Halina Koryciak-Komarska TERAPIA GENOWA Znajomość genetyki molekularnej oraz udoskonalenie metod techniki genetycznej pozwala obecnie na izolację, klonowanie i sekwencjonowanie genów. Dzięki temu można poznać genetyczne przyczyny chorób oraz zastosować metody genetyczne do leczenia tych chorób. Terapia genowa opiera się na izolowaniu potrzebnego genu i wprowadzeniu go do komórek osób chorych. Prawidłową kopię genu można wprowadzić albo do komórek linii zarodkowej, albo do komórek somatycznych. Obecnie prowadzi się badania dotyczące komórek somatycznych. Wprowadzenie czynnej kopii genu niweluje przyczynę choroby. W przypadku nowotworów najczęściej wprowadza się gen, który powoduje śmierć komórki. Dzięki tej terapii można naprawić, zamienić lub zablokować wadliwy gen. Jednym z największych problemów terapii genowej jest znalezienie odpowiedniego wektora wprowadzającego gen do komórki bez skutków ubocznych. Problem ten wynika z faktu, że dobrymi wektorami są pochodne wirusów chorobotwórczych, gdyż najlepiej przystosowane są one do przenoszenia swoich genomów do komórek docelowych. Znane są dwie metody wprowadzenia genów do organizmu: (1) terapia in vivo, polegająca na wprowadzeniu genów bezpośrednio do organizmu oraz (2) terapia ex vivo, gdy możliwe jest pobranie komórek od pacjenta, wprowadzenie czynnej kopii genu i wprowadzenie ich ponownie do organizmu. Wektory w terapii genowej. Najczęściej stosowanymi wektorami są wirusy. Przed wykorzystaniem ich trzeba usunąć geny potrzebne do funkcji wirusowych, aby wirus nie rozwijał się w organizmie oraz aby obniżyć odpowiedź immunologiczną pacjenta. Takie wirusy nazywamy wirusami przygotowanymi. Czynna kopia genu jest wprowadzana do pozostałego wirusowego genomu razem z sekwencjami DNA promującymi i regulującymi transkrypcję danego genu. Wektory wirusowe
Wektory niewirusowe
- domena wiążąca wprowadzane DNA, Ligandy po związaniu z komplementarnymi receptorami błony komórkowej są transportowane do wnętrza komórki w pęcherzykach, zwanych endosomami. Receptory ulegają recyrkulacji, natomiast ligandy są kierowane do lizosomów, gdzie ulegają degradacji. Znajomość ligandów dla receptorów została wykorzystana w tworzeniu wektorów do selektywnego wprowadzenia DNA do wybranych komórek docelowych. Najczęściej stosowana do wiązania DNA jest poli-L-lizyna (PLL ), będąca polikationem złożonym z lizyny o długości cząsteczki od 15 do około 1000 reszt lizynowych. Do wiązania DNA używane są także białka: spermina, spermidyna oraz histony. Najpopularniejszym naturalnym ligandem jest transferyna. Jako ligandy używane są także przeciwciała anty-CD3 i anty-CD5, lektyny roślinne i bakteryjne, mannoza i inne. Transport koniugatu do jądra powoduje dołączenie się do polikationu wiążącego DNA domeny sygnałowej NLS (nuclear localization signals). Jest to białko zawierające charakterystyczną sekwencję aminokwasów dla wielu polipeptydów jądrowych (na przykład w histonie H1). Przykładem zastosowania terapii genowej jest pomoc ludziom z niedoborem deaminazy adenozyny. Jest to choroba dziedziczona autosomalnie polegająca na obecności dwóch zmutowanych alleli genu deaminazy adenozyny ( ADA ). Niedobór tego enzymu ma wpływ na komórki układu immunologicznego co prowadzi do braku odporności organizmu. Gen kodujący ADA został sklonowany i w 1990 roku przeprowadzono pierwsze próby leczenia tej choroby. Gen ten został wprowadzony do wektora retrowirusowego i wraz z nim do pobranych od pacjenta limfocytów T. Komórki te namnożono w hodowli i następnie ponownie wprowadzono do pacjenta. Jednak ze względu na krótkie życie limfocytów T zabieg ten musi być regularnie powtarzany. Gdyby udało się wprowadzić gen ADA do komórek prekursorowych w szpiku wystarczyłby jeden zabieg. Terapia genowa stosowana jest także w leczeniu nowotworów. Zastępuje się wadliwe geny supresji nowotworów genami poprawnymi. Można także użyć genów egzogennych, które indukują śmierć komórki nowotworowej albo spowodują wzrost jej podatności na mechanizmy obronne organizmu lub większą wrażliwość na leki. Na przykład transfekcja komórki nowotworowej genem kinazy tymidylanowej pochodzącym z wirusa opryszczki powoduje zwiększenie jej wrażliwości na leki.
Zwierzęta transgeniczne. Jednym z modeli badawczych są zwierzęta transgeniczne. Na drodze inżynierii genetycznej - poprzez przenoszenie genów - można wprowadzić nowe cechy do organizmów zwierzęcych. Takie zmienione genetycznie zwierzęta nazywamy zwierzętami transgenicznymi, a przeniesiony gen - transgenem. Jedną z odmian zwierząt transgenicznych są zwierzęta o celowanej modyfikacji genomu, tak zwane mutanty zerowe, nokauty lub zwierzęta z ukierunkowaną delecją. Mutanty zerowe pozbawione są funkcjonalnie czynnego genu. Zwierzętom tym usuwa się gen i zastępuje go obcym zmodyfikowanym fragmentem DNA drogą rekombinacji homologicznej (patrz podrozdział „Rekombinacja homologiczna”). Nie powstaje wtedy produkt genu, co daje możliwość zaobserwowania konsekwencji jego braku. Dzięki celowanej mutacji można zbadać mechanizmy regulacyjne genu, modelowanie chorób dziedzicznych i nowotworowych, tworzenie nowych leków oraz stworzyć nowe geny. Możemy także stwierdzić, które geny są niezbędne do życia. Najczęstszym modelem do badań są myszy transgeniczne. Zamianę genu przeprowadza się następująco: zmieniony fragment DNA, zwany wstawką, zawierający odcinki homologiczne do odcinków otaczających usuwany gen, wprowadzamy do zapłodnionej komórki jajowej lub do komórek węzła zarodkowego blastocysty myszy. Komórki ze zintegrowanym genomem wyodrębniamy od pozostałych w czasie hodowli na podłożu selekcyjnym, a następnie wszczepiamy do blastocysty. Blastocysta ze zmienionymi komórkami jest implantowana do matek zastępczych. Transgen wprowadzany jest do komórek jedną z trzech metod:
Oprócz obserwacji zachowania się transgenu, można zwierzęta transgeniczne wykorzystać do produkcji rekombinowanych białek. W inżynierii genetycznej wykorzystuje się rekombinację DNA w celu przeniesienia genów z jednego organizmu do drugiego. Wymiana genów między organizmami jest ważna z dwóch powodów. Po pierwsze, w produkcji biologicznie ważnych białek (leki i białka lub enzymy stosowane w produkcji przemysłowej) (Tabele I i II). Po drugie, transfer genów służy do tworzenia organizmów o zmienionych właściwościach. Ekspresja rekombinowanych genów kodujących białka potrzebuje specjalnych wektorów, zwanych wektorami ekspresyjnymi, mającymi sekwencje sygnałowe DNA decydujące o transkrypcji i translacji genów klonowanych. Tabela I. Rekombinowane ludzkie białka wykorzystywane jako leki. Białko Choroba
alfa 1-antytrypsyna rozedma
kalcytonina riketsje
gonadotropina kosmówkowa bezpłodność
erytropoetyna anemia
czynnik VIII hemofilia
insulina cukrzyca
interferony (alfa, beta, gamma) infekcje wirusowe, nowotwory
interleukiny nowotwory
tkankowy aktywator plazminogenu skrzepy krwi
hormon wzrostu zahamowanie wzrostu
Tabela II. Rekombinowane białka wykorzystywane w przemyśle Białko Zastosowanie przemysłowe
renina serowarstwo
alfa-amylaza przemysł browarniczy
bromelaina zmiękczanie mięsa, klarowanie soków
katalaza antyoksydant żywnościowy
celulaza produkcja alkoholu i glukozy
lipaza serowarstwo
proteaza detergenty
REKOMBINACJA HOMOLOGICZNA. Rekombinacja homologiczna należy do procesów rearanżacji genów, czyli do formowania się nowego układu przez przemieszczanie dużych fragmentów DNA. Rodzicielskie dupleksy DNA przylegają do siebie rejonami o podobnych sekwencjach. Nowe cząsteczki DNA powstają przez zerwanie, a następnie przyłączenie homologicznych segmentów. W rekombinacji homologicznej pośredniczy białko aktywowane ATP, zwane recA. Umożliwia ono jednoniciowemu DNA szybkie przeszukanie dupleksu DNA, aby znaleźć identyczne lub podobne sekwencje. Następnie białko recA katalizuje wymianę nici w miejscu największej homologii. Rekombinacja homologiczna odgrywa kluczową rolę w naprawie DNA. Dostarcza ona matrycy dla syntezy DNA w celu wypełnienia ubytku. W późniejszych badaniach wykazano jej rolę w integracji DNA przenoszonego do genomów bakteryjnych po koniugacji, transdukcji i transformacji. Badając produkty mejozy u grzybów Robin Holliday opracował model rekombinacji homologicznej. Pierwszy etap to odpowiednie ustawienie się dwóch homologicznych dupleksów DNA. Następnie w każdym z dupleksów jeden z łańcuchów ulega przecięciu przez endonukleazę. Końce rozciętych łańcuchów, opuściwszy swój wyjściowy dupleks, przyłączają się do homologicznych fragmentów drugiego dupleksu DNA. Postępuje wymiana nici, co prowadzi do przesuwania się punktu skrzyżowania nici (crossover). Zjawisko to nazwano przemieszczaniem się ramion (branch migration). Tak powstały produkt pośredni jest następnie przecinany i ponownie łączony na dwa sposoby. Jeżeli przecinane są dwie przemieszczane nici dokonujące inwazji, to powstają takie same cząsteczki z wyjątkiem wymienionych rejonów. Jeżeli przecięciu ulegną nici nie dokonujące „inwazji”, to otrzymamy zrekombinowaną cząsteczkę, w której lewa połowa pochodzi z jednego rodzicielskiego dupleksu DNA, a prawa z drugiego (rys. 1). Opisany model Holliday'a był podstawą do dalszych badań nad rekombinacją homologiczną. Badano rekombinację homologiczną plazmidów u Escherichia coli, czyli kolistego dwuniciowego DNA. Komórki bakteryjne były traktowane chloramfenikolem, który zatrzymuje replikację bakteryjnego DNA, ale nie plazmidowego. Stwierdzono obecność około jednej czwartej plazmidów w formie dimerów o kształcie ósemki - jest to produkt pośredni procesu rekombinacji. Wyizolowane dimery rozcinano endonukleazą EcoRTI hydrolizującą badany plazmid tylko w jednym, określonym miejscu. Jeżeli dimer składa się z plazmidów kowalencyjnie złączonych w jednym punkcie (rejon homologii) to powstaje struktura mająca cztery ramiona, przypominająca grecką literę chi. Ustalono, że prawie wszystkie dimery o kształcie ósemki po zadziałaniu endonuleazą przechodzą w formę chi, co dowodzi, że jest ona produktem pośrednim rekombinacji homologicznej plazmidów (rys. 2). Dokładne wytłumaczenie mechanizmu rekombinacji homologicznej było możliwe dzięki modyfikacji Meselsona-Raddinga. Rekombinacja homologiczna zachodzi z udziałem białka, które jest kodowane przez geny rec. Białko recA katalizuje parowanie się jednoniciowych cząsteczek DNA z komplementarnymi rejonami dupleksów DNA. Powstaje produkt pośredni w postaci trójniciowego DNA nazwanego pętlą D, ponieważ nić wypierana z dupleksu tworzy pętlę w kształcie litery D (rys 3). Pierwszym etapem działania białka recA jest tworzenie filamentu z jednoniciowym DNA, oznaczanym ssDNA (single stranded DNA). Jednoniciowy DNA występujący w środku tej struktury jest rozciągnięty. Aby powstał tak rozciągnięty kompleks niezbędny jest ATP. Struktura ta umożliwia jednoniciowemu DNA odszukanie rejonów komplementarnych w dwuniciowym DNA. In vivo jednoniciowy DNA znajduje się w uszkodzonych rejonach DNA. Następnie kompleks recA-ssDNA wiąże się z dwuniciowym DNA, który jest częściowo rozwinięty, aby umożliwić odczytanie jego sekwencji zasad. Jednoniciowy i dwuniciowy DNA są ustawione obok siebie w miejscu wiążącym DNA w cząsteczkach białka recA. Dochodzi do szybkiego przeszukiwania dwuniciowego DNA, aby znaleźć sekwencję komplementarną do jednoniciowego DNA. W następnej kolejności dwuniciowy DNA ulega rozwinięciu, powstają nowe pary między inwazyjnym jednoniciowym DNA a jedną z nici dotychczasowego dupleksu DNA. Rozpoczyna się wymiana nici DNA przez przemieszczanie się ramion (rys 4). ATP jest niezbędny do wiązania DNA z białkiem recA. Hydroliza ATP jest potrzebna do uwolnienia białka recA od DNA. Kompleks jednoniciowego DNA z białkiem recA wykazuje polarność. Monomery recA asocjują z ssDNA w kierunku od końca 5' do 3'. Umożliwia to białku recA katalizowanie procesu w jednym kierunku. Energii do przesuwania filamentu recA i inwazyjnego ssDNA dostarcza hydroliza ATP. Hydroliza ATP potrzebna jest także do zapoczątkowania przemieszczania się ramion DNA. Atakujący DNA musi być jednoniciowy. W jego powstaniu ważną rolę odgrywają geny recB, recC i recD. Kodują one białka tworzące kompleks recBCD. Ma on aktywność helikazy i nukleazy. Samo białko recB katalizuje rozplatanie dwuniciowej helisy DNA przy udziale ATP, natomiast recD jest nukleazą. Kompleks recBCD przyłącza się do jednego z końców liniowego dwuniciowego DNA i rozplata go. Splatanie DNA, które zachodzi w tylnej części przesuwającego się kompleksu, zachodzi wolniej od rozplatania. Z tego powodu powstają dwie jednoniciowe pętle, które powiększają się w czasie przesuwania się recBCD wzdłuż nici DNA. Hydroliza ssDNA następuje w pobliżu specyficznej sekwencji, zwanej chi - 5'GCTGGTGG3' (rys. 5, 6). Poznano także inne białka potrzebne do rekombinacji homologicznej, między innymi białko SSB (białko wiążące pojedynczą nić), które bierze również udział w replikacji DNA. Stabilizuje ono niesparowane nici DNA do chwili, gdy białko recA utworzy wokół niego strukturę filamentu. Innym ważnym białkiem w rekombinacji homologicznej jest topoizomeraza I, która usuwa napięcia powstające wskutek owijania jednej cząteczki DNA wokół drugiej podczas przemieszczania się ramion. Proces przemieszczania się ramion katalizowany jest przez białko ruvB wraz z białkiem ruvA. Połączenia typu Hollidaya rozcinane są przez białko ruvC, które jest nukleazą. Rozcięte łańcuchy są następnie odpowiednio łączone przez ligazę DNA (rys. |