GENE CLONING & DNA ANALYSIS

KLONOWANIE GENÓW I ANALIZA DNA

Rozdział 1.

Dlaczego klonowanie genów i analiza DNA są ważne ?

W połowie 19 wieku Grzegorz Mednel sformułował zespół zasad wyjaśniających, na czym polega dziedziczenie cech biologicznych. Podstawowym założeniem tych praw jest to, że każda dziedziczna właściwość organizmu jest kontrolowana przez czynnik zwany genem, który jest fizycznie obecny gdzieś w komórce. Prawa Mendla powstałe w 1900 roku dały początek genetyce, nauce mającej na celu zrozumienie, czym dokładnie są geny i jak one pracują.

1. Wczesny rozwój genetyki

Przez pierwszych 30 lat nowa nauka rozwijała się w zaskakującym tempie. Idea, że geny ulokowane są w chromosomach została zaproponowana w 1903 roku przez W. Suttona i została potwierdzona eksperymentalnie w 1910 przez T.H. Morgana. Morgan i jego koledzy później rozwinęli technikę mapowania genów a w 1922 roku przedstawili zrozumiałą analizę wzajemnego ulokowania 2000 genów w 4 chromosomach muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Mimo tych badań aż do lat 40. nie ma naukowych dowodów co do molekularnej natury genów. Aż do odkryć MacLeod’a, McCarty’ego i Avery’ego w 1944 roku, i Hershey’a oraz Chase’a w 1952 nie wierzono, że tokwas deoksyrybonukleinowy (DNA) jest nośnikiem materiału genetycznego: do tego czasu sądzono, że geny zbudowane są z białek. Odkrycie roli DNA było niesamowicie stymulowało badania genetyczne i wielu sławnych biologów (wśród których największy wpływ mieli Delbruck, Chargaff, Crick i Monod) rozpoczęło drugi wielki wiek genetyki. W ciągu 14 lat pomiędzy 1952-1966 struktura DNA została zbadana, złamano kod genetyczny a także opisano procesy transkrypcji i translacji.

1. Odkrycie klonowania genów i PCR

Nowa generacja biologów molekularnych wciąż niezadowolona była z dotychczasowych osiągnięć technicznych i badawczych i aż do późnych lat 60. nie poznano dokładnych technik służących do badania genów. Lata 1971-1973 można uznać jako okres niezwykle szybkiego rozwoju badań nad genami.

Odkryto wówczas wiele metod wykonania eksperymentów, które dotychczas były tylko na kartce, i to z sukcesem. Te metody określane wspólną nazwą technologia rekombinacji DNA lub inżyniera genetyczna dały wstęp do klonowania genów i początek złotej erze genetyki. Zapoczątkowały one szybkie i skuteczne sekwencjonowanie DNA i pozwoliły poznać genom człowieka który został skompletowany w roku 2000. Bodźcem do tych badań była chęć poznają jak geny mogą być przyczynami groźnych chorób zwłaszcza raka. Jak również dzięki tym badaniom zrodziła się biotechnologia, gdzie chciano wykorzystać posiadana wiedze o genach do produkcji białek i innych komponentów w procesach przemysłowych. W 1980 roku było jasne, że istnieje potrzeba takiej techniki, które stanie na wysokości zadań jakie postawiono przed genetyką. Kary Mullis w 1985 odkryła PCR. Archegenetyka, ekologia molekularna, DNA kryminalne były nowymi dziedzinami które mogły się rozwinąć dzięki PCR. Mogły one dać odpowiedzi na temat ewolucji człowieka oraz na to jaki wpływ mają zmiany środowiska na biosferę.

1.3 Czym jest klonowanie?

Czym jest dokładnie klonowanie? Najprostszą odpowiedzią jest prześledzenie etapów eksperymentu klonowania na rysunku poniżej (Figure 1.1):

1. Fragment DNA zawierający pożądany gen do wklonowania, jest wprowadzany do kolistej cząsteczki zwanej wektorem, aby otrzymać zrekombinowaną cząsteczkę DNA.

2. Wektor transportowany jest do komórki gospodarza, którą jest zazwyczaj bakteria, choć inne typy komórek też mogą być używane

3. W komórce gospodarza wektor się powiela, produkując setki identycznych kopii, nie tylko swoich ale także genu który niesie.

4. Kiedy komórki gospodarza się dzielą, kopie zrekombinowanego DNA są przekazywane do progenów i następuje dalsza replikacja wektora.

5. Po wielu podziałach powstaje kolonia, lub klon, identycznych komórek gospodarza. Każda komórka w klonie zawiera jedną lub więcej kopii zrekombinowanej cząsteczki DNA; gen niesiony przez zrekombinowaną cząsteczkę został sklonowany.

4. Czym jest PCR?

Reakcja łańcuchowa polimerazy znacznie różni się od klonowania. Zamiast serii manipulacji na żywych komórkach, PCR przeprowadza się w pojedynczej probówce poprzez zmieszanie DNA z reagentami i umieszczeniu próbki w termocyklerze – urządzeniu umożliwiającym inkubację mieszaniny w odpowiednich temperaturach. Podstawowe kroki PCR (Figure 1.2):

1. Mieszanina jest podgrzewana do temperatury 94 ^OC, w której dochodzi do zerwania wiązań wodorowych które trzymają razem dwie nici DNA, powodując denaturację cząsteczki.

2. Mieszanina jest chłodzona do 50-60 ^OC. Dwie nici DNA mogłyby się ponownie połączyć w tej temperaturze, ale większość się nie łączy ponieważ w mieszaninie jest nadmiar krótkich cząsteczek DNA, zwanych oligonukleotydami lub starterami, które przyłączają się do DNA w określonych miejscach

3. Temperatura rośnie do 74 ^OC, jest to optymalne ciepło dla obecnej w mieszaninie polimerazy DNA Taq, która przyłącza się do jednego końca każdego startera i prowadzi syntezę nowych odcinków DNA komplementarnych do matrycy. Mamy zatem 4 nici zamiast dwóch początkowych.

4. Rozpoczyna się drugi cykl, temperatura rośnie znów do 94 ^OC, dupleksy złożone z nici początkowych i tych zsyntetyzowanych znów się rozdzielają do pojedynczych nici. Po drugim cyklu mamy razem 8 nici DNA, które na początku kolejnego cyklu ponownie są rozdzielne po pojedynczych nici. Po 30 cyklach mamy około 130 milionów nowych cząsteczek dsDNA, z których każda jest kopią regionu cząsteczki początkowej ograniczonej z dwóch stron starterami.

1.5 Dlaczego klonowanie genów jest takie ważne?

Zarówno klonowanie genów, jak i PCR to proste procedury. Dlaczego w takim razie są tak istotne w biologii? Głównie dlatego, że obie techniki, pozwalają uzyskać czystą próbkę indywidualnego genu, oddzielonego od wszystkich innych genów w komórce.

1.5.1 Otrzymywanie czystej próbki genu przez klonowanie

Aby zrozumieć dokładnie jak w klonowaniu możemy otrzymać czystą próbkę genu, przeanalizujmy eksperyment z Figure 1.3. W tym przykładzie fragment DNA, który chcemy klonować, jest jednym z wielu, w mieszaninie fragmentów, z których każdy stanowi sekwencję genu lub jej część. Ta mieszanina może stanowić nawet cały genom organizmu, np. człowieka. Każdy z tych fragmentów jest włączany do innej cząsteczki wektora, tworząc rodzinę rekombinowanych cząsteczek DNA, z których jedna niesie interesujący nas gen docelowy. Zwykle tylko jedna rekombinowana cząsteczka DNA jest transportowana do pojedynczej komórki gospodarza, więc chociaż ostateczny zestaw klonów może zawierać wiele różnych rekombinowanych cząsteczek, każdy indywidualny klon zawiera wiele kopii tylko jednej cząsteczki. Gen jest teraz oddzielony od wszystkich pozostałych genów z początkowej mieszaniny wszystkich fragmentów, a jego indywidulane cechy mogą być teraz badane w szczegółach.

W praktyce, kluczem do sukcesu w badaniach nad genami jest możliwość odróżnienia jednego klonu, który nas interesuje, od innych. Jeśli rozważymy genom E. Coli, który zawiera około 4000 genów kluczowe wydaje się być rozpoznanie tego jednego kluczowego genu (Figure 1.4).

Problem ten staje się nawet poważniejszy, jeżeli przypomnimy, że i tak bakterie są stosunkowo prostymi orgazmami, a ludzki genom zawiera około pięć razy więcej genów. Używa się różnych strategii do rozpoznawania określonego genu. Niektóre z nich wymagają zmian w podstawowym mechanizmie klonowania, tak aby tylko zrekombinowane komórki z pożądanym genem mogą się dzielić, a interesujący nas klon jest automatycznie wyselekcjonowany. Inne metody prowadzą do selekcji w oparciu o wygląd sklonowanych komórek.

Kiedy gen jest sklonowany, nie istnieje prawie żadne ograniczenie w ilości uzyskanej informacji o jego strukturze i ekspresji. Dostępność sklonowanego materiału spowodowała rozwój analitycznych metod badania genów, z ciągle pojawiającymi się nowymi technologiami.

1.5.2 PCR także może być wykorzystywany do oczyszczania genu

Reakcja łańcuchowa polimerazy także może służyć do otrzymania czystej próbki genu, ponieważ obszar powielanej cząsteczki DNA jest ograniczony miejscami przyłączania się oligonukleotydowych starterów, które można tak skonstruować aby łączyły się precyzyjnie w tym miejscu DNA, aby amplifikowany był tylko interesujący nas region materiału genetycznego (Figure 1.5)

Wynik jest taki sam jak podczas klonowania, choć nie występuje tu problem selekcji, ponieważ pożądany gen jest automatycznie „wyselekcjonowany” przez to, w jakich miejscach przyłączą się startery.

Eksperyment PCR trwa kilka godzin, podczas gdy klonowanie zajmuje wiele tygodni. Dlaczego wiec wciąż jest używane? Dlatego że PCR ma 2 podstawowe ograniczenia:

• Aby przyłączyć startery w odpowiednich pozycjach, z każdej strony interesującego nas genu, sekwencja tych miejsc przyłączania musi być znana – nie można użyć techniki PCR do badania nieznanych genów

• Istnieje ograniczenie długości odcinka, który można powielić przez PCR - łatwo można powielać fragmenty tylko do 5 kb, fragmenty do 40 kb można powielić używając specjalnych technik, ale to i tak są krótsze fragmenty niż wiele genów, zwłaszcza ludzkich i innych kręgowców. Musimy użyć klonowania jeżeli potrzebujemy powielić dłuższy gen.

Z powodu tych ograniczeń, klonowanie jest jedynym sposobem izolacji długich lub nieznanych genów. Mimo to PCR ma nadal wiele zastosowań, na przykład nawet jeśli sekwencja danego genu nie jest znana, nadal można określić odpowiednie sekwencje dla pary starterów, bazując na wiedzy o sekwencji odpowiadającego mu genu w innym organizmie. Gen który został otrzymany i zsekwencjonowany np. z myszy może posłużyć do zaprojektowania pary starterów do izolacji odpowiadającego mu genu u ludzi.

Poza tym często potrzebujemy wyizolować lub wykryć gen o znanej sekwencji. Np. reakcja PCR dla genu ludzkiej globiny jest używane do badania obecności mutacji, które mogą wywołać chorobę krwi – talasemię. Zaprojektowanie odpowiednich starterów dla tej reakcji PCR jest łatwe, ponieważ sekwencja ludzkich genów globiny jest znana. Po PCR, kopie genu SA sekwencjonowane lub badane w jakiś inny sposób aby określić, czy obecne są w nich jakieś mutacje talasemii.

Innym klinicznym zastosowaniem jest użycie starterów do PCR komplementarnych do DNA wirusów wywołujących choroby. Pozytywny wynik wskazuje, że próbka zawiera wirusa i że osoba od której została on pobrana powinna poddać się leczeniu aby zapobiec rozwojowi choroby. Niezwykła czułość metody okazuje się być bezcenna, gdyż można odnaleźć nawet jedną cząsteczkę odpowiadającą sekwencji wirusa w mieszaninie. To oznacza, że tą techniką możemy wykryć wirusa w najwcześniejszych etapach infekcji, zwiększając szanse na powodzenie leczenia. Ta wielka czułość oznacza, że PCR można także użyć do DNA z włosa lub wyschniętych plam krwi a nawet kości nieboszczyków.

1. Jak sobie poradzić z tą książka?

Rozdział 2 będzie poświęcony jednej z najważniejszych jednostek badawczych – wektorom – które przenoszą materiał genetyczny do komórki gospodarza, w której zostaje on powielony. Żeby zaszedł akt klonowania, cząstka musi być zdolna do wniknięcia do komórki, i do zreplikowana się w dużej ilości kopii w komórce gospodarza. Dwie podstawowe organizacje DNA odpowiadają tym zadaniom:

• plazmidy, które są małymi kółkami DNA znajdowanymi w bakteriach i niektórych innych organizmach. Mogą się replikować niezależnie od chromosomy komórki gospodarza

• chromosomy wirusowe, a dokładnej chromosomy bakteriofagów, które infekując bakterie, przenoszą materiał genetyczny który chcemy sklonować do komórek tych małych żyjątek (bakterii), gdzie jest on poddawany replikacji razem z macierzystym genomem bakterii.