Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny
Biochemia I – laboratorium

Ćwiczenie K

Wyznaczanie profilu topnienia DNA z grasicy cielęcej

21.11.2012

1. WSTĘP.

   1. Celem ćwiczenia było wykreślenie profilu topnienia roztworu kwasu deoksyrybonukleinowego z grasicy cielęcej. Roztwór DNA otrzymano podczas wykonywania ćwiczenia J. Celem było również wyznaczenie stężenia oraz czystości badanego DNA, temperatury topnienia
      i przedziału temperaturowego denaturacji badanej próbki DNA, a także stopnia przeprowadzonej denaturacji DNA oraz hipochromizmu punktowego.

2. WYKONANIE I WYNIKI.

   1. Wyznaczenie stężenia oraz czystości badanego DNA

Do dwóch kuwet kwarcowych dodaliśmy po 3 ml 0,1 M roztworu SSC i wyzerowaliśmy spektrofotometr względem tych roztworów. Z kuwety oznaczonej „P” jako próbka wylaliśmy roztwór SSC i dodaliśmy do niej 3 ml otrzymanego roztworu DNA z grasicy cielęcej. Zmierzyliśmy absorbancję przygotowanego roztworu DNA przy długości fali 260 nm oraz 280 nm, wyniki zamieściliśmy w tabeli 1. Znając absorbancję obliczyliśmy stężenie oraz czystość badanego DNA. Wyniki tych obliczeń również zmieściliśmy w tabeli 1.

Tabela 1 Absorbancje, stężenie i czystość badanego DNA

A260	A280	CDNA [mg/ml]	czystość DNA
0,673	0,355	0,03365	1,89821

Stężenie DNA wyliczyliśmy z wzoru:

C_DNA = 0,05 x A₂₆₀ [mg/ml]

Czystość preparatu określiliśmy obliczając stosunek absorbancji przy 260nm i 280 nm
(A₂₆₀/ A₂₈₀).

1. Wyznaczenie temperatury topnienia i przedziału temperaturowego denaturacji badanej próbki DNA

Na powierzchnię roztworów w obu kuwetach ostrożnie nawarstwiliśmy olej parafinowy, aby uniemożliwił on parowanie roztworu DNA podczas ogrzewania. Pod nadzorem asystenta włączyliśmy programy służące do rejestracji zmiany absorbancji w czasie oraz zmiany temperatury w czasie. Rozpoczęliśmy ogrzewanie próbek w spektrofotometrze i jednocześnie obserwowaliśmy zmiany temperatury i absorbancji roztworu DNA przy długości fali 260 nm. Po osiągnięciu przez roztwór DNA temperatury, przy której można zaobserwować maksymalną wartość absorbancji A₂₆₀^kłębka automatycznie zostało wyłączone grzanie próbek i włączone chłodzenie. Programy wciąż rejestrowały zmiany temperatury i absorbancji w czasie teraz dla chłodzonego roztworu DNA. Po osiągnięciu przez roztwór temperatury początkowej Absorbancja próbki po denaturacji jest definiowana jako A^Rn₂₆₀. Pomiary zapisane przez programy zestawiliśmy odpowiednio w tabeli 2.

Tabela 2 Pomiary i wyniki obliczeń

Lp.	T [° C]	A260	ΔA260	Tśr [° C]	ΔAśr	ΔAśr/ΔT $\left\lbrack \frac{1}{C} \right\rbrack$
1	60	0,770995	0,097995	61	0,000331	5,42623E-06
2	62	0,770664	0,097664
3	64	0,770723	0,097723	65	0,001752	2,69538E-05
4	66	0,772475	0,099475
5	68	0,779297	0,106297	69	0,023422	0,000339449
6	70	0,802719	0,129719
7	72	0,834077	0,161077	73	0,045243	0,000619767
8	74	0,87932	0,20632
9	76	0,914092	0,241092	77	0,026121	0,000339234
10	78	0,940213	0,267213
11	80	0,963118	0,290118	81	0,014217	0,000175519
12	82	0,977335	0,304335
13	84	0,990624	0,317624	85	0,004152	4,88471E-05
14	86	0,994776	0,321776
15	88	0,999238	0,326238	89	0,001662	1,86742E-05
16	90	1,0009	0,3279
17	92	1,00128	0,32828	93	0,00053	5,69892E-06
18	94	1,00181	0,32881

Na podstawie tabeli sporządziliśmy wykres:

Wykres 1 Zależność pochodnej absorbancji średniej po temperaturze od temperatury.

Przykładowe obliczenia:

ΔA₂₆₀ = A₂₆₀ − A₂₆₀^RT = 0, 7709 − 0, 6730 = 0, 0979

Gdzie:

A₂₆₀- absorbancja roztworu DNA w danej temperaturze (λ=260nm)

A₂₆₀^RT - absorbancja natywnej formy DNA w temperaturze pokojowej (RT, ang. room temperature)

$$T_{sr} = \frac{T_{1} + T_{2}}{2} = \frac{60\ C + 62\ C}{2} = 61\ C\ \backslash n$$

T_śr- temperatura średnia z dwóch pomiarów

T₁- temperatura pierwszego pomiaru

T₂- temperatura drugiego pomiaru

A₂₆₀^T_sr = |A₂₆₀^T_n−A₂₆₀^T_n + 1| = |0,0979−0,0976| = 0, 0003

Gdzie:

n- krok denaturacji

$$\frac{{A}_{260}^{T_{sr}}}{T} = \frac{0,0003}{61\ C} = 5,42 \times 10^{- 6}$$

Sporządziliśmy też wykres zależności pochodnej absorbancji po temperaturze od temperatury dla wszystkich pomiarów z zakresu od 60 °C do 94 °C.

Wykres 2 Zależność pochodnej absorbancji średniej po temperaturze od temperatury.

Na podstawie tych wykresów odczytaliśmy temperatury topnienia DNA, które wynoszą przy mniejszej liczbie danych 73 °C, natomiast przy wzięciu pod uwagę wszystkich danych 73,72 °C.

Wykonaliśmy również wykres zależności absorbancji od temperatury.

Wykres 3 Zależność absorbancji od temperatury.

Opracowanie tego wykresu było naszym drugim sposobem na wyznaczenie temperatury topnienia DNA, która wynosi ok. 74 °C. Korzystając z linii pomocniczych obliczyliśmy szerokość przejścia, która wynosi ok. 23 °C.

2.3 Obliczenie procentowej wielkości przeprowadzonej renaturacji Rn roztworu DNA

Obliczyliśmy procentową wielkość przeprowadzonej renaturacji roztworu DNA wykorzystując wzór:

$$Rn = \frac{A_{260}^{klebka} - A_{260}^{\text{Rn}}}{A_{260}^{klebka} - A_{260}^{\text{spirali}}} \times 100\%$$

$$Rn = \frac{1,0026 - 0,9036}{1,0026 - 0,6730} \times 100\% = 30,0337\%$$

2.4 Obliczenie hipochromizmu punktowego (przy długości fali 260 nm) H₂₆₀ dla otrzymanej próbki DNA.

Obliczyliśmy hipochromizmu punktowy dla otrzymanej próbki DNA na podstawie wzoru:

$$H_{260} = 1 - \frac{A_{260}^{\text{spirali}}}{A_{260}^{klebka}}$$

$$H_{260} = 1 - \frac{A_{260}^{\text{spirali}}}{A_{260}^{klebka}} = 1 - \frac{0,6730}{1,0026} = 0,3287$$

WNIOSKI

Cele ćwiczenia zostały zrealizowane, za równo denaturacja, jak i denaturacja DNA powiodły się. Czystość preparatu wyniosła 1,898. Na tej podstawie możemy przypuszczać, że jest on zanieczyszczona RNA , jednak nie ma to większego wpływu na pozostałe otrzymane wyniki doświadczenia.

Pod wpływem zwiększającej się temperatury roztworu DNA absorbancja przy 260 nm wzrastała, jest to tak zwany efekt hipochromowy i obserwujemy go na wykresie zależności absorbancji od temperatury (wykres 3). Podczas obniżania temperatury absorbancja maleje, DNA ulega denaturacji.

Z wykresów wyznaczyliśmy wartość temperatury topnienia. Wynosi ona około 74 °C, natomiast szerokość przejścia, którą wyznaczyliśmy z wykresu zależności absorbancji od temperatury wynosi 23 °C.

Wielkość przeprowadzonej renaturacji wyniosła 30,03%, jest ona niewielka. Przyczyną tego może być zbyt szybkie schładzanie roztworu DNA oraz podgrzanie go do temperatury wyższej niż temperatura topnienia.

Hiperchromizm punktowy dla otrzymanej próbki DNA wyniósł H₂₆₀ =0,3287.