Wykład 4 – 29.10.2009

Najczęstsze skażenia związkami ropopochodnymi:

1. Olej napędowy – są to węglowodory wrzące w temperaturze 190-370^oC. W zależności od pory roku (olej zimowy lub letni) zawartość węglowodorów alifatycznych, czyli parafin 40-60%. Węglowodorów naftenowych jest od 20 do 30% i węglowodorów aromatycznych 15-30%. Do olejów dodaje się substancje uszlachetniające paliwo. Są to przeciwutleniacze, deaktywatory metali, stabilizatory, deemulgatory i biocydy. Udział tych substancji dochodzi do kilku % i substancję te mogą utrudniać proces biodegradacji węglowodorów. Szczególny wpływ mogą mieć deemulgatory i biocydy.

2. Paliwa lotnicze – to mieszanina węglowodorów o temperaturze wrzenia 150-155^oC. Występują tam parafiny od C₉ do C₁₄. W zależności od rodzaju silnika udział parafin waha się od 10 do 75%, węglowodorów aromatycznych od 4 do 22%, pozostałe to węglowodory naftenowe od 15-65%. Paliwa te mogą zawierać również kilka % zawartości olefin.

3. Oleje opałowe - olej ten uważany jest za najmniej przyjazny środowisku paliwo i jego przeznaczeniem jest stosowanie jako opał w różnego rodzaju instalacjach grzewczych. W olejach opałowych obecne są pozostałości po destylacji ropy naftowej. Parafiny od C₂₆ do C₆₀ się tam znajdują, niewielka ilość olefin, naftenów i arenów. Są tam obecne również substancje żywiczno-asfaltowe. Zły wpływ na środowisko wynika głównie z faktu obecności połączeń metaloorganicznych, połączeń zawierające S, N i O. Rozróżnia się oleje opałowe ciężkie i lekkie. Za najbardziej przyjazny środowisku uważany jest lekki olej opałowy. Np. eksterm plus – produkt ten spełnia normy światowe pod względem eksploatacyjnym jak i wymagań ochrony środowiska.

4. Paliwa żeglugowe – są to substancje stałe lub półpłynne o temperaturze 25^oC, a skład ich jest zbliżony do olejów opałowych ciężkich. Zanieczyszczenia paliwami żeglugowymi są o tyle groźne, że gromadzą się w mule (na dnie) zbiorników wodnych, rzek i portów. W osadach dennych panują warunki beztlenowe, w których biodegradacja węglowodorów zachodzi bardzo powoli, stąd zanieczyszczenia te zalegają (bardzo długo) przez lata wpływając bardzo niekorzystnie na ekosystem.

5. Oleje smarowe – stanowią poważne zagrożenie. Oleje smarowe to oleje silnikowe, turbinowe, sprężynowe, do przekładni, stosowane do świdrów. Do tych smarów stosuje się stosunkowo duże dodatki uszlachetniające, co może utrudniać ich biodegradacje. Wśród tych związków największe znaczenie eksploatacyjne mają dodatki przeciwzużyciowe, przeciwutleniacze, modyfikatory tarcia. Toksyczność tych olejów wynika z obecności WWA (PAHS). WWA mają działanie kancerogenne i mutagenne. Oleje te w czasie eksploatacji zmieniają swój skład chemiczny i właściwości. Przestają spełniać wymagania normatywne.

6. Smary plastyczne – mają konsystencję stałą lub ciekłą. Bazę stanowią głównie parafiny. Są to zwykle produkty o specjalnym przeznaczeniu (podłoża samochodowe do łożysk, smary lotnicze). Wśród produktów z przerobu ropy naftowej ich udział nie przekracza 3%. Produkty te zawierają jednak WWA, jony metali, naftenian ołowiu. Prowadzi się pracę nad użyciem do produkcji tych smarów olejów roślinnych i wyeliminowanie związków zawierających oleje ciężkie.

Wydobycia ropy naftowej i największe katastrofy:

Światowe wydobycie ropy naftowej wynosi 4 mld ton rocznie, z czego w Arabii Saudyjskiej koło 14 %, Rosja 12%, USA 12%, Irak 6%, Chiny 5%, Meksyk 5%, Wenezuela 4%, Norwegia 3,5%. W Polsce złoża ropy naftowej występują koło Krosna Odkańskiego, Kamienia Pomorskiego, Karlina, Sulencina, Jasła, Gorlic. Pewne znaczenie mają również złoża na szelfie Morza Bałtyckiego. Zasoby ropy naftowej w tych miejscach szacowane są na 4 mln ton, a wydobycie nie przekracza 0,2 mln ton rocznie. Co stanowi 0,01 światowego wydobycia. W Polsce rocznie do środowiska przyrodniczego dostaje się około 40-50 tys. ton produktów ropopochodnych. Co stanowi około 0,03% zużycia produktów ropopochodnych. Wielkość tych zrzutów ropy naftowej nie jest precyzyjnie oszacowana gdyż rejestrowane są tylko mega wycieki, a tysiące małych jest wręcz ukrywanych. Wśród największych katastrof wymienia się katastrofę tankowca Prestiż w 2002 r. w Hiszpanii i podobna awaria była w zatoce Perskiej w połowie lat 90-tych. W Polsce obszarami zanieczyszczonymi produktami ropopochodnymi są: obszary przemysłowe, tereny byłych i obecnych baz wojskowych, tereny zakładów petrochemicznych, otoczenia stacji benzynowych i przeładunku paliw.

Drogi biodegradacji węglowodorów:

Węglowodory w środowisku przyrodniczym ulegają przemianom fizyko-chemicznym i biologicznym.

u Przemka jest.

1. Węglowodory w środowisku przyrodniczym podlegać mogą działaniu światła, tlenu i ozonu. Co nie prowadzi wprawdzie do ich biodegradacji, ale czyni je bardziej przyswajalnymi do mikroorganizmów. Węglowodory jako takie są substancjami inertnymi chemicznie i te wstępne oddziaływania czynników fizyko-chemicznych mogą mieć poważny wpływ na to z jaką szybkością będą atakowane przez mikroorganizmy. Mówi się o tzw. wstępnym utlenieniu węglowodorów.

2. Węglowodory mogą być atakowane przez różne grupy drobnoustrojów zarówno przez fotoautotrofy i tlenowe heterotrofy i węglowodory są dla nich podstawowym źródłem węgla. Efekt ten jest produkcją biomasy, wydzielenie CO₂ i H₂O (mineralizacja).

3. Węglowodory mogą być również wykorzystywane jako źródło węgla w warunkach deficytu tlenu bądź w warunkach ściśle beztlenowych. Z tą różnicą że oddychanie tlenowe zostaje zastąpione oddychaniem azotanowym lub siarczanowym. Energia może być również zdobywana w drodze redukcji żelaza +3 do Fe⁺². Produktem rozpadu węglowodorów w tych wszystkich przypadkach jest CO₂. W przypadku oddychania azotowego gromadzić się może azot w formie gazowej. W przypadku siarczanowego wodór. A w wyniku tzw. metanogenezy gromadzony może być metan. W procesach bioremediacji uwzględnia się działanie wszystkich wyżej wymienionych mikroorganizmów i w zależności od warunków występujących w miejscu skażenia daną grupą mikroorganizmów przyjmuje się za dominującą i wspomaga jej rozwój.

Akceptory elektronów uczestniczące w procesach beztlenowego rozkładu węglowodorów.

Akceptor elektronów	Produkt redukcji	Typ oddychania	Mikroorganizmy
NO3^−	NO2^−, NH3, N2	denitryfikacja	Bacillus, Pseudomonas
SO4^2−	S, H2S	Redukcja siarczanów	Desulfovibrio
CO2	CH4	metanogeneza	Methanobacterium
Fe^3+	Fe^2+	Redukcja żelaza	Shewanella

Biodegradacja alkanów:

Alkany mogą podlegać degradacji według 4 różnych szlaków. Enzymami, którym zawdzięczamy zapoczątkowanie procesu asymilacji są monooksygenazy, czyli enzymy przyłączające atom tlenu bezpośrednio do cząsteczki węglowodoru. W wyniku tej reakcji powstają odpowiednie alkohole. Kolejne etapy utleniania węglowodorów alifatycznych odbywają się z udziałem dehydrogenaz.

Wymienione wcześniej 4 drogi degradacji alkanów to:

1. Oksydacja terminalna (utleniona zostaje grupa metylowa)

2. Oksydacja diterminalna (utlenione są obydwie końcowe grupy metylowe)

3. Oksydacja subterminalna (utlenienie następuje przy drugim od końca atomie węgla)

4. Droga przez alkeny gdzie w I etapie następuje utworzenie podwójnego wiązania pomiędzy ostatnimi atomami węgla, a następnie utlenienie do epoksydu.

Utlenione związki to odpowiednie kwasy karboksylowe ulegają dalszym przemianom w ramach β-oksydacji. A w przypadku drogi przez alkeny α-oksydacja. Po czym produkty tych przemian włączone są do szlaków centralnych.

Uwaga: Metabolity pośrednie powstające w ramach biodegradacji przez alkeny ulegają dalszym przemianom w ramach α-oksydacji.

Podstawowym elementem procesu bioremediacji jest badanie tzw. aktywności oddechowej, czyli sumy reakcji, w ramach których wiązany jest tlen i wydzielany CO₂. Parametr ten jest wskaźnikiem również aktywności oksygenaz – enzymów rozpoczynających proces bioremediacji wszystkich grup węglowodorów oraz enzymów odpowiedzialnych za rozszczepienie pierścienia aromatycznego oraz pierścienia węglowodorów cyklicznych. Narzędziem kontroli przebiegu procesu bioremediacji jest również aktywność dehydrogenaz – enzymów odpowiedzialnych za dalsze utlenienie związków pośrednich powstających w wyniku przyłączenia atomu lub cząsteczki tlenu.

Wykład 5 – 5.11.2009

Mikroorganizm y wykorzystywane w procesach bioremediacji:

Zdolność drobnoustrojów do biodegradacji składników ropy naftowej kształtowała się na przestrzeni wielu lat. Jest ona wynikiem adaptacji mikroorganizmów do warunków panujących w zanieczyszczonym środowisku oraz na wskutek szerokiego wykorzystania produktów petrochemicznych w wielu gałęziach przemysłowych. W tamkach w których składowane jest paliwo, rurociągach gromadzą się liczne gatunki głównie bakterii dla których węglowodory są podstawowym źródłem węgla. Mikroflora ta rozwija się najchętniej na granicy faz (fazy wodnej i olejowej). Rozwojowi drobnoustrojów sprzyja dostęp tlenu. W środowisku glebowym natomiast mamy do czynienia z mikroflorą charakterystyczną dla gruntów, które to mikroorganizmy wykształciły odpowiednie systemy enzymatyczne by likwidować substancję toksyczne zagrażające ekosystemowi glebowemu. Charakterystyczne jest to że z gleby możemy izolować mikroorganizmy wyspecjalizowane w degradacji określonych, wybranych ksenobiotyków.

W procesach bioremediacji wykorzystuje się zarówno bakterie, drożdże jak i grzyby. Mikroorganizmy te można znaleźć w wodach słodkich, morskich o różnych temperaturach i na różnej głębokości. Ekosystemy wodne są obfite w bakterie i drożdże natomiast w gruntach obserwuje się zwiększony udział grzybów i promieniowców. Mikroorganizmy, które zdolne są wykorzystania węglowodorów jako jednego źródła węgla jest niewielki procent. Całej zbiorowości mikroorganizmów szacuje się że jest to 0,01-0,1%. Natomiast pozostała grupa mikroorganizmów atakujących węglowodory to organizmy posiadające zdolność do wykorzystania różnych substratów. Wśród bakterii największe znaczenie mają bakterie należące do poszczególnych rodzajów: Achromobacter, Acinetobacter, Acinomecys (promieniowce), Aeromonas, Alcalignes, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Mycobacterium, Nocardia, Gordonia (Mikobacterie). W ostatnich latach szczególną uwagę zwraca się na przetrwalnikujące Aktinomyncety i Mikobacterie. Są one zwykle gram dodatnie i charakteryzują się zdolnością do biodegradacji węglowodorów alifatycznych, alicyklicznych jak i aromatycznych. Szczególnie ważną ich cechą jest to że atakują związki z podstawnikami. Bioremediacja prowadzona z wykorzystaniem mikroorganizmów naturalnie bytujących przebiega bardzo powoli. Mechanizmy adaptacyjne nie są na tyle silne, intensywne by doprowadzić do szybkiego usunięcia substancji toksycznych.

Na użytek procesów bioremediacji przygotowuje się konsorpcja mikroorganizmów wyspecjalizowanych pod kontem degradacji określonych substancji. Przygotowanie ich może obejmować:

1. Izolowanie mikroorganizmów z zanieczyszczonego miejsca, wyhodowanie tych mikroorganizmów w większej skali i powtórne wprowadzenie do zanieczyszczonego miejsca. Prace te uzupełnia się dodatkowymi doświadczeniami mającymi na celu dobranie dla tej mikroflory odpowiedniego źródła azotu, fosforu, ewentualnego wzbogacenia w odpowiednie makro i mikroelementy i ewentualną niewielką korektę pH. Izolacja i selekcja tych mikroorganizmów w najprostszym układzie polega na pobraniu próbki gleby, dodaniu do niej roztworu substancji odżywczych, które zainicjują wzrost mikroorganizmów oraz określonej dawki węglowodorów które stanowią zanieczyszczenie. Taką próbkę podaje się zwykle kilku dniowej hodowli wstrząsanej i można oczekiwać że rozwiną się w tym środowisku głównie mikroorganizmy zaangażowane w degradacje węglowodorów.

2. Bardziej złożonym sposobem uzyskania wyspecjalizowanych mikroorganizmów jest metoda stopniowego wzbogacania „sequential enrichment method”. Metoda ta polega na przeprowadzeniu cyklu hodowli w których substratami są grupy węglowodorów niezdegradowane w poprzednim etapie. W metodzie SEM wykorzystywanych jest kilka zwykle około 5 następujących po sobie hodowli. W pierwszej z nich źródłem węgla są węglowodory stanowiące zanieczyszczenie. Materiał biologiczny stanowi gleba zanieczyszczona (mikroorganizmy bytujące w tej glebie) i hodowla prowadzona jest w roztworze zawierającym niewielkie ilości substancji biogennych – inicjujących wzrost mikroorganizmów. Po kilku dniach hodowli zbiera się niezdegradowaną pozostałość węglowodorów i stosuje się jako źródło węgla w drugim etapie hodowli. Hodowle te szczepione są mieszaniną kultur z pierwszego etapu. Mieszaninę węglowodorów niezdegradowanych w drugim etapie używa się jako substrat w III etapie. Postępując według tej procedury uzyskuję się mieszaniny (konsorpcja mikroorganizmów) tolerujących i degradujących coraz to bardziej odporne na degradacje mieszaniny węglowodorów. Z każdym etapem natomiast „gubimy” mikroorganizmy, które bytują mimo obecności węglowodorów. W mieszaninie tej pozostają tylko mikroorganizmy wyspecjalizowane w kierunku degradacji – najtrudniej degradowalnych składników. Postępowanie to może zabezpieczyć nas przed dwoma najistotniejszymi, najważniejszymi pułapkami w procesach bioremediacji. I pułapka – charakterystycznym dla procesów bioremediacji jest to że proces oczyszczania przebiega stosunkowo szybko w pierwszej fazie, zwykle do usunięcia około 70% zanieczyszczeń i bardzo trudno w końcowej fazie oczyszczenia. W tej fazie pozostają już do degradacji związki trudno degradowalne. A z drugiej strony mikroflora gleby jest bardziej zaadaptowana do obecności węglowodorów i w tej sytuacji wprowadzenie do oczyszczonego miejsca mikroflory ukierunkowanej na najtrudniej degradowalne składniki może być wyjściem z sytuacji. II pułapka – jak wskazują wyniki procesów bioremediacji prowadzonych w większej skali może dojść w końcowej fazie bioremediacji do sytuacji w której namnożyło się zbyt dużo biomasy i obumarłe populacje stają się źródłem pożywek dla generacji aktualnie się rozwijających. Populacje te będą ignorować substancję zanieczyszczające ponieważ są zaadaptowane do obecności tych związków, a produkty rozkładu wcześniejszych generacji mikroorganizmów stanowią łatwiejsze źródło substancji biogennych. Metoda SEM przygotowująca materiał biologiczny w sposób ściśle ukierunkowany może nas zabezpieczyć przed wyżej opisanymi zjawiskami.

3. Do procesów bioremediacji kieruje się również mieszaniny mikroorganizmów hodowanych w laboratoriach jako monokultury o ściśle znanych uzdolnieniach enzymatycznych. Łączy się je w zestawy dwóch do pięciu szczepów i zestawy te określane są terminem biopreparaty kieruje się je do określonych miejsc zanieczyszczeń.

Podsumowanie: Mikroorganizmy stosowane w procesach bioremediacji przygotowywane są:

a) w oparciu o selekcję mikroorganizmów z zanieczyszczonego środowiska i są to niemal naturalne konsorpcja bytujące w danym ekosystemie (SEM).

b) w postaci biopreparatów – konsorpcjów przygotowanych w laboratoriach i w nich są mikroorganizmy dla których wykonano badania diagnostyczne i biochemiczne. Szczepy te mieszane są i są to głównie mieszaniny dwóch do pięciu szczepów i nie występują pomiędzy nimi zjawiska antagonizmu. Wszystkie kultury rozwijają się równolegle.

Charakterystycznym jest to że w procesach bioremediacji, w których wprowadzamy własną mikroflorę stosuje się zwykle zestawy mikroorganizmów. Wynika to z faktu że nieznany dotąd mikroflory która by wykorzystywała zdolności do degradacji wszystkich rodzajów węglowodorów – stąd konieczność stosowania mieszaniny kultur. Mimo że w procesach bioremediacji liczymy zwykle na zwiększony udział bakterii to nie należy zapominać o możliwościach w zakresie detoksykacji zanieczyszczeń grzybami. Szczególne znaczenie mogą tu mieć grzyby uczestniczące w rozkładzie materiałów celulozowych przede wszystkim są to grzyby białej zgnilizny i brunatnej. Szczepy te wydzielają poza komórkę enzymy, o niskiej specyficzności substratowej. Enzymy te mogą atakować nie tylko strukturę lignin i hemicelulozy ale również struktury węglowodorów polialifatycznych. Po reakcjach wstępnych produkty pośrednie mogą być następnie asymilowane przez bakterie. W ostatnich latach zwraca się również uwagę na lipazy produkowane głównie przez grzyby, które mogą przyspieszać biodegradację na poziomie β-oksydacji.

Czynniki fizyko-chemiczne sprzyjające intensyfikacji bioremediacji:

Zanieczyszczenia węglowodorami powodują, że w danym środowisku mamy do czynienia z relatywnym deficytem związków azotanowych. Stąd wynika potrzeba uzupełnienia tych związków by zachowana była proporcja 10:2. Źródło azotu dodawane jest zwykle w postaci typowych nawozów w agrotechnice w których głównym źródłem azotu są jony amonowe, niewielki dodatek azotanów i mocznika. Wszystkie te źródła azotu są również odpowiednie dla mikroflory glebowej. Nawozy te zawierają również związki fosforu zwykle w ilości 20-krotnie mniejszej niż związki azotu i jest to również proporcja odpowiednia dla mikroorganizmów.

Jak wynika z badań prowadzonych w naszej strefie klimatycznej najbardziej odpowiednie temperatury dla procesów bioremediacji to 12-25^oC. Wilgotność gruntu powinna wynosić około 20-30%, a struktura grunta powinna być na tyle luźna, by zapewnić wystarczający dopływ powietrza. Duże znaczenie ma parametr określany terminem aktywność wody, który jest miernikiem chłonności wody przez dany grunt i utrzymania wilgotności. Typowy zakres pH gruntu to od 5,5 do 7 i w tym zakresie pH mogą się rozwijać zarówno bakterie jak i grzyby glebowe.

Rozwiązania technologiczne stosowane do bioremediacji gruntów:

1. Landfarming i pryzma.

Metody te są stosunkowo proste i niedrogie, dość powszechnie stosowane do oczyszczania gruntu zanieczyszczonego substancjami ropopochodnymi. Oczyszczanie tą metodą przebiega jednak stosunkowo długo i wymaga kontroli wielu parametrów. Podczas tego procesu rozwijają się nie tylko mikroorganizmy uczestniczące w procesie degradacji ale i inne mikroorganizmy glebowe. Tak więc trudno jest kontrolować ten proces pod względem mikrobiologicznym i biochemicznym, a nie odpowiednia mikroflora namnożona w dużych ilościach może stanowić źródło węgla dla rozwoju kolejnych generacji mikroorganizmów oczyszczając tym samym asymilacje zanieczyszczeń. Przy aktualnym stanie wiedzy potrafimy w laboratorium wyhodować zaledwie 1% gatunków bytujących w gruncie. O istnieniu pozostałych gatunków wiemy z analizy DNA mikroflory glebowej tak więc w warunkach "polowych" bez dysponowania odpowiednią aparaturą nie jesteśmy w stanie kontrolować mikroflory rozwijającej sie podczas prowadzenia procesu Landferningu. Procesy te polegają na utworzeniu odpowiednio skonstruowanych rowów ziemnych lub pryzm.

Rys.

W rowach ziemnych po odpowiednim ich zaizolowaniu umieszcza się ruszt na którym usypuje się warstwę spulchnioną zanieczyszczonego gruntu. Pod rusztem zainstalowane są rury i dreny umożliwiające zbieranie odcieku zanieczyszczonego gruntu oraz wtłaczanie powietrza. Pożywki dostarczane są zwykle z powierzchni gruntu i zraszanie gruntu odbywa się tą drogą.

Technologia pryzm jest w pewnym sensie "odwróceniem" technologii Landferningu i polega na uformowaniu pryzmy zanieczyszczonego gruntu, przy czym pod próżnią umieszcza się sekcje przy pomocy której do pryzmy może być wtłaczanie powietrza oraz wpompowywane pożywki i woda. Tą drogą może być również oddzielany odciek. Pryzmy zwykle okrywane są materiałem zabezpieczającym przed zbyt szybkim parowaniem wody i zabezpieczają utrzymanie w dłuższym czasie w miarę stabilnej temperatury.

W warunkach Landferningu i pryzmy bardzo trudno uzyskać wysoki stopień oczyszczania. Początkowa faza oczyszczania trwa stosunkowo szybko. Druga faza powolnego oczyszczania trwa bardzo długo. W technologiach tych duże znaczenie ma bioagumentacja, czyli wprowadzenie wyspecjalizowanych mikroorganizmów w stosunku do zanieczyszczeń. Kontrola namnażania tej grupy mikroorganizmów, sprostanie ich wymaganiom pokarmowym może przyspieszyć proces biodegradacji. W końcowej fazie procesu dotkliwe są problemy niskiej biodostępności węglowodorów dla mikroorganizmów. Przy tych rozwiązaniach technologicznych stosowanie środków powierzchniowo - czynnych nie daje zbyt dobrych rezultatów. Wśród rozwiązań stosowanych w tych technologiach jest wtłaczanie powietrza pod zwiększonym ciśnieniem co powoduje większe rozluźnienie struktury gruntu i ułatwienie ulatniania się niżej cząsteczkowych zanieczyszczeń. Pewną modyfikacją procesu Landferningu jest projektowanie tzw. komór ziemnych w których można prowadzić przemiennie procesy tlenowe i beztlenowe co jest korzystne dla biodegradacji węglowodorów poliaromatycznych i policyklicznych. Rozkład przebiega w pewnych fazach bardziej intensywniej w warunkach beztlenowych. W komarach tych proces może być znacznie o wiele precyzyjnie kontrolowany.

2. Kompostowanie – dojrzały kompost - w rozumieniu technologii bioremediacji jest procesem w którym do zanieczyszczonego gruntu dodaje się dojrzały kompost uzyskany z rozkładu różnego typu odpadów roślinnych. Dojrzały kompost taki zawiera wiele cennych substancji mineralnych, enzymy oraz spory mikroorganizmów, które brały udział w procesie typowego kompostowania. Strategia kompostowania polega na przygotowaniu gruntu, który ma być poddany procesowi bioremediacji (rozluźnienie struktury). Następnie należy skontrolować poziom zanieczyszczeń by ich zawartość była na poziomie na tyle niskim by być nietoksyczne dla mikroorganizmów oraz należy ustalić ten poziom przed rozpoczęciem oczyszczania z uwzględnieniem procesów biosorpcji zanieczyszczeń do matrycy gruntu. Zjawisko biosorpcji może się okazać na tym etapie korzystne ponieważ może powodować pozorne obniżenie stężenia biodostępnych zanieczyszczeń, a tym samym przyspieszać rozwój mikroorganizmów zdolnych do ich degradacji. W procesie kompostowania korzystna jest również obecność enzymów głównie tych uczestniczących w rozkładzie związków celulozowych. Enzymy te będą powodowały rozkład substancji roślinnej, a tym samym stopniowe uwalnianie substancji toksycznych. W tym etapie proces wymaga precyzyjnej kontroli nie tylko poziomu zanieczyszczeń ale i innych organicznych związków węglowych oraz organicznych i nieorganicznych związków azotowych. Pamiętać należy, że proces bioremediacji z dodatkiem kompostu jest procesem tlenowych i przy właściwych proporcjach C:N:P oraz dostępie tlenu i właściwym dodatku dojrzałego kompostu może zintensyfikować proces rozkładu zanieczyszczeń. Intensywna faza biodegradacji przebiega zwykle ze znacznym wzrostem temperatury oczyszczanej masy gruntu. Temperatura jest tu parametrem wymagającym szczególnej kontroli bowiem zbyt wysoka może doprowadzić do wyniszczenia mikroflory prowadzącej proces biodegradacji. Po osiągnięciu poziomu zanieczyszczeń takiego, który jest tolerowany przez mikroflorę glebową proces biodegradacji przebiega wielokrotnie wolniej i wymaga od technologa wypracowania szczególnych strategii w tym etapie. Zjawisko biosorpcji w tej fazie jest wysoce niekorzystne i jednym ze sposobów w tej fazie jest dodawanie środków powierzchniowo - czynnych, które uwodniły by te zanieczyszczenia z matrycy gruntu. W pewnych przypadkach można zaryzykować zastosowanie kolejnej dawki dojrzałego kompostu i obecne tam enzymy rozłożyły by materie organiczną gruntu uwalniając tym samym uwięzione w niej cząsteczki zanieczyszczeń. Etap wymaga również ścisłej kontroli organicznych i nieorganicznych związków węglowych i azotowych, przy czym szczególnie ważnym jest ograniczenie poziomów organicznego źródła węgla. Jak wynika z najnowszych badań procesy kompostowania prowadzone w profesjonalny sposób stanowią wysoce skuteczną technologie usuwania zanieczyszczeń takich jak: węglowodory monoaromatyczne (benzen, toluen), materiały wybuchowe (2,3,4,6 - nitrotoluen), PC, węglowodory poliaromatyczne i pestycydy. W sensie fizycznym proces kompostowania dzieli się na: mezofilny (rozpoczęcie procesu kompostowania), termofilny (faza intensywnego oczyszczania), etap chłodny (jest to okres spowolnienia degradacji substancji organicznej) i etap dojrzewania. W ostatnim etapie używa się również pojęcie starzenia się zanieczyszczeń i oznacza on sorpcję resztkowych zanieczyszczeń do matrycy gruntu z jednoczesną tolerancją mikroorganizmów na ich obecność. Zjawiska te utrudniają degradację w ostatnim etapie.

Najważniejszymi cechami procesu kompostowania są:

-używanie dojrzałego kompostu

-wykorzystanie potencjału enzymów, które brały udział w tworzeniu tego kompostu w procesie bioremediacji

-prowadzenie procesu oczyszczania w warunkach tlenowych, w których produkty działania tych enzymów mogą być szybko wykorzystane do wzrostu mikroorganizmów uczestniczących w procesie biodegradacji.

Tak więc w tym procesie wykorzystywany jest nie tylko potencjał metaboliczny mikroorganizmów ale i enzymów wytworzonych wcześniej dla potrzeb rozkładu materii organicznej. Procesy kompostowania prowadzi się w rowach ziemnych, otwartych stosach, silosach, bębnach obrotowych i różnego typu zbiornikach otwartych.

3. Bioreaktory - w procesach bioremediacji stosuje się:

a) bioreaktory kolumnowe - to zwykłe rury poziome do których wprowadza się zanieczyszczony grunt, którego strukturę rozluźnia się dodatkiem materiałów porowatych np. słomy i innych materiałów ułatwiających przepływ powietrza. Do rury wprowadzane jest powietrze oraz odpowiednimi przewodami doprowadzane są pożywki, woda i zbierany jest odciek. Niekiedy bioreaktorem tym nadaje się wolny ruch obrotowy. To rozwiązanie technologiczne daje możliwość precyzyjnej kontroli w masie oczyszczania i utrzymania stałych warunków temperatury i wilgotności.

b) bioreaktory obrotowe lub bębnowe - te bioreaktory jakie takie nie są wyposażone w systemy mieszania ale dzięki zamocowaniu podobnym jak w betoniarkach zanieczyszczony grunt może być podczas obrotu przerzucany a tym samym napowietrzany. Rozwiązanie to jest stosunkowo często stosowane ze względu na dostępność tego typu urządzeń.

c) bioreaktory szlamu - szczególny rodzaj bioreaktorów stanowią bioreaktory szlamu i służą do oczyszczania zanieczyszczeń zalegających w osadach dennych zawierających głównie substancję wysoce zredukowane i wymagających dostarczenia dużej ilości tlenu. W bioreaktorach tych stosuje się zwykle wysoce sprawne mieszadło typu ślimakowego umożliwiające intensywne odnawianie powierzchni kolejnych partii szlamu.

Modyfikacje procesów bioremediacji:

1. Połączenie procesu fitobioremediacji z bioagumentacją - strategia ta polega na wprowadzeniu do strefy przykorzeniowej roślin dodatkowych kultur mikroorganizmów wyspecjalizowanych w biodegradacji danego zanieczyszczenia. Przy tym rozwiązaniu biodegradacja przebiega z udziałem nie tylko roślin (enzymów roślinnych) ale i mikroorganizmów tzw. ryzobakterii naturalnie tam bytujących i tych wprowadzanych do tego układu.

2. Z wprowadzeniem dodatku syntetycznych środków powierzchniowo - czynnych - w przypadku silnej sorpcji substancji stanowiących zanieczyszczenie do cząstki materii organicznej i nieorganicznej gruntu dodaje sie do oczyszczanego gruntu odpowiednie sulfuktanty. Związki te obniżają napięcie powierzchniowe na granicy faz (woda - zanieczyszczenie) i przyśpieszają transport hydrofobowych związków do fazy wodnej. W procesach bioremediacji znalazły zastosowanie następujące preparaty: SDS, Triton X-100, Brij. Preparaty te dodaje sie w ściśle określonych ilościach nie tylko ze względu na to, że same jako takie stanowią zanieczyszczenie ale również ze względu na to że ich użycie w nieodpowiednich proporcjach może nie przynieść efektu desorpcji węglowodorów.

3. Kometabolizm - niektóre substancje ksenobiotyczne nie mogą być przyswajane przez mikroorganizmy i ich degradacja może następować jedynie w obecności innych podobnych strukturalnie związków (benzen, toluen). Te dodatkowe substancje nazywa się kosubstancjami. Dzięki stosunkowo niskiej specyficzności enzymów biorących udział w biodegradacji. Enzymy wytworzono na asymilacji kosubstratów mogą być wykorzystane do rozkładu niedegradowalnego ksenobiotyku. Przykład może stanowić biodegradacja ortoksylenu w obecności toluenu oraz rozkład związków poliaromatycznych w obecności rozgałęzionych cyklodekstryn.

Wykład 6 - 10.12.2009

Innowacje w zakresie technologii bioremediacji:

1. Technologie z wykorzystaniem procesu wstępnego utlenienia (reakcja Fentona) - wśród substancji stosowanych do wstępnego utlenienia wymienia się nadtlenek wodoru i ozon. Obie te substancję użyte w nadmiernym stężeniu mogą powodować zniszczenie mikroflory bytującej w zanieczyszczonym środowisku. Dodatkowym mankamentem jest to że reakcja Fentona (z dodatkiem H₂O₂ w obecności jonów żelaza) najlepsze efekty daje przy pH 3 najwyższej 4. Gleby i wody z zasobów wodnych mają pH powyżej 5 i reakcja Fentona w tych warunkach nie przebiega zbyt efektywnie. Przy stosowaniu tych technologii należy również zwrócić uwagę że zarówno H₂O₂ jak i O₃ to substancje bakteriobójcze i użyte w nadmiernym stężeniu mogą powodować wyniszczenie mikroflory bytującej w oczyszczanym środowisku. Tak więc przed zastosowaniem procesu wstępnego utlenienia przeprowadzić należy próby wstępne mające na celu dobranie odpowiedniej dawki czynnika utleniającego jak również ustalenie pH przy którym reakcja jeszcze zachodzi. Efekty reakcji wstępnego utlenienia są zazwyczaj bardzo dobre i procesy te są często stosowane. Jednakże podkreślane jest by proces przeprowadzony w oparciu o najnowszą wiedze. By podczas tego procesu nie nastąpiły zbyt dotkliwe, uboczne, niepożądane efekty: zakwaszenie środowiska, zniszczenie struktury gruntu, wyniszczenie życia w gruncie.

2. Bioremediacja wspomagana preparatami enzymatycznymi - w ramach badań nad procesami zachodzącymi w sposób naturalny w glebie stwierdzono że enzymy pozakomórkowe wytwarzane m.in. przez grzyby białej i brunatnej zgnilizny (z klasy Basidomycetes). Wytwarzane enzymy uczestniczą w rozkładzie materiałów celulozowych i enzymy te mogą również powodować wstępne utlenienie substancji zanieczyszczającej np. węglowodorów poliaromatycznych czy PCB. Wśród tych enzymów są oksygenazy, peroksydazy czy lakkaza. Substancję zanieczyszczające utlenianie z udziałem tych enzymów stają sie łatwiej przyswajalne dla mikroorganizmów. Jak wskazują dane korzystnym w rozkładzie węglowodorów jest dodatek lipaz - enzymów rozkładających tłuszcze. Rola tych enzymów nie jest w pełni wyjaśniona. Prawdopodobnie chodzi o intensyfikację przemian towarzyszących β-oksydacji. Zastosowanie preparatów lipaz wprowadzanych do oczyszczanego środowiska po rozpoczęciu procesów oczyszczania z udziałem mikroorganizmów daje pozytywne efekty. Interesującym jest również to, że w obecności tych enzymów przyspieszeniu ulegają końcowe fazy procesu bioremediacji.

3. Stosowanie syntetycznych i naturalnych związków powierzchniowo - czynnych - surfaktantów - mikroorganizmy uczestniczące w rozkładzie związków hydrofobowych, węglowodorów, tłuszczów wytwarzają związki powierzchniowo - czynne powodujące:

a) zwiększenie rozpuszczalności tych związków w fazie wodnej

b) ich emulgacje do mikro i makro kropli co powoduje zwiększenie powierzchni kontaktu pomiędzy fazą wodną a fazą hydrofobową

Mikro krople mogą być transportowane do wnętrza komórki. W przypadku makro kropli asymilacja węglowodorów odbywa się dzięki zasiedleniu tej makro kropli przez komórki mikroorganizmów. Proces utlenienia węglowodorów zachodzi dzięki działaniu membranowych oksygenaz utleniających substrat. Produkty utlenienia transportowane do komórki i tam proces asymilacji kontynuowany jest. Zarówno proces wnikania mikro kropli do komórki jak i proces zasiedlania makro kropli przez komórki zachodzi między innymi dzięki tworzeniu związków powierzchniowo - czynnych. Generalnie rola biosurfaktantów polega na zwiększeniu biodostępności węglowodorów dla mikroorganizmów, chodzi o ich uwolnienie z matrycy gruntu bądź lepsze rozproszenie w środowisku wodnym. Technologia stosowania środków powierzchniowo - czynnych wymaga przeprowadzenia dokładnych prób wstępnych mających na celu określenie optymalnego stężenia biosurfaktanta.

Strategia:

1) procesy utleniania i redukcji - mikroorganizmy mogą redukować metale dla obniżenia ich biodostępności lub utleniać te jony np. szczepy Pseudomonas utleniają arsin do arsenianu, selenin do selanianu. Formy bardziej utlenione są mniej toksyczne. Szczepy Desulfiovibrio redukują selaniany i selaniny do elementarnego selenu który jest nietoksyczny, szczepy Pseudomonaas redukują chromiany (Cr⁺⁶ - najbardziej toksyczny) do związku nierozpuszczalnego - imertyzacja, w którym chrom jest +3. Ta przemiana może zachodzić w warunkach tlenowych. Obserwowane są również reakcje odwrotne i tak szczepy Bacillus utleniają selen do toksycznego selanianu, zwiększając jego selektywność. Szczepy Clostridium w warunkach beztlenowych utleniają sole kadmu, chromu, ołowiu i cynków. Wszystkie wymienione uzdolnienia mikroorganizmów w zależności od rodzaju zanieczyszczenia i warunków tam panujących tlenowe lub beztlenowe może wykorzystać je w celu zwiększenia relatywności tych mikroorganizmów lub immobilizacji poprzez ich wytrącenie lub związanie w kompleks.

2) biosorpcja, immobilizacja metalu przez biomasę komórek - kompleksacja (wiązanie kompleksowe) zarówno bakterie, algi jak i grzyby zdolne są do wiązania i sorpcji metali. Proces wiązania metali może zachodzić na 2 sposoby:

a) metale mogą podlegać niespecjalizowanemu wiązaniu na powierzchni ściany komórkowej

b) wiązanie to może mieć charakter bardziej specyficzny i odbywa się we wnętrzu komórek. Proces ten przebiega różnie w zależności od rodzaju mikroorganizmów, metalu i pH. Przy niskim pH wiązanie metalu jest ograniczone z wyjątkiem chromianów i selanianów.

Spośród jonów metali kompleksacji ulegają najłatwiej jony w następującym porządku: złoto, lantanu, miedzi i kadmu. W przypadku gleby obecne tam substancje towarzyszące powodują duże odstępstwa od wyników pozostałych układach w laboratoriach.

3) mobilizacja, uruchomienie - działanie mikroorganizmów polegające na szybkim wyrzuceniu, uwolnieniu związku chemicznego z jednoczesną zmianą jego toksyczności. Klasycznym przykładem mobilizacji (zwiększenia ruchliwości danych jonów) jest proces metylacji. Metylacja powoduje zwiększenie lotności jonów metali i toksyczności danego jonu. Przyłączone do jonu metalu grupy metylowe bądź alkilowe powodują, że związki te stają się bardziej lipofilne i bardziej są transportowane przez membranę. Konwersja metalu z formy jonowej (nieorganicznej) w formę organiczną jest zjawiskiem bardzo ważnym z ekologicznego punktu widzenia. Metylacja jonów Hg powoduje utworzenie CH₃Hg⁺ i to połączenie jest 10:100 razy toksyczne od nieorganicznego Hg. Metylortęć jest natomiast bardziej lotna i dzięki temu szybko zostaje przekazana do atmosfery z danego środowiska. Oprócz rtęci metylowaniu mogą również ulegać ołów, arsen i selen. Zjawiska te zachodzą w sposób naturalny i praktycznie brak jest konkretnych technologii intensyfikujących zachodzenie tych procesów.

Podsumowanie: Problematycznym jest użycie przy omawianiu tych zjawisk pojęcia remediacji ponieważ mikroorganizmy nie powodują usunięcia toksycznych jonów metali a jedynie ich unieruchomienie bądź zmniejszenie toksyczności. Mechanizmy funkcjonujące w mikroorganizmach są zbliżone do tych jakie znamy z chemii nieorganicznej i organicznej. Chodzi tu o reakcje utlenienia i redukcji:

-zmiany stopnia toksyczności

-unieruchomienie metali poprzez zmniejszenie ich rozpuszczalności bądź związania w kompleksy.

Bardzo pospolitym mechanizmem jest zmiana pH środowiska. Pamiętać należy o tym że w środowisku kwaśnym większość soli jest o wiele łatwiej rozpuszczalna a więc bardziej toksyczna niż przy wysokich wartościach pH. Wszystkie wymienione te zjawiska wykorzystuje się nie tylko dla potrzeb zanieczyszczonych terenów, ale i w kopalniach dla pozyskania wybranych metali np. molibdenu, wolframu, tytanu, których wydobycie z ubogich rud jest nieopłacalne. Jony tych metali ulegają łatwo sorpcji na powierzchni komórek wybranych grup bakterii, tym samym ich stężenie ulega koncentracji i ich wydobycie staje się bardziej efektywne. Instalacje takie są powszechnie stosowane w Ameryce Północnej i Południowej, w wybranych krajach azjatyckich i technologie te są rozbijane.

PYTANIA:

-schemat od przemka, akceptory elektronów, warunki procesów, mikroorganizmy, strategie