Biotechnologia, Data wykonania ćwiczenia 16.10.2013

Grupa 3, środa 12-15

FERMENTACJA ALKOHOLOWA

1.Fermentacja alkoholowa to beztlenowy niecałkowity rozkład związków organicznych, głównie utlenianie cukrów, przebiega według poniższego schematu:

C_6­H₁₂O₆ →2C₂H₅OH + 2CO₂ + 28 kcal

Produkty fermentacji nie mogą być dalej metabolizowane bez udziału tlenu. Pierwsze etapy procesu fermentacji alkoholowej mogą być zbieżne z początkowymi etapami oddychania tlenowego ( np. glikoliza).

Celem fermentacji jest utlenianie cukrów z pewnym niewielkim zyskiem energetycznym- z 1 mola glukozy powstają 2 mole ATP.

Mikroorganizmy przeprowadzające proces fermentacji.

• Drożdże głównie z rodzaju Saccharomyces (należą do klasy workowców- ascomyces) i do rodzaju drożdży właściwych (Saccharomyces taceaces). Najczęściej stosowane Saccharomyces cerevisiae mogą wytwarzać nawet do 12% etanolu, zaś wolno rosnące Saccharomyces sake nawet do 20%.

• Bakterie np. Sarcina ventriculli, Zymomonas mobilis, Thermoaerobacter ethanolicus.

Wykorzystanie fermentacji alkoholowej:

• przemysł spirytusowy

• przemysł farmaceutyczny

• przemysł spożywczy

• przemysł chemiczny

• produkcja biopaliw

Efekt Pasteura- w warunkach tlenowych fermentacja jest zahamowana, ale następuje intensywny przyrost biomasy drożdży. W warunkach beztlenowych następuje mniejszy przyrost biomasy, ale intensywnie przebiega proces fermentacji .

Odwrotny efekt Pasteura- mimo, iż fermentacja jest procesem beztlenowym to niezbędna jest minimalna ilość tlenu do jej zachodzenia (ok.0,05%). Tlen potrzebny jest do syntezy związków t.j. sterole czy kwas nikotynowy niezbędny do budowy błony komórkowej.

2. Cel ćwiczenia:

• Wykonanie barwienia przyżyciowego drożdży prasowanych i suszonych w celu określenia liczby żywych i martwych komórek.

• Badanie wykorzystywania różnych substratów przez drożdże piwowarskie Saccharomyces cerevisiae.

• Oznaczanie biomasy drożdży w hodowli tlenowej i beztlenowej (efekt Pasteura).     

3. Przebieg doświadczeń: 

a) Oznaczenie żywotności drożdży - barwienie przyżyciowe drożdży prasowanych:

• wykonano rozczyn z drożdży, który naniesiono na szkiełko podstawowe;

• naniesienie kropli błękitu metylenowego i przykrycie szkiełkiem nakrywkowym;

• zliczenie liczby komórek martwych (zabarwionych) oraz żywych pod mikroskopem przy powiększeniu 60x.

b) Oznaczenie żywotności drożdży - barwienie przyżyciowe drożdży suszonych:

• rozpuszczenie kilku kuleczek drożdży w niewielkiej ilości wody;

• naniesienie rozczynu na szkiełko podstawowe, wykonanie barwienia i zliczeń jak wyżej.

c) Wykorzystanie różnych substratów przez drożdże piwowarskie:

• 3 probówki wyposażone w rurki Durhama zawierające wodę drożdżową, purpurę bromokrezolową i kolejno cukry: glukozę, sacharozę i skrobię zaszczepiono po 0,1 ml zmywu drożdży ze skosu;

• hodowle inkubowano 3 dni w temp. 30^oC.

d) Oznaczanie biomasy drożdży w hodowli tlenowej i beztlenowej:

• do kolb zawierających 250 ml pożywki mineralnej z dodatkiem sacharozy i melasy zaszczepiono po 1 ml zmywu drożdży ze skosu;

• w dwóch kolbach zawierających różne substraty umieszczono rurki fermentacyjne wypełnione wodą destylowaną (warunki beztlenowe) i inkubowano w temperaturze pokojowej;

• dwie kolby zabezpieczone gazą (warunki tlenowe) inkubowano na wytrząsarce;

• po okresie inkubacji zważono probówkę wirówkową, następnie odwirowano 50 ml hodowli drożdży przy 10 tyś. obr/min, na koniec zważono probówkę wraz z osadem.

4. Wyniki i wnioski:

Poniżej przedstawione są wyniki oraz wnioski do wyżej wymienionych doświadczeń wyszczególnionych w podpunktach a - d.

a,b) Udział komórek martwych obliczono ze wzoru:

X= $\frac{b}{a + b}*100\%$

a - średnia liczba komórek bezbarwnych (żywych)

b - średnia liczba komórek zabarwionych (martwych)

W przypadku drożdży prasowanych uzyskano komórek:

- żywych: 336, 304, 290, 320. średnio: 312

- martwych: 16, 25, 12, 20. średnio: 18

X= ok. 5,45%

W przypadku drożdży suszonych uzyskano komórek:

- żywych: 120, 115, 104, 125. średnio: 116

- martwych: 25, 25, 32, 15. średnio: 24

X= ok. 17,14%

• Liczba komórek martwych nie powinna przekraczać 5 % w drożdżach prasowanych i 25% w drożdżach suszonych. Okazuje się zatem, że drożdże prasowane (spożywcze w postaci kostki) posiadają niewielki odsetek komórek martwych, jednak w wykonanym doświadczeniu w niewielkim stopniu przekraczają odpowiednią ilość (tzn. 5%). Różnica ta może wynikać z niedokładności podczas zliczania komórek. W przypadku drożdży suszonych % komórek martwych nie przekracza 25%, co świadczy o dobrej jakości produktu i dobrze przeprowadzonym doświadczeniu.

c) Po inkubacji sprawdzono obecność CO₂ w probówkach zawierających rurki Durhama oraz kolor podłoża.

• W probówkach z sacharozą i glukozą zaobserwowano zmianę koloru podłoża na żółty, oraz obecność gazu, który świadczy o wykorzystaniu cukrów w procesie fermentacji. Widać także było wzrost biomasy drożdży. Uzyskane wyniki świadczą o zajściu fermentacji. W probówkach ze skrobią nie zaobserwowano zmiany koloru podłoża ani produkcji gazu, więc cukier nie został wykorzystany - brak fermentacji.

• Drożdże piwowarskie Saccharomyces cerevisiae jako substrat do fermentacji zużywają m.in. sacharozę i glukozę, natomiast nie wykorzystują skrobii jako substratu.

d) Oznaczenia probówek:

Hodowla	Waga probówki wirówkowej [g]	Waga probówki z osadem [g]	Waga osadu - świeża masa drożdży [g]
1-warunki tlenowe, sacharoza	29,6366	31,0307	1,3941
2-warunki beztlenowe, sacharoza	29,4673	30,2790	0,8117
3-warunki tlenowe, melasa	29,4526	30,1328	0,6802
4-warunki beztlenowe, melasa	29,8368	najmniej osadu, struktura luźna, nie udało się oddzielić osadu od płynu

• Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że warunki tlenowe są korzystniejsze dla rozwoju drożdży, ponieważ w przypadku obu substratów uzyskaliśmy większą świeżą masę drożdży niż w hodowli w warunkach beztlenowych (efekt Pasteura), natomiast porównując użyte substraty wydajniejszą produkcję biomasy uzyskaliśmy przy użyciu pożywki z dodatkiem sacharozy.