MATERIAŁY POMOCNICZE DO ĆWICZEŃ

Z „BIOCHEMII ZWIERZĄT”

KIERUNEK : RYBACTWO

DR MARIA MIKA

KRAKÓW 2008

-1-

A .Wprowadzenie do ćwiczeń:

• Obecności - student obowiązany jest być na wszystkich zajęciach, w wyjątkowej sytuacji może mieć dwie nieobecności – usprawiedliwione ( nie ma możliwości odrobienia ćwiczeń).

• Warunki zaliczenia – warunkiem otrzymania zaliczenia jest otrzymanie pozytywnych ocen z kolokwiów obejmujących zakres materiału ćwiczeń , obecności i aktywność studenta na zajęciach. Student który nie otrzymał zaliczenia w pierwszym terminie, może otrzymać zaliczenie w terminach poprawkowych ustalonych przez prowadzącego ćwiczenia.

• Uwaga!! – Na wszystkich ćwiczeniach konieczne jest posiadanie fartucha ochronnego. W przypadku jego barku student nie zostanie wpuszczony na salę ćwiczeń.

B. Zasady BHP:

1. Laboratorium chemiczne jest miejscem pracy w którym należy zachowywać się w sposób odpowiedzialny i poważny.

2. W laboratorium znajdują się płyny żrące , łatwo palne , trujące , barwiące, dlatego należy pracować w fartuchu ochronnym.

3. Na stołach laboratoryjnych znajdują się zestawy odczynników które są dokładnie opisane. Przed opuszczeniem sali trzeba sprawdzić , czy wszystkie odczynniki znajdują się na swoim miejscu.

4. Korzystając z odczynników , należy pamiętać iż otwierając butelkę trzeba odłożyć korek tak ,aby nie zabrudzić stołu. Po użyciu odczynnika butelkę zamknąć korkiem i odstawić na właściwe miejsce.

5. Ńie wolno używać tej samej pipety szklanej lub końcówki pipety automatycznej do różnych roztworów. Nie wlewać raz pobranego roztworu ponownie do butelki.

6. Należy starannie usunąć rozlane na stół lub podłogę odczynniki.

7. Przy ogrzewaniu cieczy nad palnikami należy zwrócić uwagę na ustawienie probówki pod odpowiednim kątem i zachować bezpieczeństwo pracy.

8. Odczynniki stężone i żrące znajdują się pod digestorium. Podczas pracy z nimi należy zachować szczególną ostrożność i zabezpieczyć się , stosując opuszczoną szybę wyciągu. Wszystkie odczynniki stanowią potencjalne zagrożenie , szczególnie dla oczu oraz błon śluzowych jamy ustnej i nosa.

9. Nie wolno pipetować ustami stężonych kwasów, zasad, bromu i roztworów cyjanków. Posługujemy się w tym celu pipetami zaopatrzonymi w gruszki gumowe, pipetami automatycznymi, lub biuretami

10. Żadnej substancji nie bada się smakiem.

11. W wypadku oparzenia się kwasem , należy natychmiast przemyć skórę roztworem węglanu amonu lub węglanu sodu. W wypadku poparzenia się zasadą - przemyć skórę rozcieńczonym roztworem kwasu octowego, a następnie spłukać wszystko wodą.

12. W razie dostania się kwasu lub zasady do ust - natychmiast przepłukać je duża ilością wody , a następnie wymienionymi w p. 11 roztworami. W przypadku połknięcia roztworu kwasu lub zasady - wypić dużą ilość mleka lub wody z surowym białkiem jaja.

13. Jeżeli jakiś płyn dostanie się do oka ,natychmiast należy przemyć go dużą ilością wody.

14. Każdy wypadek np. poparzenia lub skaleczenia należy zgłosić osobie prowadzącej ćwiczenia

15. Wiele odczynników stosowanych w laboratorium biochemicznym jest truciznami , często więc należy myć ręce, a bezwzględnie przed opuszczeniem laboratorium.

16. Przed opuszczeniem laboratorium sprawdź czystość i porządek na swoim stanowisku pracy

-2-

1. Teoretyczne wprowadzenie do węglowodanów.

Węglowodany ( cukry, sacharydy ) powstają w procesie fotosyntezy w komórkach roślin zielonych i stanowią główne źródło energii.

Ze względu na wielkość cząsteczki można je podzielić na :

• monosacharydy ( cukry proste i ich pochodne)

• oligosacharydy (2,3 lub więcej do 6 cukrów prostych połączonych wiązaniami

o-glikozydowym

• polisacharydy ( polimery o dużej masie cząsteczkowej zawierające dużą liczbę reszt monosacharydów)

Monosacharydy - cukry proste o wzorze ogólnym C_nH_2nO_n to wielowodorotlenowe aldehydy lub wielowodorotlenowe ketony . Stąd, jeśli posiadają grupę aldehydową (-CHO) nazywamy je aldozami, a jeśli grupę ketonową (-C=O) to ketozami.

Natomiast w zależności od liczby atomów w cząsteczce cukru prostego dzielimy je na:

Aldozy (grupa –CHO- przy C₁) Ketozy ( grupa –C=O przy C₂)

Triozy ← 3 → -

Tetrozy ← 4 → terulozy

Pentozy ← 5 → pentulozy

Heksozy ← 6 → heksulozy

Szereg aldoz

-3-

Cukry proste tworzą dwa szeregi konfiguracyjne D i L przy czym cukry naturalne występują w przyrodzie głównie do szeregu D. Przynależność danego cukru do szeregu D lub L zależy od konfiguracji grupy OH i H przy ostatnim asymetrycznym atomie węgla tj. C₄ dla pentoz i C₅ dla heksoz. Węgiel asymetryczny to taki węgiel który posiada cztery różne podstawniki( w postaci atomów lub grup atomów).

Jeżeli grupa alkoholowa OH przy ostatnim węglu asymetrycznym jest po stronie prawej to taki cukier należy do szeregu D , jeśli jest po stronie lewej do szeregu L.

. aldehyd D-glicerynowy aldehyd L- glicerynowy

-3-

Formy D i L cukrów są izomerami optycznymi zwanymi enancjonomerami czyli odbiciami lustrzanymi. Tak więc izomeria D i L to izomeria lustrzana.

Badanie właściwości cukrów prostych, dwucukrów i wielocukrów.

Reakcje charakterystczne

Cukry proste (monosacharydy) , zarówno aldozy jak i ketozy , ogrzewane ze stężonymi kwasami solnym lub siarkowym ulegają odwodnieniu do cyklicznych aldehydów , przy czym z pentoz powstaje furfural (aldehyd furylowy) natomiast z heksoz 5-hydroksymetylenofurfural (aldehyd 5-hydroksymetylenofurylowy) zgodnie z podanymi reakcjami:

Oprócz wolnych monosacharydów reakcję te dają także monosacharydy powstające w wyniku hydrolizy z disacharydów oraz z polisacharydów zarówno wolnych jak i występujących w połączeniu z innymi związkami. Furfural oraz 5-hydroksymetylenofurfural mogą kondensować z fenolami i aminami aromatycznymi lub ich pochodnymi takimi jak -naftol, antron i tymol oraz floroglucyna, orcyna i rezorcyna.

-3-

Do celów analitycznych stosuje się następujące reakcje oparte na powyższej zasadzie:

Reakcja Molischa z α - naftolem :

Zasada: jest to najbardziej ogólna reakcja na cukry zarówno wolne jak i związane. Ujemny jej wynik wyklucza obecność cukru, dodatni zaś nie zawsze jest wystarczający do jego stwierdzenie ponieważ podobną reakcję dają np. aldehydy , acetony .Zasada próby polega na powstaniu czerwono-fioletowego zabarwienia w wyniku kondensacji pochodnych furfuralowych z - naftolem.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór glukozy

10% etanolowy roztwór α-naftolu

H₂SO₄ – stężony

Do 1ml roztworu glukozy dodać 1-2 kropli świeżo sporządzonego 10% etanolowego roztworu - naftolu. Po dokładnym zmieszaniu , bardzo ostrożnie! po ściance probówki wprowadzić 1 ml stężonego roztworu H₂SO₄ tak, aby była widoczna granica między cieczami. W miejscu zetknięcia się obu cieczy powstaje czerwono-fioletowy pierścień. Pierścień zielony określa negatywną reakcję . Dla porównania przeprowadzić reakcję z wodą!

Reakcja tymolowa

Zasada: Dodatnią reakcję z tymolem dają wszystkie cukry, zarówno wolne jak i związane. Zasada przebiegu obu reakcji jest podobna jak w reakcji Molischa, różnica polega na zastosowaniu tymolu zamiast -naftolu.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki:roztwór glukozy

3%roztwór tymolu w 96%etanolu

HCL stężony

Do 1 ml roztworu glukozy dodać 4 krople alkoholowego roztworu tymolu i 1 ml stężonego HCL. Wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Czerwone zabarwienie roztworu określa reakcje pozytywną. Dla porównania wykonać reakcją z wodą.

Reakcja Seliwanowa z rezorcyną na ketozy

Zasada: W reakcji tej barwny związek z rezorcyną daje hydroksymetylenofurfural, powstający dużo łatwiej z ketoz niż z aldoz pod wpływem działania kwasu solnego. Próba ta pozwala więc na odróżnienie ketoz od aldoz ponieważ w obecności rozcieńczonego roztworu HCL tylko ketozy ulegają odwodnieniu w czasie ogrzewania w temp.100⁰C przez 30 sekund

Wykonanie oznaczenia :

Odczynniki : roztwór fruktozy

roztwór glukozy

odczynnik Seliwanowa (0,05%roztwór rezorcyny w 25%HCL)

Do dwóch probówek dać 1 ml odczynnika Seliwanowa. Do pierwszej dodać 2 krople roztworu fruktozy a,do drugiej 2 krople glukozy. Po dokładnym zmieszaniu wstawić do wrzącej łaźni wodnej. Wyjąć obie probówki po 30 sekundach i porównać zabarwienie. W obecności ketozy w ciągu 30 sekund powstaje czerwone zabarwienie. Roztwory aldoz krótko ogrzewane nie ulegają zabarwieniu. Zabarwienie może wystąpić po dłuższym ogrzewaniu .

-4-

Wykrywanie pentoz

Próba Biala z orcyną na pentozy

Zasada: W obecności soli żelaza (III) furfural powstający z rybozy w środowisku HCl daje z orcyną kompleks o barwie zielonej

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór pentozy (np. ksylozy, rybozy)

0,2% roztwór orcyny w 20% HCl

1% FeCl₃

Do 2 ml 0,2% roztworu orcyny w 20% HCl dodać kroplę FeCl₃ i 0,5 ml roztworu pentozy. Wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 3 - 5 minut. W obecności pentoz powstaje zielone zabarwienie. Dla porównanie przeprowadzić reakcję na heksozie (np. glukozie )

Reakcje redukcyjne

W środowisku zasadowym formy pierścieniowe cukrów przekształcają się w formy łańcuchowe z odtworzeniem wolnych grup aldehydowych lub ketonowych. Grupy te nadają cząsteczkom cukru własności redukcyjne. Aktywna w tych warunkach forma aldehydowa lub ketonowa redukuje niektóre jony metali ciężkich Szczególnie łatwo redukują jony metali takich jak : Cu⁺², Bi^+2, Ag⁺¹.

Ponieważ w środowisku zasadowym wodorotlenki tych metali wytrącają się w postaci koloidalnych osadów, co nie pozwala na wykazanie redukcyjności cukrów zwykle wprowadza się związki organiczne (winian sodowo-potasowy), które z wodorotlenkami metali ciężkich tworzą rozpuszczalne kompleksy. Na wskutek dysocjacji takiego kompleksu w roztworze pojawiają się jony metali , które mogą ulec redukcji przez cukier redukujący. W reakcjach tych cukrowiec ulega utlenieniu, przy czym produktu utlenienia są rozmaite w zależności od przebiegu reakcji.

Reakcja Trommera

Zasada: Próba ta polega na redukcji przez cukier jonu miedzi Cu⁺² do Cu⁺¹ Przebiega ona w podwyższonej temperaturze w środowisku alkalicznym. Jeżeli ogrzewamy wodorotlenek miedzi w roztworze alkalicznym to przechodzi on w czarny nierozpuszczalny tlenek miedzi (I) zgodnie z reakcją:

CuSO₄ + 2NaOH → Cu(OH)₂ + Na₂SO₄

Cu(OH)₂ → CuO + H₂O

czarny osad

W obecności cukru-związku redukującego reakcja ta przebiega odmiennie:

2Cu(OH)₂ → Cu₂O + 2H₂O + 1/2O₂

osad czerwony

Powstają nierozpuszczalne kryształki tlenku miedzi (I) , które w zależności od swojej wielkości posiadają barwę od żółtej przez pomarańczową do czerwonej. Reakcja ta jest bardzo czuła i pozwala wykryć nawet ślady cukrów.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór glukozy (lub innego monosacharydu)

1M NaOH

0,2 N CuSO₄

-5-

Do 2 ml glukozy dodać 5 kropli 1M NaOH i kroplami 0,2N CuSO_4, aż do momentu pojawienia się osadu Cu(OH)₂ (należy unikać nadmiaru siarczanu miedzi gdyż wytrąca się czarny tlenek miedzi (II) maskujący właściwą barwę). Po podgrzaniu we wrzącej łaźni wodnej około 5 minut wytrąca się pomarańczowo- czerwony osad Cu₂O .

Dla porównania reakcję wykonać na wodzie .

Reakcja Fehlinga

Zasada: jest to zmodyfikowana reakcja Trommera, w której zastosowano winian sodowo-potasowy (sól Seignetta) jako odczynnik zapobiegający wytrącaniu się jonów Cu^+2. tworzy on z jonami Cu⁺²sól kompleksową. W ten sposób nadmiar nie zredukowanych jonów Cu⁺² pozostaje w roztworze nie przechodząc w czarny tlenek miedzi (II) CuO. Dalszy przebieg reakcji jest identyczny jak w przypadku reakcji Trommera.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór glukozy

Fehling I (roztwór CuSO₄)

Fehling II (NaOH + winian sodowo-potasowy)

Do probówki wlać około 2 ml glukozy oraz 1 ml Fehlinga I i 1 ml Fehlinga II . Zawartość probówki bardzo dokładnie wymieszać, a następnie ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez około 10 minut dla uzyskania czerwono- pomarańczowego osadu tlenku miedzi (I) Cu₂O. Dla porównania przeprowadzić reakcją na wodzie.

Reakcja Benedicta

Zasada: Podobnie jak w próbach Tromera i Fehlinga w tej reakcji redukcji ulegają jony Cu⁺²

do Cu⁺¹ pod wpływem cukru. Odczynnikiem utrzymującym jony Cu⁺² w roztworze jest cytrynian sodowy ,pełniący rolę soli Seignetta

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki:roztwór glukozy

odczynnik Benedicta(CuSO₄ + Na₂CO₃ bezw. + cytrynian sodu)

Do około 2 ml odczynnika Benedicta dodać kilka kropli glukozy, wymieszać i ogrzać na łaźni wodnej 3 – 5 minut. Po oziębieniu wytrąca się czerwono-pomarańczowy osad tlenku miedzi (I) Cu₂O. Dla porównania przeprowadzić reakcję na wodzie.

Reakcja Tollensa

Zasada:Redukcja soli srebra do srebra metalicznego w środowisku alkalicznym , w obecności wolnych grup aldehydowych lub ketonowych cukrów. Reakcja przebiega następująco:

AgNO₃ + NH₄OH → AgOH + NH₄NO₃

AgOH + 2NH₃ → Ag(NH₃)₂OH

2Ag(NH₃)₂OH + R-CHO → 2Ag + R- COONH₄ + NH₃ + H₂O

Wykonanie oznaczenia

Odczynniki: roztwór glukozy (lub innego cukru)

roztwór azotanu srebra

amoniak

Do suchej i czystej probówki wlać 3 ml roztworu azotanu srebra , a następnie dodawać po kilka kropli amoniaku, aż powstający osad AgOH rozpuści się w nadmiarze. Do powstałej soli kompleksowej dodać 2 ml glukozy lub innego cukry redukującego i po wymieszaniu umieścić probówkę we wrzącej łaźni wodnej . Po około 10 minutach wydzieli się na ścianach probówki metaliczne srebro w postaci lustra.

-6-

Disacharydy

Disacharydy (dwucukry) składają się z dwóch cząsteczek cukrów prostych połączonych wiązaniem O- glikozydowym. Wiązanie glikozydowe nie odznacza się dużą trwałością szczególnie w obecności jonów wodorowych. Hydrolizę wiązania glikozydowego można bardzo łatwo przeprowadzić pod wpływem kwasów, lub enzymatycznie. Enzymy katalizujące tę reakcje odznaczają się dużą specyficznością działania , zależną nie tylko od rodzaju składników ale i również od typu wiązania glikozydowego ( i ).

Pwszechnie występującym disacharydem jest sacharoza popularny cukier spożywczy, który otrzymuje się na skale przemysłową z trzciny cukrowej i buraków cukrowych. Disacharyd ten utworzony jest przez reszty glukozy i fruktozy połączone anomerycznymi atomami węgla.

Hydrolizę sacharozy do glukozy i fruktozy katalizuje sacharaza nazywana również inwertazą.

Hydroliza kwaśna sacharozy

Zasada: pod wpływem kwasów mineralnych sacharoza ulega rozpadowi na glukozę i fruktozę. Rozpad sacharozy zachodzi również wpływem enzymu - inwertazy.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór sacharozy

2N H₂SO₄

2N NaOH

Odmierzyć 20 ml sacharozy do zlewki i dodać 6 ml 2N H₂SO₄ Roztwór w zlewce podgrzać do wrzenia i gotować przez 3 minuty. Po ostudzeniu zobojętnić 2N NaOH , kontrolując proces zobojętnienia papierkiem lakmusowym. Na produktach hydrolizy wykonać reakcję Fehlinga.

Osazony

Monosachardy , zarówno aldozy jak i ketozy oraz disacharydy redukujące reagują z aminami np. z fenylohydrazyną. W pierwszym etapie kondensacji z fenylohydrazyną powstają fenylohydrazony, które następnie utleniają się w przypadku aldoz do ketofenylohydrazonów zaś ketozy do aldofenylohydrazonów. Powstałe związki kondensują z kolejną cząsteczką fernylohydrazyny, co prowadzi ostatecznie do wytworzenia difenylohydrazonów czyli osazonów , niezależnie od tego czy cukrowcem była aldoza czy ketoza. Na tym etapie reakcja zatrzymuje się na wskutek powstania chelatowego wiązania między atomami azotu obydwóch reszt fenylohydrazyny. Wytrąca się żółty osad o charakterystycznych kształtach. Reakcja przebiega według równania:

-7-

Na podstawie tej reakcji nie można jednak rozróżnić monosacharydów epimerycznych . Różnią się one bowiem ułożeniem podstawników tylko przy dwóch kolejnych (C-1i C-2) atomach węgla w cząsteczce, przy których zachodzi właśnie reakcja kondensacji z fenylohydrazyną. Do takich heksoz należy glukoza , fruktoza i mannoza. Proces enolizacji umożliwiający zamianę tych heksoz , zachodzi w środowisku rozcieńczonych wodorotlenków następuje etapami i jest odwracalny. Otwarcie formy pierścieniowej i przesunięcie równowagi w kierunku postaci łańcuchowej poprzez jego formę enolową, prowadzi do wytworzenia cukrów epimerycznych. Enolizacja niweluje więc różnice konfiguracji podstawników przy atomach C-1, C-2 , stąd osazony tych cukrowców mają identyczne kryształy. Żółto zabarwione kryształy osazony poszczególnych mono- i disacharydów różnią się temperaturą topnienia i kształtem kryształów co pozwala je łatwo identyfikować pod mikroskopem.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki : roztwory cukrowców

mieszanina - chlorowodorek fenylohydrazyny + krystaliczny octan sodu (1:2)

Do 10 ml roztworu cukrowca dodać szczyptę mieszaniny- chlorowodorku fenylohydrazyny

i krystalicznego octanu sody .Ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 60 minut.

Po upływie tego czasu mieszaninę oziębić i oglądać utworzone osazony pod mikroskopem.

-8-

Polisacharydy

Polisacharydy (wielocukry) należą do związków organicznych najobficiej występujących w przyrodzie. Są one produktami polikondensacji monosacharydów połączonych wiązaniami glikozydowymi. Sumaryczny wzór wielocukrów jednoskładnikowych można wyrazić jako:

M_n - (n-1)H₂O, gdzie M oznacza dowolny monosacharyd , zaś n - liczbę jego cząsteczek. Masa cząsteczkowa polisacharydów waha się w szerokich granicach t.j. od kilku tysięcy do kilku milionów. Ze względu na budowę chemiczną polisachrydy można podzielić na homoglikany (jednoskładnikowe: np. skrobia, glikogen, celuloza) i heteroglikny (wieloskładnikowe: np. chondroityna, heparyna, kwas hialuronowy).

Roślinną substancja zapasową jest skrobia składająca się z amylozy i amylopektyny. Amyloza nie ma rozgałęzień i jest zbudowana z reszt glukozy połączonych wiązaniami α-1,4-glikozydowymi. Amylopektyna jest rozgałęzioną formą skrobi, w której na jedno wiązanie α-1,6-glikozydowe przypada około trzydzieści wiązań α-1,4- glikozydowych. Połowę węglowodanów spożywanych przez ludzi stanowi skrobia. Zarówno amylopektyna jak i amyloza są hydrolizowane przez α-amylazę , wydzielaną przez gruczoły ślinowe i przez trzustkę.

Komórki zwierzęce magazynują glukozę w postaci glikogenu. Glikogen jest rozgałęzionym polimerem o dużej masie cząsteczkowej , zbudowanym z reszt glukozy. Większość reszt glukozy jest w glikogenie połączona wiązaniami α-1,4-glikozydowymi. Rozgałęzienia powstają w miejscach wiązań α-1,6- glikozydowych występujących przeciętnie co dziesięć reszt glukozy.

Bardzo ważnym polisacharydem roślinnym jest celuloza pełniąca funkcje strukturalne , a nie odżywcze. Jest ona nie rozgałęzionym polimerem reszt glukozy , połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi. Konfiguracja β pozwala celulozie na tworzenie bardzo długich , prostych łańcuchów.

Reakcja skrobi z jodem

Zasada: Cząsteczki jodu wchodzą „do kanału” utworzonego przez spiralnie skręcone łańcuchy polisacharydu i są „przytrzymywane” przez tlen przy pierwszym i czwartym atomie węgla każdej cząsteczki glukozy . Wytwarza się więc łańcuch drobin jodu , wzdłuż którego mogą przesuwać się elektrony , co powoduje pochłanianie światła przez cały kompleks. Skrobia na wskutek adsorbcji cząstek jodu barwi się na kolor niebieski.

-9-

Barwa kompleksu zależy od budowy i stopnia rozgałęzienia łańcucha polisacharydu. Amyloza daje z jodem zabarwienie niebieskie, zaś amylopektyna - fioletowe. Amyloza o konfiguracji liniowej nie jest zdolna do tworzenia kompleksu z jodem . Musi istnieć konfiguracja helisu,

aby cząsteczki jodu mogły się w niej regularnie ułożyć. Jedna cząsteczka jodu przypada na sześć reszt glikozydowych czyli na jeden skręt helisu. Ogrzewanie powoduje rozkręcenie helisu co jest przyczyną znikania zabarwienia z jodem

Wykonanie próby:

Odczynniki:kleik skrobiowy

J₂ w KJ

0,01M NaOH

0,01M HCL

1. Do 2 ml kleiku skrobiowego dodać kroplę roztworu J₂ w KJ. Powstaje niebieskie zabarwienie.

2. Probówkę w której powstała niebieska barwa ogrzać - niebieskie zabarwienie znika. Po ochłodzeniu pod wodą zabarwienie powraca.

3. Wpływ zasad na zabarwienie z jodem. W środowisku zasadowym zabarwienie nie powstaje ponieważ jod reaguje z zasadą według równania:

J₂ + 2NaOH → NaJ +Na JO + H₂O + NaJO

W środowisku kwasowym reakcja przebiega w kierunku odwrotnym:

NaJO + NaJ + 2HCL → 2NaCL + J₂ + H₂O

Do 2 ml kleiku skrobiowego dodać kilka kropli 1M roztworu NaOH i kroplę roztworu jodu w KJ. Zabarwienie nie powstaje. Po zakwaszeniu kwasem solnym, barwa pojawia się.

Badanie rozpuszczalności celulozy

Rozpuszczalność celulozy w odczynniku Cross-Bewana ( ZnCL₂ w stężonym HCL)

Odczynniki:odczynnik Cross-Bowana

H₂O

bibuła filtracyjna

Kawałek bibuły filtracyjnej rozpuścić w 2 ml odczynniku Cross-Bewana, wytrząsając przez około 3 minuty. Bibuła po kilku minutach przejdzie do roztworu. Po dodaniu 2 ml wody bibuła ponownie wytrąci się do roztworu.

Reakcja glikogenu z jodem

Odczynniki: roztwór glikogenu

J₂ w KJ

Do roztworu glikogenu (1ml) dodać dwie krople J₂ w KJ. Powstaje jasno-czerwonobrunatne zabarwienie.

-10-

Ćwiczenie III

Identyfikacja cukrów

Korzystając z poprzednio wykonanych reakcji można zidentyfikować nieznany cukier. Postępuje się według niżej przedstawionego schematu:

Reakcja Molischa (+) → obecny cukier

reakcja z jodem

roztwór bezbarwny

barwa niebieska barwa jasnoczerwona

(skrobia) (glikogen)

reakcja redukcyjna (+) reakcja redukcyjna (-)

( r. Fehlinga) (r. Fehlinga)

{glukoza,fruktoza,mannoza, (sacharoza lub brak cukru)

galaktoza,pentoza,laktoza}

hydroliza

(5ml roztworu +1kropla HCL stęż.)

ogrzać, zobojętnić

próba Biala (+) próba Biala (- )

(pentoza)

reakcja Seliwanowa (+) reakcja Seliwanowa (-)

(fruktoza) (glukoza, mannoza, galaktoza)

-11-

Aminokwasy

Aminokwasy są podstawowymi jednostkami strukturalnymi białek. Zbudowane są z grupy karboksylowej , aminowej, atomu wodoru oraz charakterystycznej grupy R (łańcuch boczny aminokwasu), która wiąże się kowalencyjnie z atomem węgla, określanym jako węgiel α. Ten atom węgla nazwano α ponieważ sąsiaduje on z grupą karboksylową. W roztworach wodnych aminokwasy występują tylko w znikomej ilości (0,1%) jako cząsteczki elektrycznie nie- naładowane , natomiast w ogromnej większości są jonami. Jony te zależnie od oddziaływania środowiska mogą mieć charakter kwasowy bądź zasadowy. W środowisku kwasowym aminokwas przyłącza proton i staje się kationem. Natomiast w środowisku zasadowym oddaje proton i zachowuje się jak anion.

W środowisku o pH obojętnym aminokwasy występują w formie zjonizowanej jak jony obojnacze (jony dwubiegunowe) Aminokwas w postaci jonu obojnaczego ma protonową grupę aminową (NH₃⁺) oraz zjonizowana grupę karboksylową (COO^-)

NH₂ NH₃⁺

 

H C COOH H C COO^-

 

R R

aminokwas jon dwubiegunowy

postać niezjonizowana ( obojnaczy , dipol aminokwasu)

Ze zmianami pH roztworu zmienia się stan jonizacji cząsteczki aminokwasu .W roztworze kwaśnym (np. pH 1) cofa się dysocjacja grupy karboksylowej – staje się ona niezjonizowana (COOH) , a zjonizowana pozostaje grupa aminowa (NH₃⁺) W roztworze zasadowym(np. pH 11) zjonizowana jest grupa karboksylowa (COO^-),a niezjonizowana - grupa aminowa (NH₂)

NH₃⁺ NH₃⁺ NH₂

  

H  C COOH H C  COO^- H C COO^-

  

R ⁺ R R

forma przeważająca forma przeważająca forma przeważająca

w pH 1 w pH 7 w p H 11

Wszystkie aminokwasy (z wyjątkiem glicyny) zawierają cztery różne podstawniki wokół węgla (węgiel połączony z grupą karboksylową) . Ich steroizomery, należące do szeregu D lub L, są optycznie czynne. W białkach występują tylko L-aminokwasy, a jonizacji ulegają jedynie grupy w łańcuchach bocznych R aminokwasów oraz końcowa grupa aminowa i karboksylowa, ponieważ pozostałe grupy karboksylowe i aminowe są zablokowane wiązaniem peptydowym ( CO-NH ). Ze wzglądu na to , że łańcuch boczny aminokwasu może posiadać ładunek ujemny lub dodatni, wyróżnia się aminokwasy obojętne, kwaśne i zasadowe Ponadto wchodzące w skład białek aminokwasy, mogą zawierać w łańcuchu bocznym nie polarne grupy hydrofobowe bądź polarne reszty hydrofilowe, które nie ulegają jonizacji lub mogą dysocjować tylko przy odpowiednim pH roztworu.. Różne łańcuchy boczne aminokwasów sprawiają, że związki te wykazują odmienne właściwości fizykochemiczne. Aminokwasy mają różną wielkość i różny charakter kwasowo-zasadowy.

W obrębie aminokwasów wchodzących w skład białek tradycyjnie wyróżnia się dwie grupy . Do pierwszej z nich należą aminokwasy niepolarne, które mają boczny łańcuch alifatyczny

(glicyna, alanina, walina, leucyna, izoleucyna i metionina) lub pierścień aromatyczny (fenyloalaniana, tyrozyna, tryptofan). Do tej grupy zalicza się także prolinę hydrofobowy iminokwas zawierający drugorzędową grupę iminową.

-12-

W obrębie drugiej grupy znajdują się aminokwasy polarne, które w łańcuchu bocznym mają grupę hydroksylową niejonizującą w warunkach fizjologicznych (pH ok. 7,4), ale uczestniczącą w tworzeniu wiązań wodorowych (seryna, treonina i tyrozyna) oraz nie jonizująca grupę sulfhydrylową - cysteina, która może tworzyć wiązanie dwusiarczkowe z inną resztą cysteiny. Z kolei aminokwasy dikarboksykowe (kwas asparaginowy i glutaminowy) zawierające dodatkową jonizującą grupę karboksylową oraz aminokwasy diaminowe (arginina, lizyna, histydyna) mające dodatkowo jonizującą grupę aminową , biorą udział w oddziaływaniach elektrostycznych. W warunkach fizjologicznych łańcuch boczny wymienionych aminokwasów może być naładowany ujemnie lub dodatnio. Ponadto aminokwasy z polarnym łańcuchem bocznym, ale nie posiadającym ładunku, mogą uczestniczyć w tworzeniu wiązań wodorowych w obrębie cząsteczki białka (asparagina - amid kwasu asparaginowego oraz glutamina - amid kwasu glutaminowego).

-13-

Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów

Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów można podzielić na dwa typy. Pierwsze z nich to reakcje wspólne dla wszystkich aminokwasów. Wynikają one z występowania grup funkcyjnych: karboksylowej i aminowej. Z kolei reakcje specyficzne dla poszczególnych aminokwasów wiążą się z występowaniem charakterystycznego układu w łańcuchu bocznym na przykład grupy hydroksylowej –OH lub sulfhydrylowej –SH, reszty fenylu lub fenolu, bądź układu indolowego, imidazolowego czy guanidynowego. Reakcje te pozwalają na odróżnienie niektórych aminokwasów. Zależnie od charakteru bocznego łańcucha poszczególne aminokwasy tworzą różne barwne pochodne.

Miareczkowanie glicyny metodą Sorensena

Zasada.Podczas miareczkowania aminokwasu , np.glicyny roztworem NaOH , z grupy aminowej NH₃⁺ aminokwasu dysocjują jony H⁺. Wiążą się one z jonami OH^- , tworząc słabo zdysocjowane cząsteczki wody , zgodnie z równaniem:

COO^- COO^-

˝ ˝

H₃N⁺ ľCľH + → H₂N ľCľH + H₂O

˝ ˝

R R

Odszczepienie protonów od wszystkich grup amoniowych NH₃⁺ zachodzi dopiero przy wartościach pH roztworu powyżej 12. Bark odpowiednich wskaźników alkacymetrycznych, które zmieniłyby barwę w tym zakresie pH sprawia że uchwycenie końcowego punktu miareczkowania jest bardzo trudne, a najczęściej nawet niemożliwe. Jeżeli podczas miareczkowania stosuje się fenoloftaleinę, to zmiana barwy tego wskaźnika następuje wcześniej niż zostanie osiągnięty punkt równoważnikowy. Zatem dla ilościowego oznaczenia aminokwasu (glicyny) grupa NH₂ musi być zablokowana. W tym celu do roztworu aminokwasu dodaje się aldehyd mrówkowy (grupa NH⁺₃ nie reaguje z aldehydem) , co prowadzi do powstania połączenia N, N-dihydroksymetylowego danego aminokwasu zgodnie z poniższą reakcją:

Wytworzenie takiej pochodnej aminokwasu powoduje, że uwolnione w warunkach doświadczenia jony H⁺ z grupy NH⁺₃, nie mogą być już wiązane z zablokowanymi grupami COO^-., natomiast powodują zakwaszenie środowiska, stąd po dodaniu aldehydu mrówkowego znajdująca się w roztworze fenoloftaleina ulega odbarwieniu. Teraz aminokwas zachowuje się jak słaby kwas, który można już oznaczyć przy użyciu NaOH w obecności fenoloftaleiny. Ilość grup karboksylowych odpowiada ilości aminokwasu (glicyny)

-14-

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki::roztwór glicyny

0.2% roztwór fenoloftaleiny w etanolu

0,1mmol/L NaOH

aldehyd mrówkowy o pH 8,5 (20%roztwór wodny aldehydu mrówkowego + 3

krople fenoloftaleiny + NaOH dodany kroplami do różowego zabarwienia)

Do zlewki wlać 5 ml roztworu glicyny dodać 2 krople fenoloftaleiny. Następnie z biurety dodawać roztwór NaOH, aż do uzyskania lekko różowego zabarwienia . Oznacza to osiągnięcie w roztworze wartości pH wynoszącej około 8,3. Wtedy dla zablokowania grupy aminowej dodać 5 ml 20% roztworu aldehydu mrówkowego o pH około 8,5. Różowe zabarwienie roztworu znika. Dodawanie NaOH należy kontynuować, aż do ponownego uzyskania lekko różowego zabarwienia miareczkowanego roztworu. Mnożąc ilość zużytego NaOH przez równoważnik glicyny (0,0075) można obliczyć ilość glicyny w roztworze.

Reakcja van Slyke’ a z kwasem azotowym (III)

Zasada: wolne -aminokwasy zachowują się jak aminy I-rzędowe. Pod wpływem kwasu azotowego (III) ulegają one dezaminacji, wydziela się wtedy wolny drobinowy azot, natomiast aminokwasy są zamieniane w odpowiednie -hydroksykwasy. Kwas azotowy (III), który jest czynnikiem deaminującym, ze względu na jego nietrwałość otrzymujemy w reakcji z azotynem sodu , działając na niego kwasem octowym:

NaNO₂ + CH₃COOH ľ→ HNO₂ + CH₃COONa

Otrzymany w ten sposób HNO₂ reaguje z aminokwasem , zgodnie z poniższym równaniem:

COOH COOH

˝ ˝

H₂N ľCľ H + HNO₂ ľ→ HO ľCľH + H₂O + N₂­

˝ ˝

R R

Wykonanie oznaczenia:

Odczynnik:i 10%NaNO₂

stężony CH₃COOH

0,5mol/l glicyny

Do 1 ml roztworu glicyny dodać 1 ml NaNO₂ , a następnie 1 ml CH₃ COOH. Powstający w tej reakcji HNO₂ nie ulega rozkładowi do tlenków, lecz reaguje z grupą aminową glicyny. Obserwuje się wydzielenie pęcherzyków bezbarwnego , gazowego azotu.

Reakcja z ninhydryną

Zasada:Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu – poprzez iminokwasy do amoniaku, dwutlenku węgla i aldehydu uboższego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji 2 cząsteczek ninhydryny: zredukowanej i utlenionej z amoniakiem powstaje fioletowo niebieskie zabarwienie, którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu -amonowego aminokwasów. Dodatni barwny odczyn ninhydrynowy dają oprócz aminokwasów, peptydów i białek , także sole amonowe, aminocukry i amoniak. Oznaczana próba musi być wolna od tych związków.

-15-

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: 0,5 mol/l roztwór glicyny

0,1% roztwór ninhydryny

Do około 1 ml roztworu glicyny dodać 2 krople roztworu ninhydryny. Próbkę ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez około 3 minuty , pojawia się niebiesko-fiołkowe zabarwienie.

Reakcja dla cysteiny (aminokwas siarkowy)

Zasada: ogrzewanie roztworu cysteiny w środowisku silnie zasadowym prowadzi do deaminacji , a także powstania jonów siarczkowych. Podobnie reaguje cysteina zawarta w białku. Jony siarczkowe reagują z octanem ołowiu (+2) . Powstaje wtedy czarny osad siarczku ołowiu (+2)

COOH COOH

˝ ˝

H₂N ľCľH + 2 OH^- → C= O + NH₃ + S^2- + H₂O

˝ ˝

CH₂ľ SH CH₃

Cysteina kwas pirogronowy

Pb²⁺ + S²⁺ ľľ→ PbSŻ czarny

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór cysteiny

30% NaOH

1 N Pb(CH₃COO)₂

Do 1 ml roztworu cysteiny dodać 2 ml NaOH i ogrzewać około 15-20 minut we wrzącej łaźni wodnej. Następnie dodać kilka kropel roztworu Pb(CH₃COO)₂ i ponownie ogrzać. Wytrąca się czarny osad PbS.

-16-

Reakcja ksantoproteinowa dla aminokwasów aromatycznych.

Zasada: Tyrozyna - aminokwas zawierający w łańcuchu bocznym pierścień aromatyczny podczas ogrzewania ze stężonym kwasem azotowym (V) ulega reakcji nitrowania, tworząc żółto zabarwioną dinitrotyrozynę

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór jaja kurzego

HNO₃

NaOH stężony

Do 2 ml roztworu białka jaj kurzego dodać 2 ml HNO₃ i bardzo ostrożnie lekko podgrzać.

Uwaga ! reakcja silnie egzotermiczna. Roztwór zabarwia się na żółto. Po oziębieniu zawartość probówki zalkalizować NaOH (ostrożnie!!) powstaje pomarańczowe zabarwienie.

Reakcje dla układu indolowego w tryptofanie.

Zasada: Związki zawierające układ indolowy, np. tryptofan lub białka zwierające ten aminokwas w roztworze stężonego kwasu np. siarkowego tworzą barwne produkty kondensacji z aldehydami lub ich pochodnymi. Reakcje te mogą być wykorzystane do ilościowego oznaczania tryptofanu zarówno wolnego jak również związanego w cząsteczce białka. Tryptofan, kondensuje z kwasem glioksalowym (reakcja Adamkiewicza i Hopkinsa) oraz aldehydem mrówkowym (reakcja Voiseneta), tworzy fiołkowo zabarwione produkty zgodnie z równaniem reakcji:

-17-

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór białka jaja kurzego

kwas glioksalowy

H₂SO₄ stężony

2.5% aldehyd mrówkowy

HCL stężony

0.05%NaNO₂

1 .Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml kwasu glioksalowego, wymieszać i podwarstwić stężonym H₂SO₄ ( 1-2 ml), wlewając go bardzo ostrożnie!!! po ściance nachylonej probówki. Na granicy zetknięcia obu warstw, tworzy się fiołkowy pierścień. Próbę należy wykonać pod wyciągiem przy opuszczonej szybie!

2. Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 kroplę 2,5% roztworu aldehydu mrówkowego oraz 2 do 3 ml stężonego HCL. Zawartość probówki ostrożnie wymieszać i odstawić na 5 minut. Po upływie tego czasu dodawać kroplami , świeżo przygotowany 0.05% roztwór NaNO₂ Tworzy się zabarwienie fiołkowe.

Reakcja Sakaguchiego dla układu guanidynowego w argininie.

Zasada: Związki zawierające resztę guanidynową, w tym arginina i białka zawierające ten aminokwas reagują z -naftolem w środowisku zasadowym zawierającym bromian(I) Powstaje wtedy pomarańczowo-czerwony barwnik. Reakcja ta jest bardzo czuła i może służyć do ilościowego oznaczania argininy w białkach. Reakcji tej nie dają inne niskocząsteczkowe związki azotowe (np. mocznik, kreatyna itp.) ponieważ w tej reakcji niezbędny jest odpowiedni układ , gdzie R jest grupa alkilową: H₂N ľCľ R



NH

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki:: roztwór jaja kurzego

20% NaOH

2%α naftol

woda bromowa

Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 ml NaOH i 2 do 3 kropli alkoholowego roztworu -naftolu i zawartość probówki dobrze wymieszać. Następnie dodać po kropli świeżo przygotowanej wody bromowej ( w środowisku zasadowym powstaje bromian (I)) i ponownie wymieszać . Tworzy się związek o pomarańczowo-czerwonym zabarwieniu.

-18-

Ćwiczenie IV

I. kolokwium : cukry

Białka

Aminokwasy połączone wiązaniami peptydowymi tworzą łańcuch polipetydowy. Wiązanie peptydowe łączy grupę karboksylową jednego aminokwasu z grupą aminową drugiego aminokwasu. Powstanie dipeptydu z dwu wolnych aminokwasów wiąże się z uwolnieniem jednej cząsteczki wody zgodnie z poniższą reakcją :

R₁ O R₂ O R₁ O R₂ O

    

⁺H₃N C C + ⁺H₃N  C  C ⁺H₃N C CN CC + H₂O

    

H O^- H O^- H H H O^-

↓

wiązanie peptydowe

Równowaga tej reakcji jest znacznie silniej przesunięta w kierunku hydrolizy niż w kierunku syntezy. W związku z tym biosynteza wiązań peptydowych wymaga dostarczenia energii swobodnej, natomiast hydroliza wiązań jest termodynamicznie korzystna. Wiele aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi tworzy liniową strukturę łańcucha polipeptydowego. W łańcuchu polipeptydowym możemy wyznaczyć kierunek, ponieważ jego składniki mają dwa różne końce – z jednej strony grupą aminowa, a z drugiej grupę karboksylową . Jako początek łańcucha polipeptydowego umownie przyjęto jego koniec aminowy czyli koniec N i dlatego sekwencje aminokwasowe łańcucha polipeptydowego zapisuje się poczynając od reszty aminokwasowej z wolną (końcową ) grupa α-aminową np:

R₁ O R₂ O R₃ O R₄ O R₅ O

        

⁺H₃NC C NCC  NCC N CC NCC

        

H H H H H H H H H O^-

końcowa reszta końcowa reszta

aminowa kwarboksylowa

koniec N koniec C

pentapetyd

Łańcuch polipeptydowy jest złożony z powtarzających się regularnie fragmentów , tworzących łańcuch główny oraz fragmentów zmiennych – charakterystycznych łańcuchów bocznych różnych aminokwasów. Większość naturalnych łańcuchów polipeptydowych – białek - zawiera od 50 – 2000 reszt aminokwasowych.

Omawiając budowę białek często wymienia się cztery poziomy ich struktury. Struktura pierwszorzędowa określa po prostu sekwencję aminokwasów. Struktura drugorzędowa opisuje wzajemne przestrzenne ułożenie reszt aminokwasowych, sąsiadujących ze sobą w sekwencji liniowej. Niekiedy sposób wzajemnego ułożenia przestrzennego reszt aminokwasowych powtarza się regularnie i wtedy białko ma strukturę okresową. Przykładem struktury drugorzędowej jest helisa α lub nić β. Struktura trzeciorzędowa odnosi się do powiązań przestrzennych i wzajemnego ułożenia reszt aminokwasowych oddalonych od siebie sekwencji liniowej oraz lokalizacji mostków dwusiarczkowych. W białkach składających się z więcej niż jednego łańcucha polipeptydowego , można określić jeszcze jeden poziom organizacji struktury. Każdy z tych łańcuchów nazywa się w takim przypadku

-19-

podjednostką danego białka. Struktura czwartorzędowa opisuje wzajemne ułożenie przestrzenne podjednostek i rodzaj ich kontaktu. Badania konformacji, funkcji i ewolucji

białek doprowadziły do wyróżnienia jeszcze dwu dodatkowych, ważnych poziomów ich

organizacji. Naddrugorzędowa struktura odnosi się do zespołów struktur drugorzędowych. W wielu białkach na przykład nić β jest oddzielona od drugiej nici β helisą α, taki motyw nazywa się jednostką βαβ. .Niektóre łańcuchy polipeptydowi fałdują się, tworząc dwa lub więcej ściśle zwiniętych rejonów. Te ściśle zwinięta jednostki globularne , nazywane domenami, złożone są ze 100 do 400 reszt aminokwasowych.

Reakcje charakterystyczne dla białek

Wykazanie amfoterycznego charakteru białek

Białka są polielektrolitami zawierającymi rozmaite grupy funkcyjne w bocznym łańcuchu aminokwasów. Niektóre z nich łatwo ulegają dysocjacji w roztworach wodnych. Jony wodorowe znajdujące się w roztworze mogą zmieniać jonizację tych grup i stąd całkowity ładunek cząsteczki zależy od pH środowiska. Przy określonej wartości pH roztworu w wyniku jonizacji w cząsteczce białka powstaje tyle samo ładunków dodatnich co ujemnych, czyli białko osiąga punkt izoelektryczny, który podobnie jak w przypadku aminokwasów oznacza się symbolem pI. W tych warunkach suma ładunków elektrycznych danego białka jest równa zeru. Białka mają charakter amfoteryczny, wynikający przede wszystkim z występowania wolnych grup karboksylowych COO^- (kwasu asparaginowego, i glutaminowego oraz C-końcowej grupy cząsteczki) i amoniowej NH₃⁺ ( lizyny i argininy oraz N-końcowej grupy cząsteczki). W roztworach o pH powyżej wartości pI białko występuje w postaci anionu. Zachowuje się wtedy jak kwas, czyli oddaje jony wodorowe. Zaś w roztworach o pH poniżej punktu pI białko występuje w postaci kationu. Zachowuje się wtedy jak zasada, czyli przyłącza jony wodorowe. Wynika z tego ,że cząsteczka białka w pierwszym przypadku staje się silnie zdysocjowany zasadą polianionową podczas gdy w drugim przypadku staje się coraz silniej zdysocjowanym kwasem polikationowym

1. Zachowanie się białek w obecności kwasów

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki : 0,5% roztwór żelatyny

0,01mol/l HCL

zieleń bromokrezolowa

Przygotować dwie probówki. Do jednej nalać 2 ml wody destylowanej, a do drugiej 2 ml 0,5% żelatyny. Do obu probówek dodać po 3 krople zieleni bromokrezolowej i kroplami z pipety roztwór HCL, aż do otrzymania barwy żółtej (pH około 3). Porównać ilość zużytego kwasu do otrzymania barwy w wodzie destylowanej i w roztworze żelatyny.

2. Zachowanie się białek w obecności zasad

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: : 0,5% roztwór żelatyny

0,01mol/l NaOH

błękit tymolowy

Do 2 probówek nalać kolejno: do pierwszej 2 ml wody destylowanej a do drugiej 2 ml 0,5% żelatyny. Do obu probówek dodać po 3 krople błękitu tymolowego i miareczkować z pipety roztworem NaOH aż do uzyskania barwy niebieskiej . Porównać ilość kropli zużytej zasady przy miareczkowaniu wody i żelatyny.

-20-

Białka jako koloidy

Układy koloidalne są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. Wszystkie komórki są zespołami mniej lub bardziej różnorodnych układów koloidowych. W przyrodzie ożywionej zasadniczą rolę odgrywają ciekłe roztwory koloidowe – zole, których fazą dyspresyjną jest woda. Trwałość takich roztworów zależy od wielu czynników np. ładunku elektrycznego cząsteczek rozproszonych, stopnia uwodnienia i temperatury. Zmiany tych czynników mogą doprowadzić do łączenia się cząsteczek w większe skupienia, wskutek czego wypadają one z roztworów (koagulacja)

Ze względu na jakość fazy rozproszonej można wyróżnić następujące typy układów koloidowych:

A.roztwory wielkocząsteczkowych biopolimerów - białek, kwasów nukleinowych i polisacharydów (faza rozproszona skład się z cząsteczek o rozmiarach 5-100nm)

B.roztwory micelarne, których typowymi przedstawicielami są roztwory mydeł i detergentów

C. roztwory substancji nie polarnych , które nie wykazują powinowactwa do wody

Pierwsze dwa typy układów koloidowych zalicza się do hydrofilowych (liofilowych) a trzeci do hydrofobowych (liofobowych). Koloidy hydrofilowe nazywa się także emulsoidami lub koloidami odwracalnymi. Koloidy hydrofobowe natomiast – suspensoidami koloidami nieodwracalnymi lub zawiesiną koloidową. Te dwa typy układów koloidowych różnią się znacznie cechami fizykochemicznymi.

Roztwory koloidów hydrofilowych, zależnie od temperatury i stężenia, mogą występować w formie ciekłej –jako zole lub w formie elastycznego ciała stałego – jako żele. Przechodzenie zolu w żel nazywa się żelatynowaniem (żelowaniem) i jest procesem odwracalnym:

+ H₂O + H₂O

(pęcznienie) podniesienie temp.

Koloid suchy ←ľľľľ→ żel ←ľľľľľľľľ→ zol

(osuszenie) obniżenie temp.

− H₂O (osuszenie)

− H₂O

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: żelatyna (subst.)

skrobia (subst.)

1.Do 2 probówek odważyć : do pierwszej 0,5 g skrobi a do drugiej 0,5 g żelatyny . Dodać 1ml wody i po wymieszaniu pozostawić na 30 minut w celu napęcznienia. Następnie dodać po 5 ml wody , wstawić do wrzącej łaźni wodnej i mieszać od czasu do czasu do otrzymania jednorodnego roztworu. Po ostudzeniu pod zimna wodą lub w lodzie otrzymuje się żele, które po ponownym ogrzaniu znów przechodzą w zole.

2. Skrobię i żelatynę w oddzielnych probówkach zalać wrzącą wodą bez uprzedniego napęcznienia. Zwrócić uwagą na różnicę w rozpuszczaniu się koloidu napęczniałego i suchego.

Denaturacja białek

Terminem tym obejmuje się zmiany w konformacji łańcucha polipetydowego, wskutek których białko traci właściwości. Denaturacja występuje wówczas, kiedy pod wpływem czynników fizycznych lub chemicznych ulega zniekształceniu lub zniszczeniu struktura IV, III lub II rzędu. Czynniki denaturujące działają na wiązania które stabilizują przestrzenną strukturę białek.

-21-

Do wiązań tych należy zaliczyć przede wszystkim wiązania wodorowe tworzące się między grupami CO i NH wiązań peptydowych (w tym samym lub różnych łańcuchach polipeptydowych), a także między grupami funkcyjnymi łańcuchów bocznych, takimi jak : COOH, OH, NH₂, i SH . W utrzymaniu konformacji cząsteczki białka współdziałają również wiązania jonowe, powstające między grupami COO^- i NH₃⁺, a także oddziaływania hydrofobowe między aminokwasami niepolarnymi. Ważnym czynnikiem stabilizującym konformację łańcuchów polipeptydowych są kowalencyjne wiązania disiarczkowe, tworzące się między resztami cysteiny tego samego lub różnych łańcuchów polipeptydowych. Istotną rolę odgrywają ponadto metale łączące ze sobą łańcuchy boczne aminokwasów wiązaniami koordynacyjnymi

W wyniku rozerwania wiązań stabilizujących strukturę białka uwolnione grupy funkcyjne mogą wytwarzać inne wiązania, które zmieniają konfigurację cząsteczki. Taka nowa, zdeformowana cząsteczka odznacza się zawsze zmianą, a nawet utratą właściwości biologicznych (enzymatycznych, antygenowych, hormonalnych), a niekiedy zmianie ulegają również jej właściwości fizykochemiczne.

Denaturację białka wywołują niektóre czynniki fizyczne takie jak: ogrzewanie, wysychanie, ultradźwięki, promieniowanie krótkofalowe. Chemiczne czynniki denaturujące to: kwasy, zasady , jony metali ciężkich, mocznik , detergenty, fenol, chloroform, rozpuszczalniki mieszające się z wodą jak : alkohol, aceton.

1.Denaturacja cieplna

Zasada: Ciepło powodując zrywanie wiązań wodorowych w cząsteczce, prowadzi do nieodwracalnej denaturacji białek. Proces denaturacji cieplnej rozpoczyna się dla różnych białek w różnych temperaturach (między 40 a 100^oC ). Tylko nieliczne białka wytrzymują krótkie gotowanie (np. żelatyna , rybonukleaza). Białko zdenaturowane w pI jest nierozpuszczalne.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór białka

NaCL , MgSO₄

Około 2 ml roztworu białka jaja kurzego zagotować do wrzenia. Tworzy się biały, kłaczkowaty osad wytrąconego białka. Osad staje się wyraźniejszy po dodaniu niewielkiej ilości NaCL lub MgSO₄.

2. Denaturacja pod wpływem etanolu.

Zasada: Rozpuszczalniki organiczne (np. etanol, aceton), dezorganizując warstwę wodną otaczającą cząsteczki białek i osłabiając oddziaływania hydrofobowe, powodują wytrącenie białek. W temp. poniżej 0⁰C nie denaturują białek. Działania takie ujawniają się w większych stężeniach i w wyższej temperaturze (20-30⁰C)

Wykonanie oznaczenia

odczynniki: roztwór białka

95% alkohol etylowy

Do 1ml roztworu białka jaja kurzego dodać 2 ml alkoholu etylowego. Po 30 minutach dodać 2 ml wody . Strąt nie rozpuszcza się.

-22-

3.Denaturacja pod wpływem stężonego kwasu siarkowego

Wykonanie oznaczenia.:

Odczynniki: roztwór białka

stężony H₂SO₄

Do około 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać bardzo ostrożnie ! kilka kropel stężonego kwasu siarkowego. Kwas ten mimo denaturacji nie wytrąca białka z roztworu.

Strącanie białka za pomocą kationów (sole metali ciężkich)

Zasada: jeśli wartość pH jest większa od pI , cząsteczki białka stają się anionami i mogą reagować z kationami. Powstające sole zależnie od rodzaju jonu dysocjują w różnym stopniu. Kationy metali alkalicznych dają sole bardzo dobrze dysocjujące i rozpuszczalne w wodzie ,

natomiast kationy metali ciężkich ( Fe³⁺, Cu^2+, Hg²⁺, Pb²⁺) tworzą sole o bardzo małej dysocjacji i trudno rozpuszczalne.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki :roztwór białka

1% FeCL₃

1% CuSO₄

1.Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać parę kropli 1% roztworu FeCL₃.Roztwór barwi się na kolor brudnopomarańczowy. Po pewnym czasie wytrąca się brunatny osad białczanu żelazowego.

2.Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać parę kropli roztworu CuSO₄. Powstaje jasnobłękitny osad białczanu miedziowego.

Strącanie białka za pomocą anionów

Zasada: Po stronie kwasowej punktu izoelektrycznego cząsteczki białka maja ładunek dodatni oraz zdolność reagowania z anionami. Niektóre kwasy organiczne dają trwałe, nierozpuszczalne połączenia z białkami i są stosowane jako odczynniki odbiałczające płyny biologiczne. Związki te w większych stężeniach powodują denaturację białka Podobnie stężone roztwory kwasów nieorganicznych (HCL, H₂SO₄) denaturują białko.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór białka

60% CCL₃COOH

Do 1 ml roztworu białka kurzego dodać kilka kropel kwasu trijchlorooctowego, wytrąca się białko w postaci białego osadu.

Reakcje barwne białek

Reakcja biuretowa – wykrywanie białek

Zasada: reakcję biuretową dają białka oraz peptydy mające więcej niż dwa wiązania peptydowe. W środowisku zasadowym układy wiązań peptydowych dają z jonami miedzi (+2)

barwne kompleksy. Aby reakcja przebiegała prawidłowo kationy Cu²⁺muszą być związane w postaci kompleksu , co chroni je przed wytrąceniem w postaci wodorotlenku miedzi. Wiązania peptydowe w środowisku zasadowym ulegają enolizacji zgodnie z równaniem:

-23-

Białko lub peptyd , w którym wiązania peptydowe uległy enolizacji, reagują z jonami Cu , dając kompleks barwy niebiesko-fioletowej. Nasilenie barwy kompleksu zależy od ilości wiązań peptydowych i budowy łańcucha peptydowego a więc intensywność barwy roztworu jest proporcjonalna do stężenia białka. W przypadku peptydów o niezbyt długich łańcuchach powstaje kompleks barwy czerwono-fioletowej.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór białka jaja kurzego

10% NaOH

1% CuSO₄

Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 2 ml 10% NaOH, a następnie dodać parę kropel roztworu CuSO₄ . Roztwór barwi się na niebiesko-fioletowo..

Reakcja Libermana

Zasada: Reakcja ta wykazuje w białku obecność grupy węglowodanowej, a więc dają ją wszystkie glikoproteidy. W obecności HCL część węglowodanowa cząsteczki białka przechodzi w furfural, który z fenolami wytworzonymi na skutek równoczesnej hydrolizy białka daje zabarwienie fiołkowe.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór białka jaja kurzego

HCL stężony

Do około 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 3 ml stężonego HCL (ostrożnie!) i ogrzewać przez 5 minut w łaźni wodnej . Roztwór barwi się na kolor fiołkowy.

Białka dają ponadto reakcje barwne charakterystyczne dla zawartych w nich aminokwasów.

-24-

Ćwiczenia V

Oczyszczanie białek metodą dializy

Do zbadania struktury , a także określenia właściwości fizykochemicznych i funkcji, białka muszą być wyizolowane z materiału biologicznego, a następnie poddane procedurze systematycznego oczyszczania. W odróżnieniu od związków niskocząseteczkowych, białka nie przechodzą przez błony półprzepuszczalne. W trakcie oczyszczania białka bądź przygotowania materiału biologicznego do różnego typu oznaczeń, zachodzi często konieczność usunięcia z roztworu białka nadmiaru soli (odsolenie) lub niskocząsteczkowych związków organicznych. Do tego celu stosuje się dializę która oparta jest na procesie dyfuzji. Proces dyfuzji zachodzi zawsze w kierunku od wyższego stężenia substancji rozpuszczonej do niższego i prowadzi do wyrównania stężeń w całej objętości roztworu bez nakładu energi. Małe cząsteczki można więc oddzielić od białka metodą dializy przez błonę półprzepuszczalną taką jak błona celulozowa. Cząsteczki o wymiarach znacznie większych niż średnica poru pozostają w woreczku dializacyjnym natomiast jony i mniejsze cząsteczki przechodzą przez pory błony i pojawiają się dializacie na zewnątrz woreczka.

W celu przyspieszenia dializy i możliwie maksymalnego oczyszczenia białek od soli lub innych niskocząsteczkowych związków zmienia się roztwór do którego próbka jest dializowana , a także stosuje się mieszanie.

Odczynniki:

mleko z dodatkiem NaCL ( 100 mg/25 ml mleka ) i glukozy (100 mg/25 ml mleka) = roztwór przeznaczony do dializy (A)

10% NaOH

1%CuSO₄

10% α-naftol

stężony H₂SO₄

Fehling I

Fehling II

20 mmol/l AgNO₃

woreczek do dializy

-25-

Wykonanie oznaczenia:

• 1.Przygotować 4 probówki do których pobrać po 1 ml roztworu do dializy czyli płynu przeddializacyjnego (A).

• 2. Przygotować woreczek do dializy, mocno związać sznurkiem jeden koniec.

• 3. Do zlewki oznakowanej symbolem B wlać 200 ml wody destylowanej

• 4.Wlać 20 ml roztworu do dializy A do woreczka dializacyjnego i mocno związać jego drugi koniec sznurkiem

• 5. Umieścić napełniony woreczek dializacyjny w zlewce B z wodą destylowaną .

• 6. Zlewkę z napełnionym woreczkiem dializacyjnym umieścić na mieszadle magnetycznym.

• 7. Co 15 minut wylewać płyn dializacyjny (B) ze zlewki do erlenmajereki ( w celu przeprowadzenia analizy) , a zlewkę napełniać 200 ml wody destylowanej przez okres 1,5 godz. Każdorazowo, do czterech probówek pobrać po 1 ml płynu dializacyjnego (B) w celu przeprowadzenia analizy

• 8. Po upływie 1,5 godz., wylać z woreczka dializacyjnego płyn dializowany (C) do erelenmajerki z której pobrać po 1 ml do czterech probówek w celu przeprowadzenia analizy tego płynu.

Analiza roztworu przeznaczonego do dializy (A), dializacyjnego (B) i dializowanego (C)

- sprawdzenie obecności białka metodą biuretową , potwierdzenie występowania cukru (glukoza i laktoza) reakcją Molischa, potwierdzenie występowania cukru redukującego rekacją Fehlinga, wykazanie występowania jonów chlorkowych.

1. Sprawdzenie obecności białka.

Rreakcja biuretowa Piotrowskiego ,

do 1 ml roztworu przeznaczonego do dializy (A), dializacyjnego (B) i dializowanego (C) dodać 1 ml 10% NaOH oraz 3 krople 1% CuSO_4. W obecności białka roztwór barwi się na kolor fioletowy.

2. Sprawdzenie obecności cukru.

Reakcja Molischa

Do 1 ml roztworu A, B i C dodać 2 krople α-naftolu. Po dokładnym zamieszaniu ostrożnie po ściance probówki wlać 1 ml stężonego H₂SO_4, tak aby widoczna była granica między cieczami. W miejscu zetknięcia się obu warstw powstaje czerwono-fioletowy pierścień w przypadku obecności cukru.

3. Potwierdzenie występowania cukrowca redukującego

Reakcja Fehlinga. .

Do 1 ml roztworu A, B i C dodać 1 ml odczynnika Fehlinga I i 1 ml Fehlinga II. Zawartość probówek dobrze wymieszać i ogrzać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut W przypadku obecności cukru redukującego powstaje pomarańczowy osad tlenku miedzi (I).

4. Potwierdzenie występowanie jonów chlorkowych.

Do 1ml roztworu A, B i C dodać 1 ml roztworu AgNO₃. Wytrąca się osad chlorku srebra w przypadku występowania jonów chlorkowych w badanych roztworach.

Na podstawie przeprowadzonego doświadczenie: porównać jak zmienia się zawartość składników (białka, cukru, jonów chlorkowych roztworze przeznaczonym do dializy (A), dializacyjnym (B) i dializowanym (C).

-26-

Ćwiczenie VI

Kolorymetria – oznaczenie poziomu białka w surowicy krwi metodą Lowry’ ego.

Kolorymetria jest działem analizy chemicznej, w którym podstawą ilościowego oznaczania substancji w roztworze stanowi prosta zależność między intensywnością zabarwiania roztworu (absorpcja światła o określonej długości fali - λ ), a stężeniem zawartej w nim substancji. Metodami kolorymetrycznymi można oznaczyć zarówno stężenia substancji mających własną barwę jak i substancji bezbarwnych, które za pomocą odpowiednich reakcji chemicznych przeprowadza się w związki barwne . W tym przypadku reakcja barwna musi przebiegać do końca, a powstałe zabarwienie musi być dostatecznie trwałe, niewrażliwe na działanie światła, mało zależne od pH, temperatury, nadmiaru odczynnika

Metody kolorymetryczne mają zastosowane tylko do oznaczenia ilościowego substancji dających barwne połączenia, które pochłaniają światło o długości fali światła widzialnego , czyli w zakresie długości od 360 do 770 nm.

W odróżnieniu od metod kolorymetrycznych spektrofotometria pozwala na oznaczenie stężenia związków pochłaniających światło nadfioletowe (tzn. o długości fali od 220 do 360 nm ) oraz podczerwone (tzn. o długości fali ponad 770 nm)

Tym niemniej metody kolorymetryczne należą do najszybszych i najłatwiejszych technik analitycznych. Odznaczają się one uniwersalnością , dokładnością i czułością przewyższającą pod tym względem inne metody.

Zasady kolorymetrii

Barwa substancji zależy od aktywnego pochłaniania, czyli absorpcji światła przez tę substancję. W czasie obserwacji światła przechodzącego przez daną substancję do oczu dochodzą promienie, które nie zostały przez nią zaabsorbowane. Widzi się więc barwę dopełniającą, na którą składają się poszczególne rodzaje przepuszczonych fal elektromagnetycznych. Na przykład barwa niebieska roztworu oznacza, że dana substancja pochłania światło żółte, przepuszczając te długości fal, które tworzą widzianą przez nas barwę dopełniającą tj., niebieską, roztwór zabarwiony na czerwono pochłania światło niebiesko- zielone, roztwór zabarwiony na żółto światło niebiesko-fioletowe.

Istnieje ścisły związek między zabarwieniem substancji a jej strukturą elektronową. Cząsteczka (lub jon) wykazuje absorbcję w części widzialnej widma lub w nadfiolecie, gdy pod wpływem promieniowania elektrony jej zostają przeniesione ze stanu podstawowego do jednego ze stanów wzbudzonych. Powstanie barwy lub jej zmiana są zawsze związane z deformacją normalnej elektronowej struktury cząsteczki. Zmiany energii elektronowej pod

-27-

wpływem naświetlania występują w cząsteczkach zawierających grupy chromatoforowe, ugrupowania z wielokrotnymi wiązaniami nienasyconymi, np.

\ \ /

C = O C = C —N = N— —N = O

/ / \

\ \

C≡C C=N C=S

/ /

Wzrost intensywności zabarwienia cząsteczki powoduje obecność tzw. grup auksochromowych, np. OH, NH₂, SH, CH₃, Cl, Br, pierścień fenylowy czy naftylowy.

Ilość światła pochłoniętego po przejściu przez barwny roztwór zależy od grubości warstwy barwnego roztworu. Zależność tą ujmuje prawo Lamberta. Zgodnie z tym prawem logarytm stosunku natężenia światła padającego do natężenia światła przechodzącego jest wprost proporcjonalny do grubości warstwy.

I_o

Log  = k • d

I

I_o - natężenie światła padającego

I - natężenie światła po przejściu przez barwny roztwór

k - współczynnik proporcjonalności

d - grubość warstwy barwnego roztworu przez który przechodzi światło (cm)

Ilość światła pochłoniętego zależy również od stężenia substancji barwnej, zależność tą podaje prawo Beera. Zgodnie z tym prawem logarytm ze stosunku natężenia światła padającego do natężenia światła przechodzącego przez roztwór jest wprost proporcjonalny do stężenia barwnej substancji.

I_o

Log  = k • c

I

gdzie : I_o

Log —— - absorbancja = A

I

k - stała charakterystyczna dla danego ośrodka optycznego

c – stężenie substancji barwnej

Łącząc wzór określający prawo Lamberta z wzorem określającym prawo Beera otrzymuje się nowe wyrażenie , ujmując matematycznie zależność pomiędzy gęstością optyczną a stężeniem substancji i grubością warstwy roztworu

A = k • c • d

Absorbancja (A) jest miarą wygaszania światła przez barwny roztwór. Innym określeniem absornbancji jest gęstość optyczna lub ekstynkcja

Zgodnie z prawem Lamberta - Beera absorbancja jest wprost proporcjonalna do stężenia i grubością warstwy barwnego roztworu.

Uzyskiwane wartości absorbancji powinny się znajdować w przedziale 0,1 -1,0 a najdokładniejsze wyniki otrzymuje się przy wartościach od 0,2 – 0,6. Ponieważ na wartość absorbancji ma wpływ grubość warstwy roztworu, należy oznaczenia przeprowadzać w kuwetach o takiej grubości warstwy, która umożliwiłaby uzyskanie wartości absorbancji w optymalnych warunkach.

-28-

Ilościowe oznaczenie białka metodą Lowry’ego

Zasada:metoda Lowry opiera się na reakcji jaką dają wiązania peptydowe i aminokwasy aromatyczne z odczynnikiem Folina Ciocaltou:

I etap → przyłączenie jonów miedzi (odczynnik Lowry C) do wiązań peptydowych

II etap → redukcja kwasu fosfowolframowego i fosfomolibdenianowego do odpowiednich tlenków przez miedź związaną z białkiem, reakcja między odczynnikiem fenolowym, a tyrozyną i tryptofanem

Metoda Lowry pozwala na oznaczenie białka już w stężeniu 1µg/ml. Jest powszechnie stosowana do oznaczania zawartości białka w płynach biologicznych i homogenatach tkankowych.

Odczynniki: Standard – krystaliczna albumina wołowa BSA o stężeniu: 50µg/ml

Lowry A 50 ml

Lowry B 1 ml

Lowry C = 50 ml Lowry A + 1 ml Lowry B

Odczynnik Folina Ciocaltou

	Próba odczynnikowa „O”	Standard	Próba badana
H2O (ml)	1		1
Standardy (ml)		1	
Próba badana (ml)			0,1
Lowry C (ml)	5	5	4,9
Inkubacja	0,5 godz. temperatura pokojowa
Odczynnik Folina Ciocaltou (ml)	0,5	0,5	0,5
Inkubacja	0,5 godz. temperatura pokojowa

rozcieńczenie surowicy: 0,1 ml surowicy + 9,9 ml Lowry C

lub 0,05 ml surowicy + 4,95 ml Lowry C

Po inkubacji zmierzyć absorbancję próbek (A) wobec próby odczynnikowej .”0”

przy fali o dł. λ = 660 nm w kuwecie o grubości warstwy d = 1cm

-29-

Obliczenie stężenia białka:

(A) Absorbancja próby badanej

x 0.05 x 100 = (.x.) g/100ml

(A) Absorbancja standardu

Stężenie białka całkowitego w surowicy

Gatunek zwierząt	Wartości g/100ml
Konie Bydło Owce Kozy Świnie Psy Koty Króliki	6,0 - 7,8 5,1 - 7,1 6,5 - 7,0 5,9 – 7,8 5,9 - 7,4 5,5 – 7,0 6,0 – 8,0 6,0 – 8,3

-30-

Ćwiczenie VII

II. kolokwium : aminokwasy , białka

Kwasy nukleinowe.

Organizmy żywe mogą istnieć wyłącznie wtedy, gdy są zdolne przekazać swą informację genetyczną organizmom potomnym . Podstawę tej informacji genetycznej stanowi kwas dezoksyrybonukleinowy

DNA → RNA → białka → komórka → organizm

Poniższy schemat przedstawia schemat przepływu informacji genetyczej

DNA DNA RNA → białko

Synteza potomnej cząsteczki DNA to replikacja ( etap na schemacie),przekazanie informacji z DNA na RNA – transkrypcja ( etap ) , a z RNA dla syntezy białka – translacja . Translacja jest związana z przetłumaczeniem informacji zapisanej w sekwencji nukleotydów na „język” aminokwasów. Istnieje możliwość przekazania informacji z RNA na DNA tj. odwrotna transkrypcja (etap )

DNA jest polimerem zbudowanym z jednostek monomerycznych – deoksyrybonukleotydów . Każdy nukleotyd składa się z zasady azotowej, cukru oraz z jednej lub więcej grup fosforanowych. Cukrem występującym w deoksyrybonukleotydach jest deoksyryboza.

Zasadami azotowymi: pochodne puryny lub pirymidyny. Zasadami purynowymi w DNA są adenina (A) i guanina (G), a pirymidynowymi – tymina (T) i cytozyna (C).

-31-

Związek zasady purynowej lub pirymidynowej z cukrem nazywamy nukleozydem. W DNA występuje 4 rodzaje nukleozydów: deoksyadenozyna, deoksyguanozyna, deoksytymidyna i deoksycytydyna. W deoksyrybonukleotydach N-9 zasady purynowej lub N-1 zasady pirymidynowej jest związany z C-1 deoksyrybozy wiązaniem N-glikozydowym. Ester nukleozydu i kwasu fosforowego nazywamy nukleotydem . Najczęstszym miejscem estryfikacji w nukleotydach występujących w przyrodzie jest grupa hydroksylowa związana z C-5 cukru. Tego rodzaju związek jest nazywany nukleozydo-5^’- fosforanem lub 5^’- nukleotydem. ( Cyfra ze znaczkiem prim ^‘ określa atom w cząsteczce cukru).

Rdzeń DNA jest niezmienny wzdłuż całej cząsteczki i składa się z reszt deoksyrybozy połączonych resztami fosforanowymi. Grupa 3^’-hydroksylowa reszt cukrowej jednego deoksyrybonukleotydu jest połączona z grupą 5^’- hydroksylową następnej reszty cukrowej wiązaniem fosfodiestrowym.

Pionowe linie oznaczają cukier, natomiast litery A,C,G

przedstawiają zasady . Symbole P oraz ukośne kreski

oznaczają wiązanie fosfodiestrowe. Kreski te łączą

środek jednej linii pionowej, oznaczający grupę 3’-OH

z końcem następnej linii oznaczającym grupę 5’-OH.

Komórkowy DNA składa się z dwóch bardzo długich łańcuchów polinukleotydowych, zwiniętych wokół jednej wspólnej osi. Każda z dwóch nici helisy jest zorientowana w przeciwnym kierunku. Na zewnątrz dwuniciowej helisy znajdują się rdzenie cukrowo-fosforanowe każdego z łańcuchów , podczas gdy zasady purynowe i pirymidynowe są skierowane do wnętrza helisy. Obydwa łańcuchy są połączone wiązaniami wodorowymi między zasadami tworzącymi pary. Adenina (A) zawsze tworzy parę z tyminą (T), a guanina (G) jest zawsze sparowana z cytozyną (C), dzięki czemu jeden łańcuch helisy jest zawsze komplementarny do drugiego. Informacje genetyczną koduje ściśle określona sekwencja zasad w każdym z łańcuchów. Wiele cząsteczek DNA tworzy formy koliste.

Podczas replikacji obydwa łańcuchy helisy DNA ulegają rozpleceniu i rozdzielają się w miarę postępu syntezy nowych łańcuchów. Każdy łańcuch rodzicielski stanowi matrycę dla nowo

-32-

powstającego łańcuchu komplementarnego. Tak więc replikacja DNA jest procesem semikonserwtywnym – każda potomna cząsteczka uzyskuje jeden łańcuch z rodzicielskiej czasteczki DNA i drugi nowo syntetyzowany. Aktywnymi prekursorami w syntezie DNA są cztery 5^’ –trifosforany deoksyrybonukleozydów. Nowa nić jest syntetyzowana w kierunku 5^’ → 3^’.

DNA nie jest jednak bezpośrednio matrycą do syntezy białek; funkcje takie pełnią natomiast cząsteczki RNA – kwasu rybonukleinowego. RNA jest długą nierozgałęzioną makrocząsteczką złożoną z nukleotydów połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi 3^’ → 5^’. Jednostką cukrową w RNA jest ryboza. Głównymi zasadami w RNA są : adeina (A)

uracyl, (U) guanina (G) oraz cytozyna (C). Adenina może tworzyć parę z uracylem , a guanina z cytozyną

Funkcję pośredników przenoszących informację w procesie biosyntezy białka pełni klasa cząsteczek RNA nazywanych informacyjnymi RNA (mRNA). Inne cząsteczki RNA, jak transportujący RNA (tRNA) i rybosomowy RNA (rRNA) stanowią część mechanizmu syntezy białka . Wszystkie rodzaje komórkowych RNA są syntetyzowane przez polimerazy RNA zgodnie z instrukcjami przekazywanymi przez matrycę DNA.

Badanie właściwości kwasów nukleinowych

Hydroliza kwasów nukleinowych, badanie produktów hydrolizy.

Zasada: w czasie ogrzewania z kwasami, kwasy nukleinowe ulegają hydrolizie rozpadając się na zasady purynowe i pirymidynowe, kwas fosforowy i pentozę. Przez łagodną hydrolizę, przeprowadzoną zasadami lub enzymami, uzyskuje się większe fragmenty kwasów nukleinowych, mianowicie nukleotydy i nukleozydy.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: nukleinian sodu

2 mol/l H₂SO₄

10% NaOH

Do 1 ml nukleinanu sodu dodać 5 ml kwasu siarkowego i wstawić do wrzącej łaźni na 10 minut. Hydrolizat zobojętnić NaOH wobec papierka lakmusowego.

↓

Następne reakcje wykonujemy na otrzymanym hydrolizacie kwasów nukleinowych !!!

1. Wykrywanie cukrów - reakcja Molischa

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: hydrolizat

10% alkoholowy roztwór α- naftolu

H₂SO₄ stężony

-33-

Do około 1 ml hydrolizatu dodać 2 krople 10% alkoholowego roztworu α-naftolu i wymieszać. Następnie ostrożnie !, po ściankach probówki dodać około 1 ml stężonego H₂SO_4, aby powstały dwie, dobrze odgraniczone warstwy. Powstaje fioletowo-czerwony pierścień.

2. Próba Biala z orcyną na pentozy

Zasada: W obecności soli żelaza (III) furfural powstający z rybozy w środowisku HCl daje z orcyną kompleks o barwie zielonej

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór pentozy (np. ksylozy, rybozy)

0,2% roztwór orcyny w 20% HCl

1% FeCl₃

Do 2 ml 0,2% roztworu orcyny w 20% HCl dodać kroplę FeCl₃ i 0,5 ml roztworu pentozy. Wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 3 - 5 minut. W obecności pentoz powstaje zielone zabarwienie. Dla porównanie przeprowadzić reakcję na heksozie (np. glukozie ).

3. Wykrywanie zasad purynowych:

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: 5%NH₄OH

5% AgNO₃

Do probówki wlać około 1 ml hydrolizatu, a następnie zalkalizować go 5% NH₄OH. Roztwór przesączyć po czym przenieść go do zlewki i zalać 5 ml AgNO₃. W obecności zasad purynowych powstaje brązowy osad

4. Wykrywanie kwasu fosforowego

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: hydrolizat

NH₄OH

HNO₃ stężony

roztwór molibdenianu amonu

Do 0,5 ml hydrolizatu dodać amoniaku, aż roztwór stanie się alkaliczny. Następnie zakwasić stężonym HNO₃ i dodać 3 ml molibdenianu amonu. Ogrzać do wrzenia, pojawia się żółty osad fosforomolibdenianu amonu.

Odróżnienie RNA od DNA

Reakcja orcynolowa

Zasada: ryboza wolna oraz związana w nukleozydach i nukleotydach ogrzewana ze stężonym roztworem HCL przechodzi w furfural, który z orcyną i jonami F³⁺ tworzy trwały kompleks o ciemno- zielonej barwie.

Wykonanie oznaczenia :

Odczynnik : 0.1%roztwór RNA

0,1%roztwór DNA

odczynnik orcynolowy

-34-

Do jednej probówki wlać 1 ml roztworu RNA i a do drugiej 1ml DNA a następnie dodać po 1 ml odczynnika orcynolowego i umieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej na około 15 minut. W probówce zawierającej RNA powstaje ciemno-zielone zabarwienie, probówka z DNA pozostaje jasnozielona (reakcja negatywna).

Reakcja z difenyloaminą.

Zasada : difenyloamina daje barwny kompleks z deoksyrybozą

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki:0,1% roztwór RNA

0,1% roztwór DNA

odczynnik difenyloaminowy

Do jednej probówki wlać 1 ml roztworu RNA i a do drugiej 1ml DNA a następnie dodać po dodać po 2 ml odczynniki difenyloaminowego. Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. W probówce zawierającej DNA powstaje niebieskie zabarwienie. RNA nie wykazuje dodatniego odczynu, próbka pozostaje bezbarwna.

-35-

Ćwiczenie VIII

III kolokwium: kwasy nukleinowe

Badanie własności lipidów prostych i złożonych

Lipidy występują w komórkach wszystkich organizmów żywych. W organizmach zwierząt są one obecne w większej ilości w różnych komórkach narządach lub w postaci wyodrębnionej tkanki tłuszczowej. Obecność lipidów w pożywieniu jest niezbędna . Pełnią one zarówno funkcje energetyczne jak i strukturalne. Są one ponadto źródłem i nośnikiem wielu substancji biologicznie czynnych i witamin.

Lipidy należą do substancji o złożonej i różnorodnej budowie i zgodnie ze współczesną terminologią dzielimy na:

I . Lipidy proste – estry kwasów tłuszczowych i alkoholi.

• Lipidy właściwe – triacyloglicerole , czyli estry kwasów tłuszczowych i glicerolu.

.

• Woski – estry wyższych kwasów tłuszczowych i alkoholi innych niż glicerol.

II. Lipidy złożone - substancje zawierające obok kwasów tłuszczowych i alkoholi również inne składniki.

1. Fosfolipidy – lipidy zawierające kwasy ortofosforowe w postaci mono- lub i diestrru.

• Glicerofosfolipidy – pochodne kwasu glicerofosforowego mające przynajmniej jedna O- arylową lub O-alkilową grupę zwiazaną z glicerolem.

• Sfingofosfolipidy - pochodne 1- fosfoceramidu.

2. Glikolipidy – związki zawierajace przynajmniej jedną resztę cukrową połączoną

wiązaniem glikozydowym z częścią lipidową.

• Glikoglicerolipidy – glikolipidy zwierające jedną lub więcej reszt glicerolowych są to : 1,2-diacylo-3glikozylo-sn-glicerole.

• Glikosfingolipidy – związki zawierające przynajmniej jedną resztę cukrową i sfingoid ( zwykle sfingozynę – 18 węglowy alkohol) , zwane też glikozylosfingoidami lub glikozyloceramidami.

III. Inne lipidy złożone , np. sulfolipidy

Kwasy tłuszczowe - występujące w lipidach nadają im odpowiedni charakter fizykochemiczny. Im większa masa cząsteczkowa kwasów tłuszczowych , tym wyższa jest temperatura topnienia lipidów. Temperatura ta będąca jakościowym wyrazem stosunku kwasów tłuszczowych nasyconych do nienasyconych w lipidach maleje wraz ze wzrostem procentowego udziału kwasów nienasyconych. Lipidy o dużej zawartości nienasyconych kwasów tłuszczowych są zazwyczaj ciekłe i oleiste.

-36-

Niektóre kwasy tłuszczowe występujące w organizmach zwierzęcych

Liczba atomów węgla	Liczba wiązań podwój- nych	Nazwa potoczna	Nazwa systematyczna	Wzór
12 14 16 18 20	0 0 0 0 0	laurynian (kwas laurynowy) mirtystynian (kwas mirystynowy) palmitynian (kwas palmitynowy) stearynian (kwas stearynowy) arachidan (kwas archidonowy)	n-dodekanian n- tetradekanian n-heksadekanian n-oktadekanian n-ikozanian	CH3(CH2)10COO^- CH3(CH2)12COO^- CH3(CH2)14COO^- CH3(CH2)16COO^- CH3(CH2)18COO^-
16 18 18 18 20	1 1 2 3 4	palmitooleinian (kwas palmitoleinowy) oleinian (kwas oleinowy) linolan (kwas linolowy) linolenian (kwas linolenowy) arachidonian (kwas arachidonowy)	cis-Δ^9-heksadekenian cis-Δ^9-oktadekenian cis,cis-Δ^9,Δ^12-oktadekadienian cis-Δ^9,Δ^12,Δ^15-oktadekatrienian cis-Δ^5,Δ^8,Δ^11,Δ^14-ikozatetraenian	CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COO^- CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COO^- CH3(CH2)4(CH=CHCH2)2(CH2)6COO^- CH3CH2(CH=CHCH2)3(CH2)6COO^- CH3(CH2)4(CH=CHCH2))4(CH2)2COO^-

Reakcje charakterystyczne dla lipidów prostych

Rozpuszczalność lipidów

Zasada: Lipidy- tłuszcze są nierozpuszczalne w wodzie , natomiast rozpuszczają się w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak eter, chloroform, aceton, gorący alkohol. Przy wytrąceniu lipidów wodą powstaje emulsja, czyli zawiesina kuleczek tłuszczu, które szybko łączą się ze sobą tak, że powstaje wyraźna granica między dolną fazą wodną i górną fazą tłuszczową. Zawiesinę tłuszczu w wodzie można utrwalić przez dodanie substancji absorbujących się na granicy obu faz. Substancje takie, zwane emulgatorami, obniżają napięcie powierzchniowe i powodują rozdrobnienie cząsteczek tłuszczu zawieszonych w wodzie. Działanie emulgujące posiadają białka, sole kwasów żółciowych oraz mydła.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: olej

alkohol

aceton

chloroform

woda

Do dwóch probówek wlać po 1 ml wody, jedną pozostawić zimną, drugą podgrzać nad palnikiem, Do kolejnych probówek wlać w takiej samej ilości alkohol, chloroform i aceton, a następnie do wszystkich probówek dodać po około 0,5 ml oleju. Obserwując roztwory stwierdzić różnicę rozpuszczalności w wyżej wymienionych rozpuszczalnikach.

-37-

Badanie składu lipidów prostych

1. Próba akroleinowa.

Zasada: próba ta pozwala wykryć w cząsteczce lipidów prostych obecność glicerolu (trójwodorotlenowy alkohol, dobrze rozpuszczalny w wodzie). Obecność jego wykrywa się przeprowadzając go w nienasycony aldehyd – akroleinę

H

/

CH₂ — OH C = O

 2H₂O 

CH — OH → CH

 KHSO₄ 

CH₂ — OH CH₂

Wynikiem reakcji jest ostra i nieprzyjemna woń będąca połączeniem zapachu SO₂ i spalonego tłuszczu. Odwodnienie glicerolu zachodzi pod wpływem kwaśnego siarczanu potasu, który ulega przy tym redukcji do SO₂ o charakterystycznym zapachu.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: olej

KHSO₄ krystaliczny

Do trzech kropli oleju w probówce dodać szczyptę krystalicznego KHSO_4, Podgrzać nad palnikiem. Po podgrzaniu wytwarza się po pewnym czasie akroleina, którą poznaje się po charakterystycznym dławiącym zapachu spalonego tłuszczu.

2. Reakcja zmydlania.

Zasada: hydroliza lipidów pozwala na wykazanie obecności kwasów tłuszczowych w cząsteczce tłuszczu. Lipidy pod wpływem podgrzanej pary wodnej ulegają hydrolizie dając glicerol i wolne kwasy tłuszczowe zgodnie z poniższą reakcją:

CHOCOR₁ CH₂OH R₁COOH

 

CHOCOR₂ + 3H₂O CHOH + R₂COOH

 

CHOCOR₃ CH₂OH R₃COOH

Triacyloglicerol glicerol kwasy tłuszczowe

Rozkład ten można również osiągnąć za pomocą hydrolizy zasadowej (KOH lub NaOH), z tym że otrzymuje się wówczas odpowiednie sole kwasów tłuszczowych nazywane mydłami, a sam proces nosi miano zmydlania tłuszczu. Sole sodowe i potasowe kwasów tłuszczowych dobrze rozpuszczają się w wodzie , tworząc micelarne roztwory koloidowe.

CH₂-O- CO-(CH₂)₁₆ — CH₃ CH₂- OH

 

CH-O- CO- (CH₂)₁₆ — CH₃ + 3NaOH → CH – OH + 3 CH₃(CH₂)₁₆ COONa

 

CH₂- O- CO- (CH₂)₁₆ — CH₃ CH₂- OH

Trójstearynian glicerolu glicerol stearynian sodu

Mydła tworzą koloidy hydrofilowe lub hydrofobowe w zależności od środowiska. W roztworze wodnym grupy polarne (COONa) skierowane są na zewnątrz a rodniki hydrofobowe (węglowodorowe) do wnętrza micelarnych kuleczek mydła. W rozpuszczalnikach organicznych układ tych grup jest odwrotny (mielca odwrócona). Grupy hydrofilowe i hydrofobowe mydła ustawiają się zatem w charakterystyczny sposób na granicy faz i zmniejszają napięcie powierzchniowe. Związki zmniejszające napięcie powierzchniowe są dobrymi emulgatorami poza mydłami należą do nich detergenty i kwasy żółciowe.

-38-

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: margaryna

2 mol/l NaOH

H₂O

W erlenmajerce umieścić kawałek margaryny i ogrzewać na płytce nad palnikiem z 10 ml wody i 2 ml NaOH. Po pewnym czasie powstaje klarowny, lekko opalizujący i pieniący się roztwór: jest to mydło sodowe .

↓

Na otrzymanym roztworze mydła wykonać poniższe reakcje !!!!

a. wysalanie mydeł

Zasada: jest to odwracalny proces fizyczny, polegający na odwodnieniu koloidalnych cząsteczek mydła. Cząsteczki mydła są otoczone warstewką wody związanej, dzięki czemu utrzymują się w roztworze. Dodanie do roztworu mydła dobrze rozpuszczalnej, obojętnej soli powoduje odwodnienie koloidalnych cząsteczek mydła, zmniejsza ich rozpuszczalność i następuje wytrącenie mydła w postaci osadu. Po dodaniu wody mydło rozpuszcza się ponownie.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: mydło (otrzymane w reakcji zmydlania)

NaCl in substantia

Do 2 ml mydła dodać NaCl in substantia, aż do nasycenia. Wytrąca się mydło wysolone w postaci osadu. Płyn znad osadu odlać , a do osadu czyli wytrąconego mydła dodać wody. Mydło rozpuszcza się.

b. wytrącanie wolnych kwasów tłuszczowych

Zasada : pod wpływem kwasów (siarkowego lub solnego) z mydeł zostają uwalniane kwasy tłuszczowe:

2 CH₃(CH₂)₁₆COONa + H₂SO₄ → 2CH₃(CH₂)₁₆COOH + Na ₂SO₄

mydło stearynowe kwas stearynowy

Wydzielone kwasy tłuszczowe po ogrzaniu do wrzenia zbierają się na powierzchni roztworu i po oziębieniu tworzą „plaster”. Kwasy te są nierozpuszczalne w wodzie, rozpuszczają się jedynie w alkoholu, eterze, chloroformie i chloroformie tłuszczach.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: mydło (otrzymane w reakcji zmydlania0

papierki lakmusowe

H₂SO₄ stężony

Do probówki nalać około 3 ml mydła, zakwasić go (wobec papierka lakmusowego) stężonym kwasem siarkowym. Po ogrzaniu na powierzchni tworzy się warstwa wytrąconych kwasów tłuszczowych, która po oziębieniu krzepnie.

c. działanie emulgujące mydeł

Zasada: mydła zawierają w swej cząsteczce grupę hydrofobową ( łańcuch węglowodorowy), nie mającą powinowactwa do wody i rozpuszczają się w tłuszczach oraz grupą hydrofilową (grupa karboksylowa – COOH) łatwo rozpuszczalną w wodzie. Mydła w roztworze umieszczają się na granicy fazy wodnej i tłuszczowej, przy czym ich dysocjowane grupy COOH, naładowane ujemnie łączą się z wodą, a grupy hydrofobowe rozpuszczają się w kuleczkach tłuszczu. W wyniku tego zostaje zniesiona granica faz, poszczególne kuleczki

tłuszczu nie łączą się z sobą i powstaje emulsja tłuszczowa. Emulsja jest formą cieczy złożonej z dwu, nie mieszających się z sobą faz – rozproszonej i rozpraszającej.

-39-

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: mydło (otrzymane w reakcji zmydlania)

olej

H₂O

Do probówki wlać 1 ml oleju a następnie dodać 5 ml wody i 1 ml mydła. Po wytrząśnięciu w probówce tworzy się trwała emulsja tłuszczowa. Do drugiej probówki wlać 1 ml oleju i tylko 5 ml wody, a następnie mocno wytrząsnąć . Utworzy się nietrwała emulsja tłuszczowa.

4.Wykazanie obecności w lipidach nienasyconych kwasów tłuszczowych – reakcja Hübla

Zasada: podwójne wiązania nienasyconych kwasów tłuszczowych nadają im specyficzne cechy chemiczne. W miejscach „nienasycenia” kwasy tłuszczowe przyłączają łatwo atomy wodoru, tlenu i innych pierwiastków , np., chlorowców ulegając przy tym przekształceniu w pochodne kwasów nienasyconych. Specjalne znaczenie ma przyłączenie J₂, ponieważ reakcja jodowania jest kryterium jakościowej charakterystyki lipidów. Reakcja ta pozwala na oznaczenie liczby wiązań podwójnych w lipidach i kwasach tłuszczowych.

CH₃(CH₂)_n – CH=CH(CH₂)_n1 COOH + J₂ → CH₃(CH₂₎)_n- CH- CH – (CH₂)_n1COOH

 

J J

kwas tłuszczowy kwas dwujodotłuszczowy

Reakcja powyższa została wykorzystana w próbie Hübla, w której w obecności chlorku rtęciowego HgCl₂ następuje przyłączenie jodu w miejscu podwójnego wiązania kwasu tłuszczowego. Po dodaniu do kwasu tłuszczowego roztworu Hübla I (alkoholowy roztwór jodu), roztwór zabarwia się na kolor brunatno-brązowy. Pod wpływem roztworu Hübla II (alkoholowy roztwór HgCl₂) następuje wbudowanie jodu w cząsteczkę kwasów tłuszczowych i mieszanina odbarwia się.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: oliwa

odczynnik Hübla I (2,6% alkoholowy roztwór jodu)

odczynnik Hübla II (3% alkoholowy roztwór HgCl₂)

Do 2 ml oliwy dodać kroplami odczynnik Hübla I. Roztwór zabarwia się na kolor brunatno-brązowy. Następnie wkropić odczynnik Hübla II. Następuje odbarwienie roztworu.

5. Utlenianie wiązania podwójnego.

Zasada: Jeżeli na lipidy zawierające kwasy tłuszczowe nienasycone podziała się substancją utleniającą , dochodzi do rozerwania wiązania podwójnego z równoczesnym utlenieniem znajdujących się w jego sąsiedztwie atomów węgla, kwas rozpada się na krótsze związki – w ten sposób można określić miejsce położenia wiązania podwójnego cząsteczce kwasu.

Jako substancję utleniającą używa się nadmanganian potasu (KMnO₄) , w którym mangan w środowisku obojętnym przechodzi ze stopnia utlenienia +7 na stopień utlenienia +4

R−CH=CH−CH₂−COOR’ + O₂ → R−CH−CH−CH₂−COOR’ →

 

OO

OH O

 II

→ R−CH−C−CH₂−COOR’ → R− CHO + OHC −CH₂ −COOR’ →

→ R−COOH + HOOC−CH ₂− COOR’

-40-

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: olej

1 mol/l Na₂CO₃

0,01 mol/l KMnO₄

Do probówki wlać parę kropli oleju a następnie dodać 3 ml Na₂CO_3. Mieszaninę lekko podgrzać. Po czym dodać kroplami KMno₄, aż do utworzenia brunatnego osadu dwutlenku manganu (MnO₂₎).

Tłuszcze złożone

Badanie składu lecytyn – fosatydylocholin

Lecytyny (fosfatydylocholiny) zbudowane są z cząsteczki glicerolu estryfikowanego dwoma cząsteczkami kwasów tłuszczowych (nasyconego i nienasyconego) oraz z jednej cząsteczki kwasu fosforowego estryfikowanego aminoalkoholem choliną (trimetyloetanolamina). Istnieje szereg odmian lecytyn, różniących się między sobą rodnikami kwasów tłuszczowych oraz położeniem kwasu fosforowego.

^-

fosfatydylocholina

(1-palmitoilo-2-oleoilofosfatydylocholina)

Lecytyny są substancjami żółtymi, woskowatymi. Na powietrzu łatwo się utleniają . Są to związki higroskopijne, łatwo rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych oraz w wodnych roztworach kwasów żółciowych. Nie rozpuszczają się w acetonie i wodzie z którą tworzą lepkie koloidalne roztwory.

Badanie składu lecytyn:

1. wykrywanie glicerolu

Na suchej lecytynie wykonać reakcje akroleinową na obecność glicerolu.

1. wykrywanie kwasów tłuszczowych:

Zasada: pod wpływem NaOH lecytyna ulega hydrolizie i tworzą się sole sodowe kwasów tłuszczowych oraz powstająca z choliny trimetyloamina N(CH₃)₃

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: lecytyna

20% NaOH

Umieścić kilka granulek lecytyny w probówce i nalać około 3 ml 20% NaOH. Ogrzewać przez kilka minut. Podczas ogrzewania czuć woń trimetyloaminy. W roztworze tworzą się mydła

-41-

1. wykrywanie kwasu fosforowego

Zasada: podczas utleniania lecytyny w wysokiej temperaturze wszystkie jej składniki ulegaja utlenieniu na substancje lotne. Fosfor jako ciało stałe pozostaje na dnie probówki, a po rozpuszczeniu w rozcieńczonym HNO₃ można go wykryć molibdenianem amonu, z którym tworzy żółty osad fosforomolibdenianu amonu (NH₄)₃PO₄⋅ 12 MoO₃

Wykonanie oznaczenia

Odczynniki: lecytyna

mieszanina do spalań (KNO₃ + K₂CO₃ w stosunku. 2:3)

HNO₃ rozcieńczony

molibdenian amonu

Do probówki wsypać kilka granulek lecytyny dodać dwukrotnie większą ilość mieszaniny do spalań i trzymać nad płomieniem palnika tak długo, aż zawartość probówki przyjmie czarne zabarwienie. Pozostałość w probówce rozpuścić w rozcieńczonym kwasie azotowym Zawartość probówki przesączyć. Do otrzymanego przesączu wlać niewielką ilość molibdenianu amonu, aż do uzyskania żółtego zabarwienia.

-42-

Ćwiczenie IX

IV kolokwium : lipidy proste i złożone

Cholesterol, kwasy żółciowe , hormony steroidowe.

Cholesterol ( 5 cholesten-3-β-ol) wchodzi w skład lipidów budulcowych ustroju . Jest głównym sterolem zwierzęcym. Wywodzi się on z 27-węglowego układu cholestenu i posiada jedno wiązanie podwójne w pozycji 5 oraz grupę hydroksylową w pozycji 3.

Cholesterol występuje w komórkach wszystkich tkanek i narządów, przeważnie jako wolny, ale także może być związany estrowo z kwasami tłuszczowymi. Wolny cholesterol stanowi niezbędny składnik błon cytoplazmatycznych i błon organellowych.W obrębie cytoplazmy cholesterol może być magazynowany w postaci pęcherzyków zawierających estry cholesterolu. Najwięcej tych pęcherzyków jest w komórkach kory nadnerczy oraz gonad gdzie cholesterol jest substratem koniecznym do syntezy hormonów steroidowych. W wątrobie z cholesterolu powstają kwasy żółciowe.

Reakcje charakterystyczne dla cholesterolu:

1. Reakcja Salkowskiego

Zasada: Po podwarstwieniu chloroformowego roztworu cholesterolu stężonym kwasem siarkowym, faza dolna kwasu fluoryzuje na zielono, natomiast warstwa górna chloroformowa barwi się na czerwono. .Przypuszcza się , że barwa reakcji pochodzi od utworzonych dodatkowo wiązań podwójnych lub kondensacji dwu cząsteczek cholesterolu

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: cholesterol

chloroform

H₂SO₄ stężony

Niewielką ilość cholesterolu wsypać do suchej probówki (obecność wody przeszkadza w reakcji !) i dodać 2 ml chloroformu , a następnie bardzo ostrożnie po ściankach probówki wlać 2 ml stężonego kwasu siarkowego tak , aby płyny nie zmieszały się. Otrzymaną reakcję oglądać pod lampa kwarcową !. Warstwa dolna kwasu siarkowego wykazuje zabarwienie żółte z zieloną fluorescencją, natomiast warstwa górna , chloroformowa jest zabarwiona na czerwono.

1. Reakcja Libermana – Burcharda

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: cholesterol

chloroform

bezwodnik kwasu octowego

H₂SO₄ stężony

W suchej probówce szczyptę cholesterolu rozpuścić w 2 ml chloroformu i dodać 10 kropli

-43-

bezwodnika kwasu octowego, następnie bardzo ostrożnie wlać po ściankach probówki 1-2 kropli stężonego kwasu siarkowego. Roztwór zabarwia się kolejno na czerwono- fiołkowo- niebiesko- zielono.

Kwasy żółciowe.

Sole kwasów żółciowych są polarnymi pochodnymi cholesterolu. Związki te są wysoce efektywnymi detergentami, ponieważ ich cząsteczki zawierają zarówno polarne, jak i niepolarne rejony. Sole kwasów żółciowych są syntetyzowane w wątrobie, magazynowane, zagęszczane w pęcherzyku żółciowym i uwalniane stamtąd do jelita cienkiego. Sole te, będące głównym składnikiem żółci, działają emulgująco na tłuszcze pokarmowe. Skuteczne zwiększenie powierzchni cząsteczek lipidów ma dwie konsekwencje: ułatwia hydrolizę tłuszczów przez lipazy i ich wnikanie do ściany jelita. Sole kwasów żółciowych są również głównym produktem rozpadu cholesterolu.

Cholesterol jest zamieniany w trihydroksykoprostanian, a następnie w cholilo-CoA, zaktywowany intermediant w syntezie większości soli żółciowych. Zaktywowany węgiel grupy karboksylowej cholilo-CoA reaguje z grupą aminową glicyny tworząc glikocholan lub grupą aminową tauryny (reszta cysterny) dając taurocholan. Glikocholan jest najważniejszą solą kwasów żółciowych

Reakcje charakterystyczne dla kwasów żółciowych

1. Próba Haya

Zasada: kwasy żółciowe obniżają napięcie powierzchniowe cieczy – siarka lub talk w obecności żółci nie utrzymuje się na powierzchni , lecz szybko opada na dno

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: żółć

talk

H₂O

-44-

Do 2 probówek wlać po 5 ml wody. Do jednej dodać kroplę żółci i dokładnie wymieszać. Do obu probówek wsypać szczyptę talku. W probówce w której znajdują się kwasy żółciowe talk szybko opada na dno, natomiast probówce gdzie jest tylko woda utrzymuje się na powierzchni.

1. Emulgujące działanie żółci

Zasada: obniżenie napięcia powierzchniowego w obecności kwasów żółciowych umożliwia tworzenie się emulsji.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: żółć

oliwa

H₂O

Do 2 probówek nalać po 5 ml wody i 5 kropli oliwy. Do jednej z nich dodać 3 krople żółci – obie probówki silnie wstrząsnąć i odstawić. Po paru minutach w probówce bez żółci nastąpi rozdzielenie warstw wody i oliwy, natomiast w probówce drugiej powstaje zawiesina tłuszczu.

1. Próba Pettenkofera

Zasada: w środowisku silnie kwaśnym fruktoza tworzy 5-hydroksymetyelenofurfural, który kondensuje z kwasami żółciowymi na barwne pochodne

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki:żółć

fruktoza lub sacharoza

H₂SO₄ stężony

Do 1 ml dwukrotnie rozcieńczonej żółci dodać kilka kryształków fruktozy lub sacharozy i po rozpuszczeniu cukru ostrożnie po ściankach probówki wlać około 1 ml stężonego kwasu siarkowego Na pograniczu obu warstw tworzy się czerwony pierścień.

Hormony steroidowe

Cholesterol jest prekursorem pięciu głównych klas hormonów steroidowych: progestagenów, glukokorykoidów, mineralokortykoidów, androgenów i estrogenów.

cholesterol (C₂₇)

↓

pregenenolon (C₂₁)

↓

progestageny (C₂₁)

glikokortykoidy (C₂₁) androgeny (C₁₉)

mineralokorykoidy (C₂₁)

estrogeny (C₁₈)

Progesteron, hormon grupy progestagenów, przygotowuje podłoże macicy do umiejscowienia jaja. Progesteron jest również niezbędny do utrzymania ciąży. Androgeny

(testosteron, androsteron, androstendion) są odpowiedzialne za rozwój drugorzędowych męskich cech płciowych, natomiast estrogeny (estradiol, estron, estriol) są konieczne do wytworzenia drugorzędowych cech płciowych żeńskich. Estrogeny wspólnie z progesteronem uczestniczą również w cyklu owulacyjnym. Glikokorykoidy (kortyzol, kortyzon, kortykosteron) pobudzają glukoneogenezę i tworzenie glikogenu oraz wzmagają rozkład

-45-

tłuszczu i białka. Umożliwiają reakcję zwierząt na stres . Mineralokortykoidy (głównie aldosteron) powodują zwiększenie resorpcji Na⁺ i wydzielanie K⁺ i H⁺ przez kanaliki nerkowe, co prowadzi do wzrostu objętości i ciśnienia krwi.

Głównymi miejscami syntezy tych grup hormonów są dla : progestegenów – ciałko żółte, estrogenów – jajnik, androgenów – jądra, glukokortykoidów i mineralokortykoidów – kora nadnerczy.

Synteza progesteronu i kortykoidów.

Progesteron jest syntetyzowany z pregnenolonu w dwóch etapach. Grupa 3-hydroksylowa pregnenolonu jest utleniania do grupy 3-ketonowej i wiązanie ⁵ izomeryzuje do wiązania ⁴_. . Koryzol , główny glukokortykoid tworzy się z progesteronu przez hydroksylację przy C-17, C-21, i C-11.

Początkowym etapem syntezy aldosteronu, głównego mineralokortykoidu jest hydroksylacja progesteronu przy C-21. Powstały deoksykortykosteron jest hydroksylowany przy C-11. Kątowa grupa metylowa C-18 zostaje utleniona do aldehydu i powstaje aldosteron.

Synteza androgenów i estrogenów

Synteza androgenów rozpoczyna się od hydroksylacji progesteronu przy C-17. Boczny łańcuch zawierający C-20 i C-21 jest odszczepiany i powstaje androstendion. Testosteron jest tworzony przez redukcję grupy ketonowej przy C-17 androstendionu. Estrogeny są syntetyzowane z androgenów przez usunięcie kątowej grupy metylowej przy C-19 i utworzenie aromatycznego pierścienia A. Z androstendionu powstaje estron , natomiast estradiol powstaje z testosteronu.

-46-

Reakcje charakterystyczne dla hormonów steroidowych:

1. Reakcja Zimmermanna

Zasada: w środowisku alkalicznym 17-ketosterydy (androsteron, androstendion, dehydroepiandrosteron) kondensują z m-dwunitrobenzenem na pochodne o barwie fiołkowo-różowej.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki :alkohol etylowy absolutny

96% alkohol etylowy

2% m-dwunitrobenzen

2,5 mol/l KOH w alkoholu etylowym

Do probówki wsypać około 10µg androsteronu, a następnie dodać kolejno:

1. 0,2 ml alkoholu etylowego absolutnego

2. 0,2 ml 2% m-dwunitrobenzenu

3. 0,2 ml 2,5mol/lKOH,

po czym inkubować roztwór przez okres minimum 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Po tym okresie w celu zahamowania reakcji dodać 1 ml 96% alkoholu etylowego.

Powstaje zabarwienie fiołkowo-różowe.

1. Reakcja Kobera

Zasada: w obecności stężonego kwasu siarkowego, estrogeny z hydrochinonem tworzą różowo-żółte zabarwienie o zielonej fluorescencji. Jest to reakcja specyficzna dla aromatycznego pierścienia A estrogenów.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: estradiol

odczynnik Kobera (70%H₂SO₄ + hydrochinon)

Do probówki wlać około 10 µl estradiolu i dodać 2 ml odczynnika Kobera. Następnie ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 20 minut. Po tym okresie oziębić probówkę pod bieżącą zimną wodą. Po oziębieniu dodać 0,2 ml H₂O i ponownie wstawić do wrzącej łaźni wodnej na okres 10 minut. Po oziębieniu powstaje żółto- kremowe zabarwienie które pod lampa kwarcową daje zieloną fluorescencję .

1. Reakcja Portera-Silbera

Zasada: jest to reakcja charakterystyczna tylko dla 17-hydroksykortykosterydów, czyli posiadających grupę hydroksylową przy C₁₇ (kortyzon, kortyzol). Z chlowodorkiem fenylohydrazyny, w obecności kwasu siarkowego powstaje żółty hydrazyn.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: kortyzol lub kortyzon

odczynnik Portera-Silbera (chlorowodorek fenylohydrazyny + kwas siarkowy)

Do probówki wlać około 10 µl koryzolu a następnie dodać 1 ml odczynnika Portera_Silbera. Probówkę wstawić do gorącej łaźni wodnej na około 5 minut, powstaje żółte zabarwienie.

1. Reakcja z błękitem tetrazoliowym.

Zasada: reakcję tę dają wszystkie kortykosterydy posiadające ugrupowanie α-ketalowe w łańcuchu bocznym przy C₁₇ ( koryzol, korytyzon, aldosteron). Redukują one błękit tetrazoliowy do różowego , a przy dużych ilościach sterydu do niebieskiego formazonu.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: kortyzol lub kortyzon

roztwór błękitu tetrazoliowego (1mg błękitu w 1ml 2mol/l NaOH)

Do probówki wlać 10 µl kortyzolu po czym dodać 1 ml roztworu błękitu tetrazoliowego. Powstaje różowe zabarwienie.

-47-

Ćwiczenia X

V. kolokwium : cholesterol, kwasy żółciowe, hormony steroidowe

I.Hemoglobina . Produkty rozkładu hemu.

Hemoglobina

Warunkiem wiązania tlenu przez hemoglobinę białka należącego do grupy hemoprotein jest obecność jednostki niebiałkowej, a mianowicie grupy hemowej. Składa się ona z części organicznej i atomu żelaza. Część organiczna protoporfiryna, zbudowana jest z czterech pierścieni pirolowych, połączonych mostkami metanowymi w pierścień tetrapirolowy. Do tego pierścienia przyłączone są łańcuchy boczne, z których cztery są grupami metylowymi, dwa – grupami winylowymi i dwa – resztami kwasu propionowego.

Atom żelaza w grupie hemowej , umieszczony w centrum pierścienia protoporfiryny, wiąże się z czterema atomami azotu wiązaniami koordynacyjnymi, piąte wiązanie – z tlenem (zachodzi proces utlenowania), a szóste wiązanie koordynacyjne służy do połączenia z białkiem przez pierścień imidazolowy histydyny.

W procesie utlenowania stopień utlenienia żelaza nie zmienia się, powstaje oksyhemoglobina (Hb-O₂). W przypadku utleniania żelazo zmienia swój stopień utlenienie z Fe⁺² do Fe⁺³ z jednoczesnym przyłączeniem cząsteczki H₂O, powstaje methemoglobina (Met-Hb).

Hemoglobina jest przenośnikiem tlenu w organiźmie w postaci oksyhemoglobiny. tj. hemoglobiny utlenowanej. Cząsteczka hemoglobiny może przyłączyć 4 cząsteczki tlenu atmosferycznego, 1g hemoglobiny wiąże 1,36 ml tlenu. Proces utlenowania hemoglobiny i trwałość powstałej oksyhemoglobiny zależy od ciśnienia parcjalnego tlenu, tzn. od jego stężenia.

Oksyhemoglobina pod działaniem kwasów, zasad i rozpuszczalników organicznych, jak etanol lub aceton, przechodzi w parahematynę, inaczej nazywaną hemichromogenem. Część białkowa jest tu denaturowana, a żelazo – w postaci Fe⁺³. Redukując hemichromogen otrzymuje się hemochromogen, zbudowany z hemu i globiny zdenaturowanej.

-48-

]

Hematyna może powstać z hemoglobiny przez działanie na nią zasadą (hematyna zasadowa) lub kwasem (hematyna kwasowa), w warunkach tlenowych, zawiera ona Fe⁺³ i nie ma części białkowej. Zarówno kwasy, jak i zasady rozbijają hemoglobinę, przy czym uwolniony hem utlenia się tlenem z Hb-O₂ na hematynę, a globina ulega denaturacji. Oksyhemoglobina pod działaniem gorącego stężonego roztworu CH₃COOH i NaCl traci białko i w ten sposób powstaje hemina z żelazem Fe^+3.. Hemina rozpuszczona w wodorotlenku przechodzi w hematyną zasadową.

Łagodne, nie denaturujące globinę, środki utleniające hemoglobinę, jak H₂O_{2,, ,} K₃[Fe(CN)₆],

KMnO₄, zmieniaja ją w methemoglobinę (Met-Hb), w której zamiast hemu występuje hematyna z żelazem Fe⁺³

HbO₂ + [Fe(CN)₆]^3- → Met-Hb + [Fe(CN)₆]^2- + O₂

Barwniki hematynowe nie wiążą tlenu, CO i dają barwne pochodne z cyjankami (cyjanomethemoglobina). Trujące działanie cyjanków polega na blokowaniu układu hemowego enzymów biorących udział w utlenieniach tkankowych.

Z hemoglobiną 300-krotnie silniej niż tlen łączy się tlenek węgla, w wyniku czego powstaje hemoglobina tlenkowęglową,- karboksyhemoglobina (Hb-CO). Zdolność wiązania CO mają chromoproteiny zawierające hem, natomiast proteiny hemetynowe właściwości tej nie wykazują. Silne toksyczne działanie tlenku węgla wiąże się z wyłączeniem hemoglobiny z udziału w transportowaniu tlenu i blokadą oksydazy cytochromowej, uczestniczącej w utlenianiu tkankowym.

-49-

Wykrywanie oraz oznaczanie hemoglobin i jej pochodnych

1. Otrzymywanie methemoglobiny

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: krew (nie rozcieńczona)

K₃[Fe(CN)₆]

Do probówki wlewamy około 0,5 ml krwi a następnie dodajemy parę kropli roztworu heksacyjanożelazianu (żelazicyjanku) potasowego K₃[Fe(CN)₆]. Pod działaniem tego środka utleniającego Hb-O₂ przechodzi w Met-Hb. Krew przybiera zabarwienie brunatne.

-49-

1. Otrzymanie hematyny kwasowej

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: 10-krotnie rozcieńczona krew

2mol/l HCL

Do probówki wlać 2 ml rozcieńczonej krwi , następnie dodać 3-4 krople 2M HCl. Roztwór zmienia barwę na brunatną ponieważ hemoglobina ulega rozkładowi na globinę i hematyną kwasową. Z hematyny w obecności jonów Cl^- tworzy się chlorowodorek hematyny – hemina.

1. Otrzymanie hematyny zasadowej i hemochromogenu

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki:10-krotnie rozcieńczona krew

5%NaOH

Na₂S₂O₄ krystaliczny

Do probówki wlać około 2 ml rozcieńczonej krwi dodać 5 kropli 5% NaOH i łagodnie podgrzać. Zawartość probówki przybiera zabarwienie brunatne wskutek utworzenia hematyny zasadowej. Po dodaniu kilku kryształków Na₂S₂O₄ barwa zmienia się na czerwoną w wyniku powstania hemochromogenu. Reakcję oglądać pod światłem!. Dwutionian sodu redukuje hematynę do hemu , który ze zdenaturowaną globiną tworzy hemochromogen.

Produkty rozkładu hemu

Normalne krwinki czerwone (erytrocyty) człowieka żyją około 120 dni. Stare komórki są usuwane z obiegu i rozkładane przez śledzionę. Część białkowa hemoglobiny ulega hydrolizie do składników – aminokwasów.

Pierwszy etap rozpadu grupy hemowej do bilirubiny to rozszczepienie jej mostka α-metinowego i utworzenie biliwerdyny, łańcuchowego tetrapirolu. Powstająca biliwerdyna

(o barwie zielononiebieskiej) występuje w dwóch formach tautomerycznych ; jedna z nich zawiera dwie grupy –OH na końcu układu, zaś druga dwie grupy karbonylowe. W następnej reakcji biliwerdyna pod wpływem specyficznej reduktazy biliwerdyny współdziałającej z NADPH + H⁺ , jest zredukowana do bilirubiny ( o barwie pomarańczowo-żółtej).

-50-

Degradacja hemu do bilirubiny

Bilirubina wytworzona w śledzionie oraz w innych tkankach poza wątrobowych musi być dostarczona do wątroby , tam bowiem zachodzi jej dalszy metabolizm. Tak więc bilirubina w kompleksie z albuminą surowicy jest transportowana do wątroby, gdzie staje się bardziej rozpuszczalna przez przyłączenie reszt cukru . Produkt sprzężenia bilirubiny z dwoma glukoronianami, zwany diglukoronidem bilirubiny , dostaje się do żółci, a następnie wraz z nią przedostaje się do jelita.

-51-

W ostatnim odcinku jelita cienkiego i na początku jelita grubego, pod wpływem bakteryjnej hydrolizy , następuje hydroliza mono- jak i diglukuronianów bilirubiny. Uwolniona wtedy bilirubina jest następnie zredukowana do mezobilirubiny (związek o barwie żółtej). W trakcie dalszych reakcji następuje redukcja grup metanowych, a także dochodzi do likwidacji wiązań podwójnych w pierścieniach pirolowych, co ostatecznie prowadzi do powstania bezbarwnego urobilinogenu ( zwanego także sterkobilinogenem). Większość tworzonego urobilinogenu jest w jelicie grubym przy udziale enzymów bakteryjnych utleniana do barwnej urobiliny i wydalana z kałem.

Reakcje charakterystyczne dla barwników żółciowych

1. Próba Gmelina

Zasada: stężony kwas azotowy utlenia barwniki żółciowe na pochodne o zmieniającej się barwie od zielonej, poprzez niebieską, fioletową, czerwoną do żółtej. Barwy te odpowiadają kolejnym produktom utlenienia bilirubiny.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki rozcieńczona żółć

HNO₃ stężony

-52-

Do probówki wlać około 1 ml rozcieńczonej żółci, a następnie bardzo ostrożnie! po ściankach probówki wlać 1 ml stężonego kwasu azotowego. Odstawić probówkę delikatnie. Po 5 do 10 minutach na pograniczu obu płynów powstaje warstwa czerwona i zielona.

1. Próba Rosina

Zasada: próba polega na utlenieniu barwników żółciowych lecz barwnikiem utleniającym jest tutaj roztwór jodu.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: rozcieńczona żółć

5% roztwór jodu

Do probówki wlać około 1 ml rozcieńczonej żółci, a następnie ostrożnie dodać 2-3 kropli jodu. Bilirubina utlenia się na zieloną biliwerdynę.

1. Próba Cole’a

Zasada: barwniki żółciowe mogą zostać zaadsorbowane przez siarczan baru BaSO₄ w kwaśnym, metanolowym roztworze. Dodając chloran potasu KClO₃, można utlenić bilirubinę i biliwerdynę na połączenie o charakterystycznym niebieskim zabarwieniu.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: rozcieńczona żółć

MgSO₄ nasycony

10%BaCl₂

etanol

H₂SO₄ stężony

2%KClO₃

W erlenmajerce zagotować 5 ml żółci, następnie dodać 2 krople nasyconego MgSO₄ i około 1ml chlorku baru BaCl_2. Wytrąca się osad. Roztwór z osadem ponownie zagotować. Po zagotowaniu przesączyć roztwór do probówki. Pobrać trochę osadu z sączka do kolejnej probówki i dodać do niego 4 ml etanolu oraz 3 krople stężonego H₂SO₄ i kroplę KCLO₃. Nie mieszać!!!!.

Gotować nad palnikiem przez 30 sek., po czym odstawić probówkę na 2 -5 minut. Po opadnięciu osadu BaSO₄ warstwa etanolu zabarwia się na kolor zielono –niebieski. Jest to utleniona bilirubina i biliwerdyna.

1. Próba Schlesingera

Zasada: jest to próba pozwalająca wykryć obecność urobiliby w moczu, jako produkt utleniania urobilinogenu. Z solami cynku daje urobilina zieloną fluorescencję.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: mocz

5 % roztwór J₂

10% alkoholowy roztwór octanu cynku

Do probówki wlać około 3 ml moczu a następnie dodać 1-3 kropel 5% roztworu jodu. Odstawić na 5 minut , po czym dodać 3 ml 10% roztworu octanu cynku. Wymieszać i pozostawić do opadnięcia osadu Oglądać zieloną fluorescencję pod lampą kwarcową !

-53-

Witaminy

Witaminy są cząsteczkami organicznymi, niezbędnymi w małych ilościach w pożywieniu zwierząt wyższych. Spełniają one prawie taka sama rolę we wszystkich organizmach , ale tylko zwierzęta wyższe utraciły zdolność ich syntezy. Witaminy dzielimy na rozpuszczalne w wodzie i rozpuszczalne w tłuszczach

Rozpuszczalnymi w wodzie są: witamina C, grupa związków znana jako witaminy B kompleks oraz witamina H. Witamina C to zjonizowana forma kwasu askorbinowego. Objawem awitaminozy kwasu askorbinowego jest schorzenie nazywane szkorbutem (gnilecem). Są to uszkodzenia naczyń włosowatych i związane z tym krwawienie dziąseł oraz rozchwianie się zębów

Tiamina (witamina B_1, aneuryna) Pirofosforan tiaminy jej ufosforylowana forma jest koenzymem transferaz. Awitaminoza witaminy B_1, nosi nazwę beri-beri i występuje przy odżywianiu się wyłącznie odtłuszczonym ryżem. Jest poważnym problemem w krajach Dalekiego Wschodu. Podczas tej choroby występują schorzenia neurologiczne i kardiologiczne, które objawiają się uszkodzeniami obwodowego układu nerwowego, bólem nóg i rąk, osłabieniem mięśni i zmianami wrażliwości skóry Serce może być powiększone i występuje niewydolność krążenia. Beri-beri jest schorzeniem które spotkać można u chronicznie niedożywionych alkoholików.

Ryboflawina (witamina B₂) jest grupa czynną koenzymów oksydoredukcyjnych (FMN, FAD) Awitaminoza tej witaminy powoduje u zwierząt zahamowanie wzrostu i schorzenia skórne, u człowieka są to zapalenia skóry oraz zmiany zapalne w okolicy warg.

Amid kwasu nikotynowego (niacyna, witamina PP) to amid kwasu pirydyno-3-karboksylowego jest grupą czynną koenzymów osydoredukcyjnych (NAD⁺, NADP⁺). Niedobór kwasu nikotynowego prowadzi do zmian skórnych zwanych pelegrą oraz do biegunki i delirium.

Pirydoksyna (witamina B₆) jest pochodną pirydyny i stanowi składnik fosforanu pirydoksalu, będącego ważnym koenzymem w przemianie aminokwasów .Niedobór witaminy B₆ nie daje typowego obrazu chorobowego. U dzieci obserwowane są drgawki epileptyczne, które spowodowane są zaburzeniami w przemianie kwasu glutaminowego. Niekiedy występują również objawy łojotoku .

-54-

Kwas pantotenowy (kompleks B₂₎ jest dwupeptydem , który w połączeniu z cysteaminą tworzy pantoteinę będącą składnikiem koenzymu A. Brak kwasu pantotenowego powoduje siwienie włosów u szczurów, pelagię u drobiu. U człowieka jednak objawy nie są znane.

Folian (kompleks B₂ ) jest pochodną pterydyny, a formą czynną biochemicznie jest kwas tetrahydrfoliowy , który jest koenzymem transferaz. U człowieka niedobór folianu objawia się przede wszystkim zamianami obrazu krwi – anemią. Przyczyną tych zmian patologicznych jest nie tyle niedobór folianu w pokarmie , ile zaburzenia w jego wykorzystaniu..

Biotyna (witamina H) jest koenzymem transferaz._. U zwierząt objawy awitaminozy polegają na zmianach skórnych i wypadaniu włosów. Awitaminozę tę powoduje podawanie specyficznego białka awidyny (białko jaja kurzego) które silnie wiąże biotynę i w ten sposób ją inaktywuje.

Kobalamina (B₁₂) jest czynnikiem zapobiegającym anemii złośliwej. Już małe jej ilości leczą u człowieka objawy tej choroby, która przejawia się znacznym zmniejszeniem ilości erytrocytów we krwi. Awitaminoza ta spowodowana jest jednak nie brakiem witaminy w pożywieniu, a zaburzeniami w resorpcji jej z przewodu pokarmowego.

Rozpuszczalne w tłuszczach to witaminy A, D, E i K

Witamina A (retinol) jest prekursorem retinolu, wrażliwej na światło rodopsyny i innych barwników wzrokowych. Brak tej witaminy prowadzi do niedowidzenia o zmierzchu (tzw. kurzej ślepoty). Ponadto młode zwierzęta potrzebują witaminy A do wzrostu. Kwas retinowy, aktywuje transkrypcję specyficznych genów, które pośredniczą we wzroście i rozwoju.

Cholesterol jest prekursorem witaminy D , która odgrywa zasadniczą rolę w kontrolowaniu metabolizmu wapnia i fosforu. 7-dehydrocholesterol (prowitamina D₃₎), w wyniku reakcji fotochemicznej zachodzącej pod wpływem promieniowania nadfioletowego, zmienia się w witaminę D_{3. .}Brak witaminy D w dzieciństwie powoduje krzywicę charakteryzującą się zaburzeniami w wapnieniu chrząstek i kości. U dorosłych brak tej witaminy prowadzi do rozmiękania i osłabiania kości w procesie zwanym ostemolacją.

-55-

Witaminę E (α-tokoferol) odkryto jako czynnik zapobiegający bezpłodności samic szczura. Objawami niedoboru tej witaminy są: u samic resorpcja płodu a u samców atrofia męskich gruczołów rozrodczych i dystrofia mięśni.

Witamina K , jest potrzebna do prawidłowego krzepnięcia krwi . Spośród czynników biorących udział w procesie krzepnięcia zmiany dotyczą przede wszystkim protrombiny, która w przypadku niedoboru tej witaminy nie jest syntetyzowana w wystarczającej ilości.

Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w wodzie

1. Wykrywanie obecności witaminy B₁ – metoda Jensena

Zasada: jest to metoda tiochromu polegająca na łagodnym utlenieniu witaminy B₁ żelazicyjankiem potasu K₃Fe(CN)₆ w środowisku alkalicznym. Powstały produkt utlenienia tiaminy – tiochrom silnie fluoryzuje na niebiesko w świetle nadfiołkowym.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór witaminy B₁

metanol

1%K₃Fe(CN)₆

30% NaOH

alkohol izobutylowy

Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B₁ a następnie dodać 1 ml metanolu oraz przy ciągłym mieszaniu 0,1ml 1% roztworu K₃Fe(CN)₆ i 1 ml NaOH. Tak przygotowaną mieszaninę odstawić do statywu na około 1 minutę. Po upływie tego czasu dodać 6 ml alkoholu izobutylowego i silnie wytrząsnąć. Po oddzieleniu warstawy alkoholowej oglądać reakcję

2.Wykrywanie obecności witaminy B_{2 –} metoda Eulera i Adlera

Zasada: roztwory wodne witaminy B₂, w środowisku obojętnym dają żółto-zieloną fluorescencję

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór wodny witaminy B₂

mieszanina pirydyny, wody i metanolu

Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B₂ dodać 2 ml mieszaniny pirydyny , wody i metanolu. Reakcję oglądać pod lampą kwarcową – widoczna jest żółto-zielona fluorescencja witaminy B₂.

3.Wykrywanie witaminy B₆ – metoda Greena

Zasada: Witamina B₆ z chlorkiem żelazowym Tworzy połączenia o barwie czerwonej.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: roztwór witaminy B₆

10% FeCl₃

Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B₆ dodać kilka kropel 10 % FeCl₃ - powstaje czerwone zabarwienie.

-56-

Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w tłuszczach

1. Wykrywanie witaminy A - metoda Carra i Price’a

Zasada: chloroformowy roztwór witaminy A z odczynnikiem Cara i Price’a (chloroformowy roztwór trójchlorku antymonu SbCl₃) daje niebieskie zabarwienie.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: chloroformowy roztwór witaminy A

odczynnik Cara i Price’a

Do probówki nalać 1 ml odczynnika Cara i Price’a a następnie 3 do 5 kropel witaminy A – pojawia się niebieskie zabarwienie.

1. Wykrywanie witaminy D₃ w tranie.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: chloroformowy roztwór tranu (1:1)

chloroformowy roztwór bromu (1: 60)

Do suchej probówki wlać 1 ml chloroformowego roztworu tranu i 1 ml roztworu bromu. Przez krótki okres czasu utrzymuje się zielone zabarwienie.

1. Wykrywanie obecności witaminy E za pomocą Fe⁺³

Zasada: podczas utleniania tokoferolu za pomocą Fe⁺³ przechodzi on w tokoferlochinon o zabarwieniu czerwonym.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: etenolowy roztwór witaminy E

0,2% FeCl₃ (w bezwodnym etanolu)

Do probówki wlać 2 ml roztworu witaminy E dodać 0,5 ml roztworu FeCl₃ . Po dokładnym wymieszaniu pojawia się czerwone zabarwienie.

-57-

Ćwiczenia XI

VI kolokwium : hemoglobina, produkty rozkładu hemu

Kinetyka reakcji enzymatycznych

Badaniem szybkości reakcji chemicznych zajmuje się kinetyka. Poznanie kinetycznych zależności pozwala na podanie szybkości reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu substratu. Szybkość reakcji zależy od wielu różnych czynników, a mianowicie od chemicznej struktury reagujących substancji, od ich stężeń oraz od środowiska w jakim zachodzi reakcja (pH roztworu) od temperatury a także od rodzaju katalizatora jak również od jego aktywatorów bądź inhibitorów.

Zadaniem kinetyki jest ustalenie charakteru reakcji i matematyczne ujęcie zależności między szybkością reakcji , a czasem jej trwania. Poznanie tej zależności pozwala podać szybkość reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu enzymu.

Szybkość reakcji chemicznej jest w każdej chwili proporcjonalna do stężenia substancji reagujących i oznacza stosunek przyrostu stężenia produktu reakcji ( lub ubytku stężenia) do czasu w którym ten przyrost (ubytek) nastąpił.

x

V =

t

V = szybkość reakcji enzymatycznej

x= stężenie produktu

t = czas (min. sek)

V

t

Zależność szybkości reakcji (v) od czasu (t) dla reakcji I rzędu

-58-

W reakcjach I rzędu szybkość reakcji jest funkcja stężenia substratu i można ja przedstawić następująco:

x

V = = k (a –x)

t

= przyrost

v = prędkość

t = czas

a = stężenie substratu

x = stężenie produktu

k = stała reakcji

powyższy wzór można zapisać jako równanie :

x/ t = k( a-x )

aby wyliczyć k – czyli stała reakcji należy zcałkować powyższe równanie :

1 a 2.303 a

k = ln = x log

t a –x t a - x

aby przejść z logarytmu naturalnego (ln) należy pomnożyć przez 2.303

a

log a - x

k = 2.303 ^-1

t

k – wyraża się w jednostce odwrotności czasu np. min ^-1, sek ^-1 itd.

a

log

a - x

t

Wykres stałej k dla reakcji I rzędu

-59-

Badanie szybkości reakcji I rzędu i wyznaczenie stałej k na przykładzie hydrolizy sacharozy

Zasada: sacharoza ulega hydrolizie w środowisku kwaśnym i stopień hydrolizy mierzy się ilością cukrów redukujących pojawiających się w czasie trwania hydrolizy. Oznaczyć można ilość powstającego produktu lub ubytek substratu w trakcie reakcji. Stężenie produktu lub substratu wyraża się w dowolnych jednostkach.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: 0,2% roztwór sacharozy (świeżo sporządzony)

6 M HCL

10% NaOH

0,25% roztwór glukozo-fruktozy( jednakowe ilości glukozy i fruktozy)

1% kwas pikrynowy

Przygotować 8 probówek do których wlać po 3 ml 10% NaOH. Zmieszać 5 ml 0,2% sacharozy i 5 ml 6 M HCL i natychmiast !!! po wymieszaniu przenieść 1ml hydrolizatu do pierwszej probówki z roztworem NaOH ( czas t = O). Do kolejnych probówek z 10% NaOH wprowadzać po 1 ml hydrolizatu po upływie: 5, 10, 15, 20, 25, 30 i 35 minut.

Następnie dodać do wszystkich probówek po 2ml 1% kwasu pikrynowego dokładnie wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Po 5 minutach probówki ostudzić i dodać do każdej po 4 ml wody, próbki są gotowe do pomiaru absorbancji.

Wartość absorbancji oznaczyć przy λ = 530 wobec próbki pierwszej (czas t = O).

Ilości mg glukozo-fruktozy wyzwolonych po określonym czasie hydrolizy odczytać z wykresu sporządzonego na podstawie krzywej standardowej :

Wykonanie krzywej standardowej

Standardy glukozo- fruktozy : 1. – 0,25 mg/ml ; 2- 0,50 mg/ml; 3- 0,75 mg/ml; 4-- 1.00mg/ml i 5 – 1,25mg/ml.

Przygotować próbki zgodnie z poniższa tabelą

↓

Nr . probówki	Standard (ml)	H2O (ml)	10%NaOH (ml)	6M HCL (ml)	1% kwas pikrynowy (ml)	Łaźnia Wodna 100^0C	H2O (ml)
„0”	0	0,5	3	0,5	2	5 min.	4
1	0,1	0,4	3	0,5	2		4
2	0,2	0,3	3	0,5	2		4
3	0,3	0,2	3	0,5	2		4
4	0,4	0,1	3	0,5	2		4
5	0,5	O	3	0,5	2		4

-60-

Oznaczyć wartość absorbancji przy λ = 530 nm wobec próbki „O” (ślepa odczynnikowa), a następnie wykreślić krzywą standardową na papierze milimetrowym na podstawie podanego poniżej przykładu:

A

(absorbancja)

0,400

0,300

0,200

0,100

0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 mg/ ml glukozo-fruktozy

po odczytaniu stężenia w badanych próbkach wypełnić poniższą tabelę:

Czas (t) ( min.)	Stężenie produktu (x)	Stężenie substratu (a – x)	a a-x	a Log a - x	K	V
O
5
10
15
20
25
30
35

Zadanie :

Obliczyć metodą matematyczną i przedstawić graficznie:

1. Zależność szybkości reakcji (v) od czasu (t) dla reakcji I rzędu

2. stałą k dla reakcji I rzędu

-61-

Ćwiczenia XII

VII kolokwium : enzymy i koenzymy

Enzymy - reakcje barwne

I. Oksydoreduktazy:

Katalaza i peroksydaza

Enzymy te są białkami złożonymi, należącymi do hemoprotein. Katalaza występuje głównie w erytrocytach a także w komórkach wątroby i nerek. Enzym ten usuwa toksyczny H₂O₂ ze środowiska reakcji, zapobiega tworzeniu rodnika hydroksylowego, uczestniczy w usuwaniu reaktywnych form tlenu. Katalaza przyspiesza reakcję, w trakcie której jedna cząsteczka nadtlenku wodoru jest dawcą (donorem), zaś druga biorcą (akceptorem ) elektronów. Reakcja utleniania i redukcji przebiega zgodnie z równaniem

H₂O₂ + H₂O₂ → O₂ + 2H₂O

Peroksydaza występuje w erytrocytach, a także komórkach tkanki płuc, tarczycy, trzustki. Enzym ten podobnie jak katalaza uczestniczy w usuwaniu reaktywnych form tlenu. W reakcjach katalizowanych przez ten enzym substratami oddającymi elektrony i protony mogą być różne związki, natomiast akceptorem elektronów jest wyłącznie nadtlenek wodoru .

AH₂ + H₂O₂ → A + 2H₂O

1. Wykrywanie katalazy

Zasada: efektem działania katalazy jest wydzielenie się banieczek gazu - tlenu z nadtlenku wodoru po dodaniu kilku kropli krwi

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: rozcieńczona krew płynem fizjologicznym 1:10

3% H₂O₂

Przygotować dwie probówki do których wlać około 0,5 ml rozcieńczonej krwi . Do pierwszej probówki wlewamy około 1 ml 3% H₂O_2..Pod działaniem katalazy następuje obfite wydzielanie tlenu (banieczki gazu), natomiast drugą probówkę z krwią ogrzewamy do wrzenia, oziębiamy (pod kranem z wodą) i dodajemy 1 ml 3% H₂O_2. Banieczki gazu nie wydobywają się z roztworu, ponieważ enzym uległ dezaktywacji przy zagotowaniu.

2. Wykrywanie peroksydazy

Zasada: katalityczną aktywność peroksydazy można wykryć na drodze przeniesienia tlenu z nadtlenku wodoru na benzydynę, która zostaje utleniona do niebieskiego barwnika.

H₂N NH₂ + 1/2O₂ → NH NH + H₂O

benzydyna benzydyna utleniona

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: rozcieńczona krew płynem fizjologicznym 1:10

CH₃COOH

3% H₂O₂

benzydyna – nasycony roztwór

Do probówki wlać 0,5 ml rozcieńczonej krwi , dodać 1 kroplę kwasu octowego, następnie

5 kropli 3% H₂O₂ i 3 krople benzydyny. Roztwór barwi się na kolor niebieski.

-62-

II.Oksydazy

Oksydazy, są enzymami, które katalizują utlenianie substratu przez odebranie wodoru (protonów i elektronów), przy czym akceptorem wodorów jest tlen atomowy bądź cząsteczkowy. W obrębie komórki tego typu enzymy występują w mitochondriach oraz peroksysomach, a także w siateczce śródplazmatycznej. W mitochondriach akceptorem wodorów jest zawsze tlen atomowy, co prowadzi do powstania wody zgodnie z równaniem:

AH₂ + ½ O₂ → A + H₂O

Wykrywanie oksydazy fenolowej

Zasada: enzym ten katalizuje proces utleniania fenolu. Fenol utlenia się najpierw do pirokatcholu, a następnie do chitonu, który daje pochodne o barwie brązowej.

OH OH O

OH O

fenol pirokatechina o-benzochinon

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: sok – miąższ ziemniaczany

1% roztwór fenolu

Na tarce jarzynowej utrzeć kawałek ziemniaka i trochę miąższu umieścić w probówce, a następnie dodać 10 kropli 1% roztworu fenolu. Po pewnym czasie miąższ ziemniaka przyjmuje zabarwienie brązowe, które z czasem nasila się.

Wykrywanie oksydazy polifenolowej

Zasada: oksydaza polifenolowa katalizuje utlenianie wielofenoli do barwnych chinonów, które dalej kondensują na pochodne, zabarwione żółto lub brązowo. Z pirogallolu powstaje żółta purpurogallina. Enzym ten jest metaloproteidem zawierającymCu ^+2.. Występuje w wielu warzywach i owocach.

OH OH O OH

OH OH OH

OH

pirogallol purpurogallina

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: sok, lub miąższ ziemniaczany

1% roztwór pirogallolu

Utarty na tarce miąższ ziemniaka przenieść do probówki , a następnie dodać 10 kropli pirogallolu. W wyniku reakcji powstaje żółte zabarwienie.

III. Hydrolazy

Hydrolazy są enzymami, które katalizują rozszczepienie substratu przy udziale cząsteczek wody, w wyniku czego z substratu powstają dwa produkty o mniejszej masie cząsteczkowej

Rozkład mocznika pod wpływem urazy.

Zasada: ureaza rozkłada mocznik na dwutlenek węgla i amoniak. Optimum działania enzymu to pH 7,8 – 7,9. W wodnym roztworze CO₂ i NH₃ ulegają kondensacji z utworzeniem węglanu amonowego. Na skutek tej reakcji odczyn reakcji jest zasadowy:

-63-

NH₂

CO + H₂O  CO₂ + 2NH₃ → (NH₄)₂CO₃

+ H₂O

NH₂

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: mocznik

uraza

fenoloftaleina

Do probówki wlać 1 ml mocznika a następnie dodać 1 ml roztworu urazy i 2 krople fenoloftaleiny. Bezbarwny początkowo roztwór czerwienieje po paru minutach.

Hydroliza sacharozy przez inwertazę

Zasada: Inwertaza należy do glikozydaz (podklasa hydrolaz). Enzym ten katalizuje reakcję hydrolizy wiązania pomiędzy α-D-glukopiranozą i β-D-fruktofuranozą w sacharozie, która jest nieredukującym disacharydem. . Enzym ten występuje w drożdżach.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: świeże drożdże

1% roztwór sacharozy

Fehling I i II

Grudkę drożdży rozdrobnić w około 5 ml wody, a uzyskaną zawiesinę drożdży rozdzielić do trzech probówek (1,2,3)

Probówka – 1	Probówka - 2	Probówka - 3
1ml zawiesiny drożdży	1ml zawiesiny drożdży	1ml zawiesiny drożdży
2 ml sacharozy	2 ml wody	zagotować nad palnikiem
Łaźnia wodna 2 minuty	Odstawić do statywu	2 ml sacharozy; odstawić
Reakcja Fehlinga Reakcja dodatnia	Reakcja Fehlinga Reakcja ujemna	Reakcja Fehlinga Reakcja ujemna

Reakcja Fehlinga: do probówki wlać 1 ml Fehlinga I i 1ml Fehlinga II oraz 1 ml z zawartość probówki -1, powtórzyć tę samą czynność z probówkami 2 i 3 . Następnie probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. O obecności cukrów redukujących świadczy pomarańczowo ceglasty osad. Jest to dodatni wynik reakcji Fehlinga.

Reakcja i zabarwienie pierwszej probówki (1) wskazuje na obecność enzymu inwertazy w drożdżach ponieważ nastąpiła hydroliza sacharozy na cukry proste posiadające własności redukujące. W probówce drugiej (2) wykazano ,że sam roztwór drożdży nie zawiera substancji redukujących .Reakcja w próbówce trzeciej (3) wykazała że drożdże posiadają zdolność hydrolizy sacharozy, lecz enzymy biorące udział w tej reakcji ulegają są nieczynne pod wpływem wysokiej temperatury.

-64-

Ilościowe oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą Wolghemuta

Zasada: amylaza śliny to enzym zaliczany do hydrolaz (podklasa glikozydazy) jest aktywowana jonami chlorkowymi. Katalizuje hydrolizę wiązań glikozydowych typu α-1,4 wewnątrz cząsteczek łańcucha polisacharydowego skrobi.

Wyróżniamy: α i β- amylazy

α−amylaza (andoamylaza dekstrynotwórcza) hydrolizuje cząsteczkę skrobi od środka łańcucha, rozrywając wiązania α-1-4-glikozydowe z pominięciem α-1-6 glikozydowych. Powstają wówczas niskocząsteczkowe dekstryny oraz α-maltoza, nie dająca zabarwienia z jodem

β−amylaza (egzoamylaza dekstyrnotwórcza) hydrolizuje co drugie wiązanie α-1-4 glikozydowe, począwszy od końca niealdehydowego, w wyniku czego następuje hydroliza łańcucha skrobi i powstaje β-maltoza i wysoko-cząsteczkowe dekstryny dające zabarwienie z jodem

Oprócz śliny amylaza występuje również w trzustce.

Za jednostkę wzorcową aktywności amylazy przyjmuje się w metodzie Wolghemuta

taką ilość enzymu, które w czasie 30 minut rozkłada do stadium achrodekstryn (nie dających zabarwienia z jodem) 1 mg skrobi

Wynik podaje się w ml 1% skrobi rozłożonej w czasie 30 minut przez 1 ml śliny

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: bufor cytrynianowo-fosforanowy o pH 6,5

1 % roztwór skrobi w 0,9% NaCl

0,02 mol/l J₂w KJ

ślina

Do probówki wlać 1 ml śliny (nie sączonej) a następnie dodać 4 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego i wymieszać. Uzyskuje się w ten sposób 5-cio krotne rozcieńczenie śliny.

W statywie przygotować 10 probówek, do pierwszej wlać 4 ml przygotowanej mieszaniny (ślina z buforem) a do następnych po 2 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego. Z probówki pierwszej pobrać 2 ml mieszaniny i przenieść do probówki drugiej,(wymieszać!). Z drugiej probówki pobrać 2 ml i przenieść do probówki trzeciej i wymieszać! itd. Z probówki dziesiątej odrzucić 2 ml roztworu.

Uzyskuje się w ten sposób następujące rozcieńczenia śliny probówkach:

1 : 5; 1: 10; 1:20; 1 : 40; 1 : 80; 1: 160 itd. Odpowiadają one następującym ilościom śliny w probówkach: 0,4 ; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,012 ml itd.

Wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 38⁰C na 5 minut, po czym do każdej probówki dodać po 2 ml 1 % roztworu skrobi w 0,9% NaCl. Zawartość probówek bardzo dokładnie wymieszać!!!!, i wstawić do łaźni wodnej (38⁰C) na okres 30 minut. Po

upływie tego czasy do każdej probówki wlać po 3 krople J₂w KJ.( zacząć dodawać od probówki w której ślina jest najbardziej rozcieńczona).

Zaobserwować w której probówce reakcja z jodem jest ujemna (stadium dekstryn nie dających zabarwienia za jodem)

Obliczyć aktywność amylazy śliny wyrażając ją liczbą równą ilości ml 1 % roztworu skrobi rozłożonej w ciągu 30 minut.

-65-

Obliczenie wyników - przykład

Przypuśćmy , ze stadium dekstryn nie dających zabarwienia z jodem , wystąpił już w probówce trzeciej. Ilość skrobi 1% w tej probówce równa jest 2 ml, czyli w probówce 3-ciej po 30 minutach nastąpił rozkład 2-ch ml 1% roztworu skrobi. Ponieważ ta probówka zawierała 0,1 ml śliny otrzymujemy proporcję:

0,1 ml śliny rozkłada po 30 minutach → 2 ml 1% skrobi

1 ml śliny rozkłada po 30 minutach → x ml skrobi

2 ml

X = = 20 ml 1 % skrobi

0,1ml

czyli 1 ml śliny rozłożył 20 ml 1% skrobi = 20 mg skrobi w czasie 30 minut.

Aktywność amylazy wynosi więc 20 jednostek.

Ćwiczenie XII

Oznaczanie aktywności aminotransferazy asparaginowej w surowicy krwi

Aminotransferazy są to enzymy przenoszące w sposób odwracalny grupę -NH₂ z aminokwasów na oksokwasy, w wyniku czego pierwotny aminokwas staje się oksokwasem, a wchodzący w reakcję oksokwas – aminokwasem. Głównym związkiem w procesach transaminacji jest 2-oksoglutaran, który jest biorcą grup –NH₂ , z różnych aminokwasów , przy czym staje się sam L-glutaminianem . Możliwa jest również droga odwrotna: przenoszenie grupy –NH₂ z glutaminianu na inne oksokwasy w wyniku czego utworzą się z nich aminokwasy (synteza aminokwasów w ustroju). Reakcja transaminacji dotyczy głównie glutaminianu, asparaginianu i alaniny.

Proces transaminacji stwierdza się prawie we wszystkich tkankach i narządach zwierzęcych Najbogatsze w aminotransferazy są : wątroba, serce, nerki i mięśnie szkieletowe. Enzymy te znajdują się głównie w cytoplazmie komórek, toteż w przypadku ich uszkodzenia bardzo łatwo przenikają do płynu tkankowego i krwi, gdzie obserwuje się duży wzrost ich aktywności

Kilkunastokrotny wzrost aktywności transaminazy asparaginowej obserwowany jest wy

III. Hydrolazy

Hydrolazy są enzymami, które katalizują rozszczepienie substratu przy udziale cząsteczek wody, w wyniku czego z substratu powstają dwa produkty o mniejszej masie cząsteczkowej

Rozkład mocznika pod wpływem urazy.

Zasada: ureaza rozkłada mocznik na dwutlenek węgla i amoniak. Optimum działania enzymu to pH 7,8 – 7,9. W wodnym roztworze CO₂ i NH₃ ulegają kondensacji z utworzeniem węglanu amonowego. Na skutek tej reakcji odczyn reakcji jest zasadowy:

NH₂

CO + H₂O  CO₂ + 2NH₃ → (NH₄)₂CO₃

+ H₂O

Enzymy są wytwarzanymi przez żywe organizmy katalizatorami, które przyśpieszają reakcje chemiczne ale same podczas reakcji nie ulegają zmianie. Enzymy charakteryzują się wysoką specyficznścią, zarówno pod względem katalizowanej reakcji jak i substratów, na które działają.

Klasyfikacja Enzymów

Zgodnie z zaleceniami Komisji Enzymowej Unii Biochemicznej enzymy klasyfikujemy według typu reakcji katalizowanej

Klasa 1 : Oksydoreduktazy – enzymy katalizujące reakcje utleniania i redukcji ( np. dehydrogenaza , reduktaza, oksydaza, oksygenaza, katalaza , peroksydaza)

Klasa 2 : Transferazy - enzymy katalizujące przenoszenie określonych grup pomiędzy poszczególnymi związkami (np. transaladolaza, transketolaza, amino-, peptydylo-,acylo-,metylo-,glukozylo-,fosfotrnsferaza, kineza, fosfomutaza)

Klasa 3 : Hydrolazy - enzymy katalizujące rozkład różnych wiązań chemicznych z udziałem cząsteczki wody (np. esteraza, fosfataza, fosfodiesteraza, nukleaza, rybonukleaza, restryktaza, lipaza, fosfolipaza, glikozydaza amylaza, peptydaza, chymotrypsyna)

Klasa 4 : Liazy (syntetazy) – enzymy katalizujące odłączenie grup od substratu bez udziału cząsteczek wody lub dołączenie grup do wiązań podwójnych ( np. dekarboksylaza, aldolaza, hydrataza, dehydrataza)

Klasa 5 : Izomerazy – enzymy katalizujące reakcje izomeryzacji (np. racemaza, epimeraza)

Klasa 6 : Ligazy (syntetazy) – enzymy katalizujące wytwarzanie wiązań pomiędzy atomami w cząsteczkach substratów (np. karboksylaza, ligaza DNA, polimeraza DNA)

Nomenklatura enzymów

Nazwy systematyczne enzymów składają się z dwóch części z których pierwsza określa typ katalizowanej reakcji, druga zaś wskazuje substraty reakcji . Każdemu enzymowi przypisujemy czterocyfrowy system klasyfikacyjny. Każda z klas dzieli się na podklasy , podklasy dzielą się na pod-podklasy .Ostatnia czwarta cyfra symbolu jest numer porządkowym enzymu w danej pod-podklasie.

Kierunek :Rybactwo

Ćwiczenia V

1.Oczyszczanie białek metodą dializy

D0 zbadania struktury , a także określenia właściwości fizykochemicznych i funkcji, białka muszą być wyizolowane z materiału biologicznego, a następnie poddane procedurze systematycznego oczyszczania W odróżnieniu od związków niskocząseteczkowych, białka nie przechodzą przez błony półprzepuszczalne. W trakcie oczyszczania białka bądź przygotowania materiału biologicznego do różnego typu oznaczeń, zachodzi często konieczność usunięcia z roztworu białka nadmiaru soli (odsolenie) lub niskocząsteczkowych związków organicznych

Do tego celu stosuje się dializę która oparta jest na procesie dyfuzji. Proces dyfuzji zachodzi zawsze w kierunku od wyższego stężenia substancji rozpuszczonej do niższego i prowadzi do wyrównania stężeń w całej objętości roztworu bez nakładu energi. Małe cząsteczki można więc oddzielić od białka metodą dializy przez błonę półprzepuszczalną taką jak błona celulozowa. Cząsteczki o wymiarach znacznie większych niż średnica poru pozostają w woreczku dializacyjnym natomiast jony i mniejsze cząsteczki przechodzą przez pory błony i pojawiają się dializacie na zewnątrz woreczka.

W celu przyspieszenia dializy i możliwie maksymalnego oczyszczenia białek od soli lub innych niskocząsteczkowych związków zmienia się roztwór do którego próbka jest dializowana , a także stosuje się mieszanie.

-2-

Odczynniki:

mleko z dodatkiem NaCL ( 100mg/25 ml mleka ) i glukozy (100mg/25 ml mleka) = roztwór przeznaczony do dializy (A)

10% NaOH

1%CuSO₄

10% α-naftol

stężony H₂SO₄

Fehling I

Fehling II

20 mmol/l AgNO₃

woreczek do dializy

Wykonanie oznaczenia:

• 1.Przygotować 4 probówki do których pobrać po 1 ml roztworu do dializy czyli płynu przeddializacyjnego (A).

• 2. Przygotować woreczek do dializy, mocno związać sznurkiem jeden koniec.

• 3. Do zlewki oznakowanej symbolem B wlać 200 ml wody destylowanej

• 4.Wlać 20 ml roztworu do dializy A do woreczka dializacyjnego i mocno związać jego drugi koniec sznurkiem

• 5. Umieścić napełniony woreczek dializacyjny w zlewce B z wodą destylowaną .

• 6. Zlewkę z napełnionym woreczkiem dializacyjnym umieścić na mieszadle magnetycznym.

• 7. Co 15 minut wylewać płyn dializacyjny (B) ze zlewki do erlenmajereki ( w celu przeprowadzenia analizy) , a zlewkę napełniać 200 ml wody destylowanej przez okres 1,5 godz. Każdorazowo .do czterech probówek pobrać po 1 ml płynu dializacyjnego (B) w celu przeprowadzenia analizy

• 8. Po upływie 1,5 godz . wylać z woreczka dializacyjnego płyn dializowany (C) do erelenmajerki z której pobrać po 1 ml do czterech probówek w celu przeprowadzenia analizy tego płynu.

Analiza roztworu przeznaczonego do dializy (A), dializacynego (B) i dializowanego (C)

- sprawdzenie obecności białka metodą biuretową , potwierdzenie występowania cukru (glukoza i laktoza) reakcją Molischa, potwierdzenie występowania cukru redukującego rekacją Fehlinga, wykazanie występowania jonów chlorkowych.

1.Sprawdzenie obecności białka.

Rreakcja biuretowa Piotrowskiego ,

do 1 ml roztworu przeznaczonego do dializy (A), dializacyjnego (B) i dializowanego (C) dodać 1 ml 10% NaOH oraz 3 krople 1% CuSO_4. W obecności białka roztwór barwi się na kolor fioletowy.

-3-

2.Sprawdzenie obecności cukru.

Reakcja Molischa

Do 1 ml roztworu A, B i C dodać 2 krople α-naftolu. Po dokładnym zamieszaniu ostrożnie po ściance probówki wlać 1 ml stężonego H₂SO_4, tak aby widoczna była granica między cieczami. W miejscu zetknięcia się obu warstw powstaje czerwono-fioletowy pierścień w przypadku obecności cukru.

3.Potwierdzenie występowania cukrowca redukującego

Reakcja Fehlinga. .

Do 1 ml roztworu A, B i C dodać 1 ml odczynnika Fehlinga I i 1 ml Fehlinga II. Zawartość probówek dobrze wymieszać i ogrzać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut W przypadku obecności cukru redukującego powstaje pomarańczowy osad tlenku miedzi (I).

4.Potwierdzenie występowanie jonów chlorkowych.

Do 1ml roztworu A, B i C dodać 1 ml roztworu AgNO₃. Wytrąca się osad chlorku srebra w przypadku występowania jonów chlorkowych w badanych roztworach.

Na podstawie przeprowadzonego doświadczenie:

Porównać jak zmienia się zawartość składników (białka, cukru, jonów chlorkowych roztworze przeznaczonym do dializy (A), dializacyjnym (B) i dializowanym (C).

Ćwiczenie

Zastosowanie chromatografii do rozdziału białek

Chromatografia jest metodą rozdziału, w której składniki mieszaniny ulegają podziałowi między dwie fazy . Jedna z nich jest fazą nieruchomą (stacjonarną ) druga fazą ruchomą .

Fazą nieruchomą może być:

1. ciało stałe (adsorbent, wymieniacz jonowy, lub sito molekularne),

2. ciecz na stałym nośniku (na bibule chromatograficznej, adsorbencie lub wymieniaczu jonowym),

3. żel (będący przeważnie odpowiednio zmodyfikowanymi polisacharydem)

Fazą ruchomą jest najczęściej ciecz zwana solwentem.

Poszczególne składniki rozdzielanej mieszaniny nazywa się solutami. Faza nieruchoma nie zmienia swego położenia w trakcie rozdziału chromatograficznego. W przeciwieństwie do tego faza ruchoma - solwent, przemieszcza się względem fazy nieruchomej.

Do rozdziału chromatograficznego mieszaniny białek jako solwenty są stosowane roztwory buforowe o stałej lub zmieniającej się wartości pH (gradient pH), a także o zmieniającej sile jonowej (gradient siły jonowej). Używane są również różnego typu rozpuszczalniki, będące często mieszaninami związków organicznych. Solwenty są wykorzystane do rozpuszczania mieszanin związków nakładanych na kolumnę , a następnie do selektywnego wymywania czyli eluowania zatrzymanych w fazie stacjonarnej składników.

Znanych jest wiele metod chromatograficznych i można ja klasyfikować według różnych kryteriów

Ze względu na charakter oddziaływania na granicy fazy nieruchomej i ruchomej metody te dzieli się na:

• chromatografię adsorbcyjną i podziałową (w tym chromatografię powinowactwa)

• chromatografię jonowymienną,

• chromatografię żelową ( sączenie molekularne)

Biorąc pod uwagę technikę wykonywania rozdziału, wyróżnia się :

• chromatografię bibułową i cienkowarstwową

• kolumnową.

Uwzględniając z kolei stan skupienia fazy ruchomej, rozróżnia się chromatografię:

• cieczową

• gazową

-2-

Zastosowanie sączenia molekularnego do rozdziału mieszaniny białek od innych związków

Metoda ta służy do rozdziału mieszaniny białek, a także do oddzielenia białek od innych związków. Wykorzystuje ona różnicę w wielkości cząsteczek .W metodzie tej stosuje się kolumny wypełnione wcześniej przygotowanym żelem. Poszczególne żele różnią się rozmiarami ziaren oraz wielkością porów w ich obrębie. Wielkość porów w ziarnach żelu powinna być zbliżona do rozmiarów niektórych cząsteczek wchodzących w skład mieszaniny. Fazę nieruchomą stanowi na przykład woda, która wypełnia pory znajdujące się w obrębie ziaren żelu, fazą ruchomą są roztwory wypełniające przestrzeń pomiędzy ziarnami.

Oddzielenie hemoglobiny od błękitu metylenowego na sicie molekularnym typu Sephadex-G-25

Zasada: Obserwacja rozdziału na sitach molekularnych jest szczególnie łatwa w przypadku oddzielenia dwóch substancji barwnych. Do tego celu można wykorzystać mieszaninę hemoglobiny i błękitu metylenowego. Rozdział tych związków obserwuje się bezpośrednio , na bezbarwnym adsorbencie. Hemoglobina jako związek, którego cząsteczki mają większe rozmiary, niż błękit metylenowy, nie przedostaje się do wnętrza porów ziaren żelu. Wypływa ona wraz z wczesnymi porcjami solwentu (faza ruchoma), pojawiając się w wycieku z kolumny jako pierwsza. Z kolei cząsteczki błękitu metylenowego przedostają się do wnętrza porów ziaren żelu (faza stacjonarna) stąd do ich elucji jest potrzebna większa objętość solwentu.

Odczynniki:hemoglobina ( masa cząsteczkowa 68 KDa)

0,2% błękit metylenowy (masa cząsteczkowa 320 KDa)

sephadex G-25

20 mmol/l NaOH

Wykonanie oznaczenia:

Kolumnę chromatograficzną o wymiarach 12-15 cm wysokości oraz 1 cm średnicy wypełnić wcześniej przygotowanym żelem typu Sephadex G-25 i przelać około 50 ml 20mmol/l roztworem NaOH. Następnie na powierzchnię żelu nałożyć 0,2-0,3 ml mieszaniny zawierającej hemoglobinę i błękit metylenowy. Po nałożeniu próbki, przez kolumnę przelewa się 50 ml 20 mmol/l roztworu NaOH, zbierając równocześnie frakcje o objętości 1ml (przy szybkości wypływu z kolumny 2 ml na jedna minutę, co odpowiada elucji 1 kropli /2-3 s. Przy przechodzeniu przez kolumnę solwentu obserwuje się szybki rozdział hemoglobiny od błękitu metylenowego . Jako pierwsze zbiera się frakcje zawierające hemoglobinę, a następnie frakcje z błękitem metylenowym.

Oddzielenie hemoglobiny od jonów Na⁺ i CL^- na sicie molekularnym typu

Sephadex G-25

Zasada: Sączenie na sitach molekularnych na przykład na żelu typu Sephadex G-25, można wykorzystać do rozdziału mieszaniny białek o bardzo małych masach cząsteczkowych. Żel Sephadex, mający tak małe pory w ziarnach, używa się jednak głównie do usunięcia z mieszaniny białek związków niskocząsteczkowych, takich jak na przykład siarczan amonu lub chlorek sodu. Zastosowanie żelu Sephadex do odsalania można wykazać rozdzielając mieszaninę białek zawierających zawierających hemoglobinę oraz chlorek sodu. Wykorzystanie do tego celu hemoglobiny , ze względu na jej czerwone zabarwienie , ułatwia obserwację umieszczania się białka wzdłuż kolumny.

Hemoglobina jako białko, którego cząsteczki mają większy rozmiar, niż pory w ziarnach żelu nie przedostaje się do ich wnętrza, natomiast przepływa wraz z solwentem pomiędzy ziarnami żelu . Stąd hemoglobina pojawia się w wycieku z kolumny jako pierwsza, w najwcześniej wyeluowanych frakcjach barwnych. Z kolei jony Na⁺ i Cl^- dostają się do wnętrza porów ziaren żelu, stąd do ich eluacji (wymycia) z sita molekularnego jest potrzebna znacznie większa objętość solwentu. Ponadto chlorek sodu jest związkiem bezbarwnym. Dla uwidocznienia przepływu przez kolumnę związków bezbarwnych stosuje się różne metody. Może to być tworzenie barwnych pochodnych, albo wytrącenie osadu.

Występowanie jonów Na⁺ bądź Cl^- jest potwierdzone dopiero we frakcjach zebranych w trakcie rozdziału chromatograficznego. W przypadku rozdziału hemoglobiny od chlorku sodu dla potwierdzenia występowania jonów Cl^- przeprowadza się reakcję z azotanem srebra, w wyniku której zachodzi wytrącanie osadu chlorku srebra.

Schemat rozdziału mieszaniny zawierającej hemoglobinę i chlorku sodu na żelu typu Sephadex G-25.

- ziarna żelu , cząsteczki Hb , jony Na⁺ i Cl^- .

A - obraz po nałożeniu na powierzchnię żelu mieszaniny zawierającej hemoglobinę i NaCl

B - rozdzielenie mieszaniny w trakcie chromatografii

C - obraz po oddzieleniu hemoglobiny

Odczynniki i materiał do badań: mieszanina zawierająca hemoglobinę i NaCl

0,1mol/l roztwór azotanu (V) srebra

Wykonanie oznaczenia:

Kolumnę chromatograficzną o wymiarach 12-15 cm wysokości oraz 1 cm średnicy wypełnić wcześniej przygotowanym żelem typu Sephadex G-25 (2 ml) i przelać 5ml wody destylowanej. Następnie na powierzchnię żelu nałożyć 0,02 ml mieszaniny zawierającej hemoglobinę i chlorek sodu. Po nałożeniu próbki , przez kolumnę przelewa się 5 ml wody destylowanej , (dwu-krotnie) zbierając równocześnie frakcje o objętości 1 ml

W uzyskanych i zabarwionych na czerwono frakcjach oznaczyć ilość hemoglobiny metodą Drabkina (str. 4) Następnie do każdej frakcji otrzymanej z kolumny dodać po 0,2 ml 0,1mol/l roztworu AgNO₃ i zawartość dobrze wymieszać. We frakcjach zawierających jony chlorkowe wytrąca się osad chlorku srebra. Rozdział chromatograficzny prowadzić tak długo , aż w wycieku z kolumny przestanie zachodzić reakcja z AgNO₃, świadcząca o wymyciu jonów chlorkowych. Po zakończonym rozdziale kolumnę należy przemyć ok.100 ml wody destylowanej, nie dopuszczając do „zapowietrzenia „ żelu.

Na podstawie przeprowadzonego doświadczenia :

1.Obliczyć stężenie hemoglobiny w poszczególnych zebranych frakcjach

2. Orientacyjnie określić zawartość jonów chlorkowych na podstawie zmętnienia próbek

Przygotowanie ćwiczenia – „Zastosowanie chromatografii do rozdziału mieszaniny białek

(dla Grażynki)

Przygotowanie mieszaniny zawierającej hemoglobinę i chlorek sodu:

Odwirować 2-3 ml krwi , otrzymane krwinki przemyć dwukrotnie 0.9% roztworem chlorku sodu, a następnie przeprowadzić hemolizę przez 2-3 krotne zamrażanie i rozmrażanie Następnie krwinki wirować przez 10 minut przez okres 10 minut. Do uzyskanego supernatantu zawierającego hemoglobinę dodać taką samą objętość 1,5% roztworu chlorku sodu. Jeżeli mieszanina jest mętna należy ją ponownie odwirować. Na kolumnę nakłada się klarowny roztwór. Można go naturalnie przygotować wcześniej i trzymać w lodówce. (trzeba sprawdzić czy można to zmrażać i odmrażać przed ćwiczeniami)

Należy pamiętać o zestawie do oznaczania hemoglobiny!!!!!!!!

Przygotować : 0,1mol/ Roztwór azotanu (V) srebra

20 mmol/l NaOH

Przygotowanie żelu Sephadex G-25:

Suchy preparat żelu typu Sephadex G-25 należy „zawiesić” na kilka godzin w wodzie destylowanej z dodatkiem azydku sodu NaN₃. W tej postaci przechowuje się zwykle żel w lodówce w temp.4^oC

Sephadex G-25 żel można używać wielokrotnie, pamiętając jednak o jego dokładnym przemyciu po każdym zakończonym rozdziale i zabezpieczeniu antybakteryjnym azydkiem sodu (0.02%). W zależności od stopnia zabrudzenia mycie żelu Sephadex przeprowadza się tylko wodą, bądź 1 molL NaCl a następnie wodą albo też 0,1 mol/l NaOH a następnie wodą.

Kierunek :Rybactwo

Ćwiczenia XII

Enzymy są wytwarzanymi przez żywe organizmy katalizatorami, które przyśpieszają reakcje chemiczne ale same podczas reakcji nie ulegają zmianie. Enzymy charakteryzują się wysoką specyficznścią, zarówno pod względem katalizowanej reakcji jak i substratów, na które działają.

Klasyfikacja Enzymów

Zgodnie z zaleceniami Komisji Enzymowej Unii Biochemicznej enzymy klasyfikujemy według typu reakcji katalizowanej

Klasa 1 : Oksydoreduktazy – enzymy katalizujące reakcje utleniania i redukcji ( np. dehydrogenaza , reduktaza, oksydaza, oksygenaza, katalaza , peroksydaza)

Klasa 2 : Transferazy - enzymy katalizujące przenoszenie określonych grup pomiędzy poszczególnymi związkami (np. transaladolaza, transketolaza, amino-, peptydylo-,acylo-,metylo-,glukozylo-,fosfotrnsferaza, kineza, fosfomutaza)

Klasa 3 : Hydrolazy - enzymy katalizujące rozkład różnych wiązań chemicznych z udziałem cząsteczki wody (np. esteraza, fosfataza, fosfodiesteraza, nukleaza, rybonukleaza, restryktaza, lipaza, fosfolipaza, glikozydaza amylaza, peptydaza, chymotrypsyna)

Klasa 4 : Liazy (syntetazy) – enzymy katalizujące odłączenie grup od substratu bez udziału cząsteczek wody lub dołączenie grup do wiązań podwójnych ( np. dekarboksylaza, aldolaza, hydrataza, dehydrataza)

Klasa 5 : Izomerazy – enzymy katalizujące reakcje izomeryzacji (np. racemaza, epimeraza)

Klasa 6 : Ligazy (syntetazy) – enzymy katalizujące wytwarzanie wiązań pomiędzy atomami w cząsteczkach substratów (np. karboksylaza, ligaza DNA, polimeraza DNA)

Nomenklatura enzymów

Nazwy systematyczne enzymów składają się z dwóch części z których pierwsza określa typ katalizowanej reakcji, druga zaś wskazuje substraty reakcji . Każdemu enzymowi przypisujemy czterocyfrowy system klasyfikacyjny. Każda z klas dzieli się na podklasy , podklasy dzielą się na pod-podklasy .Ostatnia czwarta cyfra symbolu jest numer porządkowym enzymu w danej pod-podklasie.

Kinetyka reakcji enzymatycznych

Badaniem szybkości reakcji chemicznych zajmuje się kinetyka. Poznanie kinetycznych zależności pozwala na podanie szybkości reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu substratu. Szybkość reakcji zależy od wielu różnych czynników, a mianowicie od chemicznej struktury reagujących substancji, od ich stężeń oraz od środowiska w jakim zachodzi reakcja (pH roztworu) od temperatury a także od rodzaju katalizatora jak również od jego aktywatorów bądź inhibitorów.

Zadaniem kinetyki jest ustalenie charakteru reakcji i matematyczne ujęcie zależności między szybkością reakcji , a czasem jej trwania. Poznanie tej zależności pozwala podać szybkość reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu enzymu.

Szybkość reakcji chemicznej jest w każdej chwili proporcjonalna do stężenia substancji reagujących i oznacza stosunek przyrostu stężenia produktu reakcji ( lub ubytku stężenia) do czasu w którym ten przyrost (ubytek) nastąpił.

-2-

x

V =

t

V = szybkość reakcji enzymatycznej

x= stężenie produktu

t = czas (min. sek)

v

t

Zależność szybkości reakcji (v) od czasu (t) dla reakcji I rzędu

W reakcjach I rzędu szybkość reakcji jest funkcja stężenia substratu i można ja przedstawić następująco:

x

V = = k (a –x)

t

= przyrost

v = prędkość

t = czas

a = stężenie substratu

x = stężenie produktu

k = stała reakcji

-3--

powyższy wzór można zapisać jako równanie :

x/ t = k( a-x )

aby wyliczyć k – czyli stała reakcji należy zcałkować powyższe równanie :

1 a 2.303 a

k = ln = x log

t a –x t a - x

aby przejść z logarytmu naturalnego (ln) należy pomnożyć przez 2.303

a

log

a - x

k = 2.303 ^-1

t

k – wyraża się w jednostce odwrotności czasu np. min ^-1, sek ^-1 itd.

a

log

a - x

t

Wykres stałej k dla reakcji I rzędu

-4-

Badanie szybkości reakcji I rzędu i wyznaczenie stałej k na przykładzie hydrolizy sacharozy:

Zasada: sacharoza ulega hydrolizie w środowisku kwaśnym i stopień hydrolizy mierzy się ilością cukrów redukujących pojawiających się w czasie trwania hydrolizy. Oznaczyć można ilość powstającego produktu lub ubytek substratu w trakcie reakcji. Stężenie produktu lub substratu wyraża się w dowolnych jednostkach

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: 0,2% roztwór sacharozy (świeżo sporządzony)

6 M HCL

10% NaOH

0,25% roztwór glukozo-fruktozy( jednakowe ilości glukozy i fruktozy

1% kwas pikrynowy

Przygotować 8 probówek do których wlać po 3 ml 10% NaOH. Zmieszać 5 ml 0,2% sacharozy i 5 ml 6 M HCL i natychmiast !!! po wymieszaniu przenieść 1ml hydrolizatu do pierwszej probówki z roztworem NaOH ( czas t = O). Do kolejnych probówek z 10% NaOH wprowadzać po 1 ml hydrolizatu po upływie: 5, 10, 15, 20, 25, 30 i 35 minut.

Następnie dodać do wszystkich probówek po 2ml 1% kwasu pikrynowego dokładnie wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Po 5 minutach probówki ostudzić i dodać do każdej po 4 ml wody. . próbki są gotowe do pomiaru absorbancji.

Wartość absorbancji oznaczyć przy λ = 530 wobec próbki pierwszej (czas t = O).

Ilości mg glukozo-fruktozy wyzwolonych po określonym czasie hydrolizy odczytać z wykresu sporządzonego na podstawie krzywej standardowej :

Wykonanie krzywej standardowej

Standardy glukozo- fruktozy : 1. – 0,25 mg/ml ; 2- 0,50 mg/ml; 3- 0,75 mg/ml; 4-- 1.00mg/ml i 5 – 1,25mg/ml.

Przygotować próbki zgodnie z poniższa tabelą:

Standard (nr.prob	Standard (ml)	H2O (ml)	10%NaOH (ml)	6M HCL (ml)	1% kwas pikrynowy (ml)	Łaźnia Wodna 100^0C	H2O (ml)
„O”	O	0,5	3	0,5	2	5 min.	4
1	0,1	0,4	3	0,5	2		4
2	0,2	0,3	3	0,5	2		4
3	0,3	0,2	3	0,5	2		4
4	0,4	0,1	3	0,5	2		4
5	0,5	O	3	0,5	2		4

-5-

Oznaczyć wartość absorbancji przy λ = 530 nm wobec próbki „O” (ślepa odczynnikowa), a następnie wykreślić krzywą standardowa na papierze milimetrowym na podstawie podanego poniżej przykładu:

A

(absorbancja)

0,400

0,300

0,200

0,100

0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 mg/ ml glukozo-fruktozy

po odczytaniu stężenia w badanych próbkach wypełnić poniższą tabelę:

Czas (t) ( min.)	Stężenie produktu (x)	Stężenie Substratu (a – x)	a a-x	a Log a - x	K	V
O
5
10
15
20
25
30
35

-6-

Zadanie :

Obliczyć metodą matematyczną i przedstawić graficznie:

1. Zależność szybkości reakcji (v) od czasu (t) dla reakcji I rzędu

2. stałą k dla reakcji I rzędu

Kierunek :Rybactwo

Ćwiczenia XIII

Enzymy - reakcje barwne

I Oksydoreduktazy:

Katalaza i peroksydaza

Enzymy te są białkami złożonymi, należącymi do hemoprotein. Katalaza występuje głównie w erytrocytach a także w komórkach wątroby i nerek. Enzym ten usuwa toksyczny H₂O₂ ze środowiska reakcji, zapobiega tworzeniu rodnika hydroksylowego, uczestniczy w usuwaniu reaktywnych form tlenu. Katalaza przyspiesza reakcję, w trakcie której jedna cząsteczka nadtlenku wodoru jest dawcą (donorem), zaś druga biorcą (akceptorem ) elektronów. Reakcja utleniania i redukcji przebiega zgodnie z równaniem

H₂O₂ + H₂O₂ → O₂ + 2H₂O

Peroksydaza występuje w erytrocytach, a także komórkach tkanki płuc, tarczycy, trzustki. Enzym ten podobnie jak katalaza uczestniczy w usuwaniu reaktywnych form tlenu. W reakcjach katalizowanych przez ten enzym substratami oddającymi elektrony i protony mogą być różne związki, natomiast akceptorem elektronów jest wyłącznie nadtlenek wodoru

AH₂ + H₂O₂ → A + 2H₂O

Wykrywanie katalazy

Zasada: efektem działania katalazy jest wydzielenie się banieczek gazu - tlenu z nadtlenku wodoru po dodaniu kilku kropli krwi

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: rozcieńczona krew płynem fizjologicznym 1:10

3% H₂O₂

Przygotować dwie probówki do których wlać około 0,5 ml rozcieńczonej krwi . Do pierwszej probówki wlewamy około 1 ml 3% H₂O_2..Pod działaniem katalazy następuje obfite wydzielanie tlenu (banieczki gazu), natomiast drugą probówkę z krwią ogrzewamy do wrzenia, oziębiamy (pod kranem z wodą) i dodajemy 1 ml 3% H₂O_2. banieczki gazu nie wydobywają się z roztworu, ponieważ enzym uległ dezaktywacji przy zagotowaniu.

Wykrywanie peroksydazy:

Zasada: katalityczną aktywność peroksydazy można wykryć na drodze przeniesienia tlenu z nadtlenku wodoru na benzydynę, która zostaje utleniona do niebieskiego barwnika.

H₂N NH₂ + 1/2O₂ → NH NH + H₂O

benzydyna benzydyna utleniona

-2-

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: rozcieńczona krew płynem fizjologicznym 1:10

CH₃COOH

3% H₂O₂

benzydyna – nasycony roztwór

Do probówki wlać 0,5 ml rozcieńczonej krwi , dodać 1 kroplę kwasu octowego, następnie 5 kropli 3% H₂O₂ i 3 krople benzydyny. Roztwór barwi się na kolor niebieski.

II Dehydrogenazy

Dehydrogenazy , są enzymami, które katalizują odrywanie atomów wodoru od utlenionego substratu i przenoszą je na inne enzymy czy związki pośrednie, a nie mają zdolności przenoszenia elektronów bezpośrednio na tlen. Sumarycznie reakcję można zapisać równaniem:

AH₂ + B A + BH₂

Wykrywanie dehydrogenazy mleczanowej

Zasada: Aldehyd mrówkowy w reakcji z wodą tworzy wodzian aldehydu, który pod wpływem dehydrogenazy znajdującej się w mleku, może ulec utlenieniu do kwasu mrówkowego:

H

 dehydrogenaza

H  COH + H₂O → H  C  OH → H  COOH

 -2H

OH

Aldehyd mrówkowy wodzian kwas mrówkowy

aldehydu mrówkowego

Błękit metylowy przyłącza uwolnione w powyższej reakcji dwa atomy wodoru, ulegając redukcji do leukozwiązku co objawia się zmiana barwy niebieskiej na bezbarwną.

(dehydrodogeneza mleka znajduje się tylko w świeżym mleku, niepasteryzowanym)

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: mleko niepasteryzowane

0,02% roztwór błękitu metylowego

0,5% aldehyd mrówkowy

Do trzech probówek nalać po 2 ml świeżego mleka, pierwszą probówkę wstawić na 10 minut do wrzącej łaźni wodnej. Wyjąć i ostudzić. Do wszystkich probówek dodać 1 kroplę błękitu metylowego i wymieszać. Do probówki 1 i 2 dodać 1 ml 0,5% aldehydu mrówkowego , do probówki trzeciej 1 ml wody destylowanej. Ostrożnie zmieszać i umieścić probówki w łaźni wodnej o temperaturze 38⁰C. przez okres 30 minut. Zawartość drugiej probówki ulega odbarwieniu.

-3-

II.Oksydazy

Oksydazy, są enzymami, które katalizują utlenianie substratu przez odebranie wodoru (protonów i elektronów), przy czym akceptorem wodorów jest tlen atomowy bądź cząsteczkowy. W obrębie komórki tego typu enzymy występują w mitochondriach oraz peroksysomach, a także w siateczce śródplazmatycznej. W mitochondriach akceptorem wodorów jest zawsze tlen atomowy, co prowadzi do powstania wody zgodnie z równaniem:

AH₂ + ½ O₂ → A + H₂O

Wykrywanie oksydazy fenolowej

Zasada: enzym ten katalizuje proces utleniania fenolu. Fenol utlenia się najpierw do pirokatcholu, a następnie do chitonu, który daje pochodne o barwie brązowej.

OH OH O

OH O

Fenol pirokatechina o-benzochinon

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: sok – miąższ ziemniaczany

1% roztwór fenolu

Na tarce jarzynowej utrzeć kawałek ziemniaka i trochę miąższu umieścić w probówce, a następnie dodać 10 kropli 1% roztworu fenolu. Po pewnym czasie miąższ ziemniaka przyjmuje zabarwienie brązowe, które z czasem nasila się.

Wykrywanie oksydazy polifenolowej

Zasada: oksydaza polifenolowa katalizuje utlenianie wielofenoli do barwnych chinonów, które dalej kondensują na pochodne, zabarwione żółto lub brązowo. Z pirogallolu powstaje żółta purpurogallina. Enzym ten jest metaloproteidem zawierającymCu ^+2.. Występuje w wielu warzywach i owocach.

OH OH O OH

OH OH OH

OH

Pirogallol purpurogallina

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: sok, lub miąższ ziemniaczany

1% roztwór pirogallolu

-4-

Utarty na tarce miąższ ziemniaka przenieść do probówki , a następnie dodać 10 kropli pirogallolu. W wyniku reakcji powstaje żółte zabarwienie.

III. Hydrolazy

Hydrolazy są enzymami, które katalizują rozszczepienie substratu przy udziale cząsteczek wody, w wyniku czego z substratu powstają dwa produkty o mniejszej masie cząsteczkowej

Rozkład mocznika pod wpływem urazy.

Zasada: ureaza rozkłada mocznik na dwutlenek węgla i amoniak. Optimum działania enzymu to pH 7,8 – 7,9. W wodnym roztworze CO₂ i NH₃ ulegają kondensacji z utworzeniem węglanu amonowego. Na skutek tej reakcji odczyn reakcji jest zasadowy:

NH₂

CO + H₂O  CO₂ + 2NH₃ → (NH₄)₂CO₃

+ H₂O

NH₂

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: mocznik

uraza

fenoloftaleina

Do probówki wlać 1 ml mocznika a następnie dodać 1 ml roztworu urazy i 2 krople fenoloftaleiny. Bezbarwny początkowo roztwór czerwienieje po paru minutach.

Hydroliza sacharozy przez inwertazę

Zasada: Inwertaza należy do glikozydaz (podklasa hydrolaz). Enzym ten katalizuje reakcję hydrolizy wiązania pomiędzy α-D-glukopiranozą i β-D-fruktofuranozą w sacharozie, które jest nieredukującym disacharydem. . Enzym ten występuje w drożdżach.

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: świeże drożdże

1% roztwór sacharozy

Fehling I i II

Grudkę drożdży rozdrobnić w około 5 ml wody, a uzyskaną zawiesinę drożdży rozdzielić do trzech probówek (1,2,3)

-5-

Probówka – 1	Probówka - 2	Probówka - 3
1ml zawiesiny drożdży	1ml zawiesiny drożdży	1ml zawiesiny drożdży
2 ml sacharozy	2 ml wody	zagotować nad palnikiem
Łaźnia wodna 2 minuty	Odstawić do statywu	2 ml sacharozy; odstawić
Reakcja Fehlinga Reakcja dodatnia	Reakcja Fehlinga Reakcja ujemna	Reakcja Fehlinga Reakcja ujemna

Reakcja Fehlinga: do probówki wlać 1 ml Fehlinga I i 1ml Fehlinga II oraz 1 ml z zawartość probówki -1, powtórzyć tę samą czynność z probówkami 2 i 3 . Następnie probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. O obecności cukrów redukujących świadczy pomarańczowo ceglasty osad. Jest to dodatni wynik reakcji Fehlinga.

Reakcja i zabarwienie pierwszej probówki (1) wskazuje na obecność enzymu inwertazy w drożdżach ponieważ nastąpiła hydroliza sacharozy na cukry proste posiadające własności redukujące. W probówce drugiej (2) wykazano ,że sam roztwór drożdży nie zawiera substancji redukujących .Reakcja w próbówce trzeciej (3) wykazała że drożdże posiadają zdolność hydrolizy sacharozy, lecz enzymy biorące udział w tej reakcji ulegają są nieczynne pod wpływem wysokiej temperatury.

Ilościowe oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą Wolghemuta

Zasada: amylaza śliny to enzym zaliczany do hydrolaz (podklasa glikozydazy) jest aktywowana jonami chlorkowymi. Katalizuje hydrolizę wiązań glikozydowych typu α-1,4 wewnątrz cząsteczek łańcucha polisacharydowego skrobi.

Wyróżniamy: α i β- amylazy

α−amylaza (andoamylaza dekstrynotwórcza) hydrolizuje cząsteczkę skrobi od środka łańcucha, rozrywając wiązania α-1-4-glikozydowe z pominięciem α-1-6 glikozydowych. Powstają wówczas niskocząsteczkowe dekstryny oraz α-maltoza, nie dająca zabarwienia z jodem

β−amylaza (egzoamylaza dekstrnotwórcza) hydrolizuje co drugie wiązanie α-1-4 glikozydowe, począwszy od końca niealdehydowego, w wyniku czego następuje hydroliza łańcucha skrobi i powstaje β-maltoza i wysoko-cząsteczkowe dekstryny dające zabarwienie z jodem

Oprócz śliny amylaz występuje również w trzustce.

Za jednostkę wzorcową aktywności amylazy przyjmuje się w metodzie Wolghemuta taką ilość enzymu, które w czasie 30 minut rozkłada do stadium achrodekstryn (nie dających zabarwienia z jodem) 1 mg skrobi

Wynik podaje się w ml 1% skrobi rozłożonej w czasie 30 minut przez 1 ml śliny

-6-

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: bufor cytrynianowo-fosforanowy o pH 6,5

1 % roztwór skrobi w 0,9% NaCl

0,02 mol/l J₂w KJ

ślina

Do probówki wlać 1 ml śliny (nie sączonej) a następnie dodać 4 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego i wymieszać. Uzyskuje się w ten sposób 5-cio krotne rozcieńczenie śliny.

W statywie przygotować 10 probówek, do pierwszej wlać 4 ml przygotowanej mieszaniny (ślina z buforem) a do następnych po 2 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego. Z probówki pierwszej pobrać 2 ml mieszaniny i przenieść do probówki drugiej,(wymieszać!). Z drugiej probówki pobrać 2 ml i przenieść do probówki trzeciej i wymieszać! itd. Z probówki dziesiątej odrzucić 2 ml roztworu.

Uzyskuje się w ten sposób następujące rozcieńczenia śliny probówkach:

1 : 5; 1: 10; 1:20; 1 : 40; 1 : 80; 1: 160 itd. Odpowiadają one następującym ilościom śliny w probówkach: 0,4 ; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025; 0,012 ml itd.

Wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 38⁰C na 5 minut, po czym do każdej probówki dodać po 2 ml 1 % roztworu skrobi w 0,9% NaCl. Zawartość probówek bardzo dokładnie wymieszać!!!!, i wstawić do łaźni wodnej (38⁰C) na okres 30 minut. Po

upływie tego czasy do każdej probówki wlać po 3 krople J₂w KJ.( zacząć dodawać od probówki w której ślina jest najbardziej rozcieńczona).

Zaobserwować w której probówce reakcja z jodem jest ujemna (stadium dekstryn nie dających zabarwienia za jodem)

Obliczyć aktywność amylazy śliny wyrażając ją liczbą równą ilości ml 1 % roztworu skrobi rozłożonej w ciągu 30 minut.

Obliczenie wyników - przykład:

Przypuśćmy , ze stadium dekstryn nie dających zabarwienia z jodem , wystąpił już w probówce trzeciej. Ilość skrobi 1% w tej probówce równa jest 2 ml, czyli w probówce 3-ciej po 30 minutach nastąpił rozkład 2-ch ml 1% roztworu skrobi. Ponieważ ta probówka zawierała 0,1 ml śliny otrzymujemy proporcję:

0,1 ml śliny rozkłada po 30 minutach → 2 ml 1% skrobi

1 ml śliny rozkłada po 30 minutach → x ml skrobi

2 ml

X = = 20 ml 1 % skrobi

0,1ml

czyli 1 ml śliny rozłożył 20 ml 1% skrobi = 20 mg skrobi w czasie 30 minut.

Aktywność amylazy wynosi więc 20 jednostek.

Semestr: II

Ćwiczenie XII

Oznaczanie aktywności aminotransferazy asparaginowej w surowicy krwi

Aminotransferazy są to enzymy przenoszące w sposób odwracalny grupę -NH₂ z aminokwasów na oksokwasy, w wyniku czego pierwotny aminokwas staje się oksokwasem, a wchodzący w reakcję oksokwas – aminokwasem. Głównym związkiem w procesach transaminacji jest 2-oksoglutaran, który jest biorcą grup –NH₂ , z różnych aminokwasów , przy czym staje się sam L-glutaminianem . Możliwa jest również droga odwrotna: przenoszenie grupy –NH₂ z glutaminianu na inne oksokwasy w wyniku czego utworzą się z nich aminokwasy (synteza aminokwasów w ustroju). Reakcja transaminacji dotyczy głównie glutaminianu, asparaginianu i alaniny.

Proces transaminacji stwierdza się prawie we wszystkich tkankach i narządach zwierzęcych Najbogatsze w aminotransferazy są : wątroba, serce, nerki i mięśnie szkieletowe. Enzymy te znajdują się głównie w cytoplazmie komórek, toteż w przypadku ich uszkodzenia bardzo łatwo przenikają do płynu tkankowego i krwi, gdzie obserwuje się duży wzrost ich aktywności

Kilkunastokrotny wzrost aktywności transaminazy asparaginowej obserwowany jest wynikuKinetyka reakcji enzymatycznych

Badaniem szybkości reakcji chemicznych zajmuje się kinetyka. Poznanie kinetycznych zależności pozwala na podanie szybkości reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu substratu. Szybkość reakcji zależy od wielu różnych czynników, a mianowicie od chemicznej struktury reagujących substancji, od ich stężeń oraz od środowiska w jakim zachodzi reakcja (pH roztworu) od temperatury a także od rodzaju katalizatora jak również od jego aktywatorów bądź inhibitorów.

Zadaniem kinetyki jest ustalenie charakteru reakcji i matematyczne ujęcie zależności między szybkością reakcji , a czasem jej trwania. Poznanie tej zależności pozwala podać szybkość reakcji w dowolnym czasie i przy dowolnym stężeniu enzymu.

Szybkość reakcji chemicznej jest w każdej chwili proporcjonalna do stężenia substancji reagujących i oznacza stosunek przyrostu stężenia produktu reakcji ( lub ubytku stężenia) do czasu w którym ten przyrost (ubytek) nastąpił.

x

V =

t

V = szybkość reakcji enzymatycznej

x= stężenie produktu

t = czas (min. sek)

v

t

Zależność szybkości reakcji (v) od czasu (t) dla reakcji I rzędu

-2-

W reakcjach I rzędu szybkość reakcji jest funkcja stężenia substratu i można ja przedstawić następująco:

x

V = = k (a –x)

t

= przyrost

v = prędkość

t = czas

a = stężenie substratu

x = stężenie produktu

k = stała reakcji

powyższy wzór można zapisać jako równanie :

x/ t = k( a-x )

aby wyliczyć k – czyli stała reakcji należy zcałkować powyższe równanie :

1 a 2.303 a

k = ln = x log

t a –x t a - x

aby przejść z logarytmu naturalnego (ln) należy pomnożyć przez 2.303

a

log

a - x

k = 2.303 ^-1

t

k – wyraża się w jednostce odwrotności czasu np. min ^-1, sek ^-1 itd.

-3-

a

log

a - x

t

Wykres stałej k dla reakcji I rzędu

Badanie szybkości reakcji I rzędu i wyznaczenie stałej k na przykładzie hydrolizy sacharozy:

Zasada: sacharoza ulega hydrolizie w środowisku kwaśnym i stopień hydrolizy mierzy się ilością cukrów redukujących pojawiających się w czasie trwania hydrolizy. Oznaczyć można ilość powstającego produktu lub ubytek substratu w trakcie reakcji. Stężenie produktu lub substratu wyraża się w dowolnych jednostkach

Wykonanie oznaczenia:

Odczynniki: 0,2% roztwór sacharozy (świeżo sporządzony)

6 M HCL

10% NaOH

0,25% roztwór glukozo-fruktozy( jednakowe ilości glukozy i fruktozy

1% kwas pikrynowy

Przygotować 8 probówek do których wlać po 3 ml 10% NaOH. Zmieszać 5 ml 0,2% sacharozy i 5 ml 6 M HCL i natychmiast !!! po wymieszaniu przenieść 1ml hydrolizatu do pierwszej probówki z roztworem NaOH ( czas t = O). Do kolejnych probówek z 10% NaOH wprowadzać po 1 ml hydrolizatu po upływie: 5, 10, 15, 20, 25, 30 i 35 minut.

Następnie dodać do wszystkich probówek po 2ml 1% kwasu pikrynowego dokładnie wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 minut. Po 5 minutach probówki ostudzić i dodać do każdej po 4 ml wody. . próbki są gotowe do pomiaru absorbancji.

Wartość absorbancji oznaczyć przy λ = 530 wobec próbki pierwszej (czas t = O).

-4-

Ilości mg glukozo-fruktozy wyzwolonych po określonym czasie hydrolizy odczytać z wykresu sporządzonego na podstawie krzywej standardowej :

Wykonanie krzywej standardowej

Standardy glukozo- fruktozy : 1. – 0,25 mg/ml ; 2- 0,50 mg/ml; 3- 0,75 mg/ml; 4-- 1.00mg/ml i 5 – 1,25mg/ml.

Przygotować próbki zgodnie z poniższa tabelą:

Standard (nr.prob.))	Standard (ml)	H2O (ml)	10%NaOH (ml)	6M HCL (ml)	1% kwas pikrynowy (ml)	Łaźnia Wodna 100^0C	H2O (ml)
„O”	O	0,5	3	0,5	2	5 min.	4
1	0,1	0,4	3	0,5	2		4
2	0,2	0,3	3	0,5	2		4
3	0,3	0,2	3	0,5	2		4
4	0,4	0,1	3	0,5	2		4
5	0,5	O	3	0,5	2		4

Oznaczyć wartość absorbancji przy λ = 530 nm wobec próbki „O”(ślepa odczynnikowa), a następnie wykreślić krzywą standardowa na papierze milimetrowym na podstawie podanego poniżej przykładu:

A

(absorbancja)

0,400

0,300

0,200

0,100

0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 mg/ ml glukozo-fruktozy

-5-

po odczytaniu stężenia w badanych próbkach wypełnić poniższą tabelę:

Czas (t) ( min.)	Stężenie produktu (x)	Stężenie Substratu (a – x)	a a-x	a Log a - x	K	V
O
5
10
15
20
25
30
35

Zadanie :

Obliczyć metodą matematyczną i przedstawić graficznie:

1. Zależność szybkości reakcji (v) od czasu (t) dla reakcji I rzędu

2. stałą k dla reakcji I rzędu

Semestr: II

Ćwiczenie XII

Oznaczanie aktywności aminotransferazy asparaginowej w surowicy krwi

Aminotransferazy są to enzymy przenoszące w sposób odwracalny grupę -NH₂ z aminokwasów na oksokwasy, w wyniku czego pierwotny aminokwas staje się oksokwasem, a wchodzący w reakcję oksokwas – aminokwasem. Głównym związkiem w procesach transaminacji jest 2-oksoglutaran, który jest biorcą grup –NH₂ , z różnych aminokwasów , przy czym staje się sam L-glutaminianem . Możliwa jest również droga odwrotna: przenoszenie grupy –NH₂ z glutaminianu na inne oksokwasy w wyniku czego utworzą się z nich aminokwasy (synteza aminokwasów w ustroju). Reakcja transaminacji dotyczy głównie glutaminianu, asparaginianu i alaniny.

Proces transaminacji stwierdza się prawie we wszystkich tkankach i narządach zwierzęcych Najbogatsze w aminotransferazy są : wątroba, serce, nerki i mięśnie szkieletowe. Enzymy te znajdują się głównie w cytoplazmie komórek, toteż w przypadku ich uszkodzenia bardzo łatwo przenikają do płynu tkankowego i krwi, gdzie obserwuje się duży wzrost ich aktywności

Kilkunastokrotny wzrost aktywności transaminazy asparaginowej obserwowany jest wyniku