowica wzorcowa anty-A + kropla 5% zawiesiny badanych erytrocytów w 0,85% roztworze NaCl
SZKIEŁKO II: Surowica wzorcowa anty-B+ kropla 5% zawiesiny badanych erytrocytów w 0,85% roztworze NaCl
SZKIEŁKO III: Surowica wzorcowa anty-A anty- B+ kropla 5% zawiesiny badanych erytrocytów w 0,85% roztworze NaCl
SZKIEŁKO Ia: Zawiesina erytrocytów wzorcowych grupy A Rh(-) + Surowica badana
SZKIEŁKO IIa: Zawiesina erytrocytów wzorcowych grupy B Rh(-) + Surowica badana
SZKIEŁKO IIIa: Zawiesina erytrocytów wzorcowych grupy 0 Rh(-) + Surowica badana
Równolegle wykonuje się próby kontrolne
Wynik:
- odczytujemy po 5-8 min
- obecność lub brak hemaglutynacji
ZASTOSOWANIE:
- identyfikacja antygenów powierzchniowych
- głównie diagnostyka mikrobiologiczna (identyfikacja szczepu bakteryjnego wyizolowanego od pacjenta np. odczyn Fletschera w diagnostyce leptospirozy) Salmonella typhi lub paratyphi (S. typhi wywołuje dur brzuszny tyfus; S. paratyphi niegroźne zakażenie); Shigella flexerie lub dysenterie (czerwonka); Streptococcus pneumonia (zapalenie płuc); wirusy, grzyby
- oznaczanie grup krwi w układzie AB0 (wykrycie antygenów A i B w błonie erytrocytów)przeciwciała naturalne
METODA PROBÓWKOWA
metoda półilościowa (bo nie znamy dokładniej ilości przeciwciał)
typy aglutynacji bakterii (podział ze względu na rodzaj antygenu powierzchniowego):
~ aglutynacja H (rzęskowa, obłoczkowa) delikatne obłoczki pływają
- u bakterii mających antygen rzęskowy H
- bakterie zlepiają się rzęskami w obecności swoistych przeciwciał
- powstaje strąt (łatwo ulega rozbiciu przy wstrząsaniu)
~ aglutynacja O (komórkowa, grudkowa)
- obecność antygenu somatycznego O
- bakterie zlepiają się biegunami tworząc siatkę
- powstają zwarte grudki (opadają na dno probówki)przezroczyste
~ aglutynacja Vi
- obecność antygenu powierzchniowego Vi
- bakterie zlepiają się całą powierzchnią
- powstają drobne aglutynaty (osadzają się na dnie i ściankach probówki)
Do wykonania potrzebne są:
0,15 molowy roztwór NaCl
zawiesina aglutynogenu
surowica badana
PROBÓWKA I: zawiesina aglutynogenu + 0,15 molowy roztwór NaCl PRÓBA KONTROLNA (aby sprawdzić, czy to nie są szczepy szorstkie, które będą same ze sobą aglutynować)
PROBOWKA II: zawiesina aglutynogenu + surowica badana o stopniu rozcieńczenia X PRÓBA BADANA
PROBÓWKA III: zawiesina aglutynogenu + surowica badana o stopniu rozcieńczenia Y PRÓBA BADANA
Wynik:
- odczytujemy makroskopowo
- p. kontrolna jednorodna zawiesina
- p. badana wystąpienie i stopień aglutynacji zależny od stężenia przeciwciał
ZASTOSOWANIE:
- określa miano przeciwciał (odwrotność największego rozcieńczenia, w których obserwujemy jeszcze reakcję) w danej surowicy
- diagnostyka mikrobiologiczna np.
~ odczyn Widala diagnostyka duru brzusznego (Salmonella typhi)
~ odczyn Weil – Felixa diagnostyka duru plamistego (riketsje)
~ odczyn Wrighta diagnostyka brucelozy
AGLUTYNACJA POŚREDNIA (BIERNA)
ODCZYN LATEKSOWY
malutki antygen naniesiony na nośnik (w odczynach odwróconych na kuleczce lateksowej może siedzieć też przeciwciało)
szybki, czuły
bardziej dokładny niż odczyny precypitacji
jakościowy (czasem półilościowy)
na gotowych, jednorazowych kartonikach z ciemnym tłem
Nośnik: cząsteczki lateksu
Do wykonania potrzebne są:
surowica badana
odczynnik lateksowy
surowica dodatnia
surowica ujemna
KARTONIK I: kropla badanej surowicy + odczynnik lateksowy PRÓBA BADANA (mieszamy patyczkiem)
KARTONIK II: surowica dodatnia + odczynnik lateksowy KONTROLA DODATNIA
KARTONIK III: surowica ujemna + odczynnik lateksowy KONTROLA UJEMNA
Wynik:
- oceniamy obecność aglutynacji po 2 min
ZASTOSOWANIE:
Do wykrywania:
- czynnik reumatoidalny (RF) (klasy IgM) reumatoidalne zapalenie stawów
- czynnik LE układowy toczeń trzewny (przeciwciała przeciwjądrowe atakują białe krwinki)
- antystreptolizyna O (ASO) zakażenia paciorkowcowe (Streptococcus pyogenes)
- białko C-reaktywne (CRP) w surowicy
ODCZYN HEMAGLUTYNACJI
w probówkach serologicznych lub płytkach z dołkami
erytrocyty barana lub ludzkie grupy 0 Rh-
reakcja 2 godz. w temp. pokojowej
Nośnik: krwinki czerwone (baranie), a przeciwciała są od królika
Do wykonania potrzebne są:
rozcieńczenia surowicy badanej (zinaktywowana)
erytrocyty opłaszczone wzorcowym antygenem
krwinki nieopłaszczone
0,15 molowy NaCl
surowica kontrolna dodatnia
PŁYTKA I: surowica badana+ erytrocyty opłaszczone wzorcowym antygenem PRÓBA BADANA
PŁYTKA II: surowica badana+ krwinki nieopłaszczone KONTROLA UJEMNA
PŁYTKA III: 0,15 molowy NaCl + krwinki opłaszczone KONTROLA UJEMNA
PŁYTKA IV: surowica kontrolna dodatnia + krwinki opłaszczone KONTROLA DODATNIA
Wynik:
- makroskopowo oceniamy wystąpienie lub brak aglutynacji erytrocytów
- wynik dodatni dno równomiernie pokryte krwinkami
- wynik ujemny na dnie zbity guziczek z erytrocytów
ZASTOSOWANIE:
- do wykrycia przeciwciał przeciwko rozpuszczalnym antygenom
- odczyn antyglobulinowy Coombsa
- diagnostyka kiły
- test Waalera- Rosego reumatoidalne zapalenie stawów, klasyczny czynnik reumatoidalny klasy IgM (TEST ANTYGLOBULINOWY, ale nie służy do wykrywania Rh, on służy do wykrywania czynnika RF)
ODCZYN ANTYGLOBULINOWY COOMBSA
wykrywamy przeciwciała niekompletne (przeciwciał, które są na powierzchni komórek, ale nie powodują aglutynacji erytrocytów, mają bardzo wąski region zawiasowy)
BEZPOŚREDNI
na szkiełkach przedmiotowych
szkiełka do komory wilgotnej na 10 min
Do wykonania potrzebne są:
surowica antyglobulinowa
zawiesina badanych erytrocytów
0,15 molowy roztwór NaCl
surowica antyglobulinowa
erytrocyty 0Rh(+) opłaszczone przeciwciałami anty-D
erytrocyty 0Rh(+)
SZKIEŁKO I: surowica antyglobulinowa + zawiesina badanych erytrocytów PRÓBA BADANA
SZKIŁKO II: 0,15 molowy NaCl + zawiesina badanych erytrocytów PRÓBA KONTROLNA I
SZIEŁKO III: surowica antyglobulinowa+ erytrocyty 0Rh(+) opłaszczone przeciwciałami anty-D PRÓBA KONTROLNA II
SZKIEŁKO IV: surowica antyglobulinowa + erytrocyty 0Rh(+) PRÓBA KONTROLNA III
Wynik:
-oceniamy markoskopowo wystąpienie lub brak hemaglutynacji erytrocytów
ZASTOSOWANIE:
- wykrywanie przeciwciał niekompletnych opłaszczonych in vivo na erytrocytach
- wykrywanie przeciwciał anty-D układu Rh diagnozowanie choroby hemolitycznej noworodków
- diagnostyka niedokrwistości autoimmunohemolitycznych
- diagnostyka niedokrwistości polekowych
- odczyny potransfuzyjne
POŚREDNI
wykonywany w 2 etapach
1. etap w probówkach a 2. na szkiełkach
ETAP I
Do wykonania potrzebne są:
erytrocyty wzorcowe 0Rh(+)
badana surowica
surowica anty- D
erytrocyty wzorcowe 0Rh(-)
PROBÓWKA I: badana surowica + erytrocyty wzorcowe 0Rh(+) PRÓBA BADANA
PROBÓWKA II: surowica anty-D + erytrocyty wzorcowe 0Rh(+) PRÓBA KONTROLNA I
PROBÓWKA III: surowica anty-D + erytrocyty wzorcowe 0Rh(-) PRÓBA KONTROLNA II
Wszystkie probówki inkubowane 37 stopni w cieplarce.
ETAP II
Do wykonania potrzebne są:
surowica antyglobulinowa
0,15 molowy roztwór NaCl
SZKIEŁKO I: surowica antyglobulinowa + próba badana z etapu I (badana surowica + erytrocyty wzorcowe 0Rh(+)) PRÓBA BADANA WŁAŚCIWA
SZKIEŁKO II: surowica antyglobulinowa + próba kontrolna I z etapu I (surowica anty-D + erytrocyty wzorcowe 0Rh(+)) PRÓBA KONTROLNA I hemaglutynacja
SZKIEŁKO III: surowica antyglobulinowa+ próba kontrolna II z etapu I (surowica anty-D + erytrocyty wzorcowe 0Rh(-)) PRÓBA KONTROLNA II brak hemaglutynacji
SZIEŁKO IV: 0,15 molowy roztwór NaCl + próba badana z etapu I (badana surowica + erytrocyty wzorcowe 0Rh(+)) PRÓBA KONTROLNA III brak hemaglutynacji
Wynik:
-odczytujemy makroskopowo po 2 min
ZASTOSOWANIE:
- wykrycie przeciwciał niekompletnych w surowicy
- wykrycie przeciwciał anty-D układu Rh diagnostyka konfliktu serologicznego od strony matki
- wykrycie przeciwciał anty tyreoglobulina monitorowanie leczenia przy raku tarczycy (obok poziomu tyreoglobuliny)
- wykrycie antyglobuliny (czynnik reumatoidalny RF)
ODCZYN WIĄZANIA DOPEŁNIACZA (OWD)
Do wykonania potrzebne są:
badana surowica (zinaktywowana)
przeciwciała antyerytrocytarne (surowica królika uodpornionego erytrocytami barana)
erytrocyty barana opłaszczone przeciwciałami antyertrocytarnymi
dopełniacz (jego źródłem jest surowica świnki morskiej)
0,15 molowy roztwór NaCl
znany antygen lub znana surowica
erytrocyty barana nieopłaszczone
PRÓBA WSTĘPNA: erytrocyty barana + stałe stężenie dopełniacza + rozcieńczenia przeciwciał antyerytrocytarnych
ETAP I (BRAK HEMOLIZY WYNIK DODATNI)
PROBÓWKA IA : badana surowica + znany antygen + dopełniacz PRÓBA BADANA
PROBÓWKA IB: badana surowica + znana surowica odpornościowa + dopełniacz PRÓBA BADANA
PROBÓWKA II: badana surowica + dopełniacz + zawiesina opłaszczonych erytrocytów PRÓBA KONTROLNA I hemoliza
PROBÓWKA III: znany antygen lub przeciwciało + dopełniacz + zawiesina opłaszczonych erytrocytów PRÓBA KONTROLNA II hemoliza
PROBÓWKA IV: dopełniacz + zawiesina opłaszczonych erytrocytów PRÓBA KONTROLNA III hemoliza
PROBÓWKA V: erytrocyty barana nieopłaszczone PRÓBA KONTROLNA IV brak hemolizy
ETAP II
PROBÓWKA IA: erytrocyty barana opłaszczone przeciwciałami antyertrocytarnymi + probówka IA z etapu I PRÓBA BADANA
PROBÓWKA IB: erytrocyty barana opłaszczone przeciwciałami antyertrocytarnymi + probówka IB z etapu I PRÓBA BADANA
Wynik:
- wynik dodatni etap I: związanie dopełniacza i etap II: brak hemolizy erytrocytów obecność poszukiwanego składnika w materiale
- wynik ujemny etap I: dopełniacz nie jest związany i etap II: przyłącza się do kompleksu erytrocyt-przeciwciało antyerotrycytarne (hemoliza krwinek) brak poszukiwanego składnika
ZASTOSOWANIE:
- wykrywanie obecności antygenów
- wykrywanie obecności przeciwciał
- test ilościowy (określenie miana antygenu lub przeciwciał)
- diagnostyka mikrobiologiczna zakażeń bakteryjnych, grzybiczych, wirusowych
OZNACZANIE AKTYWNOŚCI HEMOLITYCZNEJ DOPEŁNIACZA (CH50)
Zasada: oparta na ustaleniu ilości surowicy (badana surowica) wywołującej 50% lizę erytrocytów barana opłaszczonych przeciwciałami antyerytrocytarnymi, standardowa zawiesina erytrocytów
opsonizacja ułatwianie fagocytozy
kompleks atakujący błonę właściwość lityczna
niekompletne przeciwciała
8 probówek
W każdej probówce inna zawartość dopełniacza (np. 6ml, 5ml, 3ml, 2,5ml)
Uzupełniamy buforem do 7,5 ml
Długość fali 540nm, odwirować, inkubujemy
UKŁAD WSKAŹNIKOWY: erytrocyty barana opłaszczone przeciwciałami królika
ZASTOSOWANIE:
- ocena poziomu dopełniacza w surowicy
- informuje o przebiegu klasycznej drogi aktywacji dopełniacza
- można badać składowe dopełniacza
- można badać aktywność dopełniacza
OZNACZANIE ANTYSTREPTOLIZYNY O
Zasada: oparta na hamowaniu hemolizy erytrocytów pod wpływem streptolizyny O po jej ilościowym związaniu przez antystreptolizynę O
TEST PROBÓWKOWY
Do wykonania potrzebne są:
badana surowica (szukamy streptolizyny O)
wzorcowy roztwór streptolizyny O
5% zawiesina erytrocytów królika
PROBÓWKA I: badana surowica+ wzorcowy roztwór streptolizyny O (inkubujemy przez 15 min w 37stopniach) + 5% zawiesina erytrocytów królika (inkubujemy przez 60 min w 37 stopniach) PRÓBA BADANA
PROBÓWKA II: erytrocyty wskaźnikowe + 0,15 molowy roztwór NaCl PRÓBA KONTROLNA I brak hemolizy
PROBÓWKA III: erytrocyty wskaźnikowe + badana surowica nierozcieńczona PRÓBA KONTROLNA II brak hemolizy
PROBÓWKA IV: erytrocyty wskaźnikowe + wzorcowa streptolizyna O PRÓBA KONTROLNA III hemoliza
Wynik:
- makroskopowo oceniamy wystąpienie lub brak hemolizy
TEST LATEKSOWY aglutynacja bierna
na kartonikach jednorazowych
Do wykonania potrzebne są:
odczynnik lateksowy(zawiesina cząstek lateksu opłaszczonych oczyszczoną streptolizyną O)
surowica rozcieńczona w buforze glicerynowym (badana)
kontrolna surowica dodatnia
kontrolna surowica ujemna
KARTONIK I: kropla rozcieńczonej surowicy badanej + odczynnik lateksowy PRÓBA BADANA
KARTONIK II: kropla kontrolnej surowicy dodatniej( przeciwciała przeciwko streptolizynie O) + odczynnik lateksowy PRÓBA KONTROLNA DODATNIA
KARTONIK III: kropla kontrolnej surowicy ujemnej + odczynnik lateksowy PRÓBA KONTROLNA UJEMNA
Wynik:
- oceniamy po 2 min
- oceniamy wystąpienie aglutynacji obecność streptolizyny O w surowicy
ZASTOSOWANIE:
- diagnozowanie trwających lub przebytych zakażeń paciorkowcowych
- różnicowanie chorób reumatycznych
TEST LIMFOCYTOTOKSTYCZNY (CYTOTOKSTYCZNY)
modyfikacja test mikrolimfocytotoksyczny
na płytkach Terasaki z zagłębieniami
Zasada: oparta na niszczeniu komórek docelowych w obecności swoistych przeciwciał skierowanym przeciwko antygenom powierzchniowym tych komórek oraz antygenom dopełniacza
Do wykonania potrzebne są:
zawiesina limfocytów badanych izolowanych z krwi obwodowej
swoista surowica anty- HLA
dopełniacz króliczy
olej parafinowy
barwnik (np. eozyna)
formalina
PŁYTKA I: olej parafinowy (pod olej)+ surowica anty-HLA + zawiesina badanych limfocytów (inkubacja przez 30 min w 37 stopniach) + dopełniacz (inkubacja przez 60 min w 37 stopniach) + barwnik + formalina
Wynik:
- odczytujemy w mikroskopie świetlnym ocena wyglądu komórek, obliczenie ilości komórek martwych (wybarwione)
- ocena wg skali:
~ poniżej 25% kom. martwych wynik ujemny
~ 26-45% wynik wątpliwy
~ powyżej 46% wynik dodatni
- wynik reakcji można ocenić:
~ metodą morfologiczną
~ metodą izotopową
ZASTOSOWANIE:
- wykrywanie obecności antygenów powierzchniowych na komórkach
- wykrywanie obecności przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym na komórkach w płynach ustrojowych
- określanie miana przeciwciał w surowicy skierowanym przeciwko limfocytom, makrofagom, komórkom nowotworowym
- wykrywania i określania miana przeciwciał w surowicy skierowanych przeciwko antygenom zgodności tkankowej
- określanie antygenów zgodności tkankowej