gr. 11
WNOŻCiK
PCR - REAKCJA ŁAŃCUCHOWA POLIMERAZY
Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) - łańcuchowa reakcja polimeryzacji, metoda powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, polegająca na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. Do reakcji wprowadza się matrycowy DNA, trifosforany deoksyrybonukleotydów, startery oraz termostabilną polimerazę.
Przebieg PCR:
1) Reakcja rozpoczyna się denaturacją w 93-96°C, której zadaniem jest rozplecenie podwójnych nici DNA.
2) Po ochłodzeniu mieszaniny reakcyjnej do zazwyczaj empirycznie dobranej temperatury (42-68°C) następuje przyłączenie starterów do matrycy. Utworzenie takich krótkich odcinków dwuniciowych rozpoczyna proces replikacji.
3) W czasie inkubacji w temperaturze 72°C następuje wydłużanie nici (elongacja). Począwszy od końca 3' startera enzym "dokłada" kolejne, komplementarne w stosunku do matrycy nukleotydy w tempie około kilkudziesięciu na sekundę. Synteza przebiega jednocześnie na obu komplementarnych niciach matrycy. Po elongacji następuje ponownie podgrzanie mieszaniny do temperatury denaturacji i cykl może się rozpocząć od nowa.
Zastosowanie:
PCR jest stosowana praktycznie w każdej dziedzinie biologii molekularnej. Może być narzędziem w poszukiwaniu mutacji i zmienności genetycznej populacji, pozwala z niewiarygodną czułością wykazać obecność śladowej liczby komórek nowotworowych we krwi, prątków gruźlicy w plwocinie czy wirusa brodawczaka w wymazie z szyjki macicy. PCR zastępuje techniki hybrydyzacyjne w selekcji klonów z bibliotek genowych, umożliwia szybkie poszukiwanie nowych genów i ich lokalizację na chromosomach. Stosuje się ją także w diagnostyce chorób dziedzicznych, ustalaniu ojcostwa, w kryminalistyce przy ustalaniu pochodzenia śladów krwi, do powielania DNA ze szczątków organizmów wymarłych, wykrywania wirusów we krwi, np. wirusa HIV.
gr.11
Prezentacja: „Chromatografia cieczowa”
Chromatografia to technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdzielania mieszaniny związków chemicznych na grupy
i badania ich składu metodą selektywnej adsorbcji.
Chromatografia cieczowa - metoda rozdzielania, identyfikacji i oznaczenia (analizy jakościowej i ilościowej) składników mieszanin w postaci ciekłej (najczęściej w postaci roztworów w rozpuszczalnikach organicznych). Fazę ruchomą (eluent) stanowi ciekły rozpuszczalnik (woda, eter naftowy, chloroform, CCl4, cykloheksan, estry, alkohole,
kwasy organicze), a fazę stacjonarną - stały absorbent np. krzemionka (w postaci żelu), węgiel aktywowany.
Rodzaje chromatografii cieczowej:
chromatografia cienkowarstwowa - w której złoże (zwykle żel krzemionkowy) jest nałożone na płytkę szklaną lub plastikową w formie cienkiej, sprasowanej formy. Rozdział następuje poprzez powolne wnikanie roztworu w złoże
chromatografia kolumnowa - w której złoże umieszcza się
w kolumnie, po czym przez kolumnę przepuszcza się roztwór analizowanej mieszaniny - jej szczególnym przypadkiem jest HPLC
elektroforeza - jest formą chromatografii cienkowarstwowej, w której jednak najpierw nasącza się złoże mieszaniną,
a rozdział następuje na skutek działania pola elektrycznego
Zastosowanie metody:
• W analizach biochemicznych i klinicznych do oznaczania aminokwasów, białek, węglowodanów, lipidów, narkotyków, trucizn, hormonów.
• W przemyśle farmaceutycznym do oznaczania antybiotyków, steroidów, środków uspokajających
i przeciwbólowych.
• W ochronie środowiska m.in. do oznaczania pestycydów, fenoli, polichlorowanych bifenyli.
• W przemyśle spożywczym np. do oznaczania przeciwutleniczy, aflatoksyn, słodzików i innych dodatków.
Gr. 11
Transmisyjny mikroskop elektronowy
Mikroskop elektronowy to przyrząd do badania struktury ciał, w którym powiększony obraz badanej próbki otrzymuje się przy użyciu oddziałującego z nią strumienia elektronów, uformowanego przez soczewki elektromagnetyczne. Rodzaje mikroskopów elektronowych: prześwietleniowy, skaningowy i transmisyjny.
Budowa mikroskopu i zasada działania
Praca transmisyjnego mikroskopu elektronowego polega w istocie na emisji elektronów z katody otoczonej cylindrem Wehnelta, przyśpieszeniu ich w polu elektrycznym o dużej różnicy potencjałów, uformowaniu wiązki elektronów przez soczewki kondensatora i skierowanie jej na cienki preparat. Następnie wiązka przechodzi przez kolejne dwie soczewki obiektywu i projektora aż w końcu pada na ekran fluorescencyjny lub kliszę fotograficzną gdzie powstaje powiększony obraz badanej próbki. TEM umożliwia powiększanie do miliona razy.
Transmisyjny mikroskop elektronowy jest podobny do odwróconego mikroskopu świetlnego:
wiązki światła zostały zastąpione wiązką elektronów,
skupienia wiązki - soczewki szklane zostały zastąpione cewkami magnetycznymi.
Przygotowanie preparatu
W przeciwieństwie do mikroskopu świetlnego w mikroskopie elektronowym można oglądać jedynie preparaty z komórek utrwalonych. Stosowany utrwalacz to roztwór aldehydu glutarowego (w buforze o określonym pH i stężeniu), po czym dodatkowo utrwala się czterotlenkiem osmu (OsO4).
ze względu na małą przenikliwość elektronów skrawki muszą być bardzo cienkie - nie grubsze niż 0,05mm (50µm). Wymaga to odpowiednio precyzyjnego aparatu do krojenia - ultramikrotomu
niewielkie fragmenty materiału ( nie większe niż 1 mm3) po utrwaleniu muszą być usztywnione, poddaje się je procedurze przesycania polimerami akrylowymi (metakrylany) lub epoksydowymi
po spolimeryzowaniu utwardzone w ten sposób tkanki są krojone na ultramikrotomie używając noży diamentowych lub szklanych (przełomy specjalnego szkła)
skrawki umieszczone na błonach nośnych na siateczkach podtrzymujących, przed oglądaniem dodatkowo kontrastuje się związkami metali ciężkich: ołowiu i uranu
Trójwymiarowy wygląd struktury
W celu odtworzenia trójwymiarowego wyglądu struktury znajdującej się wewnątrz komórki należy:
Zanalizować kolejne skrawki obiektu zwane skrawkami seryjnymi
Rozpoznać specyficzne cząsteczki, za pomocą przeciwciała związanego z cząstkami koloidalnego złota
Gęste cząstki złota nie przepuszczają wiązki elektronów, znacząc mikrofotografiach elektronowych położenie białek rozpoznawanych przez przeciwciała jako wyraźne, czarne plamki.
Zastosowanie TEM-u
analiza mikrostrukturalna
analiza międzypowierzchni
struktura krystaliczna
lokalna analiza pierwiastkowa
w badaniach krystalograficznych, biologicznych, medycznych, a także w fizyce ciała stałego.
Gr.11
SKANINGOWY MIKROSKOP ELEKTRONOWY (SEM)
jest to mikroskop elektronowy, w którym silnie zogniskowana wiązka elektronów przesuwa się po przedmiocie wybierając linia po linii poszczególne elementy
Sposób działania:
1.Wiązka elektronów, wytworzona w dziale elektronowym, tworzy wiązkę rozbieżną. Zyskuje zbieżność dzięki soczewkom magnetycznym. Soczewka obiektywu ogniskuje wiązkę o bardzo małej średnicy (do 0,1 nm) na powierzchni próbki. Cewki odchylające nadają wiązce ruch skanujący - omiata ona wybrany prostokątny obszar powierzchni ruchem skanującym, linia po linii.
2. Elektrony wiązki, wnikające w próbkę na niewielką głębokość, częściowo z powrotem z niej wychodzą, ulegając tzw. wstecznemu rozproszeniu. Większość z nich jednak pozostaje w próbce, tracąc energię w różnego rodzaju oddziaływaniach, czemu towarzyszy emisja elektronów wtórnych, elektronów Augera, promieni rentgenowskich, światła i innych.
3. Do tworzenia obrazu próbki można wykorzystać różnego rodzaju promieniowanie, należy jedynie użyć odpowiedniego detektora. Zwykle używa się różnych detektorów dla elektronów wtórnych i dla elektronów wstecznie rozproszonych. Różnice w ilości emitowanych elektronów, związane z lokalnymi różnicami kąta padania na nierówności powierzchni albo ze zróżnicowanym składem chemicznym, powodują powstanie kontrastów w obrazie.
4. Zastosowanie do tworzenia obrazu detektora promieniowania rentgenowskiego, sprzężonego z analizatorem energii tego promieniowania umożliwia dokonywanie analiz chemicznych wybranych obszarów, a nawet uzyskanie mapy składu chemicznego powierzchni próbki.
5. Powstały w detektorze sygnał jest wzmacniany elektronicznie i przesyłany do monitora na którym tworzy się obraz.
Zastosowanie w badaniu żywności:
Badanie mikrostruktur substancji pochodzenia roślinnego (np. ziaren zbóż i roślin strączkowych, ziaren skrobi) oraz zwierzęcego
Badanie żeli hydrokoloidów (np. skrzepu kazeiny)
Badanie preparatów hydrokoloidów (np. kazeinianów, stabilizatorów, zagęstników, substancji żelifikujących)
Ocena zafałszowań w produktach spożywczych
Analiza zanieczyszczeń biologicznych w żywności
Identyfikacja alergenów
gr. 11 WNOŻCiK
BLOTTING
Blotting jest to proces, dzięki któremu można wyodrębnić określone białko bądź kwas nukleinowy(DNA lub RNA) z mieszaniny białek.
Wyróżniamy trzy typy blottingu:
a) southern blotting- używany w celu identyfikacji określonego odcinka DNA
b) northern blotting- używany w celu identyfikacji określonego odcinka RNA (najczęściej mRNA)
c) western blotting- używany w celu identyfikacji określonego polipeptydu
W dwóch pierwszych typach główną rolę odgrywa hybrydyzacja filtru, zawierającego próbkę roztworu, z wyznakowaną sondą, która wiąże się specyficznie z szukanym segmentem kwasu nukleinowego i na podstawie tego przeprowadza się autoradiografię.
W przypadku western blotu zasadniczym etapem, na podstawie którego odczytywany jest wynik autoradiograficzny, jest immunoblotting, który polega na:
a) zablokowaniu miejsc niespecyficznych na filtrze, gdyż mogą się z nimi wiązać szukane białka
b) inkubacja ze specyficznymi przeciwciałami, które wiążąc sie z nim tworzą kompleks białko-przeciwciało
c) inkubacja z odczynnikiem używanym do detekcji, którym jest najczęściej drugorzędowe przeciwciało, czyli przeciwciało, dla którego antygenem jest przeciwciało specyficzne. Drugorzędowe przeciwciała są związane z barwnikami fluorescencyjnymi, cząstkami złota lub enzymami, które to właśnie dają widoczny efekt końcowy.
Gr XII
Przeciwciała monoklonalne
Przeciwciała monoklonalne ( mAb-ang. Monoclonal AntiBodies) - to zbiór takich przeciwciał, które wykazują jednakową swoistość względem danego antygenu i ewentualnie takie samo lub podobne powinowactwo. Nazwa wywodzi się stąd, że wszystkie takie przeciwciała są otrzymywane z jednego klonu limfocytów B.
Przeciwciała monoklonalne zostały otrzymane po raz pierwszy przez Cesara Milsteina oraz Georgesa Kohlera w 1975 roku.
Wyróżniamy następujące rodzaje przeciwciał monoklonalnych:
Klasyczne przeciwciała monoklonalne
Immunotoksyny
Połączenie przeciwciał monoklonalnych z lekami
Połącznie przeciwciał monoklonalnych z izotopami
Przeciwciała o podwójnej swoistości
Przeciwciała chimeryczne i „ uczłowieczone”
Abzymy
Przeciwciała antygenizowane
Przeciwciała monoklonalne są już używane jako leki, prowadzonych jest też coraz więcej badań nad ich potencjalnymi, przyszłymi zastosowaniami.
Główne zastosowania mAb to między innymi:
Zastosowanie w terapii nowotworów. Przykładem może być Mylotarg, który jest używany w leczeniu ostrej białaczki szpikowej i będący koniugatem mAb anty-CD33 ze złożonym oligosacharydem indukującym rozcinanie DNA.
Immunosupresja w transplantologii
Immunosupresja w chorobach o podłożu zapalnym
Badania diagnostyczne w laboratorium analitycznym (testy ELISA i RIA)
Blokowanie krzepnięcia krwi przez blokowanie receptorów płytek wiążących się z fibrynogenem.
WNoŻCziK
Gr.XII
Immunoenzymatycny test ELISA
ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ELISA czyli test immunoenzymatyczny lub immunoenzymosorbcyjny, jest jednym z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach biomedycznych, zarówno naukowych, jak i diagnostycznych. Służy on do wykrycia określonych białek w badanym materiale z użyciem przeciwciał poliklonalnych lub monoklonalnych skoniugowanych z odpowiednim enzymem.
Test ELISA należy do szerszej grupy tzw. testów fazy stałej, ale nie jest pierwszym, który został wynaleziony, chociaż jest jednym z najczęściej stosowanych. Pierwszą metodą z tej grupy, w której stosuje się przeciwciała znakowane radioizotopem, jest test RIA, za wynalezienie którego ROSALYN YALOW w 1997 roku otrzymała Nagrodę Nobla.
Zasada działania testu ELISA polega na tym, że przeciwciało związane z określonym enzymem może specyficznie rozpoznawać dane białko (zawarte w materiale biologicznym), które wcześniej zostało unieruchomione na podłożu. Po dodaniu przeciwciał następuje utworzenie kompleksów immunologicznych, zatem przeciwciało także zostaje unieruchomione. Po wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała i dodaniu substratu dla enzymu związanego z przeciwciałem zajdzie reakcja enzymatyczna, czemu z kolei będzie towarzyszyło pojawienie się produktu. Wykrycie jego obecności (może to być np. produkt barwny powstający z bezbarwnego substratu) świadczy o obecności danego białka w badanym materiale.
gr.11
CHROMATOGRAFIA GAZOWA
Chromatografia gazowa to analityczna technika chromatograficzna, w której fazą nośną jest gaz (najczęściej hel, coraz rzadziej wodór). Technika ta umożliwia procentowe ustalenie składu mieszanin związków chemicznych, w których występuje ich nawet kilkaset. Nie umożliwia natomiast bezpośredniej identyfikacji struktury chemicznej związków, za wyjątkiem aparatów z detektorem masowym.
Chromatograf gazowy składa się ogólnie z następujących podstawowych elementów:
Układ nastrzykowy
Termostatowany piec
Kolumna chromatograficzna
Detektor
Rejestrator
Zasada działania chromatografu
Metoda ta jest oparta na rozdzielaniu mieszanin na długich i cienkich kolumnach z odpowiednim wypełnieniem stałym lub żelowym, a następnie detekcji stężenia kolejno wychodzących związków na wylocie kolumny. Mechanizm rozdziału oparty jest na występowaniu oddziaływań międzycząsteczkowych między związkami rozdzielanych mieszanin i wypełnieniem kolumn. Oddziaływania te hamuj± przepływ związków chemicznych przez kolumnę. Czym są one silniejsze, tym czas przejścia związku chemicznego przez kolumnę jest dłuższy. Czas przejścia danego związku chemicznego przez całą kolumnę jest nazywany jego retencją. Przy odpowiednio długiej i cienkiej kolumnie czasy retencji związków są na tyle różne, że wychodzą one z kolumny osobno, przy czym cała objętość związku wychodzi w stosunkowo krótkim czasie.
Próbka analizowanej mieszaniny jest wstrzykiwana do tzw. odparowywacza, gdzie panuje na tyle wysoka temperatura, aby wszystkie jej składniki przeszły w stan gazowy. Następnie próbka jest porywana przez gaz nośny i kierowana na kolumnę. Na końcu kolumny znajduje się detektor, który mierzy stężenie związków w gazie nośnym, które wychodzą z kolumny.
Próbki analizowane metodą chromatografii gazowej muszą być lotne oraz nie ulegać rozpadowi w podwyższonej temperaturze. Najczęściej są to rozmaite mieszaniny gazów i roztwory zawierająca lotne (zdolne do parowania) związki chemiczne. Zalet± chromatografii gazowej jest możliwość użycia bardzo niewielkiej próbki analizowanej substancji
Chromatografia gazowa jest najczęściej stosowaną metodą do szybkiej analizy złożonych mieszanin związków chemicznych oraz oceny czystości tych związków, zarówno w przemyśle jak i w rozmaitych laboratoriach. Chromatografię gazową stosuje się m.in. w:
przemyśle petrochemicznym - np. do oceny składu chemicznego produkowanej benzyny;
ochronie środowiska - do oceny stopnia zanieczyszczenia, gleby, powietrza i wody;
kryminalistyce - np. do analizy źródła pochodzenia narkotyków na podstawie składu zawartych w nich zanieczyszczeń;
kontroli antydopingowej - gdzie aparaty GC-MS (Gas chromatography - mass spectrometry) stanowią podstawową metodę wykrywania niedozwolonych substancji w krwi, pocie, moczu i ekstrakcie z włosów sportowców.
gr 11
CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA
Cytometria to grupa metod służących dokonywaniu pomiarów pewnych wybranych chemicznych i fizycznych własności pojedynczych komórek. Cytometria jest używana np. do fenotypowania, czyli do określania typu białek, które są charakterystyczne dla danej komórki, ale różne w różnych grupach komórek lub osobnikach danego gatunku
Cytometria przepływowa - technika za pomocą której bada się kilka parametrów jednej komórki jako całości, z ogromną prędkością rzędu tysięcy komórek na sekundę. Przy pomocy tej metody uzyskuje się istotne dane statystyczne o całej badanej populacji, nie daje ona natomiast informacji o strukturze trójwymiarowej pojedynczych komórek.
W cytometrze przepływowym zawiesina odpowiednio zabarwionych komórek (rozcieńczona krew, próbka cytologiczna pobrana metodą biopsji aspiracyjnej, próbka płynu z jamy ciała, itp.) jest wytłaczana w otoczce płynu osłaniającego przez specjalną dyszę, w postaci laminarnie płynącego, cienkiego strumienia zawierającego rząd pojedynczych komórek. Jest to tzw. ogniskowanie hydrodynamiczne w którym płyn osłaniający płynie szybciej niż centralny strumień z komórkami. Strumień ten (o średnicy ok. 30 mikrometrów) przepływa przed optoelektronicznymi układami rejestrującymi (fotokomórkami lub fotopowielaczami), w którym pojedyncze komórki są oświetlane przez cienkie wiązki monochromatycznego, spolaryzowanego światła (lasera, wycinki widma światła lampy rtęciowej). Pojedyncze komórki rozpraszają, załamują, odbijają i absorbują światło przechodzące przez komorę pomiarową, powodując chwilowe zmiany sygnału elektrycznego z rejestrujących elementów optoelektronicznych. Zmiany te są zależne od barwy, struktury i intensywności zabarwienia komórki. Rejestrowane są: czas zmiany tego sygnału (wskazujący na wielkość przepływającego obiektu) i amplituda zmian sygnału (wskazująca na intensywność zabarwienia, ziarnistość) oraz zmiany polaryzacji w stosunku do pierwotnej polaryzacji światła lasera (wskazujące na ukształtowanie powierzchni struktury). Rozproszenie wiązki światła jest mierzone przez przedni detektor światła rozproszonego (ang. forward scatter channel), leżący w osi wiązki światła, którego sygnał informuje o wielkości komórki oraz boczny detektor światła rozproszonego (ang. side scatter channel), ustawiony prostopadle do niej, którego sygnał uznawany jest za informujący o strukturze jądra. Bardziej rozbudowane cytometry mają dodatkowe układy optoelektroniczne ustawione pod różnymi katami w stosunku do wiązki światła, informujące o powierzchni komórki. W przypadku pomiaru fluorescencji, komórki te są wzbudzane do świecenia, a świecenie komórek jest także rejestrowane (po odpowiednim filtrowaniu wzbudzonego światła).
PARAMETRY MIERZALNE ZA POMOCA CYTOMETRU
STRUKTURALNE : rozmiar, kształt, cytoplazmatyczna ziarnistość, zawartość barwnika np.: hemoglobina, barwniki fotosyntetyczne, porfiryny, aminokwasy fluoryzujące w białkach np.:tryptofan, tyrozyna, zawartość DNA, RNA, wszystkich białek, lipidów, cukrów powierzchniowych, antygenów.
FUNKCJONALNE: ładunek powierzchniowy, ekspresja receptorów powierzchniowych, integralność błony (żywotność), aktywność endocytarna, organizacja cytoszkieletu, aktywność enzymów.
PODSUMOWANIE: zalety cytometru przepływowego
W zależności od jakości cytometru można badać koekspresję nawet czterech antygenów, co nie jest możliwe w żadnej innej metodzie
analizowania bardzo licznych populacji obiektów w krótkim czasie, oraz pozwala osiągnąć wysoką dokładność i zminimalizować rozrzut wyników.
W ciągu kilku sekund można z niezwykłą dokładnością i powtarzalnością wykryć subpopulacje rzadko występujące i nietypowe
Ogólnie, cytometria przepływowa jest wspaniałym nieinwazyjnym (tzn. nie naruszającym integralności komórkowej) narzędziem badawczym w wieloparametrowej ocenie struktury i funkcji komórek.
możliwość oznaczenia ploidii w komórkach o określonym fenotypie
Autoradiografia
Autoradiografia stanowi metodę wykrywania izotopów promieniotwórczych przy użyciu emulsji fotograficznej. Pod wpływem promieniowania jonizującego przenikającego ze znakowanego materiału biologicznego do emulsji powstaje w niej utajony, który po zastosowaniu procedury fotograficznej ujawnia się w postaci ziaren widocznych pod mikroskopem. Zatem do sporządzenia autoradiogramu potrzebne są trzy elementy:
Emulsja jądrowa
Izotopy promieniotwórcze
Materiał biologiczny
•Emulsja składa się z ziaren AgBr (kryształów) zawieszonych w żelatynie. W skład kryształów AgBr wchodzą jony Ag+ i Br - oraz srebro metaliczne, tworzące tzw. ogniska czułości.
•Cząstki przenikające przez kryształ pozostawiają na drodze swego przebiegu wolne elektrony.
•Elektrony skupiają się w obrębie ognisk czułości - powstają ujemne ładunki
•Do miejsc tych dążą kationy ulegające neutralizacji.
•Powstaje obraz utajony
•Kryształy z obrazami utajonymi ulegają szybciej redukcji w trakcie wywoływania.
Wydajność autoradiogramu
•Określa ją ilość powstających emulsji pod wpływem jednego rozpadu jądra atomowego w źródle promieniowania.
Wydajność zależy od :
rodzaju izotopu
grubości materiału biologicznego
emulsji
czasu ekspozycji
procedury technicznej
Rodzaje autoradiografii
Metoda filmu zdzieranego
Metoda emulsji płynnej
Autoradiografia śladowa
Autoradiografia mikroskopowo - elektronowa
Autoradiografia związków rozpuszczalnych
Proces fotograficzny
•Polega na wywoływaniu i utrwalaniu obrazu utajonego .
•Jest to redukcja kryształu AgBr do Ag przez chemiczne związki w środowisku zasadowym.
•Pod mikroskopem widać powstałe ziarna srebra metalicznego
•Szybkość wywołania zależy od obecności obrazów utajonych, srebro pełni rolę katalizatora.
•Najczęściej używanym wywoływaczem w ARG mikroskopu świetlnego jest D19b Kodaka.
•Utrwalanie polega na wypłukiwaniu tych kryształów , które nie tworzą obrazów utajonych i powstawaniu kompleksów w wodzie.
•Utrwalacz: tiosiarczan sodu.