Seminarium zagadnienia&,'

26. Jakie odczynniki można zastosować do rozerwania wiązań niekowalencyjnych w białkach?

W wyniku denaturacji zniszczona zostaje drugo-, trzecio- i czwartorzędowa struktura białka,

natomiast pierwszorzędowa struktura nie ulega zmianie. Zachowane pozostają mocne wiązania peptydowe,
a zniszczeniu ulegają słabe wiązania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne (jonowe), hydrofobowe oraz mostki disiarczkowe.

Denaturacja białek zachodzi pod wpływem różnych czynników, zarówno chemicznych jak i fizycznych. Zjawisko to obserwujemy pod wpływem:

W zależności od intensywności działania tych czynników (w tym czasu oddziaływania), wielkość zmian denaturacyjnych może być różna, od minimalnych do całkowitego niszczenia oddziaływań stabilizujących konformację białka. Z drugiej strony, jedne białka są bardziej wrażliwe na czynniki denaturujące
(np. lipoproteiny), inne są stosunkowo stabilne (np. albuminy).

Czynniki denaturujące działają na wiązania stabilizujące strukturę przestrzenną białka (wiązania wodorowe, wiązania jonowe, oddziaływania hydrofobowe, wiązania dwusiarczkowe, wiązania koordynacyjne), a przez to powodują zniekształcenie lub zniszczenie struktury II-, III- czy IV-rzędowej, bez hydrolitycznej degradacji łańcucha polipeptydowego.

Odczynniki denaturujące:

  1. Rozpuszczalniki organiczne - stosowane przez dłuższy czas w większych stężeniach i w wyższej temperaturze (20°C – 30°C) dezorganizując warstwę wodną otaczającą cząsteczki białka i osłabiając ich oddziaływania hydrofilowe, umoŜliwiają wzajemne łączenie się cząsteczek białka, a przez to powodują wytrącanie zdenaturowanych białek z roztworów.
    - etanol, aceton, fenol, chloroform CHCl3

  2. Zasady - stężone zasady nieorganiczne powodują denaturację białka, ale większość z nich pozostaje w stanie rozpuszczonym w środowisku zasadowym. Zdenaturowane białko ulega wytrąceniu po zobojętnieniu roztworu.
    - NaOH,

  3. Sole metali ciężkich - białka w pH wyższym od punktu izoelektrycznego posiadają ładunek ujemny, więc mogą reagować z kationami. Białczany, czyli sole metali cięŜkich (Fe+2, Fe+3, Hg+2, Pb+2)
    z białkami mają małe wartości stałych dysocjacji, przez co są trudno rozpuszczalne i wypadają
    z roztworu w formie nierozpuszczalnych kompleksów. Z tego powodu jony metali ciężkich np. rtęci, ołowiu, miedzi są wykorzystywane do wytrącania białek z roztworu.
    - siarczan miedzi IV CuSO4, octan ołowiu (CH3COO)2Pb, chlorek rtęci II HgCl2, chlorek żelaza III FeCl3

  4. Kwasy organiczne - W roztworach poniżej punktu izoelektrycznego grupy aminowe białka ulegają protonowaniu, więc białka obdarzone są ładunkiem dodatnim. Niektóre kwasy organiczne np. kwas trichlorooctowy (CCl3COOH), sulfosalicylowy, pikrynowy i fosfowolframowy, tworzą z nimi nierozpuszczalne połączenia. Białka w obecności 5 powyższych związków ulegają denaturacji i kwasy te wykorzystuje się do odbiałczania roztworów. Odbiałczanie roztworów jest konieczne przy oznaczaniu w nich stężenia niektórych niskocząsteczkowych związków (np. mleczanu czy pirogronianu w surowicy krwi), gdyż pozwala uniknąć reakcji jakie mogłyby dawać białka z odczynnikami stosowanymi do ilościowego oznaczania określonego związku.
    - kwas trichlorooctowy (CCl3COOH), sulfosalicylowy, pikrynowy i fosfowolframowy, podpuszczka


  1. Detergenty

    - SDS siarczan dodecylu sodu – anionowy. detergent (1%-owy roztwór laurylosiarczanu sodu) (aniony SDS wiążą się w stosunku jeden anion na dwie reszty aminokwasowe, nadając powstałemu kompleksowi SDS ze zdenaturowanym białkiem duży ujemny ładunek, który jest znacznie wyższy niż natywnego białka i w przybliżeniu jest proporcjonalny do masy cząsteczkowej białka), Triton (niejonowy surfaktant, eter polimeru glikolu polietylenowego (PEG) i p-tert-oktylofenolu)

  2. Sole chaotropowe (rozpad błon komórkowych i denaturacja białek):
    - r-r 6M chlorowodorku guanidyny GdnHCl , r-r 8M mocznik CO(NH2)2 -> rozpad wiązań wodorowych

  3. Substancje redukujące (mostki disiarczkowe)
    - β-merkaptoetanol (z grupy tioli), Ditiotreitol (DTT – podwójny tiol i diol)

27. Zaproponować procedurę wydzielania białka enzymatycznego z wątroby wieprzowej (z uzasadnieniem kolejności etapów)

Esteraza z wątroby świńskiej (ang. – Pig Liver Esterase, PLE)

Esteraza z wątroby świńskiej (E.C. 3.1.1.1) jest esterazą typu serynowego. PLE jest mieszaniną izoenzymów złożonych z trzech podjednostek α, β i γ, które wykazują różnice w specyficzności substratowej, optimum pH

i enancjoselektywności. Głównymi składnikami PLE są trimery γγγ, αγγ, ααγ, ααα, które można wydzielić
za pomocą elektroforezy w gradiencie pH. Frakcja I składa się tylko z podjednostek γ i wykazuje aktywność cholinoesterazową (hydrolizuje butyrylocholinę), natomiast frakcja V to podjednostki α i preferuje hydrolizę maślanu metylu.
W centrum aktywnym hydrolaz typu serynowego występuje triada katalityczna aminokwasów: seryny, histydyny i kwasu asparaginowego.

PLE nie jest enzymem uniwersalnym. Najlepiej katalizuje reakcje dyssymetryzacji związków prochiralnych lub związków mezo. W wyniku tego typów reakcji z achiralnego substratu otrzymuje się optycznie czynny produkt, o wysokim nadmiarze enancjomerycznym.

1. Rozbicie komórek w celu uwolnienia zawartych w nich białek

- Mechaniczna homogenizacja (liza osmotyczna/cykliczne zamrażanie i odmrażanie/rozbijanie ultradźwiękami)
- Po odwirowaniu nierozpuszczalnych frakcji komórkowych otrzymuje się roztwór białek i innych związków nazywany supernatantem

2. Wydzielenie z lizatu frakcji białkowej

- Wytrącanie frakcji białkowej z roztworów wodnych za pomocą rozpuszczalników organicznych mieszających się z wodą, takich jak aceton lub etanol.

- Dodanie tych rozpuszczalników zmniejsza rozpuszczalność białek w wodzie i powoduje ich wytrącanie.

- Długotrwały wpływ rozpuszczalnika organicznego w temperaturze pokojowej i powyżej powoduje denaturację białka, dlatego wytrącanie prowadzi się w obniżonej temperaturze pomocą uprzednio schłodzonych rozpuszczalników, minimalizując czas kontaktu białekz rozpuszczalnikiem.

3. Wydzielenie frakcji białek posiadających żądaną aktywność katalityczną.

a) Frakcjonowanie roztworami soli

- Dodatek soli w małym stężeniu wpływa korzystnie na rozpuszczalność białek w buforach.
- Duże stężenie soli, szczególnie tych łatwo tworzących wodziany (na przykład siarczan(VI) amonu, sodu lub magnezu) powoduje zmniejszenie rozpuszczalności i wytrącenie białka – proces ten nazywa się wysalaniem.

- Proces ten jest odwracalny i nie powoduje denaturacji białka

b) Metody chromatograficzne

Chrom. jonowymienna - wykorzystuje się zdolność białka obdarzonego ładunkiem elektrycznym do wiązania się z wymieniaczem jonowym. Im większy jest wypadkowy ładunek białka, tym silniej wiąże się ono z fazą stacjonarną i tym później wymywane jest z kolumny za pomocą roztworu NaCl o wzrastającym gradiencie.

Chrom. powinowactwa - wykorzystuje się powinowactwo białka do ligandu osadzonego (immobilizowanego) na fazie stacjonarnej. Ligandem dla enzymu może być substrat lub inhibitor. Metoda ta pozwala na bardzo dokładne oczyszczenie wymaganego enzymu.

Filtracja żelowa - Rozdział białek wykorzystujący różnice w ich budowie i kształcie. Fazę stacjonarną stanowi porowate wypełnienie (na przykład poliakryloamid, dekstran lub agaroza). Mniejsze cząsteczki dyfundują
w pory żelu i są wymywane z kolumny później niż większe. Dostępne są wypełnienia o różnej wielkości porów,
co pozwala na dokładne dobranie warunków rozdziału.

4. Oznaczenie aktywności wydzielonych frakcji.

- Metody spektrofotometryczne

1. Wydzielanie preparatu enzymatycznego PLE

2. Oczyszczanie PLE z preparatu enzymatycznego przez wysalanie

Eksykatory są stosowane w dwóch celach:

  1. do przechowywania pod normalnym ciśnieniem próbek, które są wrażliwe na wilgoć

  2. do ostrożnego odparowywania próbek i następnie przechowywania ich pod próżnią.

Esterazy (EC 3.1) – grupa enzymów z klasy hydrolaz rozkładających wiązania estrowe na kwasy i alkohole.


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Seminarium I zagadnienia
Psychologia Lekarska seminaria-zagadnienia do kolokwiumgr5, 1.Lekarski, I rok, Psychologia, Wykłady
Zagadnienia do seminarium z Układu Pokarmowego
Seminarium XI przykładowe zagadnienia
Zagadnienia obowiązujące na seminarium i kolokwium z neurofizjologii
Seminarium XIII przykładowe zagadnienia
ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA NA SEMINARIUM
Zagadnienia na zaliczenie seminariów I rok R.M. termin kolokwium, Medycyna, WUM i INNE, Fizjologia
Węglowodany zagadnienia seminaryjne i egzaminacyjne seminaria 10 i 11, materiały medycyna SUM, bioch
dodatkowe zagadnienia seminarium nr2
Suwaj zagadnienia na mgr, seminarium samorzad terytorialny
Zagadnienia do seminarium z aminokwasów i białek, Biotechnologia POLSL, Semestr V, Chemia Związków N
ZAGADNIENIA DO SEMINARIUM S3 RECEPTORY
zagadnienia seminaryjne, chemia, chemia organiczna
Zagadnienia do seminariow2012
dodatkowe zagadnienia seminarium nr1
zagadnienia SEMINARIUM ukłda krążenia, Fizjologia, Pomoce, Seminarka, fizjo pytania, krążenie, krąże
Zagadnienia do seminarium III, Ratownictwo medyczne, Ratownictwo
Lista zagadnień, Filologia francuska - TP, SEMINARIA LICENCJACKIE, Językoznawcze

więcej podobnych podstron