Ćwiczenia nr 3
Sekwencjonowanie DNA
Na ćwiczeniach przeprowadzimy rozdział produktów reakcji sekwencjonowania DNA w automatycznym analizatorze ABI 3130xl. Urządzenie to wykorzystuje elektroforezę kapilarną znakowanych fluorescencyjnie fragmentów DNA wraz z ich jednoczesną detekcją. Analizator wykorzystuje się do sekwencjonowania DNA oraz do analizy wielkości fragmentów DNA (np. mikrosatelitów, AFLP).
Reakcja sekwencjonowania
Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono cyklicznie metodą Sangera przy użyciu znakowanych terminatorów. W skład reakcji sekwencjonującej wchodzą następujące składniki:
matryca - kilka-kilkaset ng oczyszczonego, jednorodnego DNA - produkt PCR lub fragment DNA sklonowany w wektorze biologicznym (fag, plazmid, sztuczny chromosom bakterjny zawierający wklonowany interesujący nas fragment DNA)
starter do sekwencjonowania - zawsze tylko jeden, naszym celem jest uzyskanie sekwencji jednej nici DNA, tylko `w jednym kierunku'. Gdybyśmy użyli dwu starterów sekwencja byłaby nieodczytywalna.
mieszanina zawierająca bufor, jony magnezu, termostabilną polimerazę DNA, cztery typy trójfosforanów deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) oraz odpowiadające im cztery typy znakowanych fluorescencyjnie trójfosforanów dideoksynukleotydów (zamiast grupy -OH przy węglu C-3, pozwalającej na przyłączanie do rosnącego łańcucha DNA kolejnego nukleotydu, zawierają jedynie atom H, a więc gdy dideoksynukleotyd zostanie przyłączony do nowosyntetyzowanego łańcucha DNA synteza łańcucha zostaje przerwana - stąd ddNTP noszą nazwę terminatorów. W mieszaninie jest znacznie więcej dNTP niż ddNTP a ich proporcje są precyzyjnie dobrane.
woda dejonizowana wolna od nukleaz do końcowej objętości (zazwyczaj 10-20 l)
Taką mieszaninę poddaje się sekwencjonowaniu cyklicznemu, którego schemat jest bardzo zbliżony do reakcji PCR.
W każdym cyklu na matrycy sekwencjonowane są nici komplementarne. Z pewną częstością zamiast komplementarnego do matrycy dNTP do rosnącego łańcucha DNA wbudowany zostaje komplementarny ddNTP (terminator). Wtedy synteza takiego łańcucha zostaje przerwana a powstała cząsteczka, wyznakowana jest barwnikiem flourescencyjnym który przyłączony był do danego ddNTP. Ponieważ początek syntezy nici komplementarnej wyznaczony jest przez sekwencję startera, wszystkie fragmenty DNA o określonej długości (np. 120 nukleotydów) będą wyznakowane tym samym kolorem, ponieważ ich synteza została przerwana w tym samym miejscu, w pozycji w której znajdował się jeden określony nukleotyd. Warunki reakcji dobrane są w taki sposób, że efektem końcowym będzie mieszanina fragmentów o długości starter + 1, 2 ... nukleotydy. każdy taki fragment występował będzie w wielu kopiach wyznakowanych tym samym kolorem, odpowiadającym ostatniemu dobudowanemu nukleotydowi (terminatorowi). Mieszaninę tę rozdziela się elektroforetycznie w analizatorze DNA. Schemat reakcji sekwnecjonowania cyklicznego metodą Sangera przedstawia animacja dostępna online: http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html, którą pokażemy również na ćwiczeniach
Zasadnicza różnica między sekwencjonowaniem cyklicznym a `zwykłą' reakcją PCR polega na tym, że ilość produktu reakcji sekwencjonowania nie wzrasta wykładniczo lecz liniowo. Ponieważ użyty jest tylko jeden starter liczba cząsteczek matrycy nie wzrasta w trakcie reakcji - nowozsyntetyzowane cząsteczki nie służą jako matryca.
Oczyszczanie reakcji sekwencjonowania
Po reakcji sekwencjonowania niezbędne jest usunięcie niewykorzystanych terminatorów. Istnieje wiele metod, opierających się na kolumnach krzemionkowych, membranach o odpowiednio dobranych wielkościach porów oraz na strącaniu alkoholem. My wykorzystaliśmy tę ostatnią metodę, która przeprowadzana w płytkach 96 dołkowych jest szybka, wydajna, tania i wymaga minimalnego nakładu pracy.
Po oczyszczeniu produkt reakcji sekwencjonującej zawiesza się w formamidzie i umieszcza w automatycznym analizatorze DNA. Na tym etapie rozpoczniemy nasze ćwiczenia.
Rozdział produktu reakcji sekwencjonowania w automatycznym analizatorze DNA
Elektroforeza odbywa się w cienkiej kapilarze o wewnętrznej średnicy 50 m. Ponieważ stosunek powierzchni do objętości w takiej kapilarze jest bardzo korzystny, ciepło powstałe w trakcie elektroforezy jest efektywnie wypromieniowywane a zatem możliwe jest stosowanie w trakcie elektroforezy wysokiego napięcia rzędu 8 - 15 kV. To z kolei pozwala, w zależności od stosowanej długości kapilary (22 - 80 cm, w naszym laboratorium zazwyczaj używamy kapilar o długości 36 cm) na przeprowadzenie analizy w czasie od kilkunastu minut do 2.5 godziny.
Przed iniekcją próbki przez kilkadziesiąt sekund przykłada się do polimeru w kapilarze wysokie napięcie prądu (ang. Pre-Run) aby ustawić tzw. sito molekularne - uzyskać strukturę polimeru optymalną dla rozdziału elektroforetycznego.
DNA wprowadzany jest do kapilary poprzez elektroiniekcję, przyłożenie napięcia ok. 1kV przez kilkadziesiąt sekund powoduje wchodzenie ujemnie naładowanych fragmentów DNA do kapilary.
Ponieważ chcemy aby prędkość wędrówki DNA w kapilarze zależała jedynie od długości cząsteczki a nie od jej sekwencji (struktury drugorzędowej), DNA musi być zdenaturowany. Uzyskuje się to przez zastosowanie polimeru denaturującejgo (w naszym przypadku POP7 - półpłynny polimer o właściwościach zbliżonych do poliakrylamidu) oraz prowadząc elektroforezę przy stałej temperaturze (50-60°C w zależności od stosowanego protokołu).
Po iniekcji próbek prowadzi się elektroforezę a następnie zbieranie danych. W momencie gdy znakowane fluorescencyjnie fragmenty DNA przechodzą przez okienko lasera emitującego fale o długościach odpowiadających maksimom absorbcji barwników fluorescencyjnych, światło lasera wzbudza fluorescencję której sygnał rejestrowany jest przez kamerę CCD i przekazywany do komputera, gdzie sygnał jest dodatkowo przetwarzany i zapisywany w postaci plików danych, które następnie analizowane są specjalnym programem odczytującym sekwencje (ang. Basecaller) i zapisywane w formacie odczytywalnym przez wiele aplikacji.
Urządzenie jest w znacznym stopniu zautomatyzowane. Rola operatora sprowadza się do umieszczenia próbek w urządzeniu i ustawienia parametrów analizy w oprogramowaniu sterującym analizatorem. Sterowanie urządzeniem odbywa się przez specjalne oprogramowanie Data Collection Software. Pozwala ono na wprowadzenie opisu próbek i ustawienie dla nich parametrów analizy. Próbki umieszcza się w płytkach 96-dołkowych. Jednocześnie w analizatorze można umieścić dwie płytki. Płytce fizycznej odpowiada płytka logiczna utworzona w Data Collection Software i zawierająca nazwy próbek oraz odpowiadające im parametry analizy.
Kolejne kroki analizy
1. Uruchom program 3130xl Data Collection
2. Kliknij 'Plate Manager'-> New...
3. Wpisz nazwę płytki. Jako Application wybierz `Sequencing Analysis' - ta informacja potrzebna jest programowi aby wyświetlił właściwy arkusz opisu płytki. Uzupełnij pola 'Owner Name' oraz 'Operator Name'.
4. Po pojawieniu się formularza opisu płytki w kolumnie 'Sample name' wpisz nazwy próbek.
5. W kolumnie Results Group wybierz `WB_seq' - Results Group określa miejsce gdzie zostaną zapisane pliki wynikowe oraz reguły nadawania nazw folderom i próbkom.
6. W kolumnie 'Instrument Protocol' Wybierz 'SEQ_BDT3_36_POP7_inj40' - Instrument protocol zawiera informacje o parametrach elektroforezy oraz filtrach jakie maja zostać użyte
7. W kolumnie 'Analysis protocol' wybierz `WB_seq' - tutaj zawarte są informacje jak maja zostać przeanalizowane dane. Inne protokoły można stosować do juz zebranych danych - dane można analizować wielokrotnie
8. Po zakończeniu naciśnij `OK'
9. Naciśnij przycisk `Tray' na instrumencie - autosampler, czyli część sekwenatora gdzie umieszcza się próbki automatycznie zostanie ustawiona w pozycji pozwalającej na umieszczenie płytki w urządzeniu.
10. Umieść płytkę w instrumencie
11. W programie 3130xl Data Collection wejdź w zakładkę `3130xl -> Run Scheduler'
12. Naciśnij 'Find all': pojawi się lista płytek
13. Wybierz swoją płytkę i kliknij na pozycję A lub B w zależności od tego, w której z pozycji została umieszczona płytka. Ten krok ma na celu powiązanie opisu płytki - 'płytki logicznej' z płytka znajdującą się w sekwenatorze
14. Naciśnij zielona strzałkę i `OK'
15. W zakładce `3130xl-> Instrument Status ->EPT Chart' można oglądać parametry elektroforezy w czasie rzeczywistym
16. Gdy rozpocznie się zbieranie danych podgląd w czasie rzeczywistym możliwy jest w zakładce `Cap/Array Viewer' lub `Capillaries Viewer'
17. Po zakończeniu analizy sekwencje można obejrzeć w programie `Sequencing Analysis' a dalszą ich analizą zajmiemy się na kolejnych ćwiczeniach.
Po ćwiczeniach powinieneś(aś) potrafić wyjaśnić:
Na czym polega cykliczne sekwencjonowanie DNA metodą Sangera
Dlaczego DNA stanowiący matrycę powinien być oczyszczony i jednorodny
Dlaczego w reakcji sekwencjonowania stosujemy tylko jeden starter
Czym są terminatory
Czym różni się reakcja cyklicznego sekwencjonowania DNA od `zwykłej' reakcji PCR
W jaki sposób automatyczny sekwenator odczytuje sekwencję DNA
Techniki molekularne ćw. 3 4 z 4