TRANSPORT PĘCHERZYKOWY
Białka wydzielnicze są uwalniane z komórki w drodze egzocytozy
We wszystkich komórkach eukariotycznych zachodzi stały przepływ pęcherzyków, które pączkują z sieci trans AG i ulegają fuzji z błoną komórkową.
Ten szlak konstytutywnej egzocytozy (wydzielanie ciągłe, niezależne od bodźców zewnętrznych) działa w sposób ciągły i dostarcza nowo powstałe lipidy i białka do błony komórkowej; jest to droga zapewniająca wzrost błony komórkowej w czasie powiększania się komórek przed ich podziałem. Niesie ona również w procesie wydzielania (sekrecji), białka, które mają być wydzielone na zewnątrz. Pewne wydzielone białka przywierają do powierzchni komórki i stają się powierzchniowymi białkami błony komórkowej, niektóre są wbudowywane w substancję międzykomórkową, a jeszcze inne dyfundują do płynu, międzykomórkowego, aby odżywiać inne komórki lub stanowić dla nich sygnały.
Poza drogą konstytutywnej egzocytozy działającej we wszystkich komórkach eukariotycznych w sposób ciągły, istnieje droga egzocytozy regulowanej (wydzielanie okresowe, zachodzące pod wpływem bodźców), która funkcjonuje tylko w komórkach wyspecjalizowanych w wydzielaniu. Wyspecjalizowane komórki wydzielnicze wytwarzają duże ilości szczególnych produktów, takich jak hormony, śluz lub enzymy trawienne, które są magazynowane w pęcherzykach wydzielniczych. Pęcherzyki wydzielnicze odpączkowują z sieci trans AG i nagromadzają się w pobliżu błony komórkowej. Ulegają one fuzji z błoną komórkową i uwalniają swą zawartość na zewnątrz tylko wtedy, gdy komórka zostanie pobudzona przez sygnał zewnątrzkomórkowy. Na przykład, wzrost stężenia glukozy we krwi jest dla komórek trzustki sygnałem do wydzielenia hormonu insuliny.
Białka przeznaczone do pęcherzyków wydzielniczych są sortowane i pakowane w sieci trans AG. Białka wędrujące tą drogą mają właściwości wywołujące ich agregację w warunkach jonowych panujących w sieci trans AG (środowisko kwaśne i wysoki poziom Ca2+). Zagregowane białka są rozpoznawane przez nieznany mechanizm i pakowane do pęcherzyków wydzielniczych, które odrywają się od strefy trans. Białka wydzielane w drodze konstytutywnej nie agregują i dlatego są automatycznie przenoszone do błony komórkowej przez pęcherzyki transportujące drogi konstytutywnej. Selektywna agregacja pozwala na gęste upakowanie białek wydzielniczych w pęcherzykach wydzielniczych, do stężeń 200 razy większych niż stężenie niezagregowanych białek w świetle cystern AG. Zawartość takich pęcherzyków jest zagęszczana a ich rozmiar ulega zmniejszeniu - przekształcają się w ziarna wydzielnicze. To umożliwia komórkom wydzielniczym szybkie wydzielenie wielkich ilości białka, gdy zostaną do tego pobudzone.
Gdy pęcherzyk wydzielniczy lub pęcherzyk transportujący ulega fuzji z błoną komórkową i wyładowuje swą zawartość w drodze egzocytozy, jego błona staje się częścią błony komórkowej. Aczkolwiek powinno to znacznie zwiększyć powierzchnię błony komórkowej, zwiększenie takie jest tylko przejściowe, ponieważ składniki błony są usuwane z innych obszarów powierzchni w drodze endocytozy prawie tak samo szybko, jak zostały one dodane przez egzocytozę. To usuwanie błony przywraca zarówno lipidy, jak i białka pęcherzyków błonowych do sieci trans AG, gdzie mogą być użyte ponownie.
Wyróżnia się dwa główne typy endocytozy na podstawie wielkości powstających pęcherzyków endocytotycznych. Pinocytoza („picie przez komórkę") — to wchłanianie płynu i cząsteczek przez małe pęcherzyki (o średnicy < 150 nm). Fagocytoza („jedzenie przez komórkę") — to wchłanianie dużych cząstek, np. mikroorganizmów i szczątków komórkowych, przez duże pęcherzyki - fagosomy (o średnicy > 250 nm). O ile wszystkie komórki eukariotyczne ustawicznie wchłaniają płyn i cząsteczki przez pinocytozę, o tyle duże cząstki są wchłaniane głównie przez wyspecjalizowane komórki fagocytujące, np. makrofagi.
Wyspecjalizowane komórki fagocytujące wchłaniają duże cząstki
U pierwotniaków fagocytoza jest formą pobierania pokarmu; duże cząstki, np. bakterie, są pobierane do fagosomów, które następnie łączą się przez fuzję z lizosomami, gdzie cząstki pokarmu ulegają strawieniu. W organizmach wielokomórkowych tylko nieliczne komórki mogą wchłaniać duże cząstki. W jelicie zwierząt duże cząstki pokarmowe muszą zostać najpierw rozłożone przez enzymy zewnątrzkomórkowe do pojedynczych cząsteczek, zanim będą mogły być pobrane przez komórki absorpcyjne, wyścielające jelito.
Niemniej jednak, fagocytoza jest u większości zwierząt procesem ważnym dla celów innych niż odżywianie. Najbardziej wydajnie jest prowadzona przez komórki fagocytujące, takie jak makrofagi, szeroko rozpowszechnione w tkankach i pewne krwinki białe. Komórki fagocytujące bronią organizm przed infekcją, wchłaniając atakujące mikroorganizmy. Aby jakaś cząstka została wchłonięta przez makrofaga lub krwinkę białą, musi wpierw zostać związana do jej powierzchni i uaktywnić jeden z wielu receptorów powierzchniowych, który zaindukuje wysuwanie płatowatych wypustek błony komórkowej, zwanych pseudopodiami, które otaczają bakterie i łączą się na swoich końcach tworząc fagosom. Komórki fagocytujące odgrywają również ważną rolę w usuwaniu martwych i uszkodzonych komórek oraz szczątków komórkowych. Na przykład makrofagi wchłaniają każdego dnia ponad 1011 naszych zużytych erytrocytów.
Płyn i makrocząsteczki są pobierane na drodze pinocytozy
Komórki eukariotyczne ustawicznie wciągają małe fragmenty swojej błony komórkowej w postaci drobnych pęcherzyków pinocytotycznych, które później wracają do powierzchni komórki.
Na przykład makrofag w każdej godzinie wchłania ilość płynu odpowiadającą 25% jego własnej objętości. Oznacza to, że wchłania on co minuta 3% swojej błony komórkowej, co odpowiada wchłonięciu 100% błony w ciągu pół godziny. Ponieważ całkowita powierzchnia i objętość komórki pozostają podczas tego procesu niezmienione, jest oczywiste, że tyle samo błony jest dodawane do powierzchni komórki przez fuzję pęcherzyków przy egzocytozie, ile jest usuwanych w drodze endocytozy.
Pinocytoza jest zazwyczaj przeprowadzana przez dołki i pęcherzyki opłaszczone klatryną,. Po oderwaniu się od błony komórkowej pęcherzyki okryte klatryną szybko zrzucają swój płaszcz i łączą się przez fuzję z endosomem. Dołki opłaszczone po inwaginacji tworzą pęcherzyki opłaszczone, zamykające w sobie część płynu zewnątrzkomórkowego, wraz z rozpuszczonymi w nim substancjami i następnie wprowadzają je do endosomu. To pobieranie płynu jest w zasadzie zrównoważone utratą płynu zachodzącą podczas egzocytozy.
Endocytoza przebiegająca z udziałem receptorów stanowi specyficzną drogę prowadzącą do wnętrza komórek zwierzęcych
Pinocytoza, nie jest procesem wybiórczym. Pęcherzyki endocytotyczne po prostu zamykają w sobie jakiekolwiek cząsteczki przypadkowo obecne w płynie zewnątrzkomórkowym i przenoszą je do wnętrza komórki. Jednak w większości komórek zwierzęcych pinocytoza prowadzona poprzez pęcherzyki okryte klatryną stanowi równocześnie efektywną drogę pobierania z płynu zewnątrzkomórkowego specyficznych makrocząsteczek (ligandów). Te ostatnie wiążą się z komplementarnymi receptorami na powierzchni komórki i wnikają do wnętrza komórki jako kompleksy makrocząsteczek z receptorami, zawarte w pęcherzykach zamkniętych klatryną. Proces ten — nazywany endocytozą kierowaną receptorami (receptorową) — stanowi selektywny mechanizm zagęszczający, który w porównaniu ze zwykłą pinocytozą zwiększa ponad 1000 razy wydajność pobierania określonych makrocząsteczek. W konsekwencji nawet te składniki płynu zewnątrzkomórkowego, które występują w niewielkim stężeniu, mogą być wchłonięte bez pobierania odpowiednio dużej ilości płynu zewnątrzkomórkowego. Ważnym przykładem endocytozy kierowanej przez receptory w komórkach zwierzęcych jest pobieranie cholesterolu, potrzebnego do wzrostu błon.
Cholesterol jest bardzo trudno rozpuszczalny i transportowany w krwiobiegu w postaci związanej z białkami jako cząstki o nazwie lipoproteiny o malej gęstości, czyli LDL (ang. low-density lipoproteins). Cząstki LDL wiążą się z receptorami umieszczonymi na powierzchni komórki, a tak powstałe kompleksy są wchłaniane na drodze endocytozy kierowanej przez receptory i doprowadzane do endosomów. Wnętrze endosomów jest bardziej kwaśne niż otaczający je cytozol lub płyn zewnątrzkomórkowy i to kwaśne środowisko powoduje oddysocjowanie cząstek LDL od ich receptorów. Receptory powracają w pęcherzykach transportujących do błony komórkowej, gdzie są używane ponownie, natomiast cząstki LDL są dostarczane do lizosomów. W lizosomach cząstki LDL są rozkładane przez enzymy hydrolityczne; cholesterol zostaje uwolniony i przechodzi do cytozolu, skąd jest pobierany podczas syntezy nowych fragmentów błony. Receptory LDL są z powierzchni komórki stale wycofywane do wnętrza komórki i ulegają recyklizacji, niezależnie od tego, czy są związane z LDL.
Ta droga pobierania cholesterolu jest przerwana u osób, które odziedziczyły uszkodzony gen kodujący białkowy receptor LDL. W pewnych przypadkach receptorów w ogóle brakuje, a w innych są obecne, ale niefunkcjonalne. Ponieważ w każdym z tych przypadków komórki nie są zdolne do pobierania LDL, u osób takich cholesterol akumuluje się we krwi, powodując predyspozycję do powstania arteriosklerozy. Większość tych osób umiera wcześnie na zawał, powodowany zaczopowaniem tętnic zaopatrujących serce.
Innymi makrocząsteczkami (ligandami) wchłanianymi przez komórkę są np. transferyna (glikoproteina osocza krwi transportująca do komórek żelazo), witellogenina (forma prekursorowi białek żółtka w jajach), czynniki wzrostowe, hormony polipeptydowe (np. insulina), wirusy, toksyny bakterii.
Endocytozą za pośrednictwem receptorów jest używana też do pobierania wielu innych istotnych metabolitów, takich jak witamina B12 i żelazo, których komórka nie może pobrać mechanizmami transportu błonowego. Zarówno witamina BI2, jak i żelazo wnikają do niedojrzałej krwinki czerwonej jako kompleksy z białkiem. Tą drogą są wchłaniane również liczne receptory powierzchniowe, które wiążą zewnątrzkomórkowe cząsteczki sygnałowe; niektóre przez recyklizację powracają do błony komórkowej do powtórnego użycia, inne natomiast są degradowane w lizosomach. Niestety, endocytoza przebiegająca za pomocą receptorów może być wykorzystana przez wirusy; tą drogą wchodzą do komórki wirusy grypy, a także wirus HIV.
Makrocząsteczki doprowadzone przez endocytozę są sortowane w endosomach
Materiał zewnątrzkomórkowy pobrany w drodze pinocytozy jest szybko przenoszony do endosomów - złożonego zespołu połączonych ze sobą cewek błonowych i większych pęcherzyków. Wyróżnia się dwa zespoły endosomów: endosomy wczesne, leżące tuż pod błoną komórkową, oraz endosomy późne - w pobliżu jądra. Wnętrze przedziału tworzonego przez endosomy ma odczyn kwaśny (pH 5-6) dzięki działaniu w błonach tych organelli protonowej ATPazy transportującej, która pompuje H+ z cytozolu do światła endosomów.
Przedział utworzony przez endosomy jest głównym miejscem sortowania na prowadzącej do wnętrza komórki drodze endocytozy, tak jak sieć trans AG pełni tę funkcję w prowadzącej na zewnątrz drodze sekrecyjnej. Kwaśne środowisko w endosomach odgrywa kluczową rolę w procesie sortowania, zmuszając wiele receptorów do uwolnienia związanego z nimi cargo (ładunku). Drogi, którymi będą wędrowały receptory po wejściu do endosomów, różnią się w zależności od typu receptora:
1) większość wraca do tej samej domeny błony komórkowej, z której przybyły, jak to jest w przypadku receptora LDL,
2) pewne wędrują do lizosomów, gdzie ulegają degradacji,
3) niektóre są przemieszczane do odmiennych domen błony komórkowej, przenosząc przez to swoje cargo cząsteczek z jednej przestrzeni zewnątrzkomórkowej do drugiej — w procesie zwanym transcytozą.
Cząsteczki cargo, które pozostają związane ze swoimi receptorami, dzielą los tych receptorów. Te, które oddysocjowują od swoich receptorów w endosomie, są skazane, wraz z większością zawartości endosomu, na destrukcję w lizosomach.
Lizosomy są głównym miejscem trawienia wewnątrzkomórkowego
Wiele cząsteczek zewnątrzkomórkowych wchłoniętych przez komórki kończy swą drogę w lizosomach. Podobnie jak inne organelle komórkowe, lizosomy mają zarówno specyficzny zestaw enzymów, jak i specyficzną błonę ograniczającą. Błona lizosomów zawiera białka transportujące, które umożliwiają przeniesienie końcowych produktów trawienia makrocząsteczek, takich jak aminokwasy, cukry i nukleotydy — do cytozolu, gdzie mogą być użyte przez komórkę lub skąd mogą być wydalone poza obręb komórki. Błona ta, podobnie jak błona endosomów, zawiera ATPazę transportującą H+, która pompuje H+ do wnętrza lizosomu, podtrzymując kwaśne pH jego wnętrza. Większość białek błony lizosomu jest niezwykle silnie glikozylowana, a cukry, które pokrywają większość powierzchni białek skierowanych do światła lizosomu, ochraniają te białka przed strawieniem przez proteazy lizosomowe.
Wyspecjalizowane enzymy trawienne i białka błon lizosomu są syntetyzowane w ER i transportowane przez aparat Golgiego do jego sieci trans. Podczas pobytu w ER i sieci cis AG enzymy zostają oznakowane specyficzną ufosforylowaną grupą cukrową (mannozo-6-fosforan) tak, iż dochodząc do sieci trans AG są rozpoznawane przez odpowiedni receptor mannozo-6-fosforanu, a przez to wysortowane i upakowane do pęcherzyków transportujących, które odpączkowują i dostarczają swą zawartość do lizosomów poprzez późne endosomy.
W zależności od swego pochodzenia materiały docierają do lizosomów różnymi drogami. Cząstki zewnątrzkomórkowe są pobierane do fagosomów, które ulegają fuzji z lizosomami, oraz że płyn ze-wnątrzkomórkowy i makrocząsteczki są pobierane do mniejszych pęcherzyków - endosomów biorących udział w endocytozie receptorowej i dostarczających swą zawartość do lizosomów. Komórki mają również dodatkową drogę dostarczania materiałów do lizosomów, używaną do degradacji zużytych części samej komórki. Proces rozpoczyna się prawdopodobnie otoczeniem organelli przez błony pochodzące z ER, co tworzy cytosegregosom, który następnie ulega fuzji z lizosomom tworząc autofagosom.
Pęcherzyki transportujące przenoszą białka rozpuszczalne i błony między przedziałami
Ruch pęcherzyków między przedziałami systemu błon wewnętrznych odbywa się albo na zewnątrz komórki (transport anterogradowy = droga sekrecyjna, kończąca się wydzieleniem niesionych przez pęcherzyk białek na zewnatrz) albo też do wnętrza komórki (transport retrogradowy = droga endocytozy odpowiedzialna za wchłanianie i degradację cząsteczek spoza komórki, prowadzi od błony komórkowej, do lizosomów).
Aby przeprowadzić swą funkcję właściwie, każdy pęcherzyk transportujący, który odpączkowuje z danego przedziału, musi zabrać ze sobą tylko białka odpowiednie dla przedziału docelowego i musi ulec fuzji tylko z odpowiednią błoną docelową. Na przykład, pęcherzyk niosąc cargo (ładunek) z aparatu Golgiego do błony komórkowej nie może przyjąć białek, które mają pozostać w aparacie Golgiego i może ulec fuzji tylko z błoną komórkową, a nie z błoną jakiejkolwiek innej organelli. Biorąc udział w tym ustawicznym przepływie składników błonowych, każda organella musi zachować swą własną odrębność, to jest swój własny wyróżniający skład białek i lipidów. Wszystkie te procesy rozpoznawania się zależą od białek związanych z błoną pęcherzyków transportujących.
Pączkowaniem pęcherzyków kieruje układ białek opłaszczających
Pęcherzyki odpączkowujące z błon mają zazwyczaj na swojej cytozolowej powierzchni charakterystyczny płaszcz białkowy i dlatego nazwano je pęcherzykami opłaszczonymi. Po ukończeniu pączkowania płaszcz zostaje utracony, co pozwala błonie pęcherzyka oddziaływać bezpośrednio z błoną, z którą ma się złączyć przez fuzję. Istnieje kilka rodzajów pęcherzyków opłaszczonych, różniących się składem białkowego płaszcza. Uważa się, że płaszcz ma przynajmniej dwie funkcje: formuje błonę podczas tworzenia pęcherzyka i współdziałania przy wychwytywaniu cząsteczek, które mają być dalej transportowane.
Najlepiej zbadane są pęcherzyki, których płaszcz tworzy głównie białko klatryna; są to pęcherzyki okryte klatryną. Odpączkowują one zarówno z aparatu Golgiego w skierowanej na zewnątrz drodze sekrecyjnej oraz z błony komórkowej w skierowanej do wewnątrz drodze endocytozy. Na przykład, przy błonie komórkowej każdy pęcherzyk powstaje początkowo jako dołek oplaszczony klatryną. Cząsteczki klatryny układają się na cytozolowej powierzchni błony w rodzaj koszyka, który kształtuje błonę w pęcherzyk. Wokół szyjki głęboko wpuklonej błony tworzy się pierścień z dynaminy, małego białka wiążącego GTP. Następnie dynamina hydrolizuje związany z nią GTP, co powoduje obciśnięcie pierścienia, a przez to oderwanie pęcherzyka od błony. W transporcie pęcherzykowym biorą również udział inne rodzaje pęcherzyków transportujących o odmiennych białkach opłaszczających. Powstają one w podobny sposób i przenoszą charakterystyczne dla siebie zestawy cząsteczek pomiędzy ER, aparatem Golgiego i błoną komórkową.
Sama klatryna nie odgrywa żadnej roli w wychwytywaniu specyficznych cząsteczek przeznaczonych do transportu. Funkcję tę w pęcherzykach opłaszczonych klatryną pełni odmienna klasa białek opłaszczających, o nazwie adaptyny, zarówno wiążących płaszcz z błoną pęcherzyka, jak i pomagających w selekcji cząsteczek, które mają być transportowane. Cząsteczki przeznaczone do transportu (cargo = ładunek) mają specyficzne sygnały transportu, które są rozpoznawane przez receptory cargo, znajdujące się w błonie przedziału wyjściowego. Adaptyny pomagają w wychwyceniu określonych cząsteczek cargo przez przechwytywanie receptorów cargo i połączonych z nimi cząsteczek cargo. W ten sposób wyselekcjonowany zestaw cząsteczek ładunku, związanych ze swoimi specyficznymi receptorami, zostaje wprowadzony do wnętrza każdego nowo powstającego pęcherzyka opłaszczonego klatryną.
Odmienna klasa pęcherzyków opłaszczonych, o nazwie pęcherzyki opłaszczone białkami COP, bierze udział w przenoszeniu cząsteczek pomiędzy ER a aparatem Golgiego oraz między poszczególnymi strefami aparatu Golgiego.
Niektóre typy pęcherzyków opłaszczonych
Typ pęcherzyka opłaszczonego
Białka płaszcza
Pochodzenie
Przeznaczenie
Okryty klatryną
klatryną + adaptyna 1
aparat Golgiego
lizosom (poprzez endosomy)
Okryty klatryną
klatryną + adaptyna 2
błona komórkowa
endosomy
Okryte białkami COP
białka COP
ER,
cysterna Golgiego
aparat Golgiego
aparat Golgiego
cysterna Golgiego,
ER
Specyficzność przywierania pęcherzyków do błony zależy od białek SNARE
Pęcherzyk transportujący, który oderwał się od błony, musi odnaleźć swą drogę do właściwego celu, gdzie przekaże swą zawartość. Jeśli odległość jest mała — tak jak między ER a aparatem Golgiego — pęcherzyk przemieszcza się w drodze prostej dyfuzji. Jeśli odległość jest duża — taka jak od aparatu Golgiego do zakończenia aksonu komórki nerwowej — pęcherzyki są transportowane aktywnie przez białka motoryczne, które poruszają się wzdłuż włókienek cytoszkieletu.
Gdy pęcherzyk transportujący osiągnie swą docelową organellę, musi ją rozpoznać i związać się z nią. Tylko wtedy może nastąpić fuzja błony pęcherzyka z błoną docelową i wyładowanie niesionego cargo. Wszystkie typy pęcherzyków transportujących w komórce mają na swej powierzchni znaczniki molekularne, które identyfikują pęcherzyk zależnie od jego pochodzenia i zawartości. Znaczniki te muszą zostać rozpoznane przez komplementarne receptory na powierzchni odpowiedniej błony docelowej, łącznie z błoną komórkową. Uważa się, że w rozpoznawaniu pęcherzyków bierze udział rodzina pokrewnych sobie białek transbłonowych o nazwie SNARE (ang. SNAP receptors). Białka SNARE pęcherzyków (nazywane v-SNARE) są specyficznie rozpoznawane przez komplementarne białka SNARE na cytozolowej powierzchni błony docelowej (nazywane t-SNARE). Uważa się, że każda organella i każdy typ pęcherzyka transportującego niesie specyficzne dla siebie białka SNARE, a poprawność fuzji pęcherzyka z właściwą błoną jest zapewniona oddziaływaniem pomiędzy komplementarnymi białkami SNARE.
Po rozpoznaniu przez pęcherzyk transportujący jego błony docelowej i przywarciu do niej, przekazanie ładunku do nowego przedziału wymaga fuzji pęcherzyka z błoną tego przedziału. Fuzja nie tylko dostarcza zawartość pęcherzyka do wnętrza docelowej organelli, ale również wbudowuje błonę pęcherzyka do błony organelli. Jednakże fuzja nie zawsze następuje zaraz po przywarciu obu błon i często musi oczekiwać na specyficzny sygnał uruchamiający. O ile przywarcie (dokowanie) wymaga tylko dostatecznego zbliżenia błon pozwalającego na interakcję białek wystających z błon obu spotykających się struktur, o tyle proces fuzji wymaga kontaktu znacznie bliższego, na odległość mniejszą niż 1,5 nm. Aby to nastąpiło, niezbędne jest usunięcie wody z hydrofilowych powierzchni błon, proces energetycznie bardzo niekorzystny. Jest więc wielce prawdopodobne, że fuzja błon w komórce jest katalizowana przez wyspecjalizowane białka tworzące w miejscu fuzji kompleks fuzyjny, który właśnie umożliwia przekroczenie takiej bariery energetycznej.