ĆWICZENIE 1

KWASY NUKLEINOWE I STRUKTURA

CHROMATYNY

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Wzory zasad purynowych i pirymidynowych występujących w RNA i DNA, nukleozydów i nukleotydów (powtórzenie wiadomości omawianych w trakcie kursu chemii bioorganicznej).

2. Struktura oligonukleotydów (rybo- i 2'-deoksyrybo-), zapis pełny i skrócony.

3. Struktura nukleosomu, histony i ich rola w stabilizacji struktury nukleosomu.

4. Podstawowe cechy struktury RNA i DNA.

5. Metody wykorzystywane do izolowania i analizy DNA.

6. Podstawowe różnice pomiędzy organizacją genomu pro- i eukariotycznego.

WPROWADZENIE

Podstawowe cechy struktury DNA i RNA

DNA jest nośnikiem informacji genetycznej zarówno u Procariota i Eucariota, a także niektórych wirusów.

Pojedynczy łańcuch DNA składa się z czterech deoksyrybonukleozydów, wielokrotnie powtarzających się w różnych sekwencjach (dAMP, dGMP, dCMP, dTMP), połączonych wiązaniami ,5’-fosfodiestrowymi. Pierwszy deoksyrybonukleotyd łańcucha DNA posiada wolną resztę fosforanową w pozycji ; a ostatni ma wolną grupę 3’-hydroksylową deoksyrybozy. W rezultacie każdy łańcuch DNA wykazuje polarność budowy – koniec jest odmienny od końca .

Watson i Crick w 1953 roku opublikowali trójwymiarowy model struktury DNA. Na podstawie badań rentgenograficznych przeprowadzonych przez Franklin i Wilkinsa ustalili, że DNA zbudowany jest z dwóch helikalnie splecionych nici. Dwa łańcuchy DNA są ułożone antyrównolegle

względem siebie, jedna nić zorientowana jest w kierunku →3’, a druga odwrotnie – →5’.

Zasady są skierowane do wnętrza helisy, a łańcuch cukrowo-fosforanowy znajduje się na zewnątrz. Pomiędzy zasadami znajdującymi się w przeciwległych łańcuchach tworzą się wiązania wodorowe. Adenina tworzy parę z tyminą łącząc się dwoma mostkami wodorowymi. Guanina łączy się z cytozyną za pomocą trzech mostków wodorowych. W centralnym obszarze helisy między parami zasad powstają oddziaływania typu asocjacji warstwowej.

Dwupasmowy DNA istnieje przynajmniej w sześciu formach (A-E i Z). W warunkach fizjologicznych występuje zwykle helikalna forma B, w której na pojedynczy skręt przypada około 10 par zasad (pz). Skok helisy wynosi 3,4 nm, a jej średnica 2 nm.

Cząsteczki DNA mogą osiągać znaczne rozmiary. Długość cząsteczki DNA wirusa polioma wynosi 1,7 μm (5100 pz), Escherichia coli – (4,6 x 10⁶ pz), w największym chromosomie Drosophila melanogaster - 2,1cm (6,2 x 10⁷ pz). Sumaryczna długość genomu człowieka wynosi około (3 x 10⁹ pz). Najkrótsza cząsteczka chromosomowego DNA człowieka osiąga rozmiar , a najdłuższa – około .

Cząsteczki DNA ulegają w komórce niewielkim modyfikacjom. Ograniczają się one do metylacji grup aminowych adeniny i cytozyny.

Kwas rybonukleinowy jest polimerem rybonukleotydów. Cząsteczki RNA zawierają w różnych sekwencjach rybonukleotydy adeniny, guaniny, cytozyny i uracylu. W niektórych klasach RNA

mogą występować inne zasady, które powstają na skutek modyfikacji potranskrypcyjnych. Rybonukleotydy połączone są wiązaniami fosfodiestrowymi analogicznie jak w DNA. RNA jest zazwyczaj pojedynczą cząsteczką. W obrębie nici często występują odcinki dwuniciowe. Tworzą je sekwencje zawierające komplementarne zasady ułożone w odwrotnej polarności. W związku z tym cząsteczki RNA posiadają zdolność przybierania skomplikowanych struktur. Dużym udziałem sparowanych fragmentów charakteryzują się cząsteczki rybosomowych RNA (rRNA) i transportujących RNA (tRNA), drugorzędową strukturę wykazują także eukariotyczne informacyjne RNA (mRNA). RNA ulega bardzo zróżnicowanym modyfikacjom po transkrypcji, co odzwierciedla różnorodność jego funkcji pełnionych w komórce.

W komórkach eukariotycznych występują w dużej ilości niewielkie cząsteczki RNA. Drobne jądrowe snRNA uczestniczą w procesie dojrzewania mRNA i regulacji ekspresji genów. Szereg niskocząsteczkowych RNA posiada aktywność katalityczną, są to rybozymy. RNA jest jednocześnie przenośnikiem informacji genetycznej i cząsteczką zdolną do katalizy. Powyższe fakty pozwoliły na postawienie hipotezy, że w ewolucji życia RNA pojawił się przed DNA i białkiem.

Zasadnicze cechy organizacji genomu eukariotycznego i prokariotycznego

W jądrze DNA jest upakowany w chromosomy. Każdy chromosom zawiera jedną długą, liniową, dwuniciową cząsteczkę DNA.

Chromosomowy DNA występuje w połączeniu z białkami, tworząc chromatynę. Wśród białek chromatyny wyróżniamy histony oraz liczną grupę białek, zwanych niehistonowymi. Białka niehistonowe pełnią rozliczne funkcje. Wśród nich wyróżniamy enzymy biorące udział w procesach zachodzących na terenie jądra, białka o charakterze regulatorowym jak np. receptory hormonów steroidowych, a także białka utrzymujące strukturę jądra.

Histony są typowymi białkami strukturalnymi, tworzącymi zrąb chromatyny. Są to niewielkie białka, a w ich składzie około 25% sekwencji stanowią zasadowe aminokwasy - lizyna i arginina. Właściwości histonów oraz ich klasyfikacja zależą od zawartości tych dwóch aminokwasów. Wyróżnia się histony bogate w lizynę (H1), umiarkowanie bogate w lizynę (H2A i H2B) i bogate

w argininę (H3 i H4). Histony u różnych gatunków wykazują duże podobieństwo składu aminokwasowego, co przemawia za ich małą zmiennością ewolucyjną. W trakcie życia komórki ulegają licznym modyfikacjom potranslacyjnym, które zmieniają strukturę chromatyny, a zarazem jej funkcję.

Podstawową jednostką chromatyny jest nukleosom. Nukleosom jest to elipsoidalna cząstka zbudowana z histonów i opleciona nicią DNA. Trzon nukleosomu stanowi kompleks ośmiu cząsteczek histonów - (H2A, H2B, H3, H4) x 2. Na oktamer histonowy, nawinięty jest odcinek DNA w postaci lewoskrętnej superhelisy o długości około 146 pz. Odcinek ten tworzy 1,75 obrotu, a następnie przechodzi w tzw. DNA łącznikowy, łączący dwie sąsiednie podjednostki. Zazwyczaj długość DNA łącznikowego wynosi około 60 pz. Cały odcinek DNA przypadający na nukleosom stanowi około 200 pz. Siłami podtrzymującymi nić DNA na oktamerze białkowym są oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy dodatnio naładowanymi resztami aminokwasów zasadowych a ujemnie naładowanym ortofosforanem uczestniczącym w wiązaniach fosfodiestrowych łańcucha DNA. Długość DNA upakowanego w nukleosomach zmniejsza się około siedmiokrotnie. Strukturę chromatyny stabilizuje także histon H1 oraz białka niehistonowe. Histon H1 łączy się z odcinkami DNA poza rdzeniami nukleosomów. Dzięki tym oddziaływaniom, chromatyna może tworzyć struktury wyższego rzędu, jak np. solenoid. Tak utworzone włókno DNA jest przyłączone do centralnego rusztowania białkowego i tworzy serię pętli. Ogólny stopień skrócenia konturów DNA wynosi około 10⁴. Podczas metafazy chromosomy występują w postaci najbardziej skondensowanej, a ich długość wynosi od 1,3 do 10 μm.

DNA komórek bakterii jest kolistą dwuniciową cząsteczką, często określaną jako chromosom bakteryjny. Znajduje się on w rejonie komórki zwanym nukleoidem. Kolisty genom jest zorganizowany w 50-100 superhelikalnie zwiniętych pętli lub domen, których końce połączone są z błoną komórkową za pośrednictwem kompleksu białkowego. Zwojom DNA towarzyszą białka podobne do histonów.

W wielu komórkach bakteryjnych występują plazmidy. Są to niewielkie, koliste cząsteczki dwuniciowego DNA. Plazmidy posiadają zdolność autonomicznego namnażania się w komórkach bakteryjnych. DNA plazmidowy z reguły nie zawiera genów niezbędnych do życia bakterii. Wiele plazmidów posiada geny oporności na antybiotyki. Plazmidy są około 100 razy mniejsze od chromosomu bakteryjnego, ale posiadają podobny kolisty plan budowy i są superhelikalnie zwinięte.

Plazmidy stosowane w badaniach inżynierii genetycznej są sztucznie skonstruowanymi cząsteczkami DNA, pochodzącymi od naturalnego plazmidu E. coli. W biologii molekularnej często używanymi do analiz plazmidami jest pBR-322 o długości 4362 pz lub pUC 19 o długości 2686 pz. Znana jest ich sekwencja nukleotydowa, a także sekwencje rozpoznawane przez określone endonukleazy restrykcyjne.

Endonukleazy restrykcyjne bronią komórkę bakteryjną przed konsekwencją wnikania obcego DNA (np. wirusowego). Są to enzymy o bardzo dużej specyficzności działania i hydrolizują cząsteczki DNA w obrębie rozpoznawanej przez siebie sekwencji. Sekwencje te obejmują zazwyczaj cztery lub sześć ściśle określonych pz tworzących tzw. palindrom (Rys. 1).

Endonukleazy restrykcyjne z uwagi na bardzo wysoką specyficzność działania znalazły szerokie zastosowanie w badaniach genomów i w innych dziedzinach biologii molekularnej.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Izolowanie DNA z grasicy cielęcej

Metody stosowane do wyodrębnienia DNA z materiału biologicznego mają na celu otrzymanie preparatu czystego pod względem chemicznym i jednocześnie o możliwie nieuszkodzonej strukturze.

Preparatom DNA towarzyszą zanieczyszczenia białkami jądrowymi i RNA. Metody służące do oczyszczania DNA kładą nacisk na usunięcie tych substancji. W postępowaniu preparatywnym należy ograniczać działanie deoksyrybonukleaz. W tkankach pobranych do preparatyki zostają zaburzone systemy regulacyjne i nukleazy atakują DNA komórkowy, powodując jego stopniową degradację. Właściwości tkanki, z której izoluje się DNA, mogą wpływać na stopień trudności preparatyki. Istotna jest aktywność enzymów nukleolitycznych znajdujących się w danej tkance, stosunek ilościowy RNA/DNA oraz zawartość DNA. Przykładowo, wysoką aktywnością nukleaz charakteryzują się śledziona i trzustka, stosunkowo niską zaś grasica. Zawartość DNA w różnych tkankach waha się w szerokim zakresie od około 0,2% w wątrobie szczura do 2,5% w grasicy cielęcej. Stosunek RNA/DNA wynosi około 4 dla wątroby szczura, dla grasicy cielęcej tylko 0,4. Te kryteria powodują, że grasica cielęca jest dogodnym materiałem do izolowania DNA.

Zasada metody

Izolowanie DNA obejmuje dwa etapy:

1. Uzyskanie z grasicy deoksyrybonukleoproteidu (DNP), możliwie wolnego od zanieczyszczeń rybonukleoproteidem (RNP).

Grasicę należy poddać homogenizacji w roztworze NaCl o stężeniu 0,15 mol/dm³ z dodatkiem cytrynianu sodu ( tzw.SSC). Homogenizacja powoduje zniszczenie komórek i uwolnienie z jąder komórkowych DNP i RNP. RNP w trakcie homogenizacji ulega rozpuszczeniu, DNP pozostaje nierozpuszczony. Cytrynian stosuje się jako związek wiążący jony metali dwuwartościowych, między innymi jony Ca²⁺ i Mg²⁺, które są niezbędne do działania deoksyrybonukleaz. Usunięcie tych jonów zabezpiecza DNA przed degradacją przez nukleazy.

2. Dysocjacja DNP w środowisku o dużej sile jonowej na białka i DNA.

DNP rozpuszcza się w roztworach o dużej sile jonowej, w tym przypadku w roztworze NaCl o stężeniu 2 mol/dm³. Rozpuszczone cząsteczki DNA wytrąca się z roztworu za pomocą etanolu.

Materiał i odczynniki

1. Roztwór SSC (0,15 mol/dm³ NaCl, 0,015 mol/dm³ cytrynian sodu, pH 7,0).

2. 4 mol/dm³ roztwór NaCl.

3. Grasica cielęca.

Wykonanie doświadczenia

Etap wspólny dla całej grupy

1. grasicy cielęcej (świeżej lub zamrożonej) homogenizować 2 minuty w 150cm³

wychłodzonego roztworu SSC przy pomocy blendera m-ki Bosch

2. Homogenat odwirować (15 min, 2500 obr./min).

3. Płyn nadosadowy, zawierający rozpuszczony RNP wylać.

4. Osad DNP przenieść do naczynia miksera, dodać 200 cm³ roztworu SSC.

5. Homogenizować 30 sek. w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny

(praca w zespołach)

1. Pobrać do zlewki 10 cm³ homogenatu DNP

2. Dodać 10 cm³ 4 mol/dm³ roztworu NaCl (stężenie końcowe 2 mol/dm³).

3. Preparat mieszać bez użycia bagietki do momentu, w którym roztwór stanie się wyraźnie lepki na skutek rozpuszczania się deoksyrybonukleoproteidu. Z uzyskanego w ten sposób lizatu DNP należy otrzymać dwa oddzielne preparaty DNA przeznaczone do:

a) hydrolizy zasadowej (doświadczenie nr 2)

b) hydrolizy kwaśnej (doświadczenie nr 3).

2. Porównanie podatności kwasów nukleinowych na hydrolizę w środowisku

zasadowym

Kwasy nukleinowe ulegają hydrolizie pod wpływem kwasów, ale różnią się wrażliwością na działanie zasad. W wyniku hydrolizy alkalicznej RNA powstaje mieszanina 2’- i 3’- monofosforanów rybonukleozydów. Pośrednimi produktami hydrolizy są cykliczne ,3’-monofosforany nukleozydów. DNA nie ulega hydrolizie alkalicznej, ponieważ nie mogą powstawać pośrednie produkty hydrolizy. Brak grupy –OH przy drugim węglu deoksyrybozy w DNA uniemożliwia powstawanie wiązań ,3’-fosfodiestrowych. W środowisku alkalicznym DNA może natomiast ulec denaturacji, która polega na zerwaniu wiązań wodorowych występujących pomiędzy komplementarnymi zasadami azotowymi i powstaniu pojedynczych nici.

Odczynniki

1. 0,3 mol/dm³ roztwór KOH.

2. Preparat RNA uzyskany z drożdży piekarskich ( w niskich probówkach).

3. 30% roztwór HClO₄.

4. Paski wskaźnikowe pH.

5. 96% etanol.

Wykonanie doświadczenia

1. Do zlewki pobrać 10 cm³ zlizowanego roztworu deoksyrybonukleproteidu uzyskanego z grasicy cielęcej według przepisu w doświadczeniu 1.

2. Dodać 10 cm³ 96% etanolu. Mieszać (bez użycia bagietki) aż do utworzenia kłaczkowatego osadu DNA.

3. Za pomocą bagietki przenieść wytrącony kłaczek DNA do suchej probówki wirówkowej i dodać 2 cm³ 0,3 mol/dm³ roztworu KOH.

4. Równolegle dodać 2 cm³ 0,3 mol/dm³ roztworu KOH do probówki z preparatem RNA.

5. Obie probówki wstawić na jedną godzinę do łaźni wodnej o temperaturze .

6. Ochłodzić i przy pomocy 30% roztworu HClO₄, ostrożnie doprowadzić pH roztworów do wartości 3-4, śledząc zmiany pH za pomocą pasków wskaźnikowych.

7. Roztwory przesączyć przez bibułę do oddzielnych probówek.

8. Nanieść po kilka kropli przesączu na bibułę filtracyjną, każdorazowo suszyć bibułę suszarką i obejrzeć pod lampą UV, porównując intensywność pochłaniania obu plam.

Na skutek działania roztworu KOH kwas deoksyrybonukleinowy ulega denaturacji i podczas sączenia pozostaje na sączku. W przypadku hydrolizatu RNA, drobnocząsteczkowy materiał nukleotydowy, który powstał pod wpływem hydrolizy alkalicznej rozpuszcza się w roztworze HClO₄ i przechodzi przez sączek do przesączu. O obecności nukleotydów uwolnionych podczas hydrolizy alkalicznej RNA świadczą plamy na bibule w miejscu naniesienia pochłaniające promieniowanie UV.

3. Wykrywanie składników kwasów nukleinowych w preparatach uzyskanych

po hydrolizie kwaśnej rozcieńczonym H₂SO₄

Zasada metody

Pod wpływem mocnych kwasów w podwyższonej temperaturze następuje rozpad RNA do monofosforanów nukleozydów, które ulegają dalszej hydrolizie do wolnych zasad, rybozy i kwasu ortofosforowego. W środowisku kwaśnym w cząsteczkach DNA ulegają hydrolizie wiązania β-N-glikozydowe łączące zasady azotowe z deoksyrybozą i uwalniają się wolne zasady, a po dłuższym czasie trwania hydrolizy mogą uwolnić się fosforany i deoksyryboza.

Przygotowanie kwaśnych hydrolizatów preparatów DNA i RNA

Odczynniki

1. Preparat RNA uzyskany z drożdży piekarskich w wysokich probówkach z chłodniczkami).

2. 0,2 mol/dm³ roztwór H₂SO₄.

3. 96% etanol.

Wykonanie doświadczenia

1. Do zlewki pobrać 10 cm³ zlizowanego roztworu deoksyrybonukleproteidu uzyskanego z grasicy cielęcej według przepisu w doświadczeniu 1.

2. Dodać 10 cm³ 96% etanolu. Mieszać (bez użycia bagietki) aż do utworzenia kłaczkowategoosadu DNA.

3. Wytrącony kłaczek DNA przenieść do dużej probówki z chłodniczką (na stole asystenta) i zalać 2 cm³ 0,2 mol/dm³ roztworu H₂SO₄.

4. Równolegle dodać 2 cm³ 0,2 mol/dm³ roztworu H₂SO₄ do probówki zawierającej RNA.

5. Obie probówki wstawić do wrzącej łaźni wodnej i ogrzewać przez 30 minut.

Po zakończeniu hydrolizy wykonać próby jakościowe na wykrycie składników kwasów nukleinowych.

a) Wykrywanie zasad purynowych

Zasada metody

Zasady purynowe z jonami srebrowymi tworzą trudno rozpuszczalne sole.

Odczynniki

1. 0,5% roztwór adeniny .

2. 4 mol/dm³ roztwór NaOH.

3. 25% roztwór NH₃.

4. 5% roztwór AgNO₃.

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować trzy probówki:

- do pierwszej pobrać 0,5 cm³ kwaśnego hydrolizatu RNA,

- do drugiej 0,5 cm³ kwaśnego hydrolizatu DNA,

- do trzeciej 0,5 cm³ roztworu adeniny.

2. Do każdej probówki dodać 2-3 krople 4 mol/dm³ roztworu NaOH, aby zalkalizować próby.

3. Do każdej probówki dodać kilka kropli 25% roztworu NH₃ i kilka kropli 5% roztworu AgNO₃.

Wytrąca się galaretowaty, biały osad soli srebrowych puryn.

b) Wykrywanie reszt fosforanowych

Zasada metody

Jony fosforanowe tworzą z molibdenianem amonu żółty osad molibdenianofosforanu amonu - (NH₄)₃P(Mo₃O₁₀)₄, który pod wpływem związku organicznego - metolu redukuje się do błękitu molibdenowego (mieszanina tlenków molibdenu na niższym stopniu utlenienia).

Odczynniki

1. 1% roztwór Na₂HPO₄.

2. Stężony H₂SO₄.

3. 5% roztwór molibdenianu amonu.

4. 2% roztwór metolu w 5% Na₂SO₃.

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować trzy probówki:

- do pierwszej pobrać 0,5 cm³ kwaśnego hydrolizatu RNA,

- do drugiej 0,5 cm³ kwaśnego hydrolizatu DNA,

- do trzeciej 0,5 cm³ 1% roztworu Na₂HPO₄.

2. Do każdej probówki dodać po jednej kropli stężonego H₂SO₄, kilka kropli 5% roztworu molibdenianu amonu, wymieszać i dodać kilka kropli 2% roztworu metolu, wymieszać.

Pojawia się niebieskie lub zielononiebieskie zabarwienie.

c) Wykrywanie rybozy

Zasada metody

Ryboza podczas ogrzewania ze stężonym HCl ulega odwodnieniu do furfuralu, który w obecności jonów Fe³⁺ tworzy z orcyną barwny kompleks.

Odczynniki

1. Stężony HCl zawierający 0,5% FeCl₃.

2. Orcyna in subst.

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować dwie probówki:

- do pierwszej pobrać 0,5 cm³ kwaśnego hydrolizatu RNA,

- do drugiej 0,5 cm³ kwaśnego hydrolizatu DNA,

2. Do obu probówek dodać po 1 cm³ stężonego HCl i kilka kryształków orcyny. Zagotować.

Roztwór zawierający rybozę zmienia barwę na zieloną.

d) Wykrywanie deoksyrybozy

Zasada metody

Deoksyryboza podczas ogrzewania tworzy z difenyloaminą barwny kompleks.

Odczynniki

1. Stężony H₂SO₄.

2. 0,3% roztwór difenyloaminy w stężonym kwasie octowym .

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować dwie probówki:

- do pierwszej pobrać 0,5 cm³ kwaśnego hydrolizatu RNA,

- do drugiej 0,5 cm³ kwaśnego hydrolizatu DNA,

2. Do obu probówek dodać 2-3 krople stężonego H₂SO₄ i 1 cm³ roztworu difenyloaminy

w stężonym kwasie octowym.

3. Probówki ogrzewać kilka minut we wrzącej łaźni.

Roztwór zawierający deoksyrybozę zmienia barwę na fioletowoniebieską.

6. Ilościowe oznaczanie fosforu, zadanie indywidualne na zaliczenie

Odczynniki

1. Wzorzec fosforu (roztwór KH₂PO₄ zawierający 4 μg P/ cm³).

2. Stężony H₂SO_{4 ,}

3. 5% roztwór molibdenianu amonu.

4. 0,2% roztwór eikonogenu (zawierający siarczyn i pirosiarczan sodu).

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować 5 probówek i ponumerować je kolejno.

2. Próba wzorcowa:

Do probówki nr 1 i 2 dodać 1 cm³ roztworu wzorcowego fosforu

3. Próba ślepa:

Do probówki nr 3 dodać 5 cm³ H₂O

4. Zadanie na zaliczenie:

Do probówki nr 4 i 5 dodać 1 cm³ roztworu zadania.

5. Do każdej probówki dodać 0,5 cm³ stężonego H₂SO₄

Wymieszać.

6. Do każdej probówki dodać 0,5 cm³ 5% molibdenianu amonu.

Wymieszać.

7 Do każdej probówki dodać i 0,5 cm³ 0,2% eikonogenu.

Wymieszać.

8. Do probówki nr 1, 2, 4 i 5 dodać 4 cm³ wody.

Wymieszać.

9. Wszystkie probówki uzupełnić wodą do 10 cm³.

10. Wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 20 minut.

11. Ochłodzić i ponownie uzupełnić wodą do 10 cm³.

12. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 680 nm wobec ślepej próby.

Obliczyć średnią zawartość fosforu w 1 cm³ roztworu zadania na podstawie wyników uzyskanych

z dwóch równoległych prób.

Obliczenia:

A_zad

µg fosforu/1 cm³ zadania = ────── × stężenie wzorca

A_wz

ĆWICZENIE 2

KINETYKA REAKCJI ENZYMATYCZNEJ

WYZNACZANIE STAŁEJ MICHAELISA

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Równanie Michaelisa-Menten i Lineweavera-Burka.

2. Pojęcia: szybkości maksymalnej i stałej Michaelisa.

3. Doświadczalne wyznaczanie stałej Michaelisa.

4. Reakcja katalizowana przez inwertazę.

5. Zasada metody oznaczania aktywności inwertazy.

Wprowadzenie

Enzymy są biokatalizatorami, syntetyzowanymi wyłącznie przez organizmy. Przy udziale enzymów zachodzą wszystkie procesy metaboliczne, a zmiany stężenia lub aktywności poszczególnych enzymów umożliwiają dostosowanie szybkości przebiegu procesów do aktualnych potrzeb organizmu oraz precyzyjną ich koordynację.

Podczas reakcji enzymatycznej tworzy się nietrwały kompleks enzymu z substratem (kompleks ES). Ulega on dużo łatwiej właściwej reakcji chemicznej niż wolny substrat. Powstaje produkt reakcji oraz wolny enzym.

Przy niskim stężeniu substratu i przy stałej, określonej ilości enzymu, nie wszystkie cząsteczki enzymu są połączone z cząsteczkami substratu. Enzym nie jest wysycony substratem i nie wykazuje wtedy maksymalnej aktywności katalitycznej, a szybkość reakcji zależy nie tylko od stężenia enzymu, ale i od stężenia substratu.

Przy wystarczająco dużym stężeniu substratu enzym jest maksymalnie wysycony substratem, nie ma wolnych cząsteczek enzymu i reakcja osiąga szybkość maksymalną – V_max. Dalsze zwiększanie stężenia substratu nie może spowodować wzrostu szybkości reakcji, szybkość ta jest stała, tzn. zależy tylko od stężenia enzymu – V_max = k₃ ∙ [S].

Zależność pomiędzy szybkością reakcji enzymatycznej i stężeniem molowym substratu określa równanie Michaelisa-Menten:

Wykreślona na podstawie tego równania zależność szybkości reakcji od stężenia substratu przyjmuje postać hiperboli (Rys. 1).

Wartości v dla poszczególnych stężeń substratu oznaczające przyrost ilości (stężenia) produktu w jednostce czasu dotyczą każdorazowo szybkości początkowej (v = v₀). Oznacza to, że reakcję należy prowadzić w warunkach, gdy ilość (stężenie) powstałego produktu reakcji jest wprost proporcjonalna do czasu.

Przy bardzo niskich stężeniach substratu zależność v od [S] ma przebieg liniowy, szybkość reakcji jest proporcjonalna do stężenia substratu (reakcja I rzędu). Przy stężeniu substratu znacznie przewyższającym wartość K_m szybkość reakcji osiąga wartość maksymalną (V_max) i jest niezależna od dalszego wzrostu stężenia substratu (poziomy odcinek krzywej hiperbolicznej), zależy tylko od stężenia enzymu. Jeżeli [S] = K_m, to v = ½ V_max, tzn. szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej.

Stężenie substratu wyrażone w mol/dm³, przy którym szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej nosi nazwę stałej Michaelisa – K_m. Stała ta mówi o powinowactwie enzymu do substratu. Zazwyczaj K_m równa jest stałej dysocjacji kompleksu ES na E i S, im jest ona niższa, tym łatwiej kompleks ES powstaje, a trudniej się rozpada, gdyż jest silniejsze wiązanie enzymu z substratem. Wartości K_m dla większości enzymów wahają się w granicach od 10^-5 do 10^-3 mol/dm³.

Niska wartość K_m oznacza, że enzym ma duże powinowactwo do substratu, dzięki czemu reakcja osiąga szybkość maksymalną przy stosunkowo niskim stężeniu substratu. Duża wartość K_m wskazuje na małe powinowactwo enzymu do substratu, a reakcja osiąga V_max dopiero przy odpowiednio wyższym stężeniu substratu. Przy tym samym stężeniu substratu im niższa jest wartość Km, tym większa jest szybkość reakcji.

Doświadczalnie można wyznaczyć wartość K_m dla danego enzymu z pomiarów szybkości początkowych reakcji przy różnych stężeniach substratu. Jednak z wykresu hiperboli trudno jest oszacować, czy osiągnięta została rzeczywiście V_max reakcji, a co za tym idzie, nie ma wtedy pewności, że wyznaczona wartość K_m jest dokładna. Z tego powodu, do wyznaczania wartości Km wykorzystywana jest zależność 1/v od 1/S, czyli równanie Lineweavera-Burka, które jest przekształceniem równania Michaelisa-Menten:

Znajomość wartości K_m ma istotne znaczenie przy opracowywaniu metod oznaczania aktywności enzymów a także wpływu różnych związków na kinetykę katalizowanych reakcji. Opracowano szereg metod oznaczania aktywności enzymów, które wykorzystywane są w diagnostyce różnych chorób (do takich enzymów należy np. dehydrogenaza mleczanowa, aminotransferaza alaninowa, aminotransferaza asparaginianowa, kinaza kreatynowa). Są to enzymy wskaźnikowe, oznaczanie ich aktywności w surowicy krwi chorego pozwala wyciągać wnioski o stanie jego zdrowia. Szybkość każdej reakcji enzymatycznej (aktywność enzymu) należy oznaczać w takich warunkach, aby v = V_max, gdyż tylko wtedy szybkość reakcji zależy od stężenia enzymu. Stężenie substratu musi więc być dużo większe od K_m (minimum 10 razy).

Typ reakcji katalizowanej przez enzym stał się podstawą klasyfikacji enzymów dokonanej przez Międzynarodową Unię Biochemiczną. Enzymy podzielono na sześć klas, a każdy enzym uzyskał ściśle określający go numer klasyfikacyjny (np. glutaminaza EC 3.5.1.2).

Pierwsza klasa enzymów to oksydoreduktazy. Enzymy należące do tej klasy katalizują reakcje utleniania i redukcji z udziałem koenzymów np. NAD⁺, NADP⁺, NADPH+H⁺, FAD. Należą tu :

dehydrogenazy, reduktazy, peroksydazy, oksydazy i inne.

Drugą klasą są transferazy, enzymy katalizujące reakcje przeniesienia grupy atomów z jednego substratu na drugi. Niektóre transferazy wymagają do swojego działania koenzymów (np. fosforanu pirydoksalu, pirofosforanu tiaminy). Do tej klasy należą takie enzymy jak: aminotransferazy, acylotransferazy, kinazy (fosfotransferazy).

Ogólna reakcja katalizowana przez transferazy: A + B -X → A-X + B.

Hydrolazy (trzecia klasa enzymów) katalizują reakcje hydrolizy; nie wymagają do swojego działania koenzymów. Większość enzymów tej klasy charakteryzuje się niską specyficznością substratową. Do tej klasy należą np.: glikozydazy, esterazy, peptydazy i inne hydrolazy specyficzne w stosunku do rodzaju hydrolizowanego wiązania.

Ogólna reakcja katalizowana przez hydrolazy: A-B + H₂O → A-OH + BH.

Liazy (czwarta klasa) katalizują reakcje niehydrolitycznego rozpadu lub syntezy wiązań, która przebiega bez dostarczenia energii z rozpadu ATP. Należą tu takie grupy enzymów jak: syntazy, dekarboksylazy.

Ogólna reakcja katalizowana przez liazy: A-B → A + B, A + B → A-B

Izomerazy (piąta klasa) katalizują reakcje izomeryzacji: A-B-C ↔ A-C-B. Należą tu między innymi: mutazy, epimerazy, racemazy.

Ligazy (szósta klasa) przeprowadzają reakcje syntezy wiązań, które wymagają energii, najczęściej z rozkładu ATP. Należą do tej klasy syntetazy i karboksylazy.

Ogólna reakcja katalizowana przez ligazy:A + B + ATP → A-B + ADP + P_i lub

A + B + ATP → A-B + AMP +PP_i

Jednostki aktywności enzymatycznej

Jednostka aktywości enzymatycznej (U) jest to ilość enzymu katalizująca przekształcenie 1 mikromola substratu w ciągu 1 minuty w warunkach standardowych.

Jeden katal (kat) jest to aktywność katalityczna powodująca zwiększenie prędkości reakcji o jeden mol na sekundę w ściśle określonym układzie eksperymentalnym.

Część doświadczalna

1. Wyznaczanie krzywej wzorcowej do oznaczania cukrów redukujących wobec nadmiaru sacharozy

Zasada metody

Glukoza redukuje kwas 3,5-dinitrosalicylowy do związku o barwie pomarańczowej, który wykazuje maksimum absorbancji przy długości fali 550 nm, a sama utlenia się do kwasu glukonowego. Reakcja przeprowadzana jest w środowisku zasadowym, w którym formy pierścieniowe monocukrów przekształcają się w formy łańcuchowe. Fruktoza również pośrednio powoduje powstanie pomarańczowego zabarwienia, ponieważ w środowisku zasadowym może przekrztałcić się w aldozę na skutek tautomerycznych przekształceń cząsteczki.

Absorbancja mierzonych kolejnych prób przygotowanych wzorców o wzrastającym stężeniu cukrów redukujących będzie również proporcjonalnie wzrastać, co należy przedstawić w postaci krzywej wzorcowej. Wartości absorbancji wyznaczyć na osi rzędnych, a ilość μmoli cukrów redukujących w próbie na osi odciętych.

Odczynniki

1. Roztwór wzorcowy (0,005 mol/dm³ glukoza + 0,005 mol/dm³ fruktoza).

2. 1 mol/dm³ roztwór sacharozy (przygotowany na świeżo przez dyżurnych).

3. 0,25 mol/dm³ bufor octanowy pH 4,7.

4. Odczynnik dinitrosalicylowy (1% kwas 3,5-dinitrosalicylowy, 1,6% NaOH, 30% winian sodowo-potasowy).

Wykonanie doświadczenia

Tabela 1

Nr probówki	1	2	3	4	5	6
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
Roztwór wzorcowy	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	-
Woda	0,8	0,6	0,4	0,2	-	1,0
1 mol/dm^3 roztwór sacharozy	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
0,25 mol/dm^3 bufor octanowy pH 4,7	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Ilość μmoli cukrów redukujących w próbie	2	4	6	8	10	-

1. Do 6 probówek skalowanych na 10 cm³ dodać odczynniki według tabeli 1.

2. Do wszystkich probówek dodać po 2 cm³ odczynnika dinitrosalicylowego,dokładnie wymieszać.

3. Probówk wstawić na 10 minut do wrzącej łaźni wodnej.

4. Probówki wyjąć z łaźni, oziębić i uzupełnić wodą do 10 cm³.

5. Dokonać pomiaru absorbancji przy długości fali 550 nm wobec próby ślepej (probówka 6).

6. Na papierze milimetrowym sporządzić wykres zależności absorbancji od ilości μmoli cukrów redukujących w próbie.

2. Wyznaczanie stałej Michaelisa dla inwertazy metodą ustalonego czasu

Inwertaza (sacharaza,

β-fruktofuranozydaza) należy do klasy hydrolaz, katalizuje reakcję hydrolizy sacharozy na fruktozę i glukozę (Rys. 3 ).

Hydroliza sacharozy połączona jest z inwersją, czyli zmianą kierunku skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego. Roztwór sacharozy skręca płaszczyznę światła spolaryzowanego w prawo, roztwór glukozy również w prawo (+52,5⁰), a roztwór fruktozy w lewo (-92⁰). Powstała w wyniku hydrolizy sacharozy równomolowa mieszanina glukozy i fruktozy skręca płaszczyznę światła spolaryzowanego w lewo i nazywana jest cukrem inwertowanym.

Zasada metody

Stałą Michaelisa wyznacza się doświadczalnie z pomiarów szybkości reakcji przy różnych stężeniach początkowych substratu. Do określenia szybkości reakcji wykorzystuje się metodę kolorymetryczną oznaczania ilości powstającego produktu – glukozy. Metoda ta wykorzystuje właściwości redukujące glukozy (sacharoza jest dwucukrem, który tych właściwości nie posiada).Szybkość reakcji w opisanym poniżej doświadczeniu to przyrost ilości cukrów redukujących powstalych w jednakowym, ustalonym czasie inkubacji każdej próbki.

Odczynniki

1. 1 mol/dm³ roztwór sacharozy.

2. 0,25 mol/dm³ bufor octanowy pH 4,7.

3. Odczynnik dinitrosalicylowy (1% kwas 3,5-dinitrosalicylowy, 1,6% NaOH, 30% winian sodowo-potasowy).

4. Roztwór inwertazy.

Uwaga! 1 mol/dm³ roztwór sacharozy należy przygotowywać zawsze na świeżo przed każdym doświadczeniem.

Wykonanie doświadczenia

Tabela 2

Nr probówki	1;	2;	3;	4;	5;	6;
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
1 mol/dm^3 roztwór sacharozy	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	1,0
Woda	0,95	0,9	0,8	0,6	0,4	-
Bufor octanowy pH 4,7	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
	mol/dm^3
St. początkowe sacharozy	0,017	0,033	0,066	0,133	0,20	0,333

1. Przygotować 12 probówek skalowanych na 10 cm³ i oznaczyć je od 1 do 6 i od 1` do 6`.

2. Dodać odczynniki według tabeli 2: Zawartość probówek dokładnie wymieszać.

3. Do probówek od 1` do 6` dodać po 1,5 cm³ wody, a następnie po 2 cm³ odczynnika dinitrosalicylowego.

4. Do probówek od 1 do 6 dodawać po 1,5 cm³ roztworu inwertazy w odstępach co 30 sekund (1,5 cm³ enzymu dodać do probówki 1, zapisać czas, po 30 sekundach dodać 1,5 cm³ roztworu enzymu do probówki 2, po dalszych 30 sekundach do probówki 3, itd...). Po dodaniu enzymu zawartość probówek wymieszać.

5. Dokładnie po 5 minutach od chwili dodania enzymu, do każdej probówki dodać (w podany powyżej sposób) po 2cm³ odczynnika dinitrosalicylowego, dokładnie wymieszać

6. Wszystkie probówki ogrzewać przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej.

7. Probówki ochłodzić, uzupełnić wodą do 10 cm³, dokładnie wymieszać.

8. Dokonać pomiaru absorbancji prób od 1 do 6 przy długości fali 550 nm wobec prób ślepych (probówki od 1` do 6`). Wyniki zapisać.

Na podstawie otrzymanych wyników absorbancji odczytać z wykonanej krzywej wzorcowej (doświadczenie 1) ilości μmoli cukrów redukujących w próbie. Jest to ilość powstającego produktu, który przy stosowaniu stałego czasu inkubacji jest miarą szybkości reakcji.

1. Na papierze milimetrowym narysować:

   1. wykres zależności szybkości reakcji–v (μmole/5 min) od początkowego stężenia sacharozy –substratu (mol/dm³), na podstawie wykresu odczytać wartość K_m.

   2. wykres zależności 1/v od 1/S, na podstawie wykresu obliczyć wartość K_m.

ĆWICZENIE 3

Utlenianie biologiczne

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Metody oznaczania aktywności enzymów wykorzystujące sztuczne akceptory i donory elektronów.

2. Reakcje katalizowane przez dehydrogenazę jabłczanową, bursztynianową, mleczanową i oksydazę cytochromową oraz lokalizacja komórkowa tych enzymów.

3. Procesy zachodzące w komórce dostarczające energii.

WPROWADZENIE

Procesy metaboliczne zachodzące w żywym organizmie można podzielić na dwie główne grupy: katabolizmu - ich rolą jest wyzwalanie energii i anabolizmu - syntezy, przebiegającej dzięki wykorzystaniu energii uwolnionej w procesach katabolicznych.

W katabolizmie można wyróżnić trzy etapy (Rys. 1). Pierwszy obejmuje procesy trawienia związków wielkocząsteczkowych dostarczanych z pożywieniem: wielocukrów (również dwucukrów), tłuszczów i białek. Powstałe związki drobnocząsteczkowe: monocukry, glicerol, kwasy tłuszczowe i aminokwasy są wchłaniane z przewodu pokarmowego do krwioobiegu, skąd pobierane są przez komórki różnych tkanek, gdzie następuje ich dalszy katabolizm. Glukoza i kwasy tłuszczowe są głównymi związkami dostarczającymi energii.

Drugi etap katabolizmu obejmuje procesy, w wyniku których glukoza i kwasy tłuszczowe oraz aminokwasy ulegają w komórce rozpadowi do acetyloCoA, który jest wspólnym metabolitem rozkładu wszystkich tych związków. Do tego etapu katabolizmu należą procesy β-oksydacji kwasów tłuszczowych, glikolizy i dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu.

Etap trzeci katabolizmu to procesy związane z wytwarzaniem w komórce CO₂ i H₂O, związków które są końcowymi produktami katabolizmu. Dwutlenek węgla powstaje w cyklu Krebsa i dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu, a woda w łańcuchu oddechowym.

W procesach katabolicznych zachodzących w organizmie zasadniczą rolę odgrywają dehydrogenazy, enzymy które przejmują atomy wodoru od utlenianych substratów. Dehydrogenazy cytoplazmatyczne pośrednio, a dehydrogenazy mitochondrialne bezpośrednio, związane są z łańcuchem oddechowym. Za jego pośrednictwem zredukowane w reakcjach utlenienia koenzymy dehydrogenaz NADH+H⁺ i FADH₂ ulegają utlenieniu, co jest warunkiem dalszego działania współdziałających z nimi enzymów, a więc i procesów, w których te enzymy uczestniczą.

Łańcuch oddechowy jest układem białek enzymatycznych zlokalizowanym w wewnętrznej błonie mitochondrialnej i uszeregowanym zgodnie ze wzrastającymi potencjałami utleniająco-redukującymi jego składników. Protony i elektrony z NADH+H⁺ i FADH₂ przejmowane są przez ogniwa łańcucha oddechowego i za ich pośrednictwem przekazywane na tlen cząsteczkowy z utworzeniem wody. Część energii uwalnianej podczas reakcji utleniająco-redukujących zachodzących w łańcuchu oddechowym jest wykorzystana do syntezy ATP. W ten sposób uwalnia się około 90% energii pochodzącej z przemian katabolicznych węglowodanów, tłuszczów i białek. Łańcuch oddechowy zużywa do syntezy wody około 90% wdychanego przez organizm tlenu. Proces syntezy ATP z ADP i fosforanu nieorganicznego zachodzący podczas przepływu elektronów przez łańcuch oddechowy w obecności tlenu nazywany jest fosforylacją oksydacyjną. Jest to główna droga tworzenia ATP w komórce.

Oprócz fosforylacji oksydacyjnej istotne znaczenie ma fosforylacja substratowa. Jest to synteza ATP (lub GTP) zachodząca w wyniku wykorzystania energii rozpadu wiązania makroergicznego w substracie, nie wymagająca tlenu. Część energii uwalnianej podczas procesu glikolizy i cyklu Krebsa jest wykorzystana w ten sposób. Tworzenie ATP na drodze fosforylacji substratowej jest szczególnie istotne wtedy, kiedy z różnych przyczyn synteza ATP na drodze fosforylacji oksydacyjnej jest niemożliwa, np. w krwince czerwonej, intensywnie pracujących mięśniach szkieletowych, w niedotlenionym mięśniu sercowym.

W badaniach aktywności enzymów związanych z utlenianiem biologicznym duże zastosowanie znalazły sztuczne donory lub akceptory elektronów o tak dobranych wartościach potencjałów oksydoredukcyjnych, aby zmiana barwy związana z utlenieniem lub redukcją tych związków świadczyła o aktywności odpowiedniego enzymu lub fragmentu łańcucha oddechowego. Dużą rolę w tych badaniach odegrały również inhibitory, niekiedy specyficzne, działające na określone enzymy lub w określonym miejscu łańcucha oddechowego. Przykładem może być cyjanek, który jest inhibitorem oksydazy cytochromej - ostatniego enzymu łańcucha oddechowego lub malonian - kompetycyjny inhibitor dehydrogenazy bursztynianowej - enzymu cyklu Krebsa.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Przygotowanie homogenatu

Homogenizacja jest to proces polegający na przerwaniu błon komórkowych w jak największej liczbie komórek danej tkanki, prowadzący do uwolnienia organelli komórkowych, przy jednoczesnym, jak najmniejszym ich uszkodzeniu. W praktyce nigdy nie ma idealnej homogenizacji. Pomimo, że nie wszystkie błony komórkowe ulegają pęknięciu, to część organelli już ulega zniszczeniu.

Najczęściej stosowana jest homogenizacja tłokowa w szklanym lub teflonowym homogenizatorze typu Pottera-Elvehjema, gdzie drobno pocięta tkanka jest dociskana do ścianek tubusa przez obracający się tłok (pistel). Przy materiale biologicznym o większej oporności mechanicznej można stosować homogenizację nożową, rozcieranie z kulkami szklanymi lub piaskiem; czasami stosuje się również enzymy rozkładające składniki błon lub ścian komórkowych. Homogenizację przeprowadza się w roztworze izotonicznym względem komórek, o odpowiednim pH.

Odczynniki

1. Medium A (0,25 mol/dm³ sacharoza , 0,01 mol/dm³ bufor Tris-HCl pH 7,4,

0,002 mol/dm³ EDTA).

Wykonanie doświadczenia

A) Homogenizacja wątroby

Do doświadczenia użyć wątroby. Pociąć tkankę nożyczkami na drobne kawałki i opłukać w zlewce wychłodzonym medium do homogenizacji. Ostrożnie zdekantować płyn znad wątroby. Pocięte kawałki wątroby homogenizować porcjami w niewielkiej objętości medium A w homogenizatorze szklanym typu Pottera-Elvehjema i przelewać do cylindra. Po zakończeniu homogenizacji przepłukać homogenizator 10 cm³ medium do homogenizacji, połączyć płyn z homogenatem, uzupełnić do ok. 90cm³ i całość przesączyć do cylindra przez poczwórnie złożoną gazę (na końcu gazę lekko wycisnąć). Dopełnić przesączony homogenat medium do homogenizacji do takiej objętości, aby wątroby odpowiadał 20 cm³ (homogenat 5% w/v).

B) Homogenizacja serca

Homogenat serca przygotować identycznie jak homogenat wątroby z wyjątkiem homogenizacji, którą z powodu większej oporności mechanicznej tkanki należy przeprowadzić w homogenizatorze nożowym: 15 sekund maksymalne obroty, 3 x 30 sekund 7000 obr./min. Po zakończeniu homogenizacji homogenat dopełnić medium A do takiej objętości, aby odpowiadał 20 cm³ (homogenat 5% w/v).

2. Frakcjonowanie subkomórkowe homogenatu wątroby - izolowanie

mitochondriów i soku cytoplazmatycznego

Odczynniki

1. Medium do homogenizacji (0,25 mol/dm³ sacharoza, 0,01 mol/dm³ bufor Tris-HCl pH 7,4, 0,002 mol/dm³ EDTA).

2. 0,44 mol/dm³ roztwór sacharozy.

Wykonanie doświadczenia

Do 8 probówek wirówkowych wlać po 8 cm³ 5% (w/v) homogenatu wątroby i odwirować w wirówce z rotorem kątowym 10 minut przy . Po odwirowaniu supernatant zebrać pipetą, zostawiając warstwę supernatantu nad osadem. Supernatant odwirować jeszcze raz 15 minut przy (15 min, w celu usunięcia reszty mitochondriów, a także lizosomów i części mikrosomów (pęcherzyków powstałych z siateczki śródplazmatycznej). Zebrać supernatant ze wszystkich 8 probówek do cylindra i dopełnić do 64 cm³ medium do homogenizacji. Jest to sok cytoplazmatyczny 5% w/v - zawierający jedynie rozpuszczalne składniki hialoplazmy, wolne rybosomy i niewielkie ilości mikrosomów, a nie zawierający mitochondriów, jąder i innych ziarnistości komórkowych.

Osad mitochondriów i jąder (z pierwszego wirowania) ze wszystkich 8 probówek przenieść do homogenizatora i zawiesić w medium do homogenizacji, w połowie pierwotnej objętości wziętej do wirowania (32 cm³), stosując ręczną homogenizację. Do 8 probówek wirówkowych wlać po 4 cm³ 0,44 mol/dm³ roztworu sacharozy. Zawiesinę mitochondriów w ilości po 4 cm³ nawarstwić ostrożnie na roztwór sacharozy w każdej probówce. Położenie granicy dwóch warstw zaznaczyć kreską na probówce. Odwirować (10 min, 2500 obr./min). Po odwirowaniu warstwę górną (powyżej kreski na probówce) zebrać pipetą. Jest to zawiesina mitochondriów - 10% w/v. W osadzie znajdują się jądra, całe komórki i krwinki.

3. Jakościowe oznaczanie dehydrogenazy bursztynianowej w homogenacie wątroby przy użyciu sztucznych akceptorów wodoru

Dehydrogenaza bursztynianiowa jest flawoproteiną katalizującą reakcję utlenienia bursztynianu do fumaranu (Rys. 2). Jest jedynym enzymem cyklu Krebsa związanym z wewnętrzną błoną mitochondrialną. Wchodzi w skład II kompleksu białkowego łańcucha oddechowego (reduktazy bursztynian-ubichinon), dzięki któremu FADH₂ dehydrogenazy bursztynianowej ulega utlenieniu, a protony i elektrony są przekazywane na łańcuch oddechowy.

Zasada metody

Do wykrywania aktywności dehydrogenazy bursztynianowej zastosowano dwa sztuczne akceptory elektronów - błękit metylenowy i dichlorofenoloindofenol (DCPI), które są barwne w formie utlenionej, a bezbarwne w formie zredukowanej. Standardowy potencjał redoks dla błękitu metylenowego wynosi +0,01 V, a dla DCPI +0,22 V. Potencjały utleniająco-redukujące obu tych związków są wyższe od potencjału oksydoredukcyjnego dla FAD/FADH₂, który wynosi -0,06 V i dlatego protony z FADH₂ są odbierane przez błękit metylenowy lub DCPI. Związane z redukcją odbarwienie tych związków świadczy o przebiegu reakcji enzymatycznej, katalizowanej przez dehydrogenazę bursztynianową (Rys. 3 i Rys. 4). Zredukowana forma błękitu metylenowego tzw. leukozwiązek może ulec nieenzymatycznemu utlenieniu pod wpływem tlenu z powietrza. Zapobiega się temu przez pokrycie mieszaniny w probówce warstwą płynnej parafiny.

W doświadczeniu zastosowano dwa inhibitory kompetycyjne dehydrogenazy bursztynianowej – malonian i pirofosforan. Malonian jest najbardziej znanym inhibitorem kompetycyjnym tego enzymu, o budowie podobnej do bursztynianu. Mniej znany jest fakt, że pirofosforan mimo innej budowy chemicznej jest również inhibitorem kompetycyjnym.

a) z błękitem metylenowym

Materiał i odczynniki

1. 0,01 mol/dm³ bufor Tris-HCl pH 7,4.

2. 0,5 mol/dm³ roztwór bursztynianu sodu.

3. 0,02% roztwór błękitu metylenowego.

4. 0,5 mol/dm³ roztwór malonianu sodu.

5. 5% homogenat wątroby.

Wykonanie doświadczenia

Do 5 probówek dodać odczynniki według tabeli 1.

Tabela 1.

	1	2	3	4	5
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
0,01 mol/dm^3 bufor Tris-HCl pH 7,4	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
0,5 mol/dm^3 bursztynian	0,2	-	0,2	0,2	0,2
0,02% błękit metylenowy	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
0,5 mol/dm^3 malonian	-	-	0,2	-	-
H2O	0,4	0,6	0,2	0,4	0,6
5% homogenat wątroby	0,2	0,2	0,2	0,2^+	-
WYNIKI

+ homogenat zagotowany

1.Po dodaniu homogenatu wymieszać zawartości probówek i szybko nałożyć

jednocentymetrową warstwę płynnej parafiny (po dodaniu parafiny nie mieszać).

2.Inkubować w temperaturze 37^o C około 1,5 godziny. Zanotować zmianę zabar-

wienia po 45 minutach i po 1,5 godz.

UWAGA! Po zakończeniu ćwiczenia probówki zawierające parafinę włożyć do miski z detergentem

b) z dichlorofenoloindofenolem (DCPI)

Materiał i odczynniki

1. 0,01 mol/dm³ bufor Tris-HCl pH 7,4.

2. 0,5 mol/dm³ roztwór bursztynianu sodu.

3. 0,008% roztwór DCPI.

4. 0,5 mol/dm³ roztwór malonianu sodu.

5. 5% roztwór pirofosforanu sodu.

6. 0,1 mol/dm³ roztwór KCN.

7. 1% homogenat wątroby.

Wykonanie doświadczenia

Do 7 probówek dodać odczynniki według tabeli 2.

Tabela 2.

	1	2	3	4	5	6	7
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
0,01 mol/dm^3 bufor Tris-HCl pH 7,4	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
0,5 mol/dm^3 bursztynian	0,2	-	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
0,008% DCPI	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6
5% pirofosforan	-	-	0,5	-	-	-	-
0,5 mol/dm^3 malonian	-	-	-	0,5	-	-	-
0,1 mol/dm^3 KCN	-	-	-	-	0,2	-	-
H2O	0,5	0,7	-	-	0,3	0,5	0,7
1% homogenat wątroby	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2^+	-
WYNIKI

+ homogenat zagotowany

1. Zawartość probówek wymieszać.

2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Zanotować zmianę zabarwienia po 30 minutach i po 60 minutach.

4. Jakościowe oznaczanie oksydazy cytochromowej w homogenacie serca

Oksydaza cytochromowa stanowi IV kompleks białkowy łańcucha oddechowego. Jest hemoproteiną zbudowaną z 10 łańcuchów polipeptydowych, zawiera w swojej budowie cytochromy a i a₃ oraz dwa jony miedzi, które razem z jonami żelaza cytochromów biorą udział w transporcie elektronów. Oksydaza cytochromowa jest ostatnim ogniwem łańcucha oddechowego, utlenia cytochrom c i reaguje bezpośrednio z tlenem cząsteczkowym. Tlen dzięki działaniu oksydazy cytochromowej redukuje się kosztem utlenienia 2Fe²⁺ i 2Cu⁺, a następnie przyłącza 4H⁺.

Reakcja katalizowana przez oksydazę cytochromową:

4 cyt. c (Fe²⁺) + O₂ + 4H⁺ → 4 cyt. c (Fe³⁺) + 2H₂O

W doświadczeniu zastosowano p-fenylenodiaminę jako sztuczny donor elektronów. Potencjał redox p-fenylenodiaminy jest nieco niższy od potencjału cytochromu c, dlatego w obecności tlenu p-fenylenodiamina będzie się utleniać, pod warunkiem, że oksydaza cytochromowa będzie aktywna, a ilość cytochromu c mającego kontakt z enzymem i z p-fenylenodiaminą będzie dostateczna. Pojawiające się zabarwienie świadczy o utlenieniu p-fenylenodiaminy, a tym samym o przebiegu reakcji enzymatycznej (Rys. 5). Na powietrzu związek ten praktycznie nie utlenia się bez udziału oksydazy cytochromowej.

Materiał i odczynniki

1. 0,01 mol/dm³ bufor Tris-HCl pH 7,4.

2. 0,01% roztwór cytochromu c.

3. 0,1 mol/dm³ roztwór KCN.

4. 1% roztwór p-fenylenodiaminy.

5. 5% homogenat serca.

Wykonanie doświadczenia

Do 6 probówek dodać odczynniki według tabeli 3.

Tabela 3.

	1	2	3	4	5	6
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
0,01 mol/dm^3 bufor Tris-HCl pH 7,4	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
0,01% cytochrom c	-	0,1	0,1	0,1	0,1	-
0,1 mol/dm^3 KCN	-	-	-	-	3 kr.	-
H2O	1,0	0,9	0,6	0,6	0,5	0,7
1% p-fenylenodiamina	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
5% homogenat serca	-	-	0,3^+	0,3	0,3	0,3
WYNIKI

+ homogenat zagotowany

1. Po dodaniu odczynników zawartość probówek wymieszać.

2. Obserwować zmiany zabarwienia w czasie.

3. Zinterpretować otrzymane wyniki.

Dla większości drobnocząsteczkowych metabolitów wewnętrzna błona mitochondrialna ma bardzo ograniczoną przepuszczalność, uwarunkowaną obecnością pewnych specyficznych nośników, takich jak translokaza ADP-ATP, translokaza fosforanu, anionów dikarboksylowych itp.

Natomiast błona zewnętrzna działa jak sito molekularne, przepuszcza związki o masie cząsteczkowej nie przekraczającej 10 000 daltonów. Dlatego egzogenny cytochrom c, którego masa cząsteczkowa wynosi 12 600 daltonów, nie przechodzi przez nienaruszoną błonę zewnętrzną. Jeżeli część mitochondriów uległa uszkodzeniu np. na skutek zbyt silnej homogenizacji, to egzogenny cytochrom c wchodzi w konkakt z oksydazą cytochromową, która zlokalizowana jest w błonie wewnętrznej, tuż przy jej zewnętrznej powierzchni. Wówczas w wyniku wzrostu stężenia cytochromu c nastąpi wzrost aktywności oksydazy cytochromowej.

Jeżeli bardzo mała ilość mitochondriów serca została uszkodzona podczas homogenizacji to roztwory w probówkach 4 i 6 będą miały podobne zabarwienie.

5. Badanie lokalizacji dehydrogenazy bursztynianowej, dehydrogenazy mleczanowej i oksydazy cytochromowej we frakcjach subkomórkowych wątroby

Dehydrogenaza bursztynianowa i oksydaza cytochromowa są zlokalizowane w mitochondriach. Natomiast dehydrogenaza mleczanowa jest enzymem cytoplazmatycznym związanym z procesem glikolizy. Katalizuje odwracalną reakcję utlenienia mleczanu do pirogronianu (Rys. 6).

W tkankach, które są dobrze zaopatrzone w tlen, np. w wątrobie, mięśniu sercowym, pobrany z krwi mleczan jest utleniany do pirogronianu, co umożliwia jego wykorzystanie w procesie glukoneogenezy (w wątrobie) lub jako materiału energetycznego (w mięśniu sercowym). Natomiast w komórkach, które prowadzą metabolizm beztlenowy (krwinka czerwona, mięsień szkieletowy podczas intensywnej pracy) reakcja katalizowana przez dehydrogenazę mleczanową umożliwia w tych warunkach przebieg glikolizy. Redukcja pirogronianu przez dehydrogenazę mleczanową umożliwia utlenienie NADH+H⁺, pomimo niefunkcjonowania łańcucha oddechowego. Dzięki temu glikoliza, w przeciwieństwie do innych procesów związanych z powstawaniem energii, może przebiegać i dostarczać ATP na drodze fosforylacji substratowej. Dehydrogenaza mleczanowa należy do enzymów wskaźnikowych. Oznaczanie jej aktywności oraz wykrywanie obecności izoenzymów w surowicy krwi jest wykorzystywane w diagnostyce chorób wątroby i serca.

Materiał i odczynniki

1. 0,01 mol/dm³ bufor Tris-HCl pH 7,4.

2. 0,01% roztwór DCPI.

3. 0,5 mol/dm³ roztwór bursztynianu sodu.

4. 1 mol/dm³ roztwór mleczanu sodu.

5. 0,01% roztwór cytochromu c.

6. 1% roztwór p-fenylenodiaminy.

7. 0,5 mmol/dcm³ roztwór NAD⁺.

8. 0,5 mol/dm³ roztwór malonianu sodu.

9. 5% zawiesina mitochondriów.

10. 5% sok cytoplazmatyczny.

Wykonanie doświadczenia

Do 9 probówek dodać odczynniki według tabeli 4.

Tabela 4.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
0,01 mol/dm^3 bufor Tris-HCl pH 7,4	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
0,01% DCPI	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	-	-	-
1 mol/dm^3 mleczan	-	-	-	0,3	0,3	0,3	-	-	-
0,5 mol/dm^3 bursztynian	0,2	0,2	0,2	-	-	-	-	-	-
0,01% cytochrom c	-	-	-	-	-	-	0,1	0,1	0,1
1% p-fenylenodiamina	-	-	-	-	-	-	0,3	0,3	0,3
0.5 mmol/dm^3 NAD^+	-	-	-	0,2	0,2	0,2	-	-	-
H2O	1,0	1,0	0,5	0,8	0,5	0,5	0,9	0,9	1,1
0,5 mol/dm^3 malonian	-	-	0,5	-	-	-	-	-	-
5% zawiesina mitochondriów	0,2	-	0,2	0,1	-	-	0,2	-	-
5% sok cytoplazmatyczny	-	0,2	-	-	0,4	0,4^+	-	0,2	-
WYNIKI

+ homogenat zagotowany

1. Zawartość probówek wymieszać.

2. Obserwować zmiany zabarwienia w czasie.

Dodatni wynik w probówce 2 może świadczyć o zniszczeniu części mitochondriów podczas frakcjonowania i przejściu fragmentów błon mitochondrialnych do supernatantu pomitochondrialnego. Dodatni wynik w probówce 5 może świadczyć o zaadsorbowaniu się cytozolowej dehydrogenazy mleczanowej na osadzie mitochondriów.

6. Jakościowe oznaczanie dehydrogenazy jabłczanowej w soku cytoplazmatycznym. Wpływ pH.

Dehydrogenaza jabłczanowa jest enzymem, który na terenie komórki występuje zarówno w cytoplazmie jak i w mitochondriach. W obu tych przedziałach komórkowych katalizuje taką samą reakcję, ale pełni odmienne funkcje (Rys. 7).

W cytoplazmie jest enzymem związanym z funkcjonowaniem systemu transportu atomów wodoru z NADH+H⁺ dehydrogenaz cytoplazmatycznych na mitochondrialny łańcuch oddechowy, a w mitochondriach jest jednym z enzymów cyklu Krebsa.

Reakcja katalizowana przez dehydrogenazę jabłczanową jest silnie endoergiczna, o bardzo niskiej stałej równowagi (K=10^-12). Równowaga tej reakcji jest silnie przesunięta w stronę tworzenia się jabłczanu. Aby reakcja mogła przebiegać w sposób widoczny w prawo niezbędne jest usuwanie produktów reakcji tzn. szczawiooctanu i NADH+H⁺. W mitochondriach in vivo szczawiooctan bierze udział w cyklu Krebsa, a NADH+H⁺ utlenia się przekazując protony i elektrony na łańcuch oddechowy.

Chcąc in vitro wykazać, że w reakcji tworzy się szczawiooctan należy zwiększyć pH z około 7 do 10. W środowisku bardziej zasadowym protony (z NADH+H⁺) są usuwane zgodnie z reakcją:

H⁺ + OH → H₂O i równowaga reakcji przesuwa się w prawo.

Zasada metody

Aktywność enzymu wykrywa się w ten sposób, że powstający szczawiooctan reagując z 2,4-dinitrofenylohydrazyną tworzy 2,4-dinitrofenylohydrazon szczawiooctanu, który w środowisku zasadowym jest barwny.

Materiał i odczynniki

1. 0,5 mol/dm³ bufor glicynowy pH 10.

2. 0,02 mol/dm³ bufor Tris-HCl pH 8,5.

3. 0,02 mol/dm³ bufor Tris-HCl pH 7,4.

4. 0,5 mmol/dm³ roztwór NAD⁺.

5. 0,5 mol/dm³ roztwór jabłczanu sodu.

6. 0,02% roztwór 2,4-dinitrofenylohydrazyny.

7. 1,5 mol/dm³ roztwór NaOH.

8. 5% sok cytoplazmatyczny.

Wykonanie doświadczenia

Do 4 probówek dodać odczynniki według tabeli 5.

Tabela 5.

	1	2	3	4
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
0,5 mol/dm^3 bufor glicynowy pH 10	0,2	0,2	-	-
0,02 mol/dm^3 bufor Tris-HCl pH 8,5	-	-	0,2	-
0,02 mol/dm^3 bufor Tris-HCl pH 7,4	-	-	-	0,2
0,5 mmol/dm^3 NAD^+	0,1	0,1	0,1	0,1
0,5 mol/dm^3 jabłczan	-	0,1	0,1	0,1
H2O	0,1	-	-	-
5% sok cytoplazmatyczny	0,4	0,4	0,4	0,4
WYNIKI

1. Zawartość probówek wymieszać.

2. Próby inkubować 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37^oC.

3. Po zakończeniu inkubacji do każdej probówki dodać po 0,6 cm³ 0,02% roztworu

2,4-dinitrofenylohydrazyny, wymieszać.

4. Do każdej probówki dodać 2 cm³ 1,5 mol/dm³ roztworu NaOH, wymieszać.

5. Inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej.

6. Zinterpretować uzyskane wyniki.