Uniwersytet Szczeciński Wydział Biologii
Członkowie grupy
Temat: Pozyskiwanie ze środowiska mikroorganizmów odpornych na związki toksyczne

`

1. Wprowadzenie

- odporność mikroorganizmów na związki toksyczne objawia się zdolnością rozkładu ksenobiotyków (zw. toksycznych, w tym także leków). Wynika z zdolności adaptacyjnej, oraz wytwarzania bioemulgatorów. Często też związki tego typu rozkładane są na zasadzie kometabolizmu, gdzie w rozkładzie związku biorą udział różne szczepy czy gatunki drobnoustrojów..

- mianem związków toksycznych oprócz metali ciężkich zaliczamy także węglowodory alifatyczne i aromatyczne a także pestycydy i biocydy.

- zdolność rozkładu ksenobiotyków posiadają takie bakterie jak: flavobacterium, bacillus, arthrobacter, a także niektóre grzyby.

- toksyczny wpływ metali ciężkich na mikroorganizmy objawia się blokowaniem grup funkcyjnych, zastępowaniem jonów właściwych metali w białkach strukturalnych i enzymach oraz indukcji zmian konformacyjnych w biopolimerach.

- toksyczny wpływ metali ciężkich na mikroorganizmy obiawia się najczęściej w przypadku ich nadmiaru, oraz zależnie od zmiennych środowiskowych (pH, obecności innych jonów oraz związków chelatującyh). Odporność natomiast zależna jest od uwarunkowań genetycznych (modyfikacje w budowie ściany komórkowej ograniczające jej przepuszczalność dla metali ciężkich, syntezie biopolimerów ściany komórkowej aktywnych w wiązaniu metali ciężkich. Produkcja różnych biopolimerów i drobnocząsteczkowych metabolitów, które poprzez wiązanie, precypitację lub chelatowanie ograniczają dostępność tych związków dla komórek. Możliwa jest także wewnątrzcząsteczkowa separacja metali na przykład w postaci polisfosforanów)

- w wewnątrz komórkowej detoksykacji biorą udział fitochelatyny i metalotioneiny odpowiedzialne za akumulacje i kopleksowanie metali ciężkich w wakuolach.

- wśród metali ciężkich wyróżnić możemy także pierwiastki biogenne (żelazo mangan cynk nikiel kobalt molibden oraz wanad) o ich toksyczność decyduje ich ilość w środowisku. Nadmiar bywa toksyczny na skutek zwiększonego transportu związanego z gradientem chemiosmotycznym.

2. Cel doświadczenia

Celem doświadczenia była selekcja szczepów opornych na wysokie stężenie metali ciężkich z zastosowaniem metody płytek gradientowych oraz metody replik oraz porównanie tych dwóch metod pod kątem funkcjonalności.

3. Wykonanie:

1. Metoda płytek gradientowych

Z naważki 10g gleby, wytrząsanej przez 10 min w 90ml jałowej soli fizjologicznej otrzymujemy rozcieńczenie 10⁻¹. Po sedymentacji makrocząsteczek otrzymanego rozcieńczenia wykonać kolejne rozcieńczenia (od 10⁻² do 10⁻⁵) w probówkach typu eppendorf z 0,9 ml soli fizjologicznej. Następnie nanieść na płytki po 0,1 ml rozcieńczeń 10⁻³- 10⁻⁵. Wykonie podłoży hodowlanych w tej metodzie wymaga aby szalki petriego ustawić na listewce i wylać 1 warstwę podłoża nie zawierającego jonów Ni²⁺ i pozostawić do jego zestalenia. Następnie usunąć listewki spod szalek i wylać 2 warstwę podłoża LA zawierającego Ni²⁺ i pozostawić do zestalenia. Posiewy inkubować w temperaturze 20°C przez 7 dni. Po inkubacji wyizolować pojedyncze kolonie wyrosłe w strefie największego i najmniejszego przejaśnienia jonów niklu

1. Metoda replik

Wybieramy taką płytkę z poprzedniego doświadczenia (metoda gradientowa) , na której uzyskaliśmy wzrost od 10 do 40 kolonii różnych bakterii. Następnie z a pomocą stempla pokrytego jałową gaza przenieść (przereplikować) kolonie (poprzez natychmiastowy odcisk) na płytki z podłożem LA z kolejno rosnącym stężeniem jonów niklu (0, 10, 25, 50, 100 Ni²⁺/ml). Należy zwrócić uwagę na zaznaczanie orientacji wykonanego odcisku względem płytki matrycowej (zaznaczyć flamastrem na płytce petriego). Płytki inkubować w 20°C przez 7 dni. Po uzyskaniu widocznego wzrostu przenieść do lodówki. Podczas oglądania wyników doświadczenia porównywać z wynikami osiągniętymi w doświadczeniu selekcji na płytach gradientowych.

4. Wyniki

Rysunek 1 – metoda replik

Rysunek 2 – metoda gradientowa

- W metodzie replik każdą kolonię w danym miejscu traktujemy jako replikę kolonii z poprzedniej płytki identyczną pod względem morfologicznym. Metoda pozwoliła określić odporność na metale ciężkie wielu kolonii jednocześnie. Stężenie jonów Ni²⁺ wzrastające z kolejną płytką pozwoliło uzyskać kilka kolonii które wykazywały odporność na wysokie stężenie niklu w pożywce oraz określić które kolonie na zwiększonym stężeniu nie wykazywały zdolności do wzrostu. Metoda gradientowa, także pozwoliła uzyskać kolonie o zdolności wzrostu na podłożu z jonami Ni²⁺ jednakże nie określono wartości maksymalnych w których dane kolonie wykażą wzrost w obecności metalu ciężkiego. Kolonie które wykazały wzrost w części szalki o mniejszym stężeniu Ni²⁺ mogą wykazać jego brak w części o większym stężeniu jonów Ni²⁺.

5. Wnioski

- W przemyśle mikroorganizmy poddaje się procesowi izolacji według powyższych metod w celu uzyskania kultur o maksymalnej odporności na niekorzystne działanie związków toksycznych.

- porównując obie metody mogę stwierdzić iż metoda replik pozwala uzyskać dokładniejsze wyniki odnośnie odporności danej kultury na wzrastające stężenie jonów metali ciężkich w środowisku.

- mikroorganizmy zdolne do wzrostu związków toksycznych mogą być także zdolne do ich rozkładu co może być użyteczne w procesach bioremediacji, oczyszczania gleby bądź gazów. Szeroko użyteczne są mikroorganizmy do oczyszczania środowisk skażonych metalami ciężkimi, obszary wycieków ropy naftowej, obszary hutnicze, obszary prób broni atomowej, okolice fabryk, wysypisk śmieci oraz oczyszczalni ścieków. Możliwe jest także użycie tego typu drobnoustrojów do bioakumulacji metali ciężkich w celu późniejszego ich wykorzystania (złota, srebra uranu).