Projekt z przedmiotu „Markery molekularne”
Dominik Jakubiak
biotechnologia VI semestr
Projekt pracowni analitycznej zajmującej się przyjmowaniem i oznaczaniem próbek pacjentów ze wskazaniem na oznaczenie profilu metabolizmu leków. Badanie takie okazuje się niezwykle przydatne przy lekach stosowanych w formie proleku lub których metabolit ma istotne znaczenie farmakologiczne, głównie dotyczy to leków takich jak: enkainid, proguanil, kodeina, a także leków, których zaburzenia metabolizmu mogą powodować efekty uboczne i toksyczne na orgaznizm: leki psychotropowe i fenacetyna.
Schemat postępowania przyjęty przy oznaczaniu profilu metabolizmu.
Przyjętą próbkę krwi pacjenta odpowienio przygotowywuje się do oznaczenia - izoluje się genomowe DNA pacjenta:
1. Pobrać 1 ml krwi do 100 μl EDTA.
2. Dodać 7 ml 1% cytrynianu sodu. Wirować 10 min, 2500 rpm. Odrzucić supernatant.
Osad zawiesić w 5 ml H2O.
3. Dodać1 ml 5% cytrynianu sodu. Wirować 10 min, 2500 rpm. Odrzucić supernatant.
4. Rozpuścić osad w 1 ml octanu sodu. Dodać 0,1 ml 10% SDS. Inkubować 1 h,
37OC.
5. Dodać 0,4 ml NaCl i wymieszać . Wirować 10 min, 5000 rpm, 4OC. Supernatant
przenieść do świeżej probówki. Powtarzać aż supernatant będzie klarowny.
6. Dodać 2,5 obj. etanolu absolutnego. Wymieszać i zebrać DNA do świeżych probówek.
7. Zwirować w 4OC, 13000 rpm. Przemyć DNA 70% etanolem. Zwirować ponownie
i odrzucić supernatant.
8. Osad wysuszyć w temp. pokojowej ok. 10 min.
9. Rozpuścić uzyskane DNA w 100 μl sterylnej H2O.
Następnie tak uzyskaną próbkę DNA denaturuje się i nakrapia się na odpowiednio przygotowane micro assays DNA (z przyłączonym do dna studzienek przeciwciałem), następnie dodaje się odpowiednią, wyznakowaną tym samym przeciwciałem co studzienki, jednoniciową sekwencję kodującą fragment DNA cytochromu P450 typowego dla fenotypu metabolizującego z normalną szybkością. Test wykonuje się w 2 powtórzeniach (2 studzienki dla jednego pacjenta), dwie studzienki kontrolne (nakrapiamy do nich DNA osobnika z wiadomym oznaczonym wczesniej standardowym fenotypem. Stosuje się odpowiednie warunki dla hybrydyzacji, a następnie używa się enzymu egzonukleazy S1, który potnie zarówno niezhybrydowane jednoniciowe odcinki DNA jak i poprzecina na fragmenty DNA pacjenta, w miejscach niedopasowań, które związały się z sekwencją fenotypu standardowego. Następnie stymuluje się przyłączenie DNA zawierającego przeciwciało do przeciwciała na dnie studzienek poprzez dodanie białka specyficznie przyłączanego przez przeciwciało (metoda kanapki). Wszystkie niezwiązane z fragmentem DNA na studzience sekwencje wymywamy buforem elucyjnym. Następnie przeprowadzamy reakcję PCR, używając najpierw adaptorów (bo egzanukleaza S1 zostawia tępe końce) z nieufosforylowanymi końcami, aby przyłączały się jedynie do DNA w studzience, a nie same ze sobą, używamy tutaj starterów komplementarnych do sekwencji adaptora. Reakcja ma miejsce w odpowienim termocyklerze na micro assays DNA. Na końcu próbki DNA puszczamy na żelu elektroforetycznym w warunkach denaturujących. Uzyskane prążki porównujemy z odpowiednim profilem metabolizmu. Czym więcej prążków, tym więcej mutacji punktowych, a czym grubsze prążki, tym więcej powtórzeń danego genu. DNA genu kodującego standardowy fenotyp metabolizmu różnież zostaje zamplifikowane, zatem na żelu zawsze jest obecny również prążek standardowego fenotypu (tylko jeden), jego obecność będzie również potwierdzała, że amplifikacja zaszła w odpowiednich warunkach.
Materiały do izolacji z krwi:
500 mM EDTA; pH = 8,0
Cytrynian sodu
0,2 M octan sodu; pH = 5,6
10% SDS
5 M NaCl
Etanol absolutny , etanol 70%