Ćwiczenie 4 - 04.03.2011

Hemoglobina, produkty przemiany hemoglobiny, metabolizm żelaza

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Transport O₂ i CO₂ przez hemoglobinę (Hb).

2. Katabolizm hemu, bilirubina wolna i związana.

3. Białka transportujące i magazynujące jony żelaza.

4. Metody wykorzystywane do oznaczania bilirubiny, Hb i żelaza.

WPROWADZENIE

Hemoglobina

Hemoglobina jest hemoproteiną zbudowaną z czterech łańcuchów polipeptydowych, a każdy łańcuch połączony jest z cząsteczką hemu. Bierze ona udział w transporcie tlenu z płuc do tkanek i w pewnym stopniu także CO₂ z tkanek do płuc. W naczyniach włosowatych pęcherzyków płucnych, do jonów Fe²⁺ znajdujących się w grupie hemowej cząsteczki hemoglobiny, przyłączają się cztery cząsteczki tlenu (1 g Hb wiąże 1,36 cm³ tlenu); powstaje oksyhemoglobina - hemoglobina utlenowana. W krwi żylnej tlen odłącza się i dyfunduje do komórek różnych tkanek.

Do wolnych grup aminowych w części białkowej cząsteczki Hb może przyłączyć się CO₂, powstają karbaminiany hemoglobiny. W tej postaci transportowane jest około 20% CO₂.

Prawidłowa zawartość Hb w 100 cm³ krwi pełnej wynosi u mężczyzn 14-18 g, u kobiet 12-16g, a u noworodków 18-27 g.

Bilirubina

Rozpad erytrocytów zachodzi w komórkach układu siateczkowo-śródbłonkowego, głównie wątroby, śledziony i szpiku kostnego. Tam też następuje przemiana hemu w bilirubinę. W pierwszym etapie tego procesu bierze udział zlokalizowana w mikrosomach oksygenaza hemowa, związana z mikrosomalnym łańcuchem transportu elektronów. Przy udziale O₂ i NADPH+H⁺ prowadzi ona hydroksylację węgla w grupie metinowej znajdującej się między dwoma pierścieniami pirolowymi i następnie jego usunięcie w postaci CO. W wyniku tego następuje rozerwanie układu porfirynowego i powstaje niebieskozielony barwnik - biliwerdyna, posiadająca czteropirolowy układ łańcuchowy. Następnie biliwerdyna redukuje się pod wpływem reduktazy biliwerdyny i powstaje pomarańczowożółta bilirubina, która dyfunduje do krwi.

Reakcja katalizowana przez reduktazę biliwerdyny:

biliwerdyna + NADPH + H⁺ → bilirubina + NADP⁺

Bilirubina jest związkiem trudnorozpuszczalnym, transportowanym do wątroby w połączeniu z albuminami. Jedna cząsteczka albuminy łączy się z dwiema cząsteczkami bilirubiny. Jest to tzw. bilirubina wolna, nazywana także bilirubiną pośrednią lub przedwątrobową. W warunkach fizjologicznych jej stężenie waha się w granicach 0,1-1,0 mg/100 cm³. W warunkach prawidłowych w osoczu występuje tylko bilirubina wolna. Jest ona wychwytywana przez komórki wątroby, zostaje odłączona od albuminy i przeniesiona do wnętrza hepatocytu.

W wątrobie słabo polarna cząsteczka bilirubiny ulega dalszym przemianom, które zwiększają jej rozpuszczalność i umożliwiają sekrecję do żółci.

1) 75% bilirubiny wchodzi w reakcję z UDP-glukuronianem i powstają diglukuronidy bilirubiny (kwas glukuronowy tworzy wiązanie estrowe z grupą karboksylową bilirubiny). Reakcja katalizowana jest przez UDP-glukuronozylotransferazę bilirubiny:

bilirubina + 2 UDP-glukuronian → diglukuronid bilirubiny + 2 UDP

2) 15% bilirubiny wchodzi w reakcję z aktywnym siarczanem (5` fosfosiarczanem 3` fosfoadenozyny), przy udziale sulfotransferazy ulega ona estryfikacji i tworzą się siarczany bilirubiny.

3) 10% bilirubiny tworzy połączenia z glicyną, tauryną i metioniną.

Powstające pochodne bilirubiny tworzą tzw. bilirubinę związaną, nazywaną także bilirubiną bezpośrednią lub wątrobową. W tej postaci bilirubina aktywnie wydzielana jest do żółci i wraz z nią przechodzi do przewodu pokarmowego, gdzie ulega dalszym przemianom pod wpływem flory bakteryjnej. W warunkach prawidłowych bilirubina związana nie występuje w osoczu. Dla odróżnienia obu postaci bilirubiny (tzn. wolnej i związanej) wykonuje się odczyn van den Bergha. Dodatni wynik tej próby wskazuje na obecność we krwi bilirubiny związanej.

Stężenie bilirubiny w osoczu przekraczające 1 mg/100 cm³ oznacza bilirubinemię. Umiarkowany wzrost stężenia bilirubiny nie zawsze jest zjawiskiem patologicznym. U 5-7% populacji stwierdza się nieznaczną bilirubinemię bez towarzyszących zmian patologicznych.

Hiperbilirubinemia może być spowodowana upośledzeniem sprzęgania bilirubiny w wątrobie lub zaczopowaniem przewodów żółciowych, a także wytwarzaniem większej ilości bilirubiny niż jest w stanie wydzielić do przewodów żółciowych prawidłowo funkcjonująca wątroba. Przy stężeniu bilirubiny w osoczu przekraczającym 2-2,5 mg/100 cm³ dyfunduje ona do tkanek dając obraz kliniczny określany mianem żółtaczki. Oznaczanie stężenia bilirubiny w osoczu (pośredniej i bezpośredniej) ma duże znaczenie w diagnozowaniu żółtaczek. Wzrost stężenia bilirubiny przedwątrobowej (pośredniej) towarzyszy żółtaczce noworodków. Przyczyną tego stanu jest nadmierna hemoliza erytrocytów oraz niezdolność wątroby do skutecznego sprzęgania i wydzielania zwiększonej ilości bilirubiny. Stan taki uznaje się za fizjologiczny. Jednak, gdy stężenie bilirubiny wolnej u noworodków wzrośnie powyżej 20 mg/100 cm³ może ona przekraczać barierę krew-mózg. Następstwem tego stanu jest kernicterus - żółtaczka jąder podstawnych mózgu, prowadząca do upośledzenia umysłowego.

Przyczyną podwyższonego stężenia bilirubiny przedwątrobowej może być też niedokrwistość hemolityczna, a także dziedziczne zaburzenia sprzęgania bilirubiny w wątrobie spowodowane brakiem lub poważnymi niedoborami UDP-glukuronozylotransferazy bilirubiny (zespół Criglera-Najjara, typ I, typ II). Umiarkowanie podwyższone stężenie bilirubiny wolnej (1,2-3,0 mg/100 cm³) występuje też u osób dotkniętych zespołem Gilberta, obejmującym 3-10% populacji. Spowodowane jest to upośledzeniem wychwytu bilirubiny przez wątrobę lub znacznie częściej niedoborem UDP-glukuronozylotransferazy bilirubiny. Obecność dwu dodatkowych nukleotydów (TA) w regionie promotora genu tego enzymu powoduje jego obniżoną ekspresję.

Podwyższony poziom bilirubiny wolnej może być też spowodowany uszkodzeniem miąższu wątroby, powstałym w następstwie: wirusowego zapalenia wątroby, marskości wątroby, zatruć (chlorowcopochodnymi węglowodorów, α-amanityną), długotrwałego przyjmowania hepatotoksycznych leków. Takim stanom na ogół towarzyszy upośledzenie wydzielania sprzężonej bilirubiny, prowadzące do wzrostu jej stężenia w osoczu.

Zwiększone stężenie bilirubiny sprzężonej może być wynikiem defektu wydzielania bilirubiny do żółci (zespół Dubina-Johnsona), ale przede wszystkim wskazuje na niedrożność przewodów żółciowych. Przyczyną niedrożności może być kamica żółciowa, nowotwór lub zwężenie przewodów żółciowych.

Hiperbilirubinemia spowodowana wzrostem stężenia bilirubiny sprzężonej wiąże się z obecnością bilirubiny w moczu (bilirubinuria), podczas gdy wolna bilirubina (skompleksowana z albuminą) nigdy nie pojawia się w moczu.

Metabolizm żelaza

Żelazo odgrywa zasadniczą rolę w metabolizmie energetycznym żywej komórki, biorąc udział w utlenianiu substancji organicznych. Znaczenie biologiczne tego pierwiastka warunkują jego dwie podstawowe własności.

1. Istnienie dwóch trwałych stanów wartościowości - Fe²⁺ i Fe³⁺ - co umożliwia udział w reakcjach utleniania i redukcji.

2. Zdolność tworzenia trwałych kompleksów z wieloma związkami o bardzo różnorodnej strukturze.

Jony żelaza mogą być składnikiem hemoprotein, gdzie wbudowane są w pierścień protoporfiryny, albo mogą występować w postaci związków niehemowych. Do hemoprotein należy szereg enzymów biorących udział w procesach utleniania i redukcji (np. cytochromy, oksydaza cytochromowa, katalaza, peroksydaza) oraz białka przenoszące tlen (hemoglobina i mioglobina). Do białek niehemowych należą: białko transportujące żelazo - transferyna, białka magazynujące żelazo - ferrytyna i hemosyderyna, a także szereg enzymów np. dehydrogenaza bursztynianowa, oksydaza ksantynowa, hydroksylaza fenyloalaninowa i inne.

Całkowita ilość żelaza w organizmie dorosłego mężczyzny o masie 70 kg wynosi około 3,8 g (u dorosłej kobiety o zbliżonej masie ciała jest nieco mniejsza): w hemoglobinie znajduje się około 2,5g (65%), w ferrytynie i hemosyderynie około 1,0 g (25%), w mioglobinie i enzymach około 0,3 g (8%) i w transferynie 3-4 mg.

Żelazo zawarte w osoczu stanowi bardzo małą część całkowitej ilości żelaza w organizmie. Obrót metaboliczny żelaza jest bardzo szybki. W czasie 1 sekundy 3 miliony krwinek czerwonych ulega zniszczeniu; większość uwalnianego żelaza wraca do szpiku i jest wbudowywana w cząsteczki hemoglobiny.

Transferyna jest β₁-globuliną osocza o masie cząsteczkowej około 80000. Cząsteczka apotransferyny ma zdolność do przyłączenia dwóch jonów Fe³⁺ w obecności HCO₃^-. Powstały kompleks ma budowę: transferyna - (Fe³⁺)₂ - (HCO₃^-)₂. W warunkach prawidłowych transferyna jest wysycona żelazem w około 30%.

Ferrytyna jest to rozpuszczalne w wodzie połączenie apoferrytyny z Fe³⁺. Cząsteczka apoferrytyny (m. cz. około 430000 - 480000) jest białkiem zbudowanym z 20-24 podjednostek. Wewnątrz części białkowej znajduje się około 4000-5000 atomów Fe w postaci hydroksyfosforanów żelazowych. Całkowicie wysycona żelazem cząsteczka ferrytyny zawiera 17-23% żelaza. W warunkach prawidłowych ferrytyna występuje w bardzo małych ilościach w surowicy krwi - 12-250 μg/dm³.

Dzienne wydalanie żelaza jest bardzo małe: 0,5 - 1,0 mg (przez nerki, jelito grube, w wyniku złuszczania nabłonków). W warunkach prawidłowych powinna istnieć równowaga pomiędzy wydalaniem wchłanianiem żelaza. Dieta dzienna zawiera średnio od 10 do 15 mg żelaza, z tego wchłaniane jest 5-10%, czyli około 1 mg. Stany, które wymagają większego zapotrzebowania na żelazo, np. przewlekłe krwawienia, ciąża, wzrost organizmu, stosunkowo łatwo naruszają stan równowagi i doprowadzają do utajonego niedoboru żelaza, tzn. do obniżenia jego zawartości w magazynach. Oznaczanie stężenia żelaza w surowicy nie jest dobrym wskaźnikiem dla oceny stanu magazynów.

W warunkach prawidłowych stężenie żelaza w surowicy wynosi około 120 μg/100 cm³.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Oznaczanie bilirubiny całkowitej

Zasada metody

Słabe wiązania między cząsteczkami bilirubiny i białka ulegają rozpadowi w obecności kofeiny. W środowisku zasadowym bilirubina pod wpływem diazowanego kwasu sulfanilowego przechodzi w azobarwnik.

Materiał i odczynniki

1. Wzorcowe roztwory bilirubiny - 1 mg/100 cm³, 2 mg/100 cm³, 3 mg/100 cm³,

(bilirubina rozpuszczona jest w roztworze zawierającym 0,06% NaHCO₃, 0,3%

NaCl, 70% etanol).

2. Odczynnik kofeinowy (5% kofeina, 7,5% benzoesan sodu, 12,5% octan sodu).

3. Odczynnik diazo I (0,5% kwas sulfanilowy, 2% HCl).

4. Odczynnik diazo II (0,1% roztwór NaNO₂).

5. Odczynnik Fehlinga II (10% NaOH, 35% winian sodowo-potasowy).

6. Surowica krwi.

Wykonanie doświadczenia

1.Przygotować 7 probówek:

-do pierwszej dodać 2 cm³ roztworu bilirubiny o stężeniu 1 mg/100 cm³

-do drugiej dodać 2 cm³ roztworu bilirubiny o stężeniu 2 mg/100 cm³

-do trzeciej dodać 2 cm³ roztworu bilirubiny o stężeniu 3 mg/100 cm³

-do czwartej dodać 2 cm³ wody (próba ślepa)

-do piątej dodać 2 cm³ surowicy

-do szóstej i siódmej dodać po 2 cm³ zadania

2.Do wszystkich probówek dodać po 3 cm³ odczynnika kofeinowego

3.Przygotować odczynnik diazowy - zmieszać: 10 cm³ diazo I i 0,3 cm³ diazo II

(resztę pozostawić do ćwiczenia nr 2)

4.Do wszystkich probówek dodać po 1 cm³ odczynnika diazowego

5.Po 10 minutach dodać do wszystkich probówek po 2 cm³ odczynnika Fehlinga II

6.Próby odstawić na 10 minut (ciemność)

7.Po tym czasie próby przesączyć, próba ślepa i zadanie nie wymagają sączenia

8.Zmierzyć absorbancję wobec próby ślepej przy długości fali 600 nm.

9.Zawartość bilirubiny w surowicy i zadaniu odczytać z wykreślonej krzywej wzorcowej - probówki 1, 2 i 3.

2. Badanie bilirubiny bezpośredniej wg Hejmansa van den Bergha

Materiał i odczynniki

1. Odczynnik diazo I ( 0,5% kwas sulfanilowy, 2% HCl).

2. Odczynnik diazo II (0,1% roztwór NaNO₂).

3. Surowica krwi.

Wykonanie doświadczenia

Do 2-4 kropli surowicy dodać 1-2 krople odczynnika diazowego - z poprzedniego doświadczenia

1. Jeżeli w ciągu 30 sekund powstanie czerwonofioletowe zabarwienie, to wynik interpretujemy jako odczyn bezpośredni, dodatni, natychmiastowy (obecność bilirubiny związanej).

2. Jeżeli w ciągu 30 sekund nie pojawi się zabarwienie, lecz wystąpi później, np. po upływie 10 minut, jest to odczyn bezpośredni, dodatni, opóźniony (obecność bilirubiny związanej w małym stężeniu).

3. Jeżeli w ciągu 30 minut nie powstanie zabarwienie jest to odczyn bezpośredni, ujemny (brak bilirubiny związanej).

3. Oznaczanie hemoglobiny (Hb)

Zasada metody

Hemoglobina i niektóre jej pochodne są utleniane przez K₃[Fe(CN)₆] do methemoglobiny, a następnie przekształcane pod wpływem KCN w trwały związek cyjanmethemoglobinę, która wykazuje maksimum absorbancji przy 540 nm.

Materiał i odczynniki

1. Odczynnik Drabkina (0,03% K₃[Fe(CN)₆], 0,1% NaHCO₃, 0,005% KCN).

2. Krew.

Wykonanie doświadczenia

Do 5 cm³ odczynnika Drabkina dodać 0,025 cm³ krwi. Po upływie 10 minut odczytać absorbancję wobec odczynnika Drabkina przy długości fali 540 nm.

Obliczenia

A_bad × 64400 × 201

Hb (g/100 cm³ krwi) = __________

44 × 10 × 1000

201 - rozcieńczenie krwi = 5,025 : 0,025

64400 - masa molowa Hb (g/mol)

44 - milimolowy współczynnik absorbancji przy λ = 540 nm

(jest to absorbancja jaką wykazuje roztwór o stężeniu 1 mmol/dm³ i grubości warstwy 1 cm)

dzielnik 10 - wynika z przeliczenia z 1 dm³ na 100 cm³

dzielnik 1000 - wynika z przeliczenia z milimoli na mole

4. Oznaczanie żelaza w surowicy

Zasada metody

Siarczyn sodu redukuje Fe³⁺ do Fe²⁺, 2,2'-dipirydyl w środowisku kwaśnym tworzy z jonami Fe²⁺ związek kompleksowy o zabarwieniu czerwonofioletowym. Chloroform wytrąca zdenaturowane białka.

Materiał i odczynniki

1. 0,1 mol/dm³ roztwór Na₂SO₃ .

2. Odczynnik dipirydylowy (0,1% 2,2`-dipirydyl w 3% roztworze CH₃COOH).

3. Chloroform.

4. Roztwór wzorcowy Fe³⁺ o stężeniu 100 µg Fe/100 cm³.

5. Surowica krwi.

Wykonanie doświadczenia

Przygotować 5 probówek:

1. Próba właściwa: 2 cm³ surowicy,

2. Próba wzorcowa: 2 cm³ roztworu wzorcowego Fe³⁺.

3. Próba ślepa: 2 cm³ H₂O.

4 i 5. Zadanie na zaliczenie: 2 cm³ zadania.

5. Do wszystkich probówek dodać po 2 cm³ 0,1 mol/dm³ roztworu Na₂SO₃ oraz po 2 cm³ 0,1% odczynnika dipirydylowego, wymieszać i wstawić probówki na 5 minut do wrzącej łaźni wodnej.

6. Próby oziębić.

7. Do probówki nr 1 - próba właściwa - dodać 2 cm³ chloroformu, wstrząsać 30 sekund, Zawartość probówki przelać do probówki wirówkowej i wirować (5 minut/3000 obr./min). Jeżeli warstwa górna (wodna) lub dolna (chloroformowa) jest mętna należy próbę ponownie wstrząsać i wirowanie powtórzyć. Górną warstwę zebrać ostrożnie pipetą, przenieść do kuwety i zmierzyć absorbancję przy 520 nm wobec ślepej próby. UWAGA! Chloroform rozpuszcza plastik, jeśli ścianki kuwety zmętnieją wymienić kuwetę na nową!

8. Zmierzyć absorbancję zadania i próby wzorcowej wobec próby ślepej. (W próbach 2, 3, 4 i 5 nie ma białka - więc niepotrzebne jest dodawanie chloroformu i wirowanie).

Obliczenia:

A _{zad (sur)}

μg Fe/100 cm³ zadania (surowicy krwi) = ────── × stężenie wzorca

A _wz

ĆWICZENIE 5 - 18.03.2011

PRODUKTY PRZEMIANY AZOTOWEJ

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Powstawanie kwasu moczowego i jego rola w organizmie człowieka.

2. Synteza mocznika (reakcje i enzymy).

3. Metabolizm kreatyny (reakcje i enzymy).

4. Metody wykorzystywane do oznaczania w surowicy krwi stężenia kwasu moczowego, kreatyniny i mocznika. Prawidłowe stężenia tych związków we krwi.

WPROWADZENIE

Kwas moczowy

Kwas moczowy jest końcowym produktem katabolizmu zasad purynowych w organizmie człowieka. Nukleotydy w komórkach ulegają stałym przemianom. Związki te są rozkładane za pomocą enzymów, a także ulegają samorzutnemu rozpadowi na skutek wpływu środowiska.

Nukleotydazy rozkładają hydrolitycznie nukleotydy do nukleozydów. Z nukleozydów fosforylazy nukleozydowe uwalniają wolne zasady i rybozo-1-fosforan. Większość uwolnionych zasad purynowych zostaje ponownie użyta do tworzenia nukleotydów na drodze rezerwowych szlaków metabolicznych.

Niewielka część uwolnionych zasad ulega przekształceniu do kwasu moczowego i jest wydalana z moczem.

Główne szlaki metaboliczne przemiany AMP i GMP prowadzące do utworzenia kwasu moczowego nieco się różnią. Katabolizm AMP rozpoczyna deaminaza AMP:

AMP + H₂O → IMP + NH₃

IMP i GMP są substratami dla 5' nukleotydazy, która przekształca je w nukleozydy.

IMP + H₂O → inozyna + P_i

GMP + H₂O → guanozyna P_i

Następnie nukleozydy są rozkładane za pomocą fosforylazy nukleozydów purynowych.

inozyna + P_i → hipoksantyna + rybozo-1-fosforan

guanozyna + P_i → guanina + rybozo-1-fosforan

Guanina pod wpływem hydrolazy - guanazy (deaminazy guaninowej) przekształcana jest do ksantyny.

guanina + H₂O → ksantyna + NH₃

Hipoksantyna i ksantyna są przekształcane w kwas moczowy przy udziale oksydazy ksantynowej.

hipoksantyna → ksantyna→ kwas moczowy

Mechanizm tej reakcji jest złożony, enzym do swojego działania wymaga udziału O₂, FAD, jonów molibdenu i żelaza. Jeden atom tlenu cząsteczkowego, utleniacza w obu reakcjach, zostaje dołączony do pierścienia puryny, drugi zaś zostaje zredukowany do H₂O_2. Nadtlenek wodoru następnie jest rozkładany przez katalazę do H₂O i O_2.

Przyłączenie tlenu do pierścienia puryny powoduje zwiększenie polarności, a zatem zwiększa rozpuszczalność związku w wodzie. Jednak kwas moczowy jest nadal związkiem trudno rozpuszczalnym. Lepiej rozpuszczalne są jego sole - moczany, które tworzą się w pH obojętnym i zasadowym. Kryształy moczanów wytrącają się w roztworach przekraczających stężenie 7 miligramów tego związku na 100 cm³ wody. Dlatego też znaczna część moczanów w osoczu zaadsorbowana jest na albuminach, co przeciwdziała ich wytrącaniu.

Prawidłowe stężenie kwasu moczowego (głównie w postaci moczanów) we krwi dorosłych kobiet wynosi od 2 do 6 mg/100 cm³, u mężczyzn od 3 do 7,5 mg/100 cm³. Stężenie kwasu moczowego w osoczu zależy także od diety, niższe stężenia tego związku występują u ludzi stosujących dietę wegetariańską.

W ciągu doby organizm zdrowego, dorosłego człowieka wytwarza przeciętnie od 400 do 800 miligramów kwasu moczowego, który następnie jest wydalany z moczem.

Nadmierne jego wytwarzanie powoduje podwyższenie jego stężenia we krwi (hiperurykemia) i jest przyczyną zmian chorobowych, wywołanych przez wytrącanie się kryształów moczanu sodu szczególnie w stawach i nerkach. Choroba ta jest znana jako dna moczanowa. Większość ssaków przekształca dalej kwas moczowy do łatwo rozpuszczalnej substancji - alantoiny. Brak możliwości przekształcania kwasu moczowego do alantoiny jest jednak korzystnym czynnikiem selekcyjnym. Moczany bardzo łatwo się utleniają i są bardzo wydajną substancją usuwającą wysoce reaktywne, szkodliwe formy tlenu, np.: rodniki hydroksylowe, aniony ponadtlenkowe. Obecność moczanów w osoczu może wydatnie przyczyniać się do wydłużenia życia ludzkiego i do zmniejszenia zapadalności na choroby nowotworowe. Moczany jak również bilirubina są przykładami reguły, że niektóre produkty końcowe pochodzące ze szlaków metabolicznych odgrywają ważną rolę jako czynniki ochronne.

Mocznik

Mocznik powstaje w organizmie w tzw. cyklu mocznikowym. Związek ten pochodzi głównie z przemiany azotowej białek.

Podczas deaminacji aminokwasów tworzy się bardzo toksyczny amoniak. Powstaje on również w mniejszej ilości, w przemianach innych związków, np. nukleotydów purynowych i pirymidynowych oraz amin. Proces syntezy mocznika pełni ważną biologiczną rolę w przekształcaniu amoniaku w łatwo rozpuszczalny, nietoksyczny w stężeniach fizjologicznych związek, który następnie jest wydalany z moczem.

Zdrowy, dorosły człowiek, na prawidłowej diecie jest w stanie tzw. równowagi azotowej. Dobowa ilość azotu wydalana z organizmu jest równa ilości azotu przyjmowanego z pożywieniem. Przy spożyciu białka w ilości około 100 gramów na dobę wydalane jest 16 gramów azotu. 80 - 90% całkowitej puli wydalanego azotu stanowi mocznik. Ilość wytworzonego w organizmie dorosłego człowieka mocznika zależy głównie od zawartości białka w pożywieniu i przeciętnie wynosi od 20 do 40 g na dobę. Stężenie tego związku we krwi w warunkach prawidłowych waha się w szerokich granicach, od 20 do 40 mg/100 cm³, a nawet może osiągać 50 mg/100 cm³.

Synteza mocznika zachodzi wyłącznie w wątrobie. Amoniak łączy się z CO₂ tworząc karbamoilofosforan, reakcja ta wymaga udziału dwóch cząsteczek ATP, jako źródła energii. Karbamoilofosforan następnie reaguje z ornityną, tworząc cytrulinę. Cytrulina przy udziale energii pochodzącej z hydrolizy ATP kondensuje z asparaginianem, który jest dawcą drugiego atomu azotu. Powstały argininobursztynian ulega rozszczepieniu na argininę i fumaran. Arginina hydrolizuje dając mocznik i ornitynę, zamykając w ten sposób jeden obrót cyklu. Dwie pierwsze reakcje zachodzą w mitochondriach komórek wątroby, pozostałe trzy przebiegają w cytoplazmie.

Kreatynina

Kreatynina jest produktem degradacji kreatyny. Kreatyna występuje głównie w mięśniach i w postaci fosforanu jest magazynem energii. Cykl mocznikowy jest także punktem wyjścia do syntezy tego ważnego metabolitu. Arginina, metabolit cyklu mocznikowego, ulega w komórkach nerki kondensacji z glicyną. Powstaje guanidynooctan, który jest metylowany przez S-adenozylometioninę (SAM) do kreatyny. Kreatyna jest następnie fosforylowana za pomocą ATP i przechodzi w fosforan kreatyny, stanowiący zapas łatwo uruchamianej energii w mięśniu. Ostatni etap przemiany odbywa się bez udziału enzymów. W ciągu doby około 1,6% fosfokreatyny przekształca się w bezwodnik - kreatyninę (Rys. 2).

Kreatynina jest wydalana z moczem, przeciętnie od 1 do 1,8 gramów na dobę. Prawidłowe stężenie kreatyniny w surowicy wynosi u dorosłych kobiet od 0,5 do 1 mg/100 cm³, a u mężczyzn 0,6 - 1,2 mg/100 cm³. Znacznie niższe stężenie kreatyniny występuje u małych dzieci do trzech lat (0,2-0,4 mg/100 cm³). W miarę dorastania stężenie to stopniowo wzrasta, aby osiągnąć w wieku 17 lat wartości charakterystyczne dla ludzi dorosłych.

Podwyższone stężenie kreatyniny we krwi może wystąpić w chorobach nerek, mięśni i zatruciach witaminą D.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Oznaczanie kwasu moczowego w surowicy krwi

Zasada metody

Kwas moczowy w środowisku alkalicznym redukuje sole kwasu fosforowolframowego do tlenków wolframu na niższym stopniu utlenienia, mających zabarwienie niebieskie, a sam utlenia się do alantoiny (Rys. 1). Kwas moczowy należy oznaczyć w roztworze otrzymanym po odbiałczeniu surowicy. Denaturację białek przeprowadza się za pomocą soli metali ciężkich, w tym przypadku jonów wolframu.

Odczynniki

1. 10% roztwór wolframianu sodu.

2. 0,3 mol/dm³ roztwór H₂SO₄.

3. Wzorcowy roztwór kwasu moczowego o stężeniu 1 mg/100 cm³.

4. 10,3% roztwór Na₂CO₃.

5. Odczynnik fosforowolframowy (4% Na₂WO₄ x 2 H₂O w 3% roztworze H₃PO₄).

a) Odbiałczanie surowicy

Wykonanie doświadczenia

1.Do probówki odmierzyć 8 cm³ wody i 1 cm³ surowicy.

2.Dodać 0,5 cm³ 10% roztworu wolframianu sodu, a następnie 0,5 cm³ 0,3 mol/dm³ roztworuH₂SO₄ i dokładnie wymieszać.

3.Odstawić na 30 minut, a następnie odwirować (15 min, 4000 obr./min), do dalszych oznaczeń pobrać płyn znad osadu.

b) Oznaczenie ilościowe kwasu moczowego

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotować trzy probówki.

2. Do jednej odmierzyć 3 cm³ płynu znad osadu po odbiałczeniu surowicy (próba badana)

3. Do drugiej 3 cm³ roztworu wzorcowego kwasu moczowego (próba wzorcowa)

4. Do trzeciej 3 cm³ wody (próba ślepa).

5. Do wszystkich probówek dodać po 0.5 cm³ 10,3% roztworu węglanu sodu i wymieszać.

6. Następnie odmierzyć po 0.15cm³ odczynnika fosforowolframowego

7. Zawartość probówek dokładnie wymieszać, odstawić na 5 minut.

8. Odczytać absorbancję przy 610 nm wobec próby ślepej.

Obliczenia

Współczynnik 10 wynika z faktu, że surowica w trakcie doświadczenia została dziesięć razy rozcieńczona.

2. Oznaczanie mocznika w surowicy krwi metodą ureazową

Zasada metody

Mocznik ulega hydrolizie w reakcji katalizowanej przez ureazę (enzym pochodzenia roślinnego lub bakteryjnego). Powstałe jony amonowe reagują z odczynnikiem Nesslera i tworzy się barwny produkt.

Odczynniki

1. Roztwór ureazy z ziaren soi w buforze Tris-HCl o pH 7,4.

2. 10% roztwór ZnSO₄.

3. 0,5 mol/dm³ roztwór NaOH.

4. Wzorzec do oznaczania mocznika (roztwór NH₄Cl o stężeniu 1 mg N/100 cm³).

5. Odczynnik Nesslera (zasadowy roztwór K₂[HgJ₄]).

Wykonanie doświadczenia

Przygotować trzy probówki

1. Do pierwszej probówki wirówkowej odmierzyć 1 cm³ wody i 0,2 cm³ surowicy - próba badana

2. Do drugiej i trzeciej probówki wirówkowej odmierzyć 1 cm³ wody i 0,2 cm³ zadania

3. Następnie do wszystkich probówek dodać 2 cm³ roztworu ureazy w buforze Tris-HCl, pH 7,4.

4. Probówki zakryć parafilmem, wstawić do łaźni wodnej o temp. 37⁰ C i inkubować 20 minut.

5. Po inkubacji dodać do probówki zawierającej surowicę i do probówek zawierających zadanie

0,5 cm³ 10% roztworu ZnSO₄ i 0,3 cm³ 0,5 mol/dm³ roztworu NaOH w celu wytrącenia białek.

6. Zawartość probówek dokładnie wymieszać i odwirować (5 min, 3000 obr./min). Płyn znad osadu zdenaturowanych białek zlać do suchych probówek.

Przygotować 5 probówek:

1. Do pierwszej odmierzyć 2 cm³ płynu nadosadowego z probówki z próbą badaną i 5 cm³ wody

9.Do drugiej i trzeciej odmierzyć 2 cm³ płynu nadosadowego z probówek z zadaniem

i 5 cm³ wody

12. Do czwartej dodać 1 cm³ roztworu wzorcowego i 6 cm³ wody (próba wzorcowa),

13.Do piątej 7 cm³ wody (próba ślepa),

14. Zawartość probówek wymieszać.

15.Do wszystkich probówek dodać po 1 cm³ odczynnika Nesslera, wymieszać.

16. Absorbancję odczytać po 5 minutach, przy długości fali 470 nm, wobec próby ślepej.

Obliczenia

1 mg azotu odpowiada 2,14 mg mocznika (60:28, 60 - względna masa cząsteczkowa mocznika, 28 - względna masa cząsteczkowa azotu), współczynnik 10 wynika z rozcieńczenia surowicy - w końcowej objętości znajduje się 0,1 cm³ surowicy, a 1 cm³ wzorca.

3. Oznaczanie kreatyniny w surowicy krwi

Zasada metody

Kreatynina z kwasem pikrynowym tworzy kompleks o zabarwieniu czerwonym. Reakcja ta jest mało swoista i w zależności od warunków (temperatura, czas inkubacji, pH środowiska) intensywność zabarwienia może zmieniać się nieproporcjonalnie. Rzeczywista zawartość kreatyniny w osoczu stanowi zwykle około 80% wartości oznaczanej tą metodą. (Stosowane są również metody opierające się na oznaczeniach enzymatycznych).

Odczynniki

1. 10% roztwór Na₂WO₄.

2. 0,3 mol/dm³ roztwór H₂SO_4,

3. 1 mol/dm³ roztwór NaOH.

4. 1,5% roztwór kwasu pikrynowego.

5. Wzorcowy roztwór kreatyniny o stężeniu 4 mg/ 100 cm³.

Wykonanie doświadczenia

a) Odbiałczanie surowicy

Do probówki wirówkowej pobrać 3 cm³ surowicy, dodać 1,5 cm³ 10% roztworu Na₂WO₄ i 1,5 cm³ 0,3 mol/dm³ roztworu H₂SO₄ celem zdenaturowania białek. Dokładnie wymieszać, odstawić na 30 minut, a następnie odwirować (15 min, 4000 obr./min), Płyn znad osadu zlać do suchej probówki.

b) Wykonanie oznaczenia ilościowego

Przygotować 5 probówek:

1. do pierwszej dodać 2 cm³ płynu znad osadu (próba badana)

2. do drugiej i trzeciej dodać 1 cm³ roztworu zadania i 1 cm³ wody

3. do trzeciej 1 cm³ roztworu wzorcowego kreatyniny i 1 cm³ wody (próba wzorcowa)

4. do trzeciej 2 cm³ wody (próba ślepa).

Nastepnie do wszystkich probówek dodać 1 cm³ 1,5% roztworu kwasu pikrynowego i 1 cm³ 1mol/dm³ roztworu NaOH. Wymieszać, odstawić na 15 minut i zmierzyć absorbancję wobec próby ślepej przy długości fali 520 nm.

Obliczenia

ĆWICZENIE 6 - 29.04.2011

GLIKOGEN

ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA

1. Struktura glikogenu.

2. Synteza i rozpad glikogenu (reakcje wzorami i enzymy). Hormony regulujące te procesy.

3. Rola glikogenu wątrobowego i mięśniowego.

4. Metody izolowania i oznaczania procentowej zawartości glikogenu w wątrobie.

WPROWADZENIE

Glikogen jest zapasowym materiałem energetycznym zwierząt i człowieka. Jest to rozgałęziony homoglikan, zbudowany z jednostek α,D-glukopiranozowych, które są połączone dwoma typami wiązań glikozydowych: α-1,4 i występującym średnio co dziewięć reszt glukozowych wiązaniem α-1,6.

Glikogen jest magazynowany głównie w wątrobie i mięśniach. Ilość glikogenu w wątrobie dochodzi do 6-8% masy tego narządu, natomiast w mięśniach jego zawartość może wynosić 0,7%. Jednak mięśnie, z powodu dużej masy, zawierają 3-4-krotnie większy zapas glikogenu niż wątroba. Rezerwa glukozy znajdująca się w glikogenie wątrobowym służy do utrzymywania odpowiedniego stężenia tego związku we krwi w przerwach między posiłkami. Prawidłowe stężenie glukozy we krwi waha się niewielkich granicach i wynosi 3,9-6,1 mmola/dm³ (70-110 mg/100 cm³). Zapas glikogenu zgromadzony w wątrobie wystarcza na uzupełnianie stężenia glukozy przez 12-16 godzin.

Utrzymywanie stałego stężenia glukozy we krwi jest niezwykle istotne dla organizmu. Glukoza stanowi podstawowe źródło energii dla większości tkanek. Ciągłe dostarczanie glukozy jest konieczne do sprawnego funkcjonowania układu nerwowego i erytrocytów, dla których glukoza jest jedynym materiałem energetycznym. Neurony nie katabolizują kwasów tłuszczowych i przy normalnej diecie glukoza jest głównym źródłem energii potrzebnej do podtrzymania procesów życiowych tkanki nerwowej. Już poniżej stężenia 70 mg glukozy na 100 cm³ pojawiają się pierwsze objawy hipoglikemii jak np.: senność, drażliwość, bóle głowy i poczucie głodu. Przy bardzo niskim stężeniu glukozy we krwi występuje zaburzenie czynności mózgu, które może doprowadzić do śpiączki a nawet zgonu.

W stanach przedłużonego głodzenia lub przy braku węglowodanów w pożywieniu większość energii niezbędnej dla życia neuronów pochodzi z katabolizmu tzw. ciał ketonowych - acetooctanu i 3-hydroksymaślanu, których synteza nasila się w tych warunkach. Związki te są także metabolizowane przez inne tkanki z wyłączeniem wątroby i krwinek czerwonych. Jednak podczas głodzenia stężenie glukozy nie powinno spadać znacznie poniżej dolnych granic normy. Niezbędna ilość glukozy wytwarzana jest wtedy na drodze glukoneogenezy - syntezy glukozy z substancji niewęglowodanowych.

Glikogen zmagazynowany w mięśniach nie służy utrzymywaniu stałego stężenia glukozy we krwi, a jedynie dostarcza energii w trakcie przedłużonego skurczu mięśnia. Po 12-18 godzinach głodzenia wątroba zostaje niemal zupełnie pozbawiona glikogenu, natomiast zapas glikogenu w mięśniach zmniejsza się po długotrwałym, intensywnym wysiłku.

Syntezę glikogenu katalizują dwa enzymy z klasy transferaz. Syntaza glikogenowa, która tworzy wiązania α-1,4-glikozydowe i enzym rozgałęziający (amylo[α-1→4]→[α-1→6]-transglukozydaza), który syntetyzuje wiązania α-1,6-glikozydowe. Syntaza glikogenowa może jedynie wydłużać już istniejący łańcuch. Do rozpoczęcia reakcji potrzebny jest inicjator, białko - glikogenina. Dodatkowy enzym, glukozylotransferaza, przyłącza kolejno do grupy -OH specyficznej reszty seryny w tym białku kilka reszt glukozy, łącząc je wiązaniami α-1,4- glikozydowymi. Właściwa reakcja katalizowana jest przez syntazę glikogenową. Substratem do syntezy glikogenu jest UDP-glukoza (Rys. 1).

Gdy łańcuch zostanie przedłużony, do co najmniej 11 reszt glukozowych, wówczas enzym rozgałęziający przenosi część łańcucha z jednego rozgałęzienia na inne, tworząc wiązanie α-1,6 glikozydowe i ustanawiając w ten sposób nowy punkt rozgałęzienia. Powstaje cząsteczka bardzo rozgałęziona. Zwiększenie liczby nieredukujących zakończeń łańcuchów glukozowych umożliwia przyśpieszenie zarówno syntezy glikogenu, jak i jego rozkładu na drodze fosforolizy.

Głównym enzymem przeprowadzającym rozpad glikogenu (glikogenolizę) jest fosforylaza glikogenowa, należąca do klasy transferaz. Enzym ten przy udziale ortofosforanu prowadzi fosforolizę glikogenu od nieredukujących zakończeń cząsteczki tworząc glukozo-1-fosforan.

glikogen_{(n reszt glukozy)} + P_i → glikogen_{(n-1 reszt glukozy)} + glukozo-1-fosforan

Fosforylaza glikogenowa rozłącza tylko wiązania α-1,4-glikozydowe, degradując stopniowo łańcuchy glukozowe, aż do miejsc oddalonych o cztery reszty glukozowe od punktu rozgałęzienia, stworzonego za pomocą wiązania α-1,6. Następnie enzym odgałęziający, α-[1→4]→[1→4]-transferaza glukanowa przenosi fragment trzech reszt glukozy na łańcuch główny. W ten sposób odsłania się miejsce odgałęzienia. Rozkład wiązań α-1,6 katalizuje hydrolaza - amylo-α-[1→6]-glukozydaza, która uwalnia wolną glukozę.

Glukozo-1-fosforan, będący produktem działania fosforylazy, zostaje przekształcony w glukozo-6-fosforan za pomocą fosfoglukomutazy.

Dalsze losy glukozo-6-fosforanu zależą od rodzaju tkanki. W wątrobie występuje enzym fosfataza glukozo-6-fosforanowa, przekształcająca glukozo-6-fosforan w glukozę. Tylko wolna glukoza może być przenoszona przez błonę komórkową; dokonuje tego znajdujący się w błonie komórkowej układ transportujący. Rozkład glikogenu wątrobowego powoduje wzrost stężenia glukozy we krwi.

W mięśniach nie występuje fosfataza glukozo-6-fosforanowej i brak tego enzymu uniemożliwia przekształcenie glukozo-6-fosforanu do wolnej glukozy. Uwolniony glukozo-6-fosforan służy jako materiał energetyczny wykorzystywany podczas skurczu mięśnia.

Rozkład i synteza glikogenu zależy głównie od wpływu hormonów. Kontrolę nad tworzeniem i rozkładem glikogenu prowadzą przede wszystkim dwa hormony- glukagon i insulina. Glikogenolizę w mięśniach i wątrobie może także wywołać hormon stresu - adrenalina.

CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA

1. Izolowanie glikogenu z wątroby zwierzęcej.

Zasada metody

Wiązania glikozydowe występujące w glikogenie są oporne na działanie hydrolityczne jonów OHˉ w podwyższonej temperaturze. W wysokiej temperaturze w środowisku zasadowym wiązania peptydowe białek, estrowe lipidów i fosfodiestrowe kwasów rybonukleinowych ulegają hydrolizie. W wyniku ogrzewania tkanki w roztworze KOH otrzymuje się roztwór glikogenu zanieczyszczony innymi wielocukrami, fragmentami zdenaturowanego DNA oraz związkami małocząsteczkowymi, które znajdowały się w tkance lub powstały na skutek hydrolizy. Dodanie alkoholu etylowego powoduje wytrącenie glikogenu, który jest w niewielkim stopniu zanieczyszczony zdenaturowanym DNA i wysokocząsteczkowymi heteroglikanami, które również strącają się w tych warunkach.

Odczynniki

1. 30% roztwór KOH.

2. 96% etanol.

3. NaCl in subst.

Wykonanie doświadczenia

1. 1 g wątroby umieścić w probówce wirówkowej zawierającej 2,5 cm³ 30%

roztworu KOH.

2. Probówkę zakryć korkiem z chłodniczką zwrotną i wstawić na 30 minut do

wrzącej łaźni wodnej, wstrząsać, co kilka minut.

3. Po całkowitym rozpuszczeniu tkanki, probówkę wyjąć z łaźni, oziębić i dodać

4,5 cm³ 96% etanolu, dobrze wymieszać.

4. Probówkę ponownie zakryć korkiem z chłodniczką zwrotną i wstawić do gorącej

łaźni wodnej (uwaga - nie odparowywać alkoholu, wyjąć natychmiast

po osiągnięciu wrzenia).

5. Po ostudzeniu wytrącony osad glikogenu odwirować (5 min, 3000 obr./min).

6. Płyn znad osadu wylać, osad rozpuścić w 3 cm³ wody (mieszać bagietką).

7. Wytrącić glikogen przez dodanie 6 cm³ 96% etanolu (zawartość probówki dobrze

wymieszać bagietką). Jeśli osad nie ulegnie wytrąceniu należy dodać kilka krysz-

tałków NaCl, zamieszać i wstawić na chwilę do ciepłej łaźni wodnej.

8. Wytrącony glikogen odwirować jak poprzednio (5 min, 3000 obr/min)

9. Płyn znad osadu ostrożnie wylać.

10. Osad osuszyć przez postawienie probówki do góry dnem na bibule, a następnie

rozpuścić w 10 cm³ wody destylowanej. Powstały opalizujący roztwór używać do

dalszych oznaczeń.

2. Wyznaczanie krzywej wzorcowej do oznaczania glukozy.

Zasada metody

Glukoza posiada właściwości redukujące i w środowisku zasadowym redukuje odczynnik dinitrosalicylowy, sama zaś utlenia się do kwasu glukonowego. Odczynnik dinitrosalicylowy po redukcji zmienia barwę z żółtej na pomarańczową o maksimum absorbancji 550 nm. Powstałe zabarwienie roztworu jest proporcjonalne do ilości glukozy w próbce.

Odczynniki

1. 0,01 mol/ dm³ roztwór glukozy.

2. 0,05 mol/dm³ bufor fosforanowy pH 6,9.

3. Odczynnik dinitrosalicylowy (1% kwas 3,5-dinitrosalicylosalicylowy, 1,6% NaOH, 30% winian sodowo-potasowy).

Wykonanie doświadczenia

Do 7 probówek skalowanych na 10 cm³ dodać kolejno odczynniki według tabeli 1:

Tabela 1

	1	2	3	4	5	6	7
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
H2O	1,8	1,6	1,4	1,2	1,0	0,8	2,0
. 0,01 mol/ dm^3roztwór glukozy	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0	1,2	-
Bufor fosforanowy	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Odczynnik dinitro-salicylowy	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0	2,0

1. Po dodaniu odczynników zawartość probówek dobrze wymieszać

2. Wstawić na 10 minut do wrzącej łaźni wodnej.

3. Po wyjęciu z łaźni probówki oziębić.

4. Uzupełnić wodą do 10 cm³, wymieszać.

5. Dokonać pomiarów absorbancji przy długości fali 550 nm, wobec próby ślepej

probówka nr 7.

6. Sporządzić wykres zależności absorbancji od ilości μmoli glukozy w próbie.

3. Hydroliza kwaśna glikogenu. Oznaczanie zawartości procentowej glikogenu w wątrobie na podstawie ilości uwolnionej glukozy.

Zasada metody

Glikogen ulega hydrolizie w 100⁰ C w środowisku silnie kwaśnym, gdyż w tych warunkach wiązania glikozydowe ulegają rozpadowi. Jeśli hydroliza będzie prowadzona przez odpowiednio długi okres czasu to cała ilość glikogenu ulegnie rozkładowi do wolnej glukozy. Na podstawie ilości uwolnionej glukozy można wyliczyć zawartość procentową glikogenu w wątrobie.

Odczynniki

1. 2 mol/dm³ roztwór HCl.

2. 1,2 mol/dm³ roztwór NaOH .

3. Odczynnik dinitrosalicylowy (1% kwas 3,5-dinitrosalicylosalicylowy,

1,6% NaOH, 30% winian sodowo-potasowy).

4. 0,05 mol/dm³ bufor fosforanowy pH 6,9.

Wykonanie doświadczenia

1. Otrzymany w doświadczeniu 1 roztwór glikogenu rozcieńczyć dwukrotnie:

pobrać 5 cm³, dodać 5 cm³ wody i dokładnie wymieszać.

2. Przygotować dziesięć probówek.

3. Do probówek 1-9 odmierzyć po 0,4 cm³ rozcieńczonego dwa razy roztworu

glikogenu, do probówki nr 10 dodać 0,4 cm³ wody (próba ślepa).

4. Do wszystkich probówek dodać po 0,6 cm³ 2 mol/dm³ roztworu HCl i zanotować

czas (t₀).

5. Zawartość probówki nr 1 i 10 natychmiast zobojętnić przez dodanie 1 cm³

1,2 mol/dm³ roztworu NaOH.

6. Pozostałe probówki (2-9) wstawić do wrzącej łaźni wodnej.

7. Probówki od 2 do 8smej wyjmować z łaźni w odstępach co cztery minuty, a

zawartość ich, natychmiast po wyjęciu, zobojętnić dodając 1cm³ 1,2 mol/dm³

roztworu NaOH.

8. Probówkę nr 9 wyjąć z łaźni po 40 minutach, następnie zobojętnić, jak

poprzednio.

9. Do wszystkich probówek dodać po 0,5 cm³ 0,05 mol/dm³ buforu fosforanowego

pH 6,9 w celu wyrównania we wszystkich probówkach wartości pH.

10. Następnie do wszystkich probówek dodać 2 cm³ odczynnika dinitrosalicylowego,

zawartość probówek dobrze wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na

10 minut.

11. Probówkę wyjąć, ochłodzić i uzupełnić do 10 cm³ wodą destylowaną, ponownie

wymieszać.

12. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm, wobec próby ślepej (probówka

nr 7 z doświadczenia nr 2).

Z krzywej wzorcowej do oznaczania glukozy (doświadczenie nr 2), odczytać ilość μmoli glukozy. Sporządzić wykres zależności ilości μmoli uwolnionej glukozy od czasu trwania hydrolizy kwaśnej glikogenu.

Obliczyć ilość μg glukozy uwolnionej podczas całkowitej hydrolizy próbki glikogenu i obliczyć zawartość procentową glikogenu w wątrobie. Należy uwzględnić wszystkie stosowane rozcieńczenia preparatu glikogenu uzyskanego z jednego grama tkanki i ilość oznaczonej glukozy pomnożyć przez 0,9, aby uwzględnić fakt, że ze 162 g glikogenu powstaje 180 g glukozy (162:180).

4. Zadanie ilościowe - oznaczanie glukozy (indywidualne dla każdego

studenta)

Wykonanie doświadczenia

Do 1 cm³ roztworu zadania dodać 1 cm³ wody, 0,5 cm³ 0,05 mol/dm³ buforu fosforanowego pH 6,9 i 2 cm³ odczynnika dinitrosalicylowego.

Zawartość probówek dokładnie wymieszać i ogrzewać przez 10 minut we wrzącej łaźni wodnej. Po wyjęciu oziębić i uzupełnić wodą do 10 cm³. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm wobec próby ślepej (probówka nr 7 z doświadczenia 2). Z krzywej wzorcowej odczytać ilość μg glukozy w 1 cm³ zadania.

---