Badanie szybkości hydrolizy lipidów mleka i oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej.

Wykonanie:

Celem ćwiczenia jest poznanie alkacymetrycznej metody oznaczania aktywności lipazy trzustkowej z użyciem śmietanki jako naturalnej emulsji lipidu oraz badanie szybkości katalizowanej reakcji zależnie od jej trwania.

Otrzymany w kolbce ekstrakt enzymatyczny lipazy uzupełniamy wodą destylowaną do kreski i dobrze mieszamy. Do 6 enzymatycznie czystych probówek (będą to próby pełne) odmierzamy 2,5 ml śmietanki i po 1 ml buforu. Mieszamy i umieszczamy w łaźni wodnej o temperaturze 37 st. C. Po około 5 minutach do wszystkich probówek dodajemy kolejno z otrzymanej kolby miarowej po 0,5 ml ekstraktu lipazy, dobrze mieszamy i wstawiamy do łaźni wodnej. Po 20 minutach po dodaniu enzymu wyjmujemy z łaźni 2 probówki, dodajemy po 5 ml etanolu, kilka kropel fenoloftaleiny i całość przenosimy do kolby stożkowej na 100 ml. Zawarte w próbie kwasy tłuszczowe miareczkujemy mianowanym roztworem KOH do trwałego różowego zabarwienia. Kolejne dwie próby wyjmujemy po 40 minutach i po 60 minutach od dodania enzymu i postępujemy analogicznie do prób wyjętych po 20 minutach. Dodatkowo wykonujemy także próbę kontrolną w dwóch powtórzeniach. W tym celu odmierzamy do dwóch kolb stożkowych na 100 ml i po 2,5ml śmietanki, 1 ml buforu, 5 ml etanolu, kilka kropli fenoloftaleiny oraz 0,5 ml ekstraktu lipazy a następnie miareczkujemy roztworem KOH. Do zbadania samej aktywności lipazy trzustkowej wykonujemy oznaczenie po 60 minutach (dwie próby pełne jak wyżej).

Wyniki i obliczenia:

Dla aminotransferazy asparaginianowej:

Próba kontrolna	Próba kontrolna	Próba pełna po 20 minutach	Próba pełna po 40 minutach	Próba pełna po 40 minutach	Próba pełna po 60 minutach	Próba pełna po 60 minutach
4,6 ml	4,5 ml	5,8 ml	9,1 ml	9,2 ml	12 ml	12,1 ml

Średnia prób kontrolnych: 4,55 ml

Średnia prób po 60 minutach: 12,05 ml

Różnica prób: 7,6 ml

Obliczenia:

1 ml KOH 50 μmoli kwasów tłuszczowych

7,5 ml x

x - 375 μmoli

0,5 ekstraktu 375 μmoli

10 ml roztworu y

y - 7500 μmoli

3,5 ml 7500 μmoli

1000 ml z

z - 2142857 μmoli

30 g - 2142857 μmoli

1 g - w

w - 71429 μmoli

71429 μmoli / 60 min = 1191 μmol / min*g trzustki

1

---