WYKŁAD -9-

Biotechnologia otrzymywania polisacharydów pochodzenia mikrobiologicznego

Na powierzchni bardzo wielu gatunków bakterii, na powierzchni komórek, znajdują się śluzy, gdzie głównym składnikiem tych śluzów są różnego rodzaju polisacharydy. Bardzo wiele mikroorganizmów takie egzocelularne polisacharydy wytwarza. Mają one bardzo ciekawe właściwości fizyczne i chemiczne, w zależności od pochodzenia, a w związku z tym od składu chemicznego.

W tej chwili jest około dwudziestu różnych polisacharydów otrzymywanych na drodze fermentacji, z zastosowaniem różnego rodzaju mikroorganizmów, a znajdują one zastosowanie w przemyśle żywnościowym i farmaceutycznym, jako emulsyfikatory, stabilizatory, czynniki żelujące, koagulujące, do tworzenia cienkich powłok (filmów) pokrywających różne powierzchnie.

Polisacharydy wśród mikroorganizmów mogą być różne, w związku z tym różna jest też ich klasyfikacja (nie jest ona dla nas w tej chwili istotna). Należy zwrócić uwagę na jedną rzecz. Jeżeli poszukujemy wśród mikroorganizmów pewnego rodzaju polisacharydów, to należy brać pod uwagę gdzie ich szukać. Mogą to być sacharydy:

• wewnątrz komórkowe - zapasowe (są mało atrakcyjne ze względu na proces produkcji-utrudnione oczyszczanie tych polisacharydów)

• strukturalne

• egzocelularne - otoczki i śluzy

• homopolisacharydy (pullan, dekstrany)

• heteropolisacharydy (ksantan)

• rozgałęzione

• prostoliniowe

• anionowe (alginian)

• obojętne (lewan, pullulan)

• kationowe.

Źródłem polisacharydów są bakterie gram (+) i gram (-), glony i grzyby. Głównie wykorzystuje się jednak bakterie (ze względu na uniwersalność i duże zróżnicowanie jeżeli chodzi o wytwarzanie polisacharydów).

Przeważnie wykorzystuje się te polisacharydy, które są wytwarzane jako materiały zapasowe, które są wytwarzane w takich warunkach, kiedy jest nadmiar substratu i kiedy komórka przetwarza substrat węglowy w związki zapasowe. Ponieważ są to polisacharydy, dlatego substraty do ich produkcji muszą zawierać duże ilości cukrów. W zależności od tego jakie są to polisacharydy, substratem jest glukoza, fruktoza, sacharoza, laktoza lub zhydrolizowana skrobia, metanol, węglowodory.

To dotyczy produkcji wszystkich polisacharydów otrzymywanych na drodze fermentacji, w zależności od źródła węgla można sterować długością łańcucha polisacharydu, można dodawać różnego rodzaju prekursory, czyli manipulować składem polisacharydu. Nie ma natomiast takich generalnych reguł, do tego jak synteza takiego polisacharydu koreluje ze wzrostem biomasy, każdy taki proces jest opracowywany indywidualnie, jak również warunki, które powodują, że zmusza się komórki do rozpoczęcia syntezy polisacharydów.

Wśród dwudziestu różnych polisacharydów, które otrzymuje się na drodze fermentacji, największe znaczenie mają takie jak :

PRODUKT	SUBSTRAT	MIKROORGANIZM
alginian	sacharoza	Azobacter vinelandii
lewan	2% sacharoza	Lymononas mobilis
pullulan	5% sacharoza	Aureobasidium pullulans
ksantan	6% laktoza	Xanthomonas campertis
galaktogluken	laktoza	Zooglea ramigena

Substraty do produkcji tych polisacharydów są kosztowne, ponieważ są to czyste cukry. Wydajność tych polisacharydów, jeżeli chodzi o przetwarzanie substratu jest niezbyt wysoka ale specyficzny charakter i właściwości chemiczne i fizyczne tych polisacharydów powodują, że i tak opłaca się je otrzymywać.

W zasadzie najważniejszym produktem na rynku polisacharydów pochodzenia mikrobiologicznego jest ksantan. Nazwa tego polisacharydu pochodzi od bakterii Xantomonas campestris. Jest to żywica, tzw. guma ksantanowa. Najczęściej jest wykorzystywany do otrzymywania ropy naftowej. Każda baryłka ropy naftowej wymaga około 0,5kg polimeru o określonej lepkości, takiej jaką ma żywica ksantanowa. Jeden kilogram takiej żywicy otrzymywanej na drodze fermentacyjnej kosztuje 6-7$. Ksantan jest polisacharydem rozgałęzionym, zbudowany częściowo z cukrów zmodyfikowanych, cukrów w formie kwasowej, które są jeszcze dodatkowo zestryfikowane, zawierają też jony sodu, potasu (D-glukoza, D-mannoza, D-glukonian, octan, pirogronian). Ma lepkość niezależną od temperatury w zakresie od 10 do 70°C i stałą lepkość w dużym zakresie pH od 6 do 9. Masa cząsteczkowa tego polisacharydu wynosi do 10⁶. Oznacza to, że w zależności od warunków fermentacji i w zależności od tego jakie podłoże się zastosuje, można sterować tym, jak wysoko cząsteczkowy ksantan zostanie otrzymany. Zależy to również od mikroorganizmu. Stosuje się różnego rodzaju szczepy bakterii produkującej, w zależności od tego jakie są określone potrzeby producenta.

Drugim ważnym polisacharydem otrzymywanym na drodze fermentacyjnej jest dekstran. Syntezuje go Leuconostoc mesenteroides, która to bakteria w cukrowniach, gdzie nie zachowuje się odpowiedniej czystości, zakaża proces produkcyjny, rozkłada sacharozę dzięki enzymowi zewnętrznokomórkowemu, który wydziela do podłoża, tzw. dekstransacharazę i produkuje dekstran, który magazynuje na zewnątrz komórki i powoduje chorobę żabiego skrzeku (dekstran powoduje, że cukier wygląda jak żabi skrzek). Komercyjnie produkuje się dekstran przy wykorzystaniu bakterii Leuconostoc mesenteroides lub innego gatunku Leuconostoc dextranicus albo z wykorzystaniem ekstraktów bezkomórkowych. Dekstran jest polimerem glukozy. Jego ciężar cząsteczkowy także jest różny w zależności od szczepu i od warunków fermentacji (9*10⁶ α- glukopiranozy). Dodatkowo warunki fermentacji decyduja o tym czy będzie to mały czy duży stopień rozgałęzienia. Stosuje się do produkcji sit molekularnych (np. oczyszczanie białka na kolumnie). Stopień usieciowania z innymi związkami (które wiążą wolne grupy hydroksylowe) determinuje wielkość porów zdolnych do wiązania wody w takim sicie molekularnym. Stosuje się go również w przemyśle farmaceutycznym (opatrunki pochodzenia naturalnego - biodegradowalne i neutralne dla organizmu).

Trzeci polisacharyd, o którym należałoby pamiętać to pullulan . Jest najbardziej prostym polisacharydem, w porównaniu z dwoma poprzednimi, jest to po prostu maltotrioza powtarzająca się x-razy. Masa cząsteczkowa jest różna w zależności od procesu produkcyjnego, gdzie można sterować warunkami fermentacji, czy będzie to 5*10⁴ czy 4*10⁶. Jest to polimer obojętny, ma wiele zastosować ze względu na swoje właściwości. Używany jako lepiszcze, włókna do powlekania powierzchni cienkim filmem. Ponieważ warstwy uzyskiwane z pullulanu maja niską przepuszczalność dla tlenu, to modyfikacja pullulanu (sieciowanie z innymi związkami) pozwala otrzymać folie do pakowania żywności i jest to opakowanie, które jednocześnie zabezpiecza przed utlenieniem. Głównym producentem jest Japonia, tam ten proces następuje w oparciu o Azotobacter pullulans.

Fermentacyjny proces otrzymywania tych polisacharydów jest dość trudny ze względu na specyficzne właściwości fizyczne tych związków (ich duża lepkość). W związku z tym fermentory muszą być zaopatrzone w urządzenia bardzo dobrze mieszające. Tutaj normalne napowietrzanie takiej zawartości fermentora nie wystarczy, żeby to wszystko było odpowiednio mieszane. To jest w procesie produkcyjnym miejsce, które wymaga bardzo dużego nakładu energii.

Podłoża są bardzo różne i wymagana jest duża kontrola warunków. Np. ksantan jest produkowany w warunkach deficytu źródła węgla, w związku z tym trzeba odpowiednio dozować to źródło węgla, tak aby komórki produkowały ten związek.

Najbardziej energochłonnym a jednocześnie wymagającym dużego nakładu pieniędzy jest etap oczyszczania produktu.

Po otrzymaniu czegokolwiek metodą fermentacyjną rozpoczyna się normalny proces obróbki chemicznej. W tym przypadku jest to dosyć ciekawe, dlatego że powstaje roztwór o dużej lepkości, w związku z tym wymaga cały czas odpowiedniego specyficznego mieszania, tak samo ta lepkość powoduje, że utrudniony jest proces oczyszczania tych polisacharydów.

Pierwszym etapem jest usunięcie komórek, a jeżeli chciałoby się odwirować komórki takiej lepkiej mieszaniny, to wtedy staje się to bardzo trudne i mało efektywne, w związku z tym roztwór musi być rozcieńczony przed usunięciem biomasy. Tu pojawia się pierwszy etap różniący otrzymywanie polisacharydów od otrzymywania czegokolwiek na drodze fermentacyjnej. Albo się rozcieńcza albo zabija się i dokonuje się degradacji komórek (chemicznie lub enzymatycznie). Musi być to robione w taki sposób aby te warunki nie spowodowały jednocześnie degradacji polimeru cukrowego, który się uzyskuje.

Drugi etap to izolacja samego polisacharydu. Robi się to za pomocą wytrącania rozpuszczalnikami organicznymi, mieszalnymi z wodą. Szeroko jest stosowane wytrącanie alkoholem.

Trzeci etap to odwodnienie i suszenie. To też nie jest etap prosty mimo iż tak brzmi. Stosuje się tu suszarki próżniowe, które pracują w ostrożnej temperaturze, dlatego że zbyt wysoka temperatura może spowodować degradacje polimeru, zmienić jego rozpuszczalność, kolor, spowodować, że otrzyma się produkt, który nie jest w pełni wartościowy.

Czwarty etap to mielenie cząsteczek do odpowiedniej wielkości, pakowanie w pojemniki o niskiej przepuszczalności dla wody.

Do tej pory koszt produkcji tych mikrobiologicznych polisacharydów jest o wiele wyższy niż koszt produkcji innych tradycyjnych polisacharydów, takich ja np. skrobia kukurydziana, produkty pochodzące z celulozy, modyfikowanej celulozy itd. Ponieważ cały czas modyfikuje się procesy produkcyjne, modyfikuje się szczepy w związku z tym koszty związane z produkcją polisacharydów są ciągle obniżane. Te trzy wyżej są na tyle unikalne, że opłaca się je produkować mimo tak wysokich kosztów.

Biotechnologia otrzymywania niektórych odczynników chemicznych.

Przedstawione odczynniki chemiczne mogą być traktowane jako odczynniki chemiczne i jako środki spożywcze, dlatego że metodami fermentacyjnymi, metodami naturalnymi otrzymuje się te związki chemiczne, które mają zastosowanie jako środki spożywcze.

Ponieważ można powiedzieć, że zastosowanie mikroorganizmów do produkcji związków chemicznych w szerokim tego słowa znaczeniu ma bardzo bogatą historię, jest procesem bardzo starym, sięga roku 2000 p.n.e., gzie w Asyrii wykorzystywano procesy fermentacyjne do produkcji etanolu i konsumpcyjnego kwasu octowego, czyli octu. W wieku XIX zauważono, że występuje fermentacja acetono - butanolowa i Pasteur zaobserwował, że butanol może być wytwarzany jako produkt uboczny fermentacji masłowej. Ale komercyjna produkcja butanolu w oparciu o metody fermentacyjne ruszyła dopiero w 1914 roku, kiedy odkryto bakterię, która bardzo wydajnie prowadziła proces fermentacji acetono - butanolowej, nazywa się Clostridium acetobutylicum i rozpoczęto wtedy na komercyjną skalę wykorzystywać proces fermentacyjny dla produkcji acetonu i butanolu. Ta bakteria była o tyle interesująca, że rozkładała substraty skrobiowe (skrobię kukurydzianą-nie tak bardzo drogi surowiec). To były czasy, kiedy butanol i aceton były konieczne, bowiem w czasie I wojny światowej USA zbudowało instalacje pilotowe, bowiem trzeba było mieć tanie i wydajne źródło do otrzymywania acetonu, a ten był niezbędny do produkcji kordytu. Kordyt to bezdymny proch, który był wykorzystywany jako materiał miotający, czy materiał napędowy dla ciężkiej artylerii i różnego rodzaju amunicji.

Drugim składnikiem powstającym w czasie tej fermentacji to butanol. Zapotrzebowanie na ten związek pojawiło się kiedy zaczęto produkować lakiery nitrocelulozowe. W tym miała udział firma Du Pont, a między innymi te lakiery były niezbędne dla przemysłu samochodowego, który się wtedy zaczął dynamicznie rozwijać. Oprócz firmy Du Pont należy tu podać firmę Ford, która była odbiorcą tych lakierów.

Z tych przyczyn rozpoczęto wtedy na dużą skalę wykorzystywać fermentację acetono- butanolową ale w momencie, kiedy okazało się, że odnaleziono tanie źródło ropy naftowej, że otrzymywanie tego typu związków jest przez przemysł petrochemiczny o wiele tańsze niż metodami fermentacyjnymi, fermentacja stała się metodą nieatrakcyjną. Jeżeli wzrost cen ropy będzie tak duży, ze się stanie przemysł petrochemiczny nieatrakcyjnym to prawdopodobnie powróci się do otrzymywania tych związków metodami fermentacyjnymi.

Z większością związków chemicznych, które można otrzymać metodami fermentacyjnymi i które można także otrzymać bazując na ropie jako surowcu, to metody chemiczne są o wiele tańsze. Kwas octowy i etanol w zależności od przeznaczenia otrzymuje się różnymi metodami.

Związkiem, który otrzymuje się na skalę przemysłową metodami fermentacyjnymi jest kwas itakonowy (metylenobursztyniwy). Jest to wyjątkowo chemiczny odczynnik i takie ma też zastosowanie ale jest to jednocześnie przykład na to, że normalny odczynnik chemiczny, czy substrat w syntezach chemicznych otrzymuje się na drodze biotechnologicznej w procesie fermentacyjnym opartym na aktywności grzybów i jest on otrzymywany w ilości 15 ton rocznie. Ten kwas jest znany od dość długiego czasu, a został poznany w 1834 roku w czasie destylacji kwasu cytrynowego, gdzie miało miejsce dekompozycja a następnie rozkład pewnej ilości kwasu octowego i wyizolowano przy okazji kwas itakonowy. W 1931 roku okazało się, że organizmy, które nie dokonują procesu destylacji mogą dzięki określonemu szlakowi biochemicznemu taki kwas wytwarzać, czyli Aspergillus (grzyb-uniwersalny jak promieniowce w przypadku otrzymywania antybiotyków), Rhodotorula. Metody chemiczne, które wychodzą z kwasu octowego są kosztowne jeżeli chodzi o surowiec i dają niższą wydajność w porównaniu z fermentacją.

Wykorzystanie kwasu itakonowego

• kopolimer kwas itakonowyego z akryloamidem daje tworzywo o bardzo dobrych własnościach schnących, w związku z tym jest stosowany jako dodatek do farb i lakierów i poprawia ich właściwości adhezyjne i jednocześnie nadaje im lepsze właściwości schnące.

• kopolimer kwas itakonowyego ze styrenem i butadienem służy do otrzymywania siatek do pokrywania spodów dywanów, jest dodawany do farb i daje im lepszą przylepność

• estry kwasu itakonowego stosowane do otrzymywania utrwalaczy (dodatki do farb)

• kwas itakonowy z aminami tworzy formy cykliczne, tzw. pyrrolidony i służą jako detergenty

• synteza sztucznego szkła.

Proces fermentacyjny jest znany od przeszło 30 lat. Organizmem, który jest wykorzystywany w procesie fermentacji jest Aspergillus terreus. Amerykańska forma Pfizer wykorzystuje go w fermentacji wgłębnej ale znany jest również proces fermentacji powierzchniowej. Różne procesy produkcyjne wykorzystują różne substraty cukrowe:

• glukoza, sacharoza i źródło azotu (NH₄)₂SO₄ lub NH₄NO₃

• melasa (zawierają już pewne ilości związków azotowych)

Wydajność procesu jest bardzo duża (56 - 65%). Proces jest tlenowy, przebiega przy ograniczonym dostępie Pi.

Biochemia syntezy kwasu itakonowego. U organizmów, które wytwarzają ten kwas występuje dodatkowa reakcja na etapie glikoliza - cykl Krebsa. Jest to reakcja anaplerotyczna (reakcje uzupełniające metabolity jakiegoś cyklu biochemicznego, jeżeli jego metabolity pośrednie są odciągane gdzieś na boki, żeby cały cykl zamknąć musi gdzieś z boku dochodzić określony metabolit. Ta reakcja anaplerotyczna mikroorganizmów to karboksylacja kwasu pirogroniowego do szczawiooctanu. Kwas itaoknowy powstaje z akonitanu dzięki enzymowi - dekarboksylazie itakonowej.

Pi + CO₂ → szczwaiooctan → cytrynian ↔ izocytrynian

↨ ↨

akonitian ↔ kwas itakonowy

Kwas octowy - jeden z najważniejszych odczynników chemicznych, roczna produkcja - 2,5 mln ton. Jest 34 na liście najważniejszych związków chemicznych produkowanych przez przemysł. Od 1950 roku jest otrzymywany głównie na drodze syntezy chemicznej. Drugie zastosowanie kwasu octowego w postaci octu (historycznie najstarsza forma) jest otrzymywane na drodze biotechnologicznej.

Zanim kwas octowy znalazł się jako 34 na liście najważniejszych związków chemicznych to znany był jako roztwór wodny, czyli tzw. ocet (10000 p.n.e.). Za najwcześniejszą wzmiankę o occie uważa się wzmiankę ze Starego i Nowego Testamentu. Był on znany pod nazwą wineger (franc. win - wino, aigre - kwaśny, łac. Acetum - kwaśne wino). Ocet winny otrzymuje się zapaskudzając sobie wino. Najwcześniejsze metody otrzymywania to metody biologiczne z naturalnych węglowodanów przez biologiczne utlenianie alkoholu. Otrzymany w ten sposób ocet ma dodatkowe walory smakowo - zapachowe, dlatego że procesowi utleniania alkoholu (proces tlenowy) towarzyszy aktywność metaboliczna tych organizmów, które ten proces prowadzą. Drugą starą metodą jest sucha destylacja drewna.

Ocet otrzymuje się z jabłek, słodu, winogron, melasy, skrobi, śliwek. Jest to ocet winny. W zależności z jakich źródeł pochodzi ocet winny, ma on inny kolor i inne walory smakowo - zapachowe.

Kwas octowy otrzymuje się z etanolu, metaldehydu, etylenu, metanolu/CO₂, a wykorzystuje się go do produkcji octanu winylu, octanu celulozy, bezwodnika octowego, octan etylu (estry), sole, środki farmaceutyczne. Jest to zatem związek, który ma bardzo duże zastosowanie.

Produkcja octu winnego. Wykorzystuje się tutaj bakterie fermentacji octowej z gatunku Acetobacter. Również pewne gatunki Pseudomonas są w stanie przeprowadzać tego rodzaju fermentację.

Są dwa procesy, które jednocześnie wskazują w jaki sposób to wino jest przekształcane w ocet winny.

Proces wolny jest nazywany jednocześnie procesem orleańskim albo metodą francuską. Ten proces w tej chwili nie funkcjonuje, bo jest nieekonomiczny. Tren proces jest prowadzony w beczkach, w których umieszcza się wino, czyli substrat alkoholowy dla bakterii fermentacji mlekowej. Inokuluje się to wino octem winnym pochodzącym z poprzedniej szarży, następuje samozakażenie wina. Proces fermentacji trwa cztery tygodnie, przy czym co tydzień dodaje się jedną porcję wina (dokarmianie bakterii). Po pięciu tygodniach odbiera się porcje przetworzonego substratu i dodaje się taką sama ilość wina jaka się odebrało. Bakterie rozwijają się na powierzchni beczek i tworzą one zoogleę (mother of wineger). Jest to proces powolny bo trwa aż pięć tygodni i wymaga dokarmiania, a poza tym bakterie rosną na powierzchni to różne warstwy tego co się znajduje w beczce są w różnym stopniu napowietrzane, a proces fermentacji octowej jest tlenowy w związku z tym pierwszą modyfikacją jaka tu użyto było immobilizowanie tych bakterii Na drewnianych klatkach, na których rozwijała się zooglea i jednocześnie zapewniało to lepszy kontakt bakterii z winem (rodzaj złoża zraszanego) - poprawienie wydajności.

Obecnie stosowanym procesem produkcji octu winnego jest proces szybki, tzw. niemiecki. Proces stosowany od tysiąca lat, który z pewnymi modyfikacjami jest wykorzystywany do dzisiaj. W tym przypadku cały proces fermentacji przebiega w drewnianym generatorze albo jest wewnątrz pokryty metalem. Wypełniony jest wiórami bukowymi, na nich rozwijają się bakterie. Także jest to pewien rodzaj immobilizacji. Od góry podaje się roztwór alkoholu (złoże zraszane), a od dołu tłoczone jest powietrze. Proces ten odbywa się o wiele szybciej z powodu ciągłego dopływu substratu i tlenu. Dodając 12% alkohol otrzymuje się 98% octu winnego w ciągu pięciu dni.

Usprawnienia procesu szybkiego:

• zwiększone napowietrzanie

• kontrola temperatury

• próby przeprowadzania fermentacji wgłębnej

Udało się w ten sposób zmniejszyć objętość reaktora i przyspieszyć proces utlenienia alkoholu i uzyskać większą wydajność.

Fermentacja octowa, mimo ze się nazywa fermentacją jest to proces tlenowy. Przebiega on stopniowo, najpierw powstaje acetaldehyd (dehydrogenaza alkoholowa- E₁), który zostaje uwodniony. Ta forma uwodniona staje się substratem dla dehydrogenazy acetaldehydu (E₂) i następuje utlenienie do kwasu octowego.

C₂H₅OH → CH₃CHO + H₂O ↔ CH₃CH(CH)₂ → CH₃COOH + H₂

Tą reakcję przeprowadzają bakterie fermentacji octowej, które są bakteriami tlenowymi.

Istnieje druga możliwość wykorzystania procesu fermentacji octowej ale takiego procesu, który przebiega w warunkach beztlenowych. Otrzymuje się kwas octowy, nie ocet winny z substratów takich które są przeważnie produktami ubocznymi, pozastałościami po innych procesach produkcyjnych. Głównie chodzi tu o wykorzystanie celuloz i hemiceluloz, czyli tego co pozostaje po przeróbce papieru. Jest to proces, który wykorzystuje mieszaną mikroflorę (Gram - , Bacterioides np., Ruminococcus), która w warunkach beztlenowych rozkłada celulozę i hemicelulozy do produktów rozpuszczalnych i dopiero te produkty, takie jak różnego rodzaju kwasy alifatyczne (maślany, octowy, propionowy, masłowy, walerianowy, mlekowy, bursztynowy a także etanol, CO₂ i H₂) stają się substratami dla bakterii nie cellulolitycznych, tych których działalności towarzyszy wydzielanie kwasu octowego, CO₂ i H₂. Rozważamy w drugiej możliwości zastosowanie takich substratów jak glony morskie, słoma kukurydziana, która jest wstępnie potraktowana 1% NaOH aby była bardziej dostępna dla mikroorganizmów, czy ligniny. Wybór procesu zawsze jest potraktowany celem jakiemu produkt ma służyć. Jeżeli ma to być ocet (produkt spożywczy) wybiera się proces tlenowy. Ocet spirytusowy, który stoi u nas na półkach, a w latach 80-tych był jedyną rzeczą, która się na nich znajdowała (?) jest otrzymywany przez biologiczne utlenienie alkoholu, który się uzyskuje niekoniecznie metodami biologicznymi (metoda chemibiologiczna). Jeżeli jest potrzebny kwas octowy jako odczynnik chemiczny, to można go otrzymywać w procesie beztlenowym, dlatego ze jest tańszy. Tańszy jest między innymi dlatego że nie wymaga pilnowanie sterylności warunków, tu się nic nie zakazi, dlatego że jest to prowadzone w warunkach beztlenowych i powstaje tyle kwasu, że na dobrą sprawę nie należy się spodziewać ataku ze strony niepożądanych mikroorganizmów. W procesie biologicznym powstaje półtora tony popiołu na tonę kwasu octowego. Popiół jest bogaty w węglan potasu. Proces chemiczny wymaga z kolei mniejszego nakładu energii ale ... (nie wiem bo kaseta się skończyła).

Kolejnym związkiem otrzymywanym na drodze chemicznej i biotechnologicznej jest etanol, czyli alkohol etylowy. Jego przemysłowe zastosowanie to rok 1800 ale człowiek znał alkohol etylowy w postaci roztworu od wielu lat, wtedy gdy fermentowały produkty owocowe i okazało się, ze spożycie takiego zepsutego produktu wprawia w bardzo dobry nastrój. Jeżeli chodzi o historię produkcji chemicznej i biologicznej to w 1941 roku w USA wyprodukowano 77% etanolu na drodze fermentacyjnej. II wojna światowa spowodowała prawie czterokrotny wzrost produkcji na drodze fermentacyjnej. Był o wykorzystywany do produkcji gumy syntetycznej i kordytu. Po II wojnie światowej, kiedy przemysł mógł się skupić na wydobyciu i przetwórstwie ropy naftowej okazało się, ze znaleziono w ten sposób tanie źródło etylenu, który jest substratem do produkcji alkoholu etylowego, czyli synteza chemiczna okazała się procesem o wiele tańszym od metody biologicznej. Na początku lat 70-tych na skutek rozwijającej się sytuacji politycznej na świecie, kraje arabskie, które założyły embargo na ropę naftową, ceny ropy gwałtownie wzrosły i zaczęto poszukiwać alternatywnych paliw. W związku z tym w tej chwili metody fermentacyjne produkcji tego alkoholu z tanich źródeł, to jest to nad czym się pracuje, aby rozwiązać problem alternatywnego taniego paliwa do silników. Również i butanol, jako dodatek do paliw jest lepszy o tyle, że słabiej paruje niż alkohol etylowy.

Przemysł fermentacyjny, który jest największym dostawcą w porównaniu z przemysłem chemicznym ma miejsce w Brazylii, czyli tam przemysł fermentacyjny przeważa w produkcji alkoholu etylowego. Metody fermentacyjne przeważają w krajach mało uprzemysłowionych, które nie maja taniego źródła ropy naftowej.

Etanol jako odczynnik chemiczny, jako czynnik od syntez ma duże zastosowanie.

Etanol → acetaldehyd → AcOH, aldehyd krotonowy

→ octan

→ butadien, etyloaminy, estry, CHCl₃, chlorek etylu

→ etylen → poliestry, surfaktanty, PCV, polistyren, polietylen

Inne możliwości do zastosowania to rozpuszczalnik, alternatywne paliwo.

Istnieją pewne ograniczenia i wymagania jakie muszą spełniać procesy fermentacyjne. W procesie fermentacyjnym produkcji alkoholu stosuje się trzy rodzaje substratów cukrowych w zależności od tego czym dana wytwórnia dysponuje i w zależności od przeznaczenia.

Substratami są tu substraty:

• sacharozowe - najdroższe

• skrobiowe - wymagają wstępnej obróbki

• celulozowe - tanie bo to są najczęściej odrzuty z innego rodzaju przetwórstwa ale wymagają wstępnej obróbki (kosztowna), dlatego że bardzo mało mikroorganizmów celulozę rozkłada.

Drugim ważnym warunkiem dla przebiegu fermentacji są organizmy, które tą fermentację prowadzą. Najbardziej wydajne są drożdże. Są też odporniejsze. Dotyczy ona tego, że muszą one wytrzymywać duże stężenia cukru, muszą być osmofilne i muszą wytrzymywać duże stężenie produktów, zatem muszą też być niewrażliwe na zwiększające się stężenie alkoholu. Również są wykorzystywane termofilne bakterie różnych gatunków (Clostridium thermosacharoliticum, Thermoahareobacter ethamolicus), a zwłaszcza takie, które mogą fermentować nie tylko heksozy ale także pentozy (powstają przy rozkładzie tańszych substratów, głównie celulozowych).

Proces wykorzystujący produkcję alkoholu etylowego poprzez fermentacje jest najczęściej procesem okresowym, który trwa od 40 do 70 godzin. Proces ciągły opracowano dla ługów posulfitowych (substraty z grupy substratów celulozowych). Ponad 50% kosztów produkcji zajmuje oczyszczanie. Jeżeli ma to być odczynnik pochodzący z procesu fermentacyjnego, na potrzeby przemysłu farmaceutycznego, kosmetycznego, czy chemicznego to wymagana jest 95% czystość. Dla przemysłu ogólnie stosuje się alkohol techniczny, absolutny jest 99,85%, a jako paliwo musi być to alkohol 99,92%.

Problem związany z produkcją etanolu na drodze fermentacyjnej. Ten problem stanowią tzw. odpady pogorzelniane. Mogą one byś wykorzystywane jako pasza po pewnej przeróbce, mogą być też poddawane fermentacji beztlenowej z odpowiednią mieszanką mikroflory. Wtedy otrzymuje się 65% metanu i pewną ilość dwutlenku węgla i amoniaku, czyli otrzymuję się biogaz. Jeżeli robiło się alkohol z melasy to można otrzymać 290 litrów gazu na litr otrzymanego uprzednia alkoholu. Ze ścieków posulfitowych 230 litrów gazu, ze skrobi kukurydzianej 80 litrów. Odpady pogorzelniane można stosować jako nawóz, ma on w tym momencie, kiedy rozrzuci się go na polu bardzo nieprzyjemny zapach.

Etanol - proces fermentacyjny

1. substraty sacharozowe (najdroższe):

• sok z trzciny cukrowej (koszty transportu, tnie się i mieli trzcinę, wyciska w odpowiednich prasach, ekstrahuje ciepłą wodą i uzyskuje się w ten sposób do 90% ekstrakcji cukru)

• sok z buraków cukrowych (ciągła ekstrakcja wodą w 85˚C, pozostającą pulpę celulozową wykorzystuje się jako paszę)

• wysokocukrowe melasy (zatężone roztwory cukru, by mogły być wykorzystywane przez mikroorganizmy poprzez częściową hydrolizę rozcieńczonym kwasem, sacharoza → glukoza + fruktoza)

• końcowe melasy (to co pozostaje z produkcji cukru spożywczego, czyli nie krystalizujące pozostałości)

• słodkie sorgo (wykorzystywane także jako pasza)

• serwatka

2. substraty skrobiowe (tańsze, wstępna obróbka - wymagają konwersji skrobi do cukrów fermentujących):

• nasiona zbóż, skrobia bulw, niektóre kaktusy

Skrobię przerabia się w podobny sposób jak w czasie procesu konwersji skrobi. W tym przypadku pochłania to około 20% kosztów produkcji etanolu. W USA wykorzystuje się skrobię kukurydzianą, w innych krajach skrobię tych roślin, które w tym klimacie się najlepiej rozwijają (pszenica, jęczmień, żyto, sorgo, ryż, bulwy ziemniaczane).

3. substraty celulozowe (dla produkcji alkoholu etylowego jako alternatywnego źródła paliwa, ograniczenia kosztami transportu i ograniczenia przeróbką wstępną do takich cukrów, które byłyby fermentowalne):

• celuloza, hemiceluloza, ligniny (wszystko to co znajduje się w drewnie)

• ścieki celulozowe z papierni

• ścieki posulfitowe (ścieki pochodzące z produkcji pulpy celulozowej - wymagają usunięcia toksyn, dlatego że te toksyny nie mogą znaleźć się w procesie produkcji etanolu).

Istnieją dwa procesy przygotowania substratów celulozowych (najtańsze substraty ale najdroższe w obróbce).

Substraty celulozowe poddaje się wolnej kwaśnej hydrolizie (0,8 - 1% H₂SO₄ lub 40 - 45% H₂SO₄). Nawet jeżeli stosuje się metody biologiczne, o których się mówi, że są naturalne, że są przyjazne dla środowiska, że go nie zanieczyszczają, bo nie wymagają takich nakładów energetycznych, to jednak w bardzo wielu takich procesach żeby można było tą biologię zastosować, trzeba taką ostrą chemie, która i szkodzi i truje i wymaga nakładów energetycznych też zastosować. Poza tym po każdej biotechnologii, po każdej reakcji enzymatycznej czy mikrobiologicznej jest proces chemicznego oczyszczania. Wolną, kwaśną hydrolizę wykonuje się w kotłach kwasowo - ciśnieniowych, odpornych na wysokie ciśnienia (350 kPa - 1135 hPa), ogrzewa się to wszystko parą wodną, kwas jest przeprowadzany cały czas w kółko przez zawartość takiego kotła. Trwa to 2,5 - 3,5 godziny, potem neutralizuje się wapnem. Mamy substrat dla produkcji paliwa drogą fermentacyjną. Taki proces jest wykorzystywany w Nowej Zelandii, Rosji, Brazylii.

Druga możliwość to szybka kwaśna hydroliza. Ta szybkość jest osiągana dzięki ciśnieniu 3450 hPa i temperaturze 240˚C i 0,5 % H₂SO₄. W ciągu 60 s daje 60% konwersji cukru. Instalacje pilotowe dla tego procesu funkcjonują w USA.

Alternatywą miłą dla środowiska są konwersję wykonywane na materiale nieprzyjemnym za pomocą enzymów, za pomocą mikroorganizmów, które wytwarzają enzymy cellulolityczne, ligninolityczne, najczęściej tymi organizmami są wyselekcjonowane grzyby. Procesy te wymagają niskiej temperatury i ciśnienia (obniżenie kosztów), nie trzeba niczego neutralizować, nie trzeba się obawiać dekompozycji, rozkładu cukrów. Te mikroorganizmy, które maja tu zastosowanie - mikroorganizmy cellulolityczne, czyli głównie grzyby (Tusarin, Trichoderna). Wstępna obróbka polega na mieleniu i denitryfikacji.

W przemysłowym otrzymywaniu etanolu w procesie fermentacji wykorzystuje się głównie drożdże, są one odpowiednio wyselekcjonowane, są wydajne, odporne na stężenia substratów i produktów, są większe niż bakterie w związku z tym łatwo je oddzielić. Fermentacja przebiega w ten sposób, że otrzymuje się tylko ślady produktów ubocznych. Termofilne mikroorganizmy różnych gatunków (Clostridium thermosacharolyticum, Thermoahareobacter ethamolicus), próbuje się wykorzystać z tego względu, że moją one zdolności utleniania cukrów innych niż heksozy, czyli tego czego drożdże nie rozkładają. Głównie chodzi tu o pentozy, których w przypadku substratów celulozowych jest bardzo dużo ale ta produkcja jest obarczona powstawaniem dużej ilości produktów ubocznych, a poza tym wymaga warunków beztlenowych. Wykorzystywane są bakterie Zymomonas mobilis fermentujące glukozę 10% i ↑ pochodzącą od drożdży. Są jednak mniej odporne na etanol i są trudniejsze do odparowania.

Idealny mikroorganizm, które mogą być wykorzystywane w przemyśle jako producent etanolu na dużą skalę to jest organizm, który ma zdolność szybkiego fermentowania (jego metabolizm jest szybki i wydajny), wykorzystuje pentozy (drożdże tu wysiadają), ma wysoką tolerancję na alkohol. Ponieważ oprócz wykorzystania pentoz wszystkie te cechy spełniają drożdże w związku z tym drożdże są tu tym mikroorganizmem, który się wykorzystuje jako mikroorganizm produkujący.

Cechy drożdży (otrzymywane metodami inżynierii genetycznej:

• szybki wzrost

• wysoka wydajność

• tolerancja na etanol i glukozę

• osmotolerancja

• niskie optimum pH

• odporność na stres chemiczny i fizyczny.

Biochemia procesu fermentacyjnego

C₆H₁₂O₆ → 2C₂H₅OH + 2CO₂ + ATP

Z jednego gramu glukozy otrzymuje się 0,511 gram etanolu w procesie fermentacji. Reakcje uboczne, takie jak tworzenie biomasy powodują zużycie glukozy, to jest powodem tego że nie jeden na jeden a jeden na pół. Dodatkowo drożdże wymagają pewnych dodatków, takich jak: NH₄Cl, MgSO₄, CaCl_2, ekstrakt drożdżowy zawierający witaminy niezbędne drożdżom.

Proces jest okresowy. Polega on na przygotowaniu aktywnego inokulum, a to się robi tak jak w każdym procesie wykorzystującym proces fermentacji, czyli szereg bioreaktorów o wzrastającej objętości. Warunki są tutaj tlenowe. Inokulum przygotowuje się w taki sposób, że w ciągu 5 godzin otrzymuje się 5000 komórek na litr. W każdym procesie produkcyjnym bazującym na biomasie, liczy się komórki, stąd istnieją sposoby, które umożliwiają policzyć ile jest mikroorganizmów, ile jest żywych komórek. Przygotowanie odpowiedniej biomasy jest cały czas monitorowane. Proces fermentacji trwa od 40 do 70 godzin w zależności od surowca. Następnie destylacja, oczyszczanie i mycie fermentora i zaczyna się następną szarżę, dlatego ten proces nazywa się procesem okresowym.

Występuje pewna odmiana tego procesu. Jest to tzw. proces Melle - Boint, który wymaga krótszego czasu i pozwala na zwiększenie wydajności, dlatego że używa się do zaszczepu następnej szarży drożdży z poprzedniego cyklu. Omija się tutaj etap przygotowania aktywnego inokulum. Stosuje się w Europie wtedy, gdy substratem do produkcji etanolu używa się melasy.

Proces ciągły opracowano tylko dla ługów posulfitowych, czyli dla otrzymywania etanolu dla celów technicznych, dlatego ze one same w sobie są sterylne, bo to tak niesympatyczny i brudny surowiec, że trudno założyć, żeby się to czymś zaraziło, poza tym nie prowadzi się tej fermentacji za pomocą drożdży, tylko wyselekcjonowaną, specyficzną mikroflorą.

Oczyszczanie alkoholu niezależnie od procesu produkcji jest bardzo energochłonne - powyżej 50% kosztów produkcji drogą fermentacji. Różne destylacje, np. destylacja azeotropowa benzenem.

Zapamiętać! kwas itakonowy, kwas octowy, etanol.

Biotechnologia w rolnictwie.

Pod koniec XIX wieku zaczęto stosować mechanizację w rolnictwie. Na początku XX wieku (lata 40-ste) zaczęto w rolnictwie stosować chemizację, a pod koniec XX wieku zaczęła w rolnictwo wkraczać biotechnologia.

Jeżeli chodzi o biotechnologię w rolnictwie to należy pamiętać o transgenicznych roślinach, zwierzętach i mikroorganizmach.

Transgeniczne rośliny pojawiły się w literaturze i laboratoriach na początku lat 80-tych. W połowie la 80-tych zaczęto stosować pierwsze testy polowe. W latach 86 - 92 było już 675 badań polowych na 31 gruntach w 28 krajach. Komercyjne uprawy zaczęły się w latach 90-tych. W 1996 roku było 2,8 mln hektarów obsianych roślinami transgenicznymi. W 1997 12,5 mln, a w 1998 31,4 mln hektarów.

Transgeniczne rośliny:

• ziemniaki odporne na stonkę i grzyby

• zboża odporne na herbicydy

• pomidory o przedłużonym okresie dojrzewania

• rzepak o zmienionym składzie kwasów tłuszczowych.

W roku 1994 zaczęto również wprowadzać pierwsze transgeniczne produkty w innych dziedzinach niż uprawa roślin. W tymże roku amerykańska firma MONSANTO (firma chemiczna i biotechnologiczna) uzyskała licencję na wprowadzenie na rynek USA rekombinowanego hormonu wzrostu wołu. Chodziło tu o to, by uzyskiwać ten hormon wzrostu rekombinowanymi bakteriami, szpikować bydło i otrzymywać o wiele bardziej mięsne zwierzęta. Ta firma uzyskała także rośliny transgeniczne, które wytwarzają białko, o którym słyszeliśmy na seminarium (charakterystyczne dla Bacillus thuringensis), który jest naturalnym inserktycydem.

W Uni Europejskiej przyjęły się trzy odmiany modyfikowanej genetycznie kukurydzy:

• odporna na szkodniki (MONSANTO)

• odporna na herbicydy - wbudowano geny odpowiedzialne za ekspresję enzymów dezaktywujących określone herbicydy, znalezione u mikroorganizmów (AGREVO)

• odporna do kwadratu, czyli odporna na szkodniki i herbicydy (NOVARTIS)

Pierwszą ważną z historycznego punktu widzenia rośliną wprowadzoną na rynek był transgeniczny pomidor o nazwie FLAVC SAVR, czyli pomidor o przedłużonym okresie dojrzewania.

Firma MONSANTO w 1997 roku wypłaciła duże odszkodowania 50 farmerom, którzy użyli nasion bawełny wyprodukowanych przez tą firmę. Ta bawełna była odporna na jeden z herbicydów (herbicyd najlepszy bo totalny - ramdap) ale zbiory były o wiele niższe.

13

Biotechnologia otrzymywania polisacharydów pochodzenia mikrobiologicznego.

---