METODY IZOLACJI KOMÓREK

Ogólne warunki izolacji komórek:

• skład jonowy środowiska

• pH środowiska

• substancje stabilizujące błonę komórkową

• temperatura

• czas

Ocena otrzymanej zawiesiny komórkowej:

• gęstość

• żywotność

Źródła komórek:

• węzły chłonne

• migdałki

Najczęściej izolowane są:

• limfocyty T

• limfocyty B

• monocyty

• komórki NK

• granulocyty

Otrzymywanie zawiesiny komórek z tkanek litych:

- mechaniczne rozdrobnienie tkanek

- enzymatyczne trawienie skrawków tkanek (elastaza)

- oddzielenie zawiesiny od fragmentów tkanek (sita, filtry)

WIROWANIE NA GRADIENTACH GĘSTOŚCI

ZASTOSOWANIE: izolacja konkretnych populacji komórkowych

ZASADA: różnica między gęstością względną użytego gradientu a wielkością i ciężarem właściwym izolowanych komórek

CHARAKTERYSTYKA/ WŁAŚCIWOŚCI:

- niska lepkość

- izoosmotyczne względem płynów ustrojowych

- nietoksyczne

- niezdolne do penetracji przez błony komórkowe

- łatwe do wypłukania z zawiesiny komórkowej

Najczęściej stosowane gradienty:

mieszanina Ficoll-Uropolina

 do izolacji limfocytów z krwi obwodowej

 do rozdziału komórek nowotworowych od limfoidalnych

Percoll

• do rozdziału limfocytów T od B

• do rozdziału komórek jednojądrzastych od wielojądrzastych

WYKONANIE:

• przygotowanie gradientu

• nawarstwienie zawiesiny komórek na gradient

• wirowanie

• zebranie poszczególnych, rozdzielonych populacji wzdłuż gradientu

• odpłukanie zebranych komórek

METODY ADHERENCYJNE

ZASTOSOWANIE: izolacja konkretnych populacji komórkowych

ZASADA: zdolność przylegania niektórych komórek zwłaszcza monocytów (granulocyty, limfocyty) do szkła i plastiku

POTRZEBNE SĄ:

• kolumny wypełnione watą nylonową

• kolumny wypełnione watą szklaną

• kolumny wypełnione cząstkami wielocukru

WYKONANIE:

- inkubacja komórek na płytkach lub w kolumnie

- wypłukanie podłoża odpowiednim środowiskiem (usuwanie komórek nieprzylegających)

- wypłukanie podłoża 50% roztworem FCS (pozyskiwanie zawiesiny komórek zaadsorbowanych)

METODA SZOKU OSMOTYCZNEGO

ZASTOSOWANIE: usuwanie erytrocytów z zawiesiny komórek

ZASADA: osmotyczna liza erytrocytów za pomocą roztworu hipotonicznego (woda destylowana)

WYKONANIE:

-dodanie wody destylowanej lub innego roztworu hipotonicznego do zawiesiny komórek

METODY Z ZASTOSOWANIEM IMMUNOADSORBENTÓW

ZASTOSOWANIE: izolacja różnych subpopulacji komórkowych (charakterystyczne antygeny na powierzchni błony komórkowej)

ZASADA: wiązanie antygenów powierzchniowych subpopulacji komórkowych przez przeciwciała obecne na immunoadsorbentach swoiście skierowanych wobec tych antygenów

WYKONANIE:

- inkubacja zawiesiny komórkowej i immunoadsorbentów w szklanej kolumnie (wiązanie się do opłaszczonych cząsteczek nośnika określonych komórek)

- przepłukanie kolumny dużą ilością odpowiedniego środka

METODA IZOLACJI MAGNETYCZNEJ

ZASTOSOWANIE: izolacja różnych subpopulacji komórkowych (charakterystyczne antygeny na powierzchni błony komórkowej)

ZASADA: wiązanie antygenów obecnych na błonach komórkowych przez specyficzne przeciwciała opłaszczone na magnetycznych kulkach

WYKONANIE:

- opłaszczenie przeciwciałami paramagnetycznych cząstek polistyrenu

- wymieszanie cząstek polistyrenu z zawiesiną komórek i inkubacja

- usuwanie komórek związanych z nośnikiem za pomocą magnesu

METODA ROZETOWA E

ZASTOSOWANIE: izolacja limfocytów T z zawiesiny komórkowej

ZASADA: zjawisko spontanicznego wiązania się erytrocytów barana z limfocytami T człowieka (cząsteczka CD2 limfocytów jest receptorem dla erytrocytów barana)

WYKONANIE:

- wymieszanie zawiesiny limfocytów z erytrocytami barana

- liczba erytrocytów musi być 50-razy większa od liczby limfocytów

- inkubacja (powstawanie rozet – limfocyt T połączony z 3 erytrocytami)

- rozety mogą być oddzielone od innych komórek poprzez wirowanie na gradientach gęstości

METODA SEDYMENTACJI

• pobranie krwi na heparynę/cytrynian sodu/ EDTA zapobiega przed krzepnięciem krwi

• sedymentacja erytrocytów przez 1-2 godz w 37 stopniach

• powstaje ndsącz z limfocytami, granulocytami i monocytami

TECHNIKI OCENY FENOTYPU LIMFOCYTÓW

TECHNIKA IMMUNOFLUORESCENCJI

ZASTOSOWANIE: ocena fenotypu limfocytów krwi obwodowej

ZASADA: identyfikacja charakterystycznych antygenów różnicowana za pomocą przeciwciał monoklonalnych znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi

TECHNIKI OCENY AKTYWNOŚCI LIMFOCYTÓW

TEST TRANSFORMACJI BLASTYCZNEJ

ZASTOSOWANIE: ocena aktywności limfocytów T, określenie ogólnego stanu czynnościowego limfocytów T

ZASADA: pomiar proliferacji komórek hodowanych uprzednio w obecności różnych stymulatorów

WYKONANIE:

- inkubacja przez 1- 8 dni zawiesiny izolowanej frakcji limfocytów w środowisku hodowlanym w obecności mitogenu

- w tym samym czasie w tych samych warunkach ale bez czynnika mitogennego są prowadzone hodowle kontrolne

METODA MORFOLOGICZNA

1. rozmaz z osadu hodowli komórek stymulowanych mitogenem

2. barwienie metodą Pappenhheima

3. ocena cech morfologicznych komórek pod mikroskopem

• komórki blastyczne 2-4 razy większe od limfocytów i mają wyodrębnione jądro o luźnej strukturze chromatynowej

1. obliczenie indeksu blastycznego: X= (a/b) x 100%

1. liczba blastów

2. liczba wszystkich komórek

odsetek komórek blastycznych dla komórek niestymulowanych < 7%

METODA IZOTOPOWA

Bardziej czuła i bardziej dokładna niż morfologiczna

• pomiar promieniowania z inkorporowanych prekursorów kwasów nukleinowych lub białek

1. inkubacja zawiesiny limfocytów z dodatkiem czynnika mitogennego (przez 3-4 doby z dopływem CO2)

2. równolegle prowadzi się hodowlę danych limfocytów bez stymulacji (próba kontrolna)

3. po inkubacji do każdej hodowli dodaje się znakowaną trytem tymidynę

4. inkubacja przez 16 godzin

5. przeniesienie komórek na bibułę i suszenie przez 3 godziny w 37 stopniach

6. przeniesienie komórek do małych naczyń zawierających płyn scyntylacyjny

7. pomiar radioaktywności i ocena indeksu stymulacji

METODY OCENY CZYNNOŚCI SPRAWNOŚCIOWEJ FAGOCYTÓW

Defekty odporności (upośledzona sprawność fagocytów) spowodowane są przez:

• Zaburzenia adhezji

• Zanurzenia chemotaksji

• Zaburzenia pochłaniania

• Zaburzenia wewnątrzkomórkowego zabijania bakterii

METODY OCENY ADHERENCJI FAGOCTÓW

ZASTOSOWANIE: ocena adherencji fagocytów

ZASADA: zdolność komórek do adhezji do powierzchni stałych

WYKONANIE:

1. inkubacja komórek w plastikowym naczyniu (30 min, 37 stopni)

2. odpłukać komórki nieadherujące

3. dodać MTT (15 min, odpłukać)

4. komórki adherujące MTT przekształcają barwnik w niebieską pochodną farmazanu

5. ocena spektrofluorymetryczna wytworzonego farmazanu

METODY OCENY MIGRACJI FAGOCYTÓW

ZASTOSOWANIE: ocena zdolności fagocytów do migracji i chemotaksji

ZASADA: zdolność fagocytów do migracji i chemotaksji

Przeprowadzany in vitro dwoma sposobami

TEST MIGRACJI W KOMORACH BOYDENA

WYKONANIE:

1. Górna część komory- zawiesina badanych komórek, dolna część komory - czynnik chemotaktyczny. Między nimi jest nitrocelulozowy filtr z mikroporami

2. Inkubacja

3. Wybarwienie błony filtru

4. Mikroskopowa ocena procentu komórek, które przeszły przez filtr

TEST MIGRACJI POD AGAROZĄ

WYKONANIE:

1. 3 studzienki wycięte w żelu agarozowym na płytce Petriego:

ŚRODKOWA  zawiesina badanych komórek

LEWA  podłoże hodowlane

PRAWA  czynnik chemotaktyczny

1. Inkubacja przez 2 godzin w 37 stopniach

2. Utrwalenie komórek alkoholem metylowym i formaldehydem

3. Wybarwienie komórek

WYNIK: indeks chemotaktyczny (IC)  droga jaką przebyły komórki w kierunku czynnika chemotaktycznego, w stosunku do drogi jaką przebyły do podłoża hodowlanego (migracja swobodna)

METODY OCENY FAGOCYTOZY

ZASTOSOWANIE: ocena zdolności komórek do fagocytozy in vitro

ZASADA: określenie indeksu fagocytarnego

WYKONANIE:

1. Dodanie do próbówki

1. Zawiesina cząstek fagocytowanych (bakterie, drożdże, ziarna skrobi, erytrocyty, cząstki lateksu)

2. Zawiesina komórek (1 komórka: 6 cząstek fagocytowanych)

1. Inkubacja 30 min, 37 stopni

2. Odwirowanie

3. Wykonanie rozmazu z osadu

4. Utrwalenie alkoholem i wybarwienie

5. Mikroskopowa ocena sfagocytowanych cząstek w minimum 100 komórkach

6. Obliczenie indeksu fagocytarnego

INNE METODY OCENY INDEKSU FAGOCYTARNEGO:

• cząstki fagocytowane znakowane fluoresceiną (odczyt spektrofluorometryczny)

• cząstki fagocytowane znakowane radioizotopem (odczyt scyntylacyjny)

• pomiar ciepła produkowanego przez fagocytujące granulocyty

METODY OCENY METABOLIZMU WEWNĄTRZKOMÓRKOWEGO FAGOCYTÓW

ZASTOSOWANIE: ocena metabolizmu wewnątrzkomórkowego fagocytów

ZASADA: badanie aktywności wybuchu tlenowego, badanie pochłaniania i redukcji NBT

OCENA AKTYWNOŚCI WYBUCHU TLENOWEGO

Toksyczne i bakteriobójczne pochodne tlenu:

• anionorodnik ponadtlenkowy

• nadtlenek wodoru

Ocena aktywności na podstawie:

• pomiaru produkcji poprzez ocenę redukcji cytochromu C

• anionorodnika ponadtlenkowego

• nadtlenku wodoru

TEST POCHŁANIANIA I REDUKCJI NBT

ZASTOSOWANIE: rutynowa diagnostyka przewlekłej choroby ziarniniakowej

Odczynnik NBT  barwa żółta w roztworze o pH = 7,2

Następuje fagocytoza żółtego NBT a następnie jego redukcja w fagolizosomach i przekształcenie w nierozpuszczalny farmazan barwy ciemnogranatowej

WYKONANIE:

1. do dołków na płytce z zagłębieniami dodać:

- odczynnik NBT

- zawiesinę badanych komórek

- zawiesinę cząsteczek lateksu

2. inkubacja 15 min, 37 stopni

3. inkubacja 15 min, temperatura pokojowa

4. rozmaz z osadu komórek

5. barwienie komórek

6. ocena mikroskopowa

WYNIK: odsetek komórek fagocytujących

• odsetek komórek niepobudzonych redukujących NBT  1-8 %

• odsetek komórek pobudzonych redukujących NBT  85%

DIAGNOSTYKA CHORÓB ALERGICZNYCH

TEST UWALNIANIA HISTAMINY

Histamina jest uwalniana podczas reakcji immunologicznej z udziałem przeciwciał klasy IgE, związanych z receptorem FcɛRI obecnych na powierzchni komórek tucznych, bazofili i specyficznego alergenu/antygenu. Wynikiem aktywacji tych komórek jest degranulacja i uwalnianie histaminy, mediatora z bardzo silnych właściwościach anafilaktycznych. Stężenie uwolnionej histaminy jest wprost proporcjonalne do wrażliwości komórek alergika.

ZASTOSOWANIE:

• ustalenie czynnika uczulającego (antygen/alergen) na podstawie poziomu uwalniania histaminy przez bazofile

• ustalenie stężenia histaminy w płynach ustrojowych (popłuczyny nosowe, surowica, BAL)

WYKONANIE:

Ocena uwalniania histaminy metodą:

• fluorymetryczną

• radioimmunoenzymatyczną

• immunoenzymatyczną

METODY OCENY DEGRANULACJI BAZOFILÓW

ZASTOSOWANIE: ocena aktywacji bazofilów pod wpływem specyficznych antygenów/alergenów

ZASDA:

• aktywowane bazofile uwalniają ziarnistości zawierające preformowane mediatory reakcji zapalnej

• ocena mikroskopowa różnic morfologicznych pomiędzy komórkami degranulującymi i niedegranulującymi

WYKONANIE:

1. Izolacja bazofilów z krwi obwodowej (gradient gęstości)

2. Inkubacja komórek z antygenem/alergenem

3. Barwienie – błękit toluidyny wybarwia bazofile na kolor purpurowy

4. Mikroskopowa ocena morfologii komórek

5. Zliczenie liczby komórek degranulujących na 500 komórek widzianych w preparacie

6. Wyliczenie indeksu degranulacji

TEST CAST ELISA

ZASTOSOWANIE: ocena aktywacji bazofilów (poprzez ocenę produkcji i uwalniania leukotrienów) pod wpływem antygenów

ZASADA:

• Izolowane bazofile, stymulowane in vitro antygenem/alergenem uwalniają leukotrieny

• Stężenie uwalnianych leukotrienów jest wprost proporcjonalne do pobudzenia komórek przez alergen

Stężenie leukotrienów ocenia się metodą immunoenzymatyczną z zastosowaniem swoistych przeciwciał przeciwko leukotrienom

WYKONANIE:

1. Izolacja bazofilów z krwi obwodowej (gradient gęstości)

2. Inkubacja komórek z antygenem/alergenem

3. Wirowanie

4. Przeniesienie supernatantu na płytkę opłaszczoną przeciwciałami przeciwko leukotrienom

5. Inkubacja – związanie leukotrienów z przeciwciałami

6. Usunięcie niezwiązanych leukotrienów

7. Inkubacja z przeciwciałami przeciwko leukotrienom – jeśli zostały związane w pierwszym etapie powstanie kompleks Ag-Ab

8. Inkubacja z przeciwciałami antyglobulinowymi, znakowanycmi enzymem (np. HRP)

9. Inkubacja z substratem dla enzymu → zmiana koloru

10. Pomiar absorbancji i ocena stężenia leukotrienów