26. Jakie odczynniki można zastosować do rozerwania wiązań niekowalencyjnych w białkach?
W wyniku denaturacji zniszczona zostaje drugo-, trzecio- i czwartorzędowa struktura białka,
natomiast pierwszorzędowa struktura nie ulega zmianie. Zachowane pozostają mocne wiązania peptydowe,
a zniszczeniu ulegają słabe wiązania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne (jonowe), hydrofobowe oraz mostki disiarczkowe.
Denaturacja białek zachodzi pod wpływem różnych czynników, zarówno chemicznych jak i fizycznych. Zjawisko to obserwujemy pod wpływem:
Wysokiej temperatury
Stężonych kwasów nieorganicznych i niektórych organicznych
Stężonych zasad nieorganicznych
Wysokich stężeń soli metali ciężkich
Wysokich stężeń rozpuszczalników organicznych
W zależności od intensywności działania tych czynników (w tym czasu oddziaływania), wielkość zmian denaturacyjnych może być różna, od minimalnych do całkowitego niszczenia oddziaływań stabilizujących konformację białka. Z drugiej strony, jedne białka są bardziej wrażliwe na czynniki denaturujące
(np. lipoproteiny), inne są stosunkowo stabilne (np. albuminy).
Czynniki denaturujące działają na wiązania stabilizujące strukturę przestrzenną białka (wiązania wodorowe, wiązania jonowe, oddziaływania hydrofobowe, wiązania dwusiarczkowe, wiązania koordynacyjne), a przez to powodują zniekształcenie lub zniszczenie struktury II-, III- czy IV-rzędowej, bez hydrolitycznej degradacji łańcucha polipeptydowego.
Odczynniki denaturujące:
Rozpuszczalniki organiczne - stosowane przez dłuższy czas w większych stężeniach i w wyższej temperaturze (20°C – 30°C) dezorganizując warstwę wodną otaczającą cząsteczki białka i osłabiając ich oddziaływania hydrofilowe, umoŜliwiają wzajemne łączenie się cząsteczek białka, a przez to powodują wytrącanie zdenaturowanych białek z roztworów.
- etanol, aceton, fenol, chloroform CHCl3
Zasady - stężone zasady nieorganiczne powodują denaturację białka, ale większość z nich pozostaje w stanie rozpuszczonym w środowisku zasadowym. Zdenaturowane białko ulega wytrąceniu po zobojętnieniu roztworu.
- NaOH,
Sole metali ciężkich - białka w pH wyższym od punktu izoelektrycznego posiadają ładunek ujemny, więc mogą reagować z kationami. Białczany, czyli sole metali cięŜkich (Fe+2, Fe+3, Hg+2, Pb+2)
z białkami mają małe wartości stałych dysocjacji, przez co są trudno rozpuszczalne i wypadają
z roztworu w formie nierozpuszczalnych kompleksów. Z tego powodu jony metali ciężkich np. rtęci, ołowiu, miedzi są wykorzystywane do wytrącania białek z roztworu.
- siarczan miedzi IV CuSO4, octan ołowiu (CH3COO)2Pb, chlorek rtęci II HgCl2, chlorek żelaza III FeCl3
Kwasy organiczne - W roztworach poniżej punktu izoelektrycznego grupy aminowe białka ulegają protonowaniu, więc białka obdarzone są ładunkiem dodatnim. Niektóre kwasy organiczne np. kwas trichlorooctowy (CCl3COOH), sulfosalicylowy, pikrynowy i fosfowolframowy, tworzą z nimi nierozpuszczalne połączenia. Białka w obecności 5 powyższych związków ulegają denaturacji i kwasy te wykorzystuje się do odbiałczania roztworów. Odbiałczanie roztworów jest konieczne przy oznaczaniu w nich stężenia niektórych niskocząsteczkowych związków (np. mleczanu czy pirogronianu w surowicy krwi), gdyż pozwala uniknąć reakcji jakie mogłyby dawać białka z odczynnikami stosowanymi do ilościowego oznaczania określonego związku.
- kwas trichlorooctowy (CCl3COOH), sulfosalicylowy, pikrynowy i fosfowolframowy, podpuszczka
Detergenty
- SDS siarczan dodecylu sodu – anionowy. detergent (1%-owy roztwór laurylosiarczanu sodu) (aniony SDS wiążą się w stosunku jeden anion na dwie reszty aminokwasowe, nadając powstałemu kompleksowi SDS ze zdenaturowanym białkiem duży ujemny ładunek, który jest znacznie wyższy niż natywnego białka i w przybliżeniu jest proporcjonalny do masy cząsteczkowej białka), Triton (niejonowy surfaktant, eter polimeru glikolu polietylenowego (PEG) i p-tert-oktylofenolu)
Sole chaotropowe (rozpad błon komórkowych i denaturacja białek):
- r-r 6M chlorowodorku guanidyny GdnHCl , r-r 8M mocznik CO(NH2)2 -> rozpad wiązań wodorowych
Substancje redukujące (mostki disiarczkowe)
- β-merkaptoetanol (z grupy tioli), Ditiotreitol (DTT – podwójny tiol i diol)
27. Zaproponować procedurę wydzielania białka enzymatycznego z wątroby wieprzowej (z uzasadnieniem kolejności etapów)
Esteraza z wątroby świńskiej (ang. – Pig Liver Esterase, PLE)
Esteraza z wątroby świńskiej (E.C. 3.1.1.1) jest esterazą typu serynowego. PLE jest mieszaniną izoenzymów złożonych z trzech podjednostek α, β i γ, które wykazują różnice w specyficzności substratowej, optimum pH
i enancjoselektywności. Głównymi składnikami PLE są trimery γγγ, αγγ, ααγ, ααα, które można wydzielić
za pomocą elektroforezy w gradiencie pH. Frakcja I składa się tylko z podjednostek γ i wykazuje aktywność cholinoesterazową (hydrolizuje butyrylocholinę), natomiast frakcja V to podjednostki α i preferuje hydrolizę maślanu metylu.
W centrum aktywnym hydrolaz typu serynowego występuje triada katalityczna aminokwasów: seryny, histydyny i kwasu asparaginowego.
PLE nie jest enzymem uniwersalnym. Najlepiej katalizuje reakcje dyssymetryzacji związków prochiralnych lub związków mezo. W wyniku tego typów reakcji z achiralnego substratu otrzymuje się optycznie czynny produkt, o wysokim nadmiarze enancjomerycznym.
1. Rozbicie komórek w celu uwolnienia zawartych w nich białek
- Mechaniczna homogenizacja (liza osmotyczna/cykliczne zamrażanie i odmrażanie/rozbijanie ultradźwiękami)
- Po odwirowaniu nierozpuszczalnych frakcji komórkowych otrzymuje się roztwór białek i innych związków nazywany supernatantem
2. Wydzielenie z lizatu frakcji białkowej
- Wytrącanie frakcji białkowej z roztworów wodnych za pomocą rozpuszczalników organicznych mieszających się z wodą, takich jak aceton lub etanol.
- Dodanie tych rozpuszczalników zmniejsza rozpuszczalność białek w wodzie i powoduje ich wytrącanie.
- Długotrwały wpływ rozpuszczalnika organicznego w temperaturze pokojowej i powyżej powoduje denaturację białka, dlatego wytrącanie prowadzi się w obniżonej temperaturze pomocą uprzednio schłodzonych rozpuszczalników, minimalizując czas kontaktu białekz rozpuszczalnikiem.
3. Wydzielenie frakcji białek posiadających żądaną aktywność katalityczną.
a) Frakcjonowanie roztworami soli
- Dodatek soli w małym stężeniu wpływa korzystnie na rozpuszczalność białek w buforach.
- Duże stężenie soli, szczególnie tych łatwo tworzących wodziany (na przykład siarczan(VI) amonu, sodu lub magnezu) powoduje zmniejszenie rozpuszczalności i wytrącenie białka – proces ten nazywa się wysalaniem.
- Proces ten jest odwracalny i nie powoduje denaturacji białka
b) Metody chromatograficzne
Chrom. jonowymienna - wykorzystuje się zdolność białka obdarzonego ładunkiem elektrycznym do wiązania się z wymieniaczem jonowym. Im większy jest wypadkowy ładunek białka, tym silniej wiąże się ono z fazą stacjonarną i tym później wymywane jest z kolumny za pomocą roztworu NaCl o wzrastającym gradiencie.
Chrom. powinowactwa - wykorzystuje się powinowactwo białka do ligandu osadzonego (immobilizowanego) na fazie stacjonarnej. Ligandem dla enzymu może być substrat lub inhibitor. Metoda ta pozwala na bardzo dokładne oczyszczenie wymaganego enzymu.
Filtracja żelowa - Rozdział białek wykorzystujący różnice w ich budowie i kształcie. Fazę stacjonarną stanowi porowate wypełnienie (na przykład poliakryloamid, dekstran lub agaroza). Mniejsze cząsteczki dyfundują
w pory żelu i są wymywane z kolumny później niż większe. Dostępne są wypełnienia o różnej wielkości porów,
co pozwala na dokładne dobranie warunków rozdziału.
4. Oznaczenie aktywności wydzielonych frakcji.
- Metody spektrofotometryczne
1. Wydzielanie preparatu enzymatycznego PLE
Posiekaną wątrobę wieprzową homogenizuje się w młynku w acetonie.
Otrzymaną zawiesinę należy przesączyć przez lejek Schotta (za spiekiem).
Brunatny osad ponownie homogenizuje się w acetonie.
Po ponownym przesączeniu osad homogenizuje się w chlorku metylenu .
Odsączony osad umieszcza się w eksykatorze i najpierw suszy pod zmniejszonym ciśnieniem (pompka wodna), a później pod próżnią (pompa olejowa).
2. Oczyszczanie PLE z preparatu enzymatycznego przez wysalanie
Przygotowuje się próbkę wirową z surowym preparatem enzymatycznym z dodanym buforem fosforanowym o pH 7,20.
Próbki wytrząsa się przez kilka minut i umieszcza w łaźni ultradzwiękowej na kolejne 3 min.
Następnie wiruje się przez 10 min przy 10000 obr/min.
Supernatant zlewa się do zlewki zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne (należy zmierzyć jego objętość) i stopniowo dodaje odpowiednią ilość roztworu siarczanu(VI) amonu doprowadzając do zadanego wysycenia roztworu (rozpuszczalność siarczanu(VI) amonu w wodzie w 4°C wynosi 70.6 g/100 ml)
Proces prowadzi się chłodząc (łaźnia z lodem) przez 1 h. Później wiruje się przez 10 min (10000 obr/min) i suszy osad pod zmniejszonym ciśnieniem.
Eksykatory są stosowane w dwóch celach:
do przechowywania pod normalnym ciśnieniem próbek, które są wrażliwe na wilgoć
do ostrożnego odparowywania próbek i następnie przechowywania ich pod próżnią.
Esterazy (EC 3.1) – grupa enzymów z klasy hydrolaz rozkładających wiązania estrowe na kwasy i alkohole.