WYKORZYSTANIE BIAŁEK BAKTRYJNYCH PATOGENÓW W MEDYCYNIE

Czynniki rozprzestrzeniania (spreading factors):

• zewnątrzkomórkowe enzymy hydrolityczne ułatwiające patogenom rozprzestrzenianie się w organizmie gospodarza i dotarcie do właściwej niszy ekologicznej

• np. proteazy, nukleazy, kolagenazy, hialuronidazy ...

• dużą ich liczbę wytwarzają Staphylococcus i Streptococcus

Streptokoki produkują:

1. streptodornazanukleaza, rozpuszcza wszelkie substancje w ropniach

2. streptokinaza aktywuje plazminogen, przez zmianę jego konformacji, dając plazminę- proteazę serynową, która rozkłada fibrynę w skrzepie i kazeinę w doświadczeniu

substancje pochodzenia bakteryjnego stosowane w medycynie:

1. substancje do terapii terapia przeciwzakrzepowa

• streptokinaza

• streptodornaza

(alteptazarekombinowany tkankowy aktywator plazminogenu)

(preparaty pochodzenia ludzkiego (pochodne aktywatorów plazminogenu tPa i uPa, które są proteazami serynowymi, aktywują na)

• białko Pla z Yersinia pestis, które aktywuje plazminogen na drodze hydrolizy

(próby SOMATYCZNEJ TERAPII GENOWEJ umieszczenie w kom. endothelium genu warunkującego wytwarzanie aktywatora plazminogenu)

strategie aktywacji plazminogenu przez mikroorg.:

-wytwarzanie zewnątrzkom. aktywatora plazminogenu

-przez receptory dla plazminogenu na powierzchni błony lub organelli lub pl zdolne do wyłapywania i wiązania plazminogenu, co doprowadza do jego aktywacji

2. toksyna botulinowa:

w medycynie:

-leczenie zeza

-leczenie przykurczy mięśni - porażenie mózgowe

w kosmetyce:

-wygładzanie zmarszczek BOTOX

• produkowana przez Clostridium botulinum

• egzotoksyna, neurotoksyna

• mieszanina kilku białek (typy A-G), najbardziej toksyczne A,B,E, a C i D toksyczne dla zwierząt

• wrażliwa na wysoką temperaturę i na wysokie zasolenie

• blokuje wydzielanie acetylocholiny w synapsach, powoduje rozluźnienie mięśni

3. dekstran:

- środek zastępczy krwi płyn, który przetacza się do krwi, aby przywrócić objętość krwi, aby małe naczynia włosowate się nie zapadły

• polimer o wysokim ciężarze cząsteczkowym, składnik śluzu Leuconostoc mesenteroides

4. wykorzystanie rekombinowanych białek: insulina, szczepionki podjednostkowe

Łatwa procedura i niskie koszty powodują, że systemy bakteryjne i drożdżowe to najczęściej stosowane systemy ekspresyjne.

Po transformacji odpowiednich szczepów i hodowli w małej objętości, identyfikujemy klony wykazujące znaczny poziom ekspresji produkowanego białka. Na tej podstawie wybieramy odpowiedni system ekspresyjny. Ostatnim etapem jest oczyszczanie białka z wykorzystaniem metod chromatograficznych. Czystość uzyskanych preparatów jest potwierdzana przez analizy SDS-PAGE i HPLC.

5. Immunotoksyny: - leczenie niektórych form nowotworów

Immunotoksynami nazywamy połączenia przeciwciał monoklonalnych z toksynami. Zasada działania takich koniugatów polega na tym, że po przyłączeniu się do danego antygenu (np. na powierzchni komórki nowotworowej) toksyna może niszczyć komórkę niosącą ten antygen. W ten sposób mogą być niszczone określone komórki bez szkody dla innych komórek organizmu.

Przciwciałorozpoznaje kom. docelową

Toksynazabija

ĆWICZENIE:

Cel: Wykazanie aktywności sklonowanego w kom. E coli genu streptokinazy

1.Przygotowanie konstruktów

• gen sck sklonowany i zsekwencjonowany

• stanowi niezależną jednostkę transkrypcyjną

• na końcu aminowym znajduje się peptyd synałowy, odcinany w czasie wydzielania przez komórkę, rejon środkowy genu jest niezbędny do aktywności białka

1. Utworzenie banku genowego DNA z wykorzystaniem wysokokopijnych plazmidów pTZ19R

2. Znalezienie klonów kazeino litycznych

3. Przeklonowanie genu skc do pBR322 otrzymując dużo bardziej stabilny plazmid rekombinacyjny pSB1

w tym plazmidzie

gen skc wyrażany z własnego promotora

P ATG. skc T

Białko peryplazmatyczne, kolonie mukoidalne

Skc+

4. Fragment DNA pSB1 sklonowano w pUC18 gdzie jest LacZ

FUZJA TRANSKRYPCYJNA

w tym plazmidzie p8

P.laktozowy ATG skc T

ekspresja genu skc pod kontrolą promotora lac

Białko peryplazmatyczne, kolonie mukoidalne

Skc+

5. Skonstruowanie FUZJI TRANSLACYJNEJ genu lacZ i skc, powstaje plazmid rekombinacyjny pKH2

w tym plazmidzie

P ATG lacZ skc T

Białko cytoplazmatycznebrak sekw. sygnałowej, fuzja z beta-galaktozydazą-> oba geny w jednej ramce odczytu, kolonie niemukoidalne

ĆWICZENIE: Test szalkowy wykazujący aktywność streptokinaz:

streptokinaza-plazminogendegradacja kazeinystrefy przejaśnienia wokół koloni wytwarzających streptokinazę, obserwacja mukoidalności koloniiwynik peryplazmatycznej lokalizacji streptokinazy

pSB1/E. coli

warstwa dolna LB + Tc//warstwa górna LB + mleko + plazminogen

Obserwacje: kolonie śluzowate- białko peryplazmatyczne, słabe przejaśnienia dookoła kolonii, nie dookoła wszystkich kolonii są przejaśnienia to jest efekt małej wydajności promotora Streptococcus w E. coli

p8/E. coli

warstwa dolna LB + Amp//warstwa górna LB +mleko + plazminogen

Obserwacje: kolonie śluzowate, są przejaśnienia, podrost wynika ze skorzystania z beta-laktamazy innych bakterii

pKH2/E. coli

warstwa dolna LB + Amp//warstwa górna LB + mleko + plazminogen

Obserwacje: obecność przejaśnień, brak śluzowatego wyglądu

kontrola - Bluescript mleko + plazminogen - kontrola negatywna, brak przejaśnień.

SZCZEPIONKI NOWEJ GENERACJI:

Z ćwiczeń 3 Szczepionki:

atenuowane np. przez delecję genów odpowiedzialnych za wirulencję

zabite mikroorganizmy

białka

Zalety atenuacji (musimy mieć pewność, że atenuacja jest nieodwracalna):

Indukcja intensywniejszej odpowiedzi imm., zabite org, indukuję bardzo słabą

Stosowanie atenuowanych organizmów do przeniesienia antygenów innych patogenów

odwrotna wakcynologia

mamy sekwencję genomu-> analiza in silico program wykrywa geny kodujące białka powierzchniowe

WYKORZYSTANIE BAKTERII MLEKOWYCH JAKO NOŚNIKA ANTYGENU:

-atenuowane bakterie mlekowe

-antygen wklonowany do DNA bakterii mlekowych

-antygen powinien ulegać ekspresji promotory konstytutywne lub indukowalne

-antygen powinien być wydzielany na zewnątrz komórkipowinien mieć sekwencję sygnałową

-antygen może być albo na plazmidzie (w wielu kopiach-plazmidy wielokopijne)

-antygen może być na chromosomie (+silny promotor)

rozważa się użycie bakterii LAB jako nośników antygenów

Izolacja genów kodujących determinanty patogenezy

Listeria monocytogenes:

• Organizm modelowy w badaniach nad odp. imm. generowaną wewnątrzkom.

• Izolacja i charakterystyka mutantów insercyjnychokreślenie funkcji i lokalizacji genów kodujących determinanty patogenezy

• Determinanty patogenezy Listeria:

-listeriolizyna O (LLO, gen hly, egzotoksyna, główny czynnik wirulencji, z rodziny hemolizyn)

-fosfolipaza

1. Listeria wnika drogą pokarmową (odporna jest na działanie HCl i enzymów trawiennych)

2. Przylega do komórki (adhezyny, internaliny)

3. Przenika do kępek Peyera, ma internalinę, która wywołuje fagocytozę

4. Wydzielając listeriolizynę O doprowadza do lizy błony, ucieka się z wakuoli unikając strawienia

5. białko ActA odpowiedzialne jest za ruch - pozwala na kontrolowaną, ukierunkowaną polimeryzację cząsteczek aktyny gospodarza - powstaje tzw. kometa misteryjna

6. Wypustka komórki jest fagocytowana przez sąsiadującą komórkę lub innego makrofaga - Listeria jest teraz zamknięta w wakuoli o podwójnej błonie

7. Bakteria wydostaje się z podwójnej wakuoli z pomocą fosfolipaz oraz LLO

Peptydy Listerii pojawią się zarówno w MHC I, jak i w MHC II, co pozwala na:

1. Aktywację limfocytów Th (CD4+)

niektóre komórki Listeria zostają strawione w wakuoli komórek APC -> obróbka peptydu i transport do MHC II -> APC prezentuje antygen limfocytom Th, które stymulują LiB do produkcji przeciwciał

2. Aktywację limfocytów Tc (CD8+)

w cytozolu Listeria produkuje pewne białka, które ulegają proteolizie -> peptyd jest transportowany do MHC I -> zarażona komórka prezentuje peptyd Tc, który niszczy zarażoną komórkę (produkcja perforyn i granzymów) oraz powstaje pamięć immunologiczna

Wykorzystanie w szczepionkach antygenów zewnętrznych (MHC I)(nukleoproteina wirusa grypy NP), antygeny powierzchniowe- najbardziej zmienne=> szczepionki stają się nieskuteczne

Wykorzystanie białek wewnętrznych => są lepsze, bo stabilniejsze!!!

Sposoby atenuacji:

osłabienie szczepu=> mutageneza=> pasażowanie

Szczepionka nowej generacji (chromosom Listeria + obce antygeny np. nukleoproteiny wirusa grypy...antygeny nowotworowe=> szczepionki przeciwnowotworowe)

Przewaga szczepionek nowej generacji nad starymi.

Użycie bakterii patogennej

niepatogennej z czynnikami patogenezy

WYSPY PATOGENNOŚCI- Kodują zespół czynników wirulencji, na chromosomie lub plazmidzie

Wykorzystanie B. Subtilis jako nośnika antygenów:

zawiera wklonowany do kasety SPAC gen kodujące hemolizynę L. monocytogenesnabycie cech patogenazdolność do wnikania do komórki

doklonowanie do kasety genu kodującego białko przeciw któremu chcemy wywołać odpowiedź immunologiczną

ĆWICZENIE:

1.Izolacja DNA B.subtilis

Zwirować nocną hodowlęzlać supernatantosad zawiesić w SSC (NaCl+cytrynian sodu)zwirowaćzlać supernatantosad zawiesić w buforze lizującym (bufor fosforanowy+sacharoza+lizozym)inkubowaćdodać roztworu lizującego ściany mureinowe (Tris+EDTA+SDS)inkubować w 37inkubować w 75stopniachpróbkę zworteksować i wirowaćpobrać supernatantdodać do supernatantu bufor ORANGE-DX i wymieszaćmieszaninę przenieść do minikolumnywirowaćwyrzucić przesączumieścić minikolumnę w probówce odbierającejdodać buforu płuczącego Wash-DX->wirowaćznowu wylaćwirować w celu usunięcia resztek buforu płuczącegominikolumnę umieścić w sterylnym eppendorfiedodać buforu Elution-DXpozostawic ją na 2 min w temp. Pokojowej zwirować i mamy!

Składniki PCR:

-matryciwy DNA nasz preparat

-dNTP roztwór trinukleotydów

-sekw. Flankujące interesujące nas geny prawy i lewy primer

-termostabilną polimerazę

-woda dejonizowana

-bufor

Analiza produktów PCR:

Do probki dodać barwniknanieść do dołkównałożyć wzorzecrozdzielać w żelu agarozowymżel zabarwić bromkiem etydyny

KREW+TOKSYNY BAKTERYJNELIZA

Określenie aktywności hemolitycznej supernatantu pohodowlanego:

Przygotowanie krwi baranka:

Odpłukanie osocza od erytrocytów

-krew zawiesić w PBS(sól fizjologiczna buforowana)zwirowaćodrzucić supernatantkrwinki zawiesić w PBSpłukać 3 razy

Przygotowanie próbek do testu

PBS+zawiesina erytrocytów preinkubować

Do probówek z erytrocytami i PBS dodać supernatant znad badanych szczepów

Inkubować zwirować probki supernatant rozcieńczyć 10xZmierzyć absorbancję (ślepa próba=kontrola -)

Obliczenie aktywności w jednostkach hemolitycznych:

Absorbancja kontroli - = 0 jednostek

Absorbancja kontroli+ (SDS)=100 jednostek hemolitycznych

Np.

1.347 - 100 j.h.

0 - 0 j.h.

0.01347 - 1 j.h.

0.061 - x j.h. x=4.5 j.h

OPATRUNEK FAGOWY

Fagi:

• Wewnątrzkomórkowe pasożyty bakterii zdolne do reprodukcji w innych komórkach

• Pozbawione własnego metabolizmu (nie syntezują zw.drobnocząsteczkowych i nie mogą syntezować ani pobierać energii)

• Odkrywcy fagów: Frederick Twort i Felix D'Herelle (wprowadził pojęcie bakteriofag i terapia fagowa)

• Maisin wyleczył w 1921 zakażoną gronkowcami skórę

• D'Herelle zastosował fagi do walki z czerwonką, cholerą, dżumą, tyfusem, infekcjami skórnymi

Wzrost szczepów antybiotykoopornych-powrót do terapii fagowych.

Projekty badawcze:

walka z paciorkowcami jelitowymi opornymi na wankomycynę, które zabijają chorych na nowotwory i AIDS

walka z Salmonella,Shigella i E.coli w produktach mięsnych i drobiowych

krople do oczu przeciwko zakażeniom gronkowcowym

walka z bakteriami MRSA (odporne na antybiotyki S.aureus)

wniosek o patent bandaża PhagoBioDerm

BAKTERIOFAGI:

2 postaci:

-faza wegetatywna (wewnątrzkomórkowa)- nie widać go

-faza spoczynkowa - obserowalny

Swoistość względem gospodarza:

Adsorpcja cząsteczek fagowych odbywa się z udziałem odpowiednich białek fagowych i receptorów komórkowych np. receptor faga lambda łączy się z białkiem LamB E.coli.

Brak receptora dla fagaoporność na bakteriofaga

Mechanizmy zmieniające swoistośc (warunkujące oporność bakterii)

1. Mutacje bakterii w wyniku których zmieniają się białka receptorowe

2. Mutacje faga warunkujące adhezhę do zmienionych receptoró

3. Restrykcje i modyfikacje

\mycobacterium smegmatis z fagiem może służyć jako wektor w leczeniu gruźlicy

Na 1 bakterie przypada 10 fagó

10^30- ilość bakterii na Ziemii

10^31- ilość fagó na Ziemii

Dobre źródło fagó:

Ścieki komunalne, wody, studzienki

RÓŻNICE MIĘDZY ANTYBIOTYKAMI A BAKTERIOFAGAMI

Antybiotyk musi być podawany ciągle, natomiast liczba fagó wzrasta, aż do momentu kiedy zaobserwujemy wyleczenie pacjenta

MOC fagowa preparatu: ILOŚĆ CZĄSTEK FAGOWYCH/ML

Opatrunek fagowy musi mieć dużą powierzchnię kontaktu ze skórą(płyny, galaretki), stosuje się szkielety organiczne np. substancje żelowe. Moc opatrunku bada się przez obserwacje stref zahamowania wzrostu.

WYKONANIE OPATRUNKU FAGOWEGO:

1.Znaleźć bakterie, wyizolować ją w stanie czystym

2.Dobrać bakteriofaga, oczyścić, namnożyć

3.Nanieść go na ranę

CEL:Przygotowanie opatrunku fagowego:

opatrunek fagowy w postaci immobilizowanej w ŻELU AGAROZOWYM zawiesiny fagowej

opatrunek w postaci immobilizowanej w ŻELU AGAROZOWYM zawiesiny fagowej umieszczonej na nośnikuGAZA

opatrunek w postaci nasączonego zawiesiną faga nośnika organicznego - GAZA

Kontrole:

• Kontrola negatywna KO zamiast zawiesiny faga RF

• Kontrola pozytywna(antybiotykowa) K1 RF+antybiotyk (np.1 mikrogram x ml^-1)

1.Krzywa lityczna:

-hodowle bakterii zaszczepić zawiesiną faga

-określić OD startowe

-hodowlę prowadzić przez dwie godziny, OD mierzyć co 30 minut

-określić miano faga i ilość bakterii w hodowli dwugodzinnej

-zwirować bakterieSUPERNATANT (źródło fagów)

2.Izolacja specyficznych fagów

• Próbkę gleby (źródło faga)dodajemy do hodowli bakteryjnej

• Inkubacja 37 prze dwa dni

• 1ml zbieramy, wirujemy, zbieramy supernatant

• dodajemy chloroform do supernatantu, worteksujemy

• wirujemy

• Określić miano faga w rozcieńczeniu -1 i -6 na szalkach duwarstwowych

• Inkubować w 37

• Zebrać cienką warstwę agaru z powstałych łysinek do eppendorfa

3.Zbadanie swoistości faga

1. na szalki z agarem odżywczym nanieść zawiesinę faga w postaci kreski

2. bakterie nanieść w postaci kresek poprzecznych

3. inkuboać w 37

4. obserwować strefy zahamowania wzrostu

4.Przygotowanie opatrunku fagowego:

• pobrać supernatant

a)zmieszać s. z agarem

b)zmieszać s. Z agarem-> nasączyć gazę

c)nasączyć gazę supernatantem

-przygotować kontrole

5.Zbadanie aktywności i trwałości opatrunku fagowego

przeprowadzić tego samego dnia i po upływie tygodnia

-przygotować szalki dwuwarstwowe

-podzielić je na 4

-połozyć opatrunki

-inkubować

-oznaczyć wielkość stref zahamowania wzrostu

---