REPLIKACJA

Proteom- całkowity, białkowy kompleks komórkowy, którego pojedyncze składniki katalizują i regulują aktywność biochemiczną komórki.

Zagadnienia związane z replikacją genomu:

A.Problem topologiczny- problem wyniknął z konieczności rozwinięcia podwójnej helisy w czasie replikacji w celu otrzymania kopii obu łańcuchów polinukleotydowych wchodzących w jej skład.

B.Problem replikacji- badanie enzymów i białek biorących udział w replikacji zarówno w komórkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych

C.Regulacja replikacji genomu- oraz jej związek z cyklem komórkowym; wykazano, że inicjacja replikacji DNA jest zasadniczym punktem kontrolnym replikacji genomu i tylko ona podlega regulacji.

Struktura plektonomiczna- jej topologia uniemożliwia rozdzielenie łańcuchów wchodzących w skład cząsteczki DNA bez konieczności jej rozwinięcia

Struktura paranemiczna- oba łańcuchy mogą ulec rozdzieleniu przez odciąganie ich od siebie, bez konieczności rozwijania cząsteczki.

Doświadczenie Meselsona i Stahla (1958) → wykazanie, że struktura powstała w replikacji ma charakter semikonserwatywny (jedna nić stara, druga nowa), a nie dsypresyjny (część z nowej, część ze starej w 1 nici) czy konserwatywny (1 cząsteczka z nowych nici, druga tylko ze starych).

Problem topologiczny został rozwiązany w momencie odkrycia topoizmoeraz (25 lat po doświadczeniu Meselsona i Stahla). Topoizomerazy to enzymy odpowiedzialne za katalizowanie reakcji przecinania i łączenia polinukleotydowych łańcuchów DNA. Wyróżniamy 3 typy topoizomeraz:

-Topoizomerazy typu IA- wprowadzają przecięcie do jednego łańcucha polinukleotydowego i przeciskają drugi łańcuch przez utworzoną przerwę. Końce przerwanego ulegają ligacji, liczba skrętów podwójnej helisy ulega zmniejszeniu o jeden.
-Topoizomerazy typu IB- działają w sposób identyczny jak IA, lecz według innego mechanizmu. Różnią się w budowie od IA i prawdopodobnie ewoluowały niezależnie od siebie.
-Topoizomerazy typu II- przecinają jednocześnie oba łańcuchy polinukleotydowe tworząc bramkę, przez którą cały sąsiedni segment podwójnej helisy zostaje przesunięty; zmniejszają liczbę skrętów o dwa.

Topoizomerazy same nie rozwijają podwójnej helisy, natomiast likwidują napięcie torsyjne spowodowane ruchem widełek replikacyjnych, ich działanie umożliwia rozdzielenie podwójnej helisy przez ich odrywanie bez konieczności obrania całej cząsteczki.

ETAPY REPLIKACJI:
1.INICJACJA
-rozpoznanie miejsca/miejsc, od których replikacja się rozpoczyna
2.ELONGACJA
-obejmuje procesy związane z działaniem widełek replikacyjnych podczas kopiowania rodzicielskich łańcuchów
3.TERMINACJA
-kończenie i ostateczne kompletowanie nowych łańcuchów DNA
+tworzenie telomerów

Ilość miejsc inicjacji replikacji:
Bakterie-1
Drożdże-ok.300
Człowiekok.20 000

1.INICJACJA U E.COLI
-miejsce inicjacji- miejsce OriC (długość 245 par zasad) z dwoma charakterystycznymi motywami sekwencyjnymi: 9 i 13-nukleotydowym
-motyw 9-nukleotydowy występuje 5-krotnie → miejsce wiązania białka inicjatorowego DnaA (ok.30 cząsteczek białka się przyłącza do miejsca inicjacji)- samo to białko nie ma możliwości zerwania wiązań wodorowych, ale przypuszcza się, że przyłączenie 30 cząsteczek tego białka powoduje napięcie torsyjne i rozdzielenie w motywie 13-nukleotydowym
-motyw 13-nukleotydowy występuje 3 razy, tandemowo ułożone, bogate w pary AT → miejsce rozdzielenia cząsteczki DNA (gdy cząsteczka DNA zwinięta jest w superzwoje ujemne, konfiguracja typowa dla chromosomu), duża ilość par AT ułatwia pękanie wiązań wodorowych , rozrywanie wspomagane jest także przez białka HU (strukturalne białka chromatyny bakteryjnej)

Rozdzielenie nici helisy → powstanie tzw.oczka → przyłączenie do oczka 2 połączonych białek DnaB (helikaza, rozrywa wiązania wodorowe)-DnaC (przenośnik dla DnaB, uwalniany po jego przyłączeniu) → powstanie kompleksu reinicjacyjnego → DnaB rozpoczyna rozszerzenie obszaru jednoniciowego DNA umożliwiając kolejne dołączenie się enzymów odpowiedzialnych za następny etap- elongacje

2.INICJACJA U DROŻDŻY
-obszary inicjacyjne- sekwencje replikujące się autonomicznie ARS (długość 200 par zasad)
-zawiera 4 subdomeny: A i B1- sekwencja rozpoznawana przez białka inicjacyjne (40 par zasad jest miejscem dołączenia białek kompleksu rozpoznającego ORC- zawiera 6 białek, regulacja replikacji, nie ulega rozpadowi w trakcie replikacji, przyłączone białka pozostają związane z DNA w ciągu całego cyklu komórkowego)
-subdomeny B2 i B3- w ich obrębie zachodzą właściwe procesy inicjacyjne, tu następuje pierwsze rozdzielanie nici podwójnej helisy dzięki napięciu torsyjnemu wywołanemu na skutek dołączenia się dubdomeny B3 czynnika białkowego 1 (ABF1) → tworzenie się oczka → formowanie widełek replikacyjnych → elongacja

3.INICJACJA U EUKARIOTÓW
-nie jest do końca poznana
-jest region inicjacyjny 8kb, który ma dwie charakterystyczne domeny (jedne, ważniejsze, bliżej środka to miejsca, w których inicjacja zachodzi z b.dużą częstością, drugie mniej ważne, rozrzucone po całym obszarze 8kb, gdzie inicjacja zachodzi z mniejszą częstotliwością)
-u wyższych eukariontów stwierdzono obecność wielu genów, których produkty białkowe mają podobne sekwencje aminokwasowe do białek ORC

ELONACJA REPLIKACJI

Widełki replikacyjne zaczynają się przesuwać wzdłuż łańcuchów Dna syntetyzując nowe nici DNA komplementarne do polinukleotydowych nici rodzicielskich.
-w czasie replikacji oba łańcuchy helisy muszą ulec kopiowaniu, polimeraza ma zdolność syntezy DNA tylko w kierunku 5’→3’, więc jedna nić kopiowana jest w sposób ciągły (nić prowadząca), druga w sposób nieciągły (nić opóźniona) w formie krótkich fragmentów, które po zreplikowaniu muszą być złączone w spójną nić potomną.
-polimerazy DNA nie są zdolne do rozpoczynania syntezy na jednoniciowej matrycy, więc aktywna matryca musi mieć choćby krótki region dwuniciowy, dostarczający wolny koniec 3’-OH, do którego enzym może dołączać kolejne nukleotydy. Synteza DNA wymaga obok łańcucha matrycowego obecności starterów

Niektóre polimerazy DNA łączą się z aktywnością co najmniej jednej egzonukleazy (mogą syntetyzować i degradować łańcuchy polinukleotydowe):
-aktywność 3’→5’ egzonukleaz – usuwanie nukleotydów od końca 3’, a więc końca łańcucha aktualnie syntezowanego (aktywność korekcyjna)
-aktywność 5’→3’ egzonukleaz- zdolność do usuwania co najmniej części fragmentów polinukleotydowych wcześniej dołączonych do matrycy (niezbędna u bakterii podczas łączenia fragmentów DNA synt. w procesie replikacji nieciągłej na matrycy opóźnionej)

POLIMERAZY
E.coli
-polimeraza DNA I- także bierze udział w replikacji genomu bakteryjnego, ale jej rola jest tylko rolą wspomagającą proces replikacji (zbudowana z pojedynczych łańcuchów peptydowych)
-polimeraza DNA II (zbudowana z poj. Łańcuchów peptydowych)
-polimeraza DNA III- właściwa polimeraza replikacyjna, wieloskładnikowy zespół białek o masie cząst. 900 kDa, gdzie jej składniki: α, ε(epsilon) i φ (phi) tworzą rdzeń enzymu
α→aktywność polimeryzacyjna
ε→aktywność egzonukleazy 3’→5’ (korekcyjna)
+ dwie podjednostki τ (tau) i γ (gamma)
+podjednostka β – przytrzymuje na matrycy rdzeń polimerazy III z pozostałymi podjednostkami: δ(delta), δ’, χ(chi) i ψ(psi).
Komórki eukariotyczne
-mają aż 5 polimeraza DNA δ- główny enzym replikacyjny, zbudowana z 2 podjednostek, współdziała z białkiem pomocniczym PCNA, które jest odpowiednikiem β → mocno trzyma enzym na matrycy DNA
-polimeraza DNA α- enzym odpowiedzialny za rozpoczynanie replikacji poprzez syntezę starterów
-polimeraza DNA γ- odp. Za replikację genomu mitochondrialnego, sama kodowana jest przez gen jądra komórkowego

SYNTEZA NICI NIECIĄGŁEJ
-początkowe produkty replikacji nici opóźnionej muszą być krótkimi segmentami polinukleotydowymi → fragmenty Okazaki (u bakt. mają długość 1000-2000 nukleotydów, u eukariotycznych są dużo krótsze i nie przekraczają 200 nukleotydów- odcinek ten odpowiada replikacji fragmentu DNA obejmującego poj. nukleosom).

Startery do replikacji DNA zbudowane są zawsze z RNA. U bakt. są syntezowane przez enzym prymazę (polimeraze RNA), która synt. startery przeciętnej długości ok. 5 nukleotydów, w kom. eukariotycznych startery synt. polimeraza DNA α, synt. 10 nukleotydowe startery RNA i dodatkowo wydłuża je przez dołączenie ok. 30-nukleotydowego odcinka DNA.
-synteza startera na nici prowadzącej ma miejsce tylko raz, na nici opóźnionej jest procesem powtarzalnym, zachodzącym przy każdej inicjacji nowego fragmentu Okazaki (u bakt. na 1000-2000 nukleotydów Okazaki powstaje 4000 starterów, w kom. eukariotycznej, gdzie fragmenty te są krótsze, powstaje ich znacznie więcej).

ZJAWISKA W OBRĘBIE WIDEŁEK U BAKTERII
-po dołączeniu się helikazy do miejsca inicjacji, jako kolejny enzym przyłącza się prymasa → kompleks zwany prymosomem, który inicjuje właściwy proces replikacji
-DnaB rozrywa wiązania wodorowe, powstają widełki replikacyjny, a napięcie torsyjne jest likwidowane przez topoizomerazy DNA
-helikazy PriA i Rep są helikazami 3’→5’

Białka SSB- białka wiążące jednoniciowy DNA, pozbawione właściwości enzymatycznej (u bakt.)
Białko RPA – u eukar.
-zamykanie łańcucha polinukleotydowego przez szereg białek ułożonych jedno przy drugim.

Po zreplikowaniu 1000-2000 nukleotydów na nici prowadzącej → synteza na nici opóźnionej → prymaza + helikazy DnaB→ starterowy RNA wydłużany w postaci łańcucha DNA przez polimerazę DNA III → +interakcja z podjednostką β → kontrola przyłączania i odłączania enzymu od matrycy → replisom przesuwa się wzdłuż nici rodzicielskiej (polimeraza III i prymaza + helikazy DnaB) → nowe fragmenty po syntezie →odłączenie się polimerazy III i przyłączenie polimerazy I , która usuwa sekwencje starterowe → ligaza DNA łączy rozdzielone fragmenty Okazaki pozbawione wiązań fosfodiestrowych

Tempo przesuwanie się widełek u eukar. Nadawane jest przez aktywność helikazy. Rozdzielone nici zabezpieczone są przez białka replikacyjny A (RPA). Polimeraza DNA α zawiera aktywność prymazy włączoną na stałe może więc budować startery DNA zarówno na początku nici prowadzącej jak też na początku syntezy każdego fragmentu Okazaki. Nie może katalizować syntezy długich łańcuchów DNA, nie wykazuje zdolności interakcji z białkiem PCNA (wiążącym do matrycy). Jest zastępowana potem przez główny enzym elongacyjny- polimerazę DNA δ. Dwie cząsteczki tej polimerazy pracują oddzielnie, a regulację przyłączania i odłączania się od matrycy opóźnionej (spełnia wieloskładnikowy kompleks białek wspomagających replikację zwany czynnikiem replikacyjny C- RFC, u bakt. kompleks γ pełni tą funkcję). Zakończenie syntezy na nici opóźnionej wymaga usunięcia starterów → endonukleaza FEN1 zasocjowana z kompleksem polimerazy DNA δ. (albo tak ,albo z udziałem dodatkowo RNazy H).

Fabryki replikacyjne- struktury wew.kom., które zawierają setki lub tysiące indywidualnych kompleksów replikacyjnych, związane z jądrową matriks, a cząsteczki DNA podczas replikacji przesuwają si przez te struktury.

TERMINACJA REPLIKACJI
-tempo syntezy DNA pięciokrotnie przekracza szybkość syntezy RNA
-terminacji u E.coli – specyficzne sekwencje terminatorowe (7 takich sekwencji) , rozpoznawane przez białko wiążące się z tymi sekwencjami o nazwie Tus.
- u ekar. Germinacja zachodzi wskutek prostego łączenia się końców nowo syntetyzowanych łańcuchów polinukleotydowych (kompleks nie ulega rozpadowi, bo jest na stałe wbudowany w struktury).

TELOMEROWY DNA
-zbudowany z sekwencji typu minisatelitarnego skupionych w krótkie, powtarzające się sekwencje o motywie podstawowym 5’-TTAGGG-3’, telomery są bogate w pary GC
-kopiowany w procesie replikacji DNA albo powstaje w niezależnym procesie syntezy, katalizowanym przez enzym telomerazę (zawiera łańcuch RNA i element białkowy). Telomeraza może syntetyzować tylko nić bogatą w G.
-białka wiążące telomerowy DNA (TBP, TRF1 w kom. ludzkich) – nadprodukcja tych białek →skracanie telomerów, a mutacja uniemożliwiająca wiązanie TBP z telomerowym DNA → znaczne wydłużanie telomerów niż zwykle.