Aleksandra Ruszkowska

Katarzyna Zagórska

Ćwiczenie I

Amfoteryczny charakter

aminokwasów i białek

1. Cel ćwiczenia:

Wykonanie krzywych miareczkowania glicyny oraz kwasu asparaginowego na podstawie uzyskanych wyników. Określenie punktów izoelektrycznych, pK grup funkcyjnych i przedziałów buforowania badanych aminokwasów. A także wyznaczenie punktu izoelektrycznego dla białka – kazeiny.

Zestawienie wyników.

Tabela 1. :

	1	2	3	4	5	6	7	8	9
pH	2,57	2,72	2,88	3,05	3,22	3,39	3,54	3,7	3,86
Zmętnienie	-	+	+	++	+++	++	-	-	-
Osad	-	-	-	+	+++	-	-	-	-

Tabela 2. Miareczkowanie kontrolne wody kwasem i zasadą.

a)kwasem

pH	Vtitranta [ml]
4,27	0,005
3,81	0,01
3,58	0,015
3,41	0,02
3,29	0,025
3,2	0,03
3,11	0,035
3,05	0,04
2,99	0,045
2,94	0,05
2,9	0,055
2,86	0,06
2,82	0,065
2,77	0,07
2,74	0,075
2,69	0,08
2,67	0,085
2,64	0,09
2,62	0,095
2,6	0,1
2,57	0,105
2,55	0,11
2,53	0,115
2,52	0,12
2,51	0,125
2,5	0,13
2,46	0,135
2,44	0,14
2,42	0,15
2,38	0,16
2,37	0,17
2,36	0,18
2,35	0,19
2,32	0,2
2,3	0,21
2,29	0,22
2,27	0,23
2,25	0,24
2,23	0,25
2,19	0,3
2,16	0,35
2,13	0,4
2,1	0,45
2,06	0,5
2,04	0,55
2,02	0,6
1,99	0,65
1,96	0,7
1,94	0,75
1,91	0,8
1,83	0,9
1,76	1
1,7	1,1
1,65	1,2
1,61	1,3
1,56	1,4
1,53	1,5
1,51	1,6
1,46	1,7

b) zasadą

pH Vtit [ml]
9,82
10,35
10,59
10,73
10,87
10,95
11,01
11,06
11,14
11,21
11,26
11,75
11,94
12,05
12,12
12,18
12,32
12,41
12,48
12,55
12,64
12,73
12,78
12,85
12,9
12,92
12,94
12,96
12,98
13

Tabela 3. Wyniki dla kwasu asparaginowego.

	Kwas asparaginowy - miareczkowanie zasadą
1	2,85
2	2,89
3	2,92
4	2,95
5	3,08
6	3,19
7	3,29
8	3,39
9	3,49
10	3,59
11	3,68
12	3,78
13	3,87
14	3,97
15	4,08
16	4,1
17	4,12
18	4,24
19	4,38
20	4,55
21	4,59
22	4,64
23	4,69
24	4,73
25	4,79
26	4,86
27	4,93
28	5,02
29	5,12
30	5,26
31	5,46
32	6
33	6,2
34	6,41
35	6,73
36	7,15
37	7,51
38	7,75
39	7,9
40	8,03
41	8,13
42	8,22
43	8,29
44	8,35
45	8,43
46	8,48
47	8,53
48	8,63
49	8,74
50	8,83
51	8,91
52	8,98
53	9,04
54	9,26
55	9,43
56	9,56
57	9,68
58	9,78
59	9,88
60	9,97
61	10,06
62	10,15
63	10,24
64	10,33
65	10,44
66	10,56
67	10,69
68	10,86
69	11,07
70	11,11
71	11,16
72	11,2

Tabela 4. Wyniki dla glicyny.

Lp.	Glicyna - miareczkowanie kwasem
1.	5,6	0,005
2.	4,95	0,01
3.	4,64	0,015
4.	4,55	0,02
5.	4,43	0,025
6.	4,37	0,03
7.	4,32	0,035
8.	4,28	0,04
9.	4,23	0,045
10.	4,2	0,05
11.	4,16	0,055
12.	4,13	0,06
13.	4,1	0,065
14.	4,07	0,07
15.	4,04	0,08
16.	4	0,09
17.	3,96	0,1
18.	3,91	0,11
19.	3,9	0,12
20.	3,85	0,13
21.	3,83	0,14
22.	3,79	0,15
23.	3,77	0,16
24.	3,74	0,17
25.	3,71	0,18
26.	3,67	0,19
27.	3,65	0,2
28.	3,6	0,25
29.	3,56	0,3
30.	3,52	0,35
31.	3,49	0,4
32.	3,47	0,45
33.	3,43	0,5
34.	3,3	0,6
35.	3,19	0,7
36.	3,1	0,8
37.	3,02	0,9
38.	2,95	1
39.	2,88	1,1
40.	2,82	1,2
41.	2,76	1,3
42.	2,71	1,4
43.	2,63	1,5
44.	2,56	1,7
45.	2,47	1,9
46.	2,38	2,1
47.	2,29	2,3
48.	2,22	2,5
49.	2,14	2,7
50.	2,06	2,9
51.	1,98	3,1
Glicyna - miareczkowanie zasadą
1.	6,75	0,005
2.	7	0,01
3.	7,21	0,015
4.	7,35	0,02
5.	7,49	0,025
6.	7,59	0,03
7.	7,66	0,035
8.	7,73	0,04
9.	7,78	0,045
10.	7,86	0,055
11.	7,91	0,065
12.	7,95	0,075
13.	7,97	0,085
14.	8,11	0,135
15.	8,21	0,185
16.	8,29	0,235
17.	8,37	0,285
18.	8,4	0,335
19.	8,66	0,435
20.	8,83	0,535
21.	8,97	0,635
22.	9,07	0,735
23.	9,16	0,835
24.	9,24	0,935
25.	9,31	1,035
26.	9,37	1,135
27.	9,49	1,335
28.	9,59	1,535
29.	9,69	1,735
30.	9,78	1,935
31.	9,87	2,135
32.	9,95	2,335
33.	10,04	2,535
34.	10,13	2,735
35.	10,22	2,935
36.	10,32	3,135
37.	10,42	3,335
38.	10,55	3,535
39.	10,72	3,735
40.	10,92	3,935
41.	11,05	4,035
42.	11,21	4,135
43.	11,4	4,235
44.	11,58	4,335
45.	11,75	4,435
46.	11,87	4,535
47.	11,96	4,635
48.	12,04	4,735
49.	12,11	4,835
50.	12,21	5,035
51.	12,29	5,235
52.	12,35	5,435
53.	12,4	5,635
54.	12,5	6,135
55.	12,57	6,635

Tabela 5. Wyniki otrzymane dla badanych aminokwasów.

Aminokwas	Wartość obliczona	Wartość literaturowa
GLICYNA	pI	6,13
	pK1	2,47
	pK2	9,78
KWAS ASPARAGINOWY	pI	3,27
	pK1	2,16
	pK2	8,91
	pK3	4,38

Wykresy:

1. Krzywa miareczkowania wody.

1. Krzywa miareczkowania glicyny.

1. Krzywa miareczkowania kwasu asparaginowego.

1. Krzywa miareczkowania glicyny i asparaginianu.

Przykładowe obliczenia:

Równanie regresji dla miareczkowania wody kwasem:

• Dla pierwszej wartości pH

ln(x)=(2,95-1,6964)/ -0,422

x=e^((2,95-1,6964)/ -0,422)

Równanie regresji dla miareczkowania wody zasadą:

• Dla pierwszej wartości pH

2,85=0,3798ln(x)+12,191

x=e^((2,85- 12,191)/0,3798)

W celu sporządzenia krzywych miareczkowania wody wyznaczono liczności titranta:

Z Wykresu A. odczytano jaka objętość kwasu (VH2Otitranta) została zużyta do zmiareczkowania wody zawartej w roztworze aminokwasu w każdym etapie miareczkowania roztworu (Tabele 3. i 4.).

Wyznaczono objętość titranta zużytą do zmiareczkowania cząsteczek aminokwasu w badanym roztworze.

V^aa= 0,005-0,051= -0,046

Następnie obliczono jaka ilość titranta przypada na liczność aminokwasu w roztworze n_aa.

Sporządzono wykres krzywych miareczkowania aminokwasów kwasem i zasadą – Wykres B i C. Odczytano z niego wartości pK dla grup funkcyjnych aminokwasów i na tej podstawie obliczono ich punkt izoelektryczny pI.

Obliczenie pI kwasu asparaginowego:

pI= (4,38+2,16)/2=3,27

Wnioski.

a) Punkt izoelektryczny białka lub aminokwasu to taka wartość pH, w której ładunek sumaryczny cząsteczki równa się zeru oraz posiada najniższą rozpuszczalność, co powoduje przy jego dużych stężeniach wytrącenie z roztworu w postaci osadu bądź widocznego zmętnienia.

W przeprowadzonym doświadczeniu największa ilość osadu i zmętnienia została zaobserwowana w pH 3,22 , co wskazuje na obecność punktu izoelektrycznego w tym punkcie. Dane literaturowe (http://en.wikipedia.org/wiki/Casein) wskazują, że pI kazeiny wynosi 4,6. Rozbieżność wyniku doświadczalnego od literaturowego spowodowana może być niedokładnym rozcieńczeniem kwasu octowego oraz złym porównaniem ilości zmętnienia i osadu w próbkach.

b) Miareczkowanie kontrolne wody , roztworów glicyny oraz kwasu asparaginowego.

Na podstawie otrzymanych wyników przeprowadzonych eksperymentów można wnioskować, że badane aminokwasy maja charakter amfoteryczny, tj. mają zdolność do reagowania z kwasami i zasadami w zależności w jakim środowisku się znajdują. Wówczas jon obojnaczy w środowisku zasadowym zachowuje się jak słaby kwas i powstaje sprzężona z nim zasada.

Otrzymane wartości pK, pI aminokwasów są zbliżone do wartości literaturowych. Niewielkie rozbieżności mogą wynikać z niedokładności pehametru użytego do doświadczenia lub niedokładnym odczytaniem wartości VH2Otitranta z wykresu miareczkowania kontrolnego wody.