Biologia molekularna 6

Transkrypcja

Egbert

Piasecki

20-03-2014

Od DNA do białka

Przepływ informacji genetycznej

DNA

 Transkrypcja

CENTRALNY

RNA

DOGMAT

 Translacja

BIOLOGII

Białko

MOLEKULARNEJ

Transkrypcja = Przepisywanie

Translacja = Tłumaczenie

Od DNA do białka

Schemat uzupełniony według obecnego stanu wiedzy:

1) Odwrotna transkrypcja

2) Replikacja RNA

3) Redagowanie RNA

Ekspresja genów

u prokariontów

mRNA – 1 lub kilka białek

(RNA policistronowy

RBS – miejsce wiązania

rybosomu

Ekspresja genów

u eukariontów

Transkrypcja – jądro

Translacja – cytoplazma

mRNA – zwykle

monocistronowy

Dojrzewanie mRNA

Splicing – snRNP (małe

jądrowe
rybonukleoproteiny)

Od DNA do białka

Ekspresja genów

DNA



 

RNA RNA RNA

dużo cząsteczek RNA

        
Wiele cząsteczek białka

Różne geny mają różną ekspresję

RNA

Różnice DNA-RNA



07.1-

RNA_structure.mov

RNA

DNA

komórkowy jest dwuniciowy

RNA

jest zwykle jednoniciowy

RNA

może tworzyć różne formy przestrzenne

RNA

– pośredniczy w przekazywaniu informacji od DNA do białek

– może pełnić funkcje strukturalne

– może pełnić funkcje katalityczne (rybozymy)

Transkrypcja

1.

Rozplecenie

krótkiego

odcinka DNA

2. Jeden z łańcuchów DNA służy jako

matryca

(nić matrycowa) w

syntezie RNA

3.

Transkrypt

– łańcuch RNA powstający podczas transkrypcji

nić kodująca,

sensowna

Różnice między replikacją a transkrypcją:

1. Łańcuch RNA nie jest związany trwale

wiązaniami wodorowymi z DNA

2. Łańcuch RNA jest wypierany z połączenia.

Zostaje odtworzona podwójna helisa DNA

3. Tylko 1 nić ulega transkrypcji  powstający

RNA jest jednoniciowy

4. RNA jest kopią ograniczonego rejonu DNA, zwykle do kilku tys.

nukleotydów

(antysensown
a)

Transkrypcja

Transkrypcję

przeprowadza

polimeraza RNA

Polimeraza RNA:

• rozplata dwuniciowe DNA
• wydłuża łańcuch RNA w kierunku 5’3’
• substraty: trifosforany rybonukleozydów (ATP, CTP, UTP, GTP)

W „bąblu transkrypcyjnym” tworzy się ok. 9-nukleotydowy odcinek hybrydu

DNA/RNA

Transkrypcja

Bardzo szybkie uwalnianie RNA z matrycy DNA umożliwia prawie

równoczesne powstawanie wielu kopii RNA

Transkrypcja rRNA

Polimeraza RNA Formowanie

rybosomów

Czas trwania transkrypcji przeciętnego genu (1500 pz) – ok. 50 s

Liczba polimeraz równolegle transkrybujących przeciętny gen – 15



Ponad 1000 transkryptów na godzinę (teoretycznie, praktycznie mniej)

Transkrypcja

Różnice polimeraza RNA – polimeraza DNA

Polimeraza RNA

Polimeraza DNA

Łączenie

Rybonukleotydy

Deoksyrybonukleotydy

Startery

Nie wymaga

Wymaga startera RNA

Błędy

1 na 10

4

nt

1 na 10

7

nt

Transkrypcja

Główne rodzaje RNA wytwarzanego w komórkach

mRNA – u eukariontów  1 gen = 1 białko

– u prokariontów  często kilka genów = kilka białek

Rodzaj RNA

Funkcja

mRNA

Kodowanie białek

rRNA

Struktura rybosomu, udział w syntezie
białka

tRNA

Udział w syntezie białka

snRNA

Splicing pre-mRNA, transport białek

siRNA,
miRNA

Regulacja aktywności genów

Transkrypcja

Struktura genu:

promotor

terminator

Miejsce startu transkrypcji (pozycja +1)

Miejsce STOP

Inicjacja transkrypcji

 główny punkt kontroli rodzaju i ilości

syntezowanego białka

Różnice w sekwencji promotorów

 regulacja transkrypcji, różnice w

wydajności inicjacji transkrypcji

Transkrypcja u prokariontów

Przebieg transkrypcji:

1.

Rozpoznanie

początku

genu przez

polimerazę

RNA

i ścisłe związanie

z DNA

Polimeraza RNA lekko

asocjuje z DNA i przesuwa
się aż do

miejsca

promotorowego

, z którym

tworzy silny kompleks
(kompleks zamknięty
– ze sparowanym DNA)

Rozpoznanie sekwencji

promotorowych u bakterii
–

podjednostka (czynnik)

sigma ().

Czynnik sigma znacznie zwiększa swoistość

wiązania holoenzymu z miejscami promotorowymi

Promotor zawiera konserwatywne sekwencje wyznaczające miejsce startu

transkrypcji

U eukariontów wiązanie wymaga dodatkowych białek

A

a

Transkrypcja u prokariontów

Przebieg transkrypcji:

2.

Polimeraza RNA rozplata

dwuniciową helisę DNA.
Zwykle ujemne
superzwinięcie sprzyja
transkrypcji. Wyjątkiem
są np. podjednostki gyrazy,
której promotory są
hamowane przez ujemne
superzwinięcie (kontrola
ekspresji genu na zasadzie
sprzężenia zwrotnego).
Początkowe rozplecenie DNA
prowadzi do utworzenia
otwartego kompleksu z
polimerazą. Proces ten
nazywa się ścisłym
wiązaniem

A

a

Transkrypcja u prokariontów

Przebieg transkrypcji:

3.

Jedna z nici służy jako matryca

Początek syntezy RNA:

• bez starterów
• niemal zawsze puryna (G dużo częściej

niż A)

• pierwsze 9 nt bez przesuwania polimerazy
• poronna inicjacja: usunięcie tych 9 nt
• przesunięcie polimerazy  uwolnienie

promotora (min. 1-2 s) = może się
przyłączyć następna polimeraza

Transkrypcja u prokariontów

Przebieg transkrypcji:

4.

Synteza RNA

– wydłużanie łańcucha

(elongacja z szybkością ok. 40 pz/s,
zależnie od sekwencji DNA)

Po zsyntetyzowaniu ok. 10 nt podjednostka

sigma ulega uwolnieniu umożliwiając
przesuwanie się polimerazy

Potrójny kompleks: polimeraza-DNA-RNA

Region rozplecionego DNA – „bąbel

transkrypcyjny”  przesuwa się wzdłuż

DNA. Długość rozplecionego odcinka DNA
jest stała = ok. 17 pz. Hybryd DNA-RNA
– ok. 12 pz

Transkrypcja u prokariontów

Przebieg transkrypcji:

5.

Sygnał terminacji

(STOP) – zakończenie

syntezy RNA i uwolnienie DNA i RNA
– dysocjacja kompleksu transkrypcyjnego,
odtworzenie dsDNA

W miejscu terminacyjnym często struktura

RNA typu spinka do włosów (GC)
+ reszty U. Taka struktura zatrzymuje
polimerazę tzn. transkrypcję

Niektóre sekwencje terminacyjne potrzebują

białka rho (). Białko wiąże się z RNA.

Terminatory zależne od rho mogą mieć

strukturę

spinki, ale nie
mają reszt U

6.

Polimeraza RNA

znowu

łączy się z

podjednostką 



07.2-

transcription.mov

Transkrypcja

Polimeraza RNA Escherichia coli

• Co najmniej 5 podjednostek: , , ’, , 
• Holoenzym:



2

’

• Czynnik  jest uwalniany po inicjacji
• Rdzeń enzymu (



2

’) przemieszcza się wzdłuż DNA

• Wymaga Mg

+2

• Enzym wiąże się bezpośrednio z 16 pz DNA, a pośrednio w sumie z 60

pz

[Większość polimeraz RNA składa się z wielu podjednostek, ale np.

polimerazy RNA bakteriofagów T3 i T7 są monomeryczne (b. wydajne
– do 200 nt/s)]

Transkrypcja

Polimeraza RNA Escherichia coli

• Co najmniej 5 podjednostek: , , ’, , 

Podjednostka 

- kodowana przez gen rpoA, rozpoznawanie

promotorów?

Podjednostka 

- kodowana przez gen rpoB, centrum katalityczne, dwie

domeny: inicjacja transkrypcji i elongacja transkrypcji, hamowanie
aktywności przez antybiotyki ryfampicynę i streptolidyginy

Podjednostka ’

– kodowana przez gen rpoC, wiązanie polimerazy z

matrycą DNA, wiąże dwa jony Zn

+2

, hamowana przez heparynę

Czynnik sigma

– najczęściej 

70

– rozpoznawanie promotora, różne

czynniki sigma mogą rozpoznawać różne promotory

Transkrypcja u prokariontów

Rozmieszczenie miejsc promotorowych – wyznaczają jednoznacznie, która

nić DNA jest nicią matrycową, czyli w jakim kierunku przebiega
transkrypcja

Transkrypcja u prokariontów

Sekwencje prokariotyczne:

Sekwencja „-35”

– TTGACA, region rozpoznawania czynnika sigma

Sekwencja „-10”

– sekwencja 6 pz (TATAAT, TATATT) zwana „kasetą

Pribnowa”. Jest to miejsce inicjacji rozplatania DNA

Miejsce startu

– w 90% puryna, zwykle G

Transkrypcja

Różnice w sekwencji promotora  różnice w wydajności transkrypcyjnej do

1000x

Sekwencja pierwszych 30 zasad podlegających transkrypcji ma wpływ na

szybkość transkrypcji poprzez kontrolę szybkości opuszczania
promotora przez polimerazę RNA. Ujemne superzwinięcie wzmaga
inicjację transkrypcji

Niektóre sekwencje promotorowe wymagają dodatkowych czynników

aktywujących np. CRP (cAMP receptor protein), których związanie
wzmaga wiązanie polimerazy

Transkrypcja

Różne geny mogą mieć

różną orientację

, tzn. są transkrybowane z różnych

nici. Kierunek transkrypcji wyznacza orientacja promotora

U bakterii geny są ułożone blisko siebie. U eukariontów odległość między

genami może wynosić do 100 tys. pz

Transkrypcja

U

prokariontów

rybosomy łączą się z powstającym mRNA (koniec 5’) w

czasie trwania transkrypcji

Transkrypcja

U

eukariontów

transkrypcja i translacja są przestrzennie oddzielone (jądro i

cytoplazma). mRNA dojrzewa w jądrze w czasie trwania transkrypcji:
synteza blokady, tzw. kap (capping) i poliadenylacja. Jeśli występują
introny, to są usuwane. Dojrzały mRNA jest transportowany przez pory z
jądra do cytoplazmy

Dojrzewanie mRNA

Dojrzewanie mRNA:

1.

Przyłączanie kapu do RNA

– do końca 5’ przyłączanie nukleotydu

guaninowego (G) z grupą metylową (wiązanie 5’-5’) – po
zsyntezowaniu 25 nukleotydów, chroni przed działaniem 5’-egzonukleaz

2.

Poliadenylacja

– przyłączanie do końca 3’ tzw. ogona poli(A)

a) enzym przycina
koniec 3’
(w miejscu
określonym przez
specjalną
sekwencję)

b) inny enzym
dołącza nukleotydy
adeninowe (ogon
poli(A) o długości
kilkuset nt)

A

a

Dojrzewanie mRNA

2.

Poliadenylacja

Sygnał poliadenylacji (5’-AAUAAA-3’) + w odległości 11-20 nt 5’-YA-3’ +

sekwencja bogata w GU = miejsce poliadenylacji

Poli(A) – chroni przed działaniem 3’-egzonukleaz, pomaga w translacji

Pre-mRNA histonów nie są poliadenylowane,

ale mają specjalną sekwencję 3’-końcową

Dojrzewanie mRNA

Rola modyfikacji mRNA:

• zwiększenie stabilności mRNA
• znaczenie w transporcie mRNA z jądra do cytoplazmy
• odróżnienie mRNA od innych RNA
• dowód kompletności mRNA dla aparatu translacyjnego

Dojrzewanie mRNA

Geny eukariotyczne są poprzerywane sekwencjami niekodującymi

Dalsze etapy dojrzewania związane są z organizacją genów
eukariotycznych

Wycinanie sekwencji niekodujących – zmniejszenie RNA w znacznym

stopniu, nawet do 5%

• Sekwencje

kodujące

–

eksony

• Sekwencje

niekodujące
–

introny

(80-10000 nt)

Dojrzewanie mRNA

Geny eukariotyczne są poprzerywane sekwencjami niekodującymi

Dojrzewanie mRNA

UTR – region nie ulegający translacji

GT – początek sekwencji końca 5’ intronu (miejsce donorowe)

AG – koniec sekwencji końca 3’ intronu (miejsce akceptorowe)

Sekwencje u
człowieka

R – A lub G

Y – C lub U

A (czerwona) –
punkt
rozgałęzienia
struktury lassa

Dojrzewanie mRNA

Usuwanie intronów z RNA –

splicing

(składanie)

DNA

DNA





Pre-mRNA = transkrypt pierwotny

Pre-mRNA = transkrypt pierwotny





1. Synteza kapu

1. Synteza kapu

2. Splicing

2. Splicing

3. Przyłączenie

3. Przyłączenie

poli(A)

poli(A)

mRNA

mRNA

Sekwencje niezbędne

do rozpoznania
(usunięcia) intronu
– rozpoznawane
przez snRNP
– małe jądrowe
rybonukleoproteiny

Sekwencje rozgałęzienia:

5’-CURAY-3’ (kręgowce)

5’-UACUAAC-3’ (drożdże)

Splicing

Budowa intronu:

Miejsce splicingowe 5’-----------------Miejsce rozgałęzienia----T--Miejsce

splicingowe 3’

 Trakt

polipirymidynowy

Splicing

Splicing:

• główna rola RNA, a nie białek

• snRNA (małe jądrowe RNA) rozpoznają

sekwencje graniczne

• snRNA + białka dodatkowe = snRNP

(small nuclear ribonucleoprotein)

• snRNP: U1, U2, U4, U5, U6 (RNA

bogate w uracyl) – biorą udział w
splicingu

•

spliceosom

spliceosom

– kompleks RNA i białka

przeprowadzający splicing

Splicing

Działanie spliceosomu:

1. Rozpoznanie miejsca rozgałęzienia przez

BBP

(branch-point-binding protein) i U2AF

(białko

pomocnicze)
2. BBP i U2AF są zastępowane przez

U2snRNP

łączące się z miejscem rozgałęzienia
3. U1snRNP łączy się z miejscem

splicingowym 5’

4. Dołącza się U4/U6-U5snRNP

5. Rearanżacja RNA:

a) tworzenie lassa

b) zerwanie nici w miejscu splicingowym
5’

c) zerwanie nici w miejscu splicingowym
3’

d) połączenie dwóch eksonów



07.3-

RNA_splicing_mech.mov

Splicing

Korzyści wynikające z istnienia intronów:

1. Zwiększenie możliwości

rekombinacji eksonów

różnych genów

(kombinacje domen białkowych)

2. Upakowanie większej ilości informacji w każdym genie 

splicing

alternatywny

 powstają różne mRNA = różne białka z tego samego

genu

Alternatywny splicing dotyczy 20-60% ludzkich genów

Splicing

Alternatywny splicing:

Głównie geny związane z układem immunologicznym i nerwowym, 75%
to geny związane z funkcjami przekazywania sygnału w komórce

6

Splicing

Dojrzewanie alternatywne RNA:

1. Alternatywne dojrzewanie końca poli(A)  m.in. różna stabilność mRNA

2. Alternatywny splicing:

a) np. -amylaza w ślinie i w

wątrobie, lekki łańcuch miozyny

b) np. immunoglobuliny –

dalsze poli(A)  białko błonowe,

bliższe poli(A)  białko

wydzielnicze

c) transpozaza elementu P

Drosophila – komórki
somatyczne (intron z kodonem
Stop  nieaktywne białko),

komórki rozrodcze (wycięcie
intronu  funkcjonalny enzym)

d) troponina T szczura

Rola mutacji w regionie splicingu

Transkrypcja

Ostatni etap dojrzewania – swoista metylacja określonych zasad (do 0,1%

A)

Dojrzałe mRNA są selektywnie eksportowane z jądra

W czasie syntezy i dojrzewania RNA powstaje wiele produktów

odpadowych

 Problem: odróżnienie prawidłowego mRNA
 Rozwiązanie: transport z jądra do cytoplazmy jest wysoce selektywny.

Kompleks porowy (pory łączące nukleoplazmę z cytosolem)
rozpoznaje i

transportuje jedynie całkowicie dojrzałe mRNA

Białka kompleksu porowego: białka wiążące ogon poli(A), kompleks
wiążący

kap, białka zaznaczające cząsteczki mRNA, których

splicing został

poprawnie zakończony

Redagowanie RNA

Redagowanie RNA

– zmiana sekwencji pierwotnego transkryptu, niewiele

znanych przykładów

1. U człowieka: apolipoproteina B

• w wątrobie Apo B-100: 4538 aa,

512 kDa

• w jelicie Apo B-84: 2158 aa, 241 kDa

kodon 2158 CU

CAAUAA (kodon Stop)

2. Receptor glutaminowy

AG w komórkach nerwowych

3. Leishmania – cytochrom b mitochondrialny  wprowadzanie reszt U

4. Wirusy: HDV, Ebola

Redagowanie RNA

Redagowanie u wirusów

A. Wirus Ebola

– dwie formy GP

są kolejno produkowane:

1. Produkcja sGP

2. Insercja 7A, zmiana miejsca
kodonu Stop, zmiana fazy odczytu

3. Produkcja GP

B. Wirus Hepatitis D

HDV-RNA koduje 1 białko – HDAg występujący

w 2 formach o przeciwstawnym biologicznie
działaniu:

S-HDAg (Ag-S) – 195 aa (24000, aktywator

transkrypcji i replikacji)

L-HDAg (Ag-L) – 214 aa (27000, hamuje

replikację, bierze udział

w dojrzewaniu wirionu – wiązanie

HBsAg)

Specyficzna mutacja

UAG → UGG zmienia

mRNA dla S-HDAg na mRNA dla L-HDAg

Transkrypcja

Czas istnienia mRNA w komórce  ilość wytwarzanego białka

Różnice w zależności od typu komórki i sekwencji mRNA (przede
wszystkim rejon 3’ nie ulegający translacji)

Średni czas trwania mRNA w komórce:

• bakterie – ok. 3 min.

• eukarionty – od poniżej 30 min. do ponad 10 godz.

Zwykle:

• długi czas trwania mRNA – białka występujące w dużych ilościach

• krótki czas trwania mRNA – białka występujące w małych ilościach, o

zmiennym stężeniu w odpowiedzi na sygnały

Transkrypcja

Różnice w procesach transkrypcji i translacji u prokariontów i

eukariontów

Ewolucja komórek - hipotezy

Hipoteza 1.

Przodek Pro- i Eukariontów

(INTRONY)

Prokarionty

Eukarionty

(UTRATA INTRONÓW)

(INTRONY)

Mały genom  szybka replikacja DNA Proste eukarionty (np. drożdże)

mają mało intronów

Hipoteza 2.

Introny – pasożytnicze ruchome elementy genetyczne, które skolonizowały

genom eukariontów

Hipoteza 3. Najbardziej prawdopodobna

Powstanie intronów umożliwiło powstanie organizmów

wielokomórkowych